Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung des antepartalen Hormonstatus von Milchkühen unter besonderer Berücksichtigung der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Konzentration
im Plasma
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Korinna Kedves Kempten (Allgäu)
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: JProf. Dr. Marion Schmicke (geb. Piechotta) Klinik für Rinder
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: JProf. Dr. Marion Schmicke (geb.Piechotta) Klinik für Rinder
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 2016
Mit freundlicher Unterstützung von Zoetis
Meiner Familie
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits präsentiert:
Artikel:
Hepatic mRNA expression of acid labile subunit and deiodinase 1 differs between cows selected for high versus low concentrations of insulin-like growth factor 1 in late pregnancy.
Piechotta M, Kedves K, Araujo MG, Hoeflich A, Metzger F, Heppelmann M, Muscher-Banse A, Wrenzycki C, Pfarrer C, Schuberth HJ, Hoedemaker M, Bollwein H, Kaske M.
J Dairy Sci. 2013 Jun; 96(6):3737-49.
Poster:
Relationship between Insulin-like growth factor I concentrations in fetal allantoic fluid and maternal blood in dairy cows.
Kedves K, Heppelmann M, Kaske M, Bollwein H, Piechotta M.
44. Jahrestagung „Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“ Hannover 2011.
Impact of antepartal differences in Insulin-like growth factor plasma concentrations on concentrations of various metabolic and reproductive hormones in dairy cows.
Piechotta M, Kedves K, Heppelmann M, Kaske M, Bollwein H.
44. Jahrestagung „Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“ Hannover 2011.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literatur ... 3
2.1 Transitperiode ... 3
2.2 Das Insulin-like Growth Factor-System ... 3
2.2.1 Insulin-like Growth Factor I ... 4
2.2.2 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine ... 8
2.2.3 Insulin ... 13
2.3 Somatotrope Achse ... 14
2.3.1 Wachstumshormon ... 14
2.3.2 Suppressor of Cytokine Signaling ... 19
2.4 Cortisol ... 20
2.5 Sexualhormone ... 21
2.6 Schilddrüsenhormone ... 23
2.7 Energiestoffwechsel ... 24
3 Material und Methode ... 26
3.1 Versuchstiere ... 26
3.1.1 Herkunftsbetrieb ... 26
3.1.2 Auswahl ... 26
3.2 Versuchszeitraum ... 28
3.2.1 Haltung der Versuchstiere ... 28
3.2.2 Blutentnahmen ... 28
3.2.3 Leberbiopsien ... 29
3.3 Bestimmung der endokrinologischen Parameter ... 29
3.3.1 Insulin-like Growth Factor I ... 29
3.3.2 Schilddrüsenhormone und Cortisol ... 30
3.3.3 Wachstumshormon ... 31
3.3.4 Progesteron und 17β-Östradiol... 32
3.3.5 Insulin ... 33
3.3.6 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine ... 34
3.3.7 Bestimmung der klinischen Parameter ... 35
3.4 Polymerase-Kettenreaktion ... 36
3.4.1 Prinzip der quantitativen Real time PCR ... 36
3.4.2 Leberbiopsien ... 37
3.5 Statistik ... 40
4 Ergebnisse ... 42
4.1 Versuchstiere ... 42
4.1.1 Auswahl der Versuchstiere auf dem landwirtschaftlichen Betrieb ... 42
4.1.2 Versuchsgruppen ... 46
4.2 Endokrinologische Parameter ... 49
4.2.1 Insulin-like Growth Factor I ... 49
4.2.2 Triiodthyronin ... 51
4.2.3 Thyroxin ... 52
4.2.4 Cortisol ... 53
4.2.5 Wachstumshormon ... 54
4.2.6 Progesteron ... 55
4.2.7 17β-Östradiol ... 56
4.2.8 Insulin ... 57
4.2.9 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine ... 58
4.3 Klinisch chemische Parameter... 61
4.4 Korrelationen ... 63
4.5 Hepatische Genexpression ... 65
5 Diskussion ... 68
5.1 Versuchstiere ... 68
5.1.1 Zeitpunkt der Probennahme ... 68
5.1.2 Grenzwert für die Einteilung in Insulin-like Growth Factor I Gruppen ... 68
5.1.3 Minimierung der Insulin-like Growth Factor I beeinflussenden Faktoren ... 69
5.2 Insulin-like Growth Factor I ... 71
5.2.1 Vergleich der Versuchsgruppen anhand von Insulin-like Growth Factor I ... 72
5.2.2 Insulin-like Growth Factor I und Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine ……….73
5.2.3 Insulin-like Growth Factor I und die Somatotrope Achse ... 75
5.2.4 Assoziation zwischen Insulin-like Growth Factor I und Schilddrüsenhormonen ……….77
5.2.5 Insulin-like Growth Factor I und Energiestoffwechsel ... 78
5.2.6 Insulin-like Growth Factor I und Sexualhormone ... 80
5.2.7 Insulin-like Growth Factor I und Cortisol ... 80
6 Zusammenfassung ... 81
7 Summary ... 84
8 Literaturverzeichnis ... 87
9 Abkürzungsverzeichnis ... 103
10 Anhang ... 107
Danksagung ... 112
Einleitung
1 Einleitung
Reproduktions- und Gesundheitsprobleme in der Milchwirtschaft haben in den letzten Jahren – in Verbindung mit steigenden Milchleistungen – deutlich zugenommen.
Fruchtbarkeitsstörungen sind mittlerweile für 25% der Abgänge bei Milchkühen verantwortlich und stellen damit die häufigste Ursache für deren Merzung dar (Opsomer und Kruif 1999).
Dem Insulinähnlichen Wachstumsfaktor (engl. Insulin-like Growth Factor, IGF)-System kommt dabei eine besondere Bedeutung zu. IGF-I spielt als ein entscheidender Wachstumsfaktor eine bedeutende Rolle bei Zellwachstum, Zellproliferation und Differenzierung (McCusker 1998). Das IGF-System ist ein komplexes System, das aus zwei Liganden (IGF-I und IGF-II), sechs IGF-Bindungsproteinen (IGFBP) sowie transmembranen Zellrezeptoren besteht. Bei Milchrindern sinkt kurz vor der Geburt die Dichte der Rezeptoren für Wachstumshormon (Growth Hormone, GH) in der Leber. Dies ist assoziiert mit deutlich sinkenden IGF-I-Plasmakonzentrationen kurz vor und während der Geburt (Lucy et al. 1992).
Zudem ist die Bioverfügbarkeit von IGF-I abhängig von der Bindung des Liganden an die sechs hochaffinen IGFBPs. Von besonderer Bedeutung ist hierbei das IGFBP-3, an das bis zu 95% des zirkulierenden IGF-I gebunden ist (McCusker 1998, Hennies und Sauerwein 2003).
Neben endokrinen und metabolischen Funktionen hat IGF-I ebenfalls wichtige para- und autokrine Aufgaben bei der Zelldifferenzierung und Wundheilung (D’Ercole et al. 1984). Es gibt Hinweise darauf, dass die abfallenden, aber interindividuell sehr unterschiedlichen IGF-I- Konzentrationen in den letzten Wochen der Trächtigkeit mit Fertilitätsproblemen nach der Geburt in Zusammenhang stehen (Kawashima et al. 2007). Je früher und zuverlässiger Kühe anhand von hormonellen oder metabolischen Parametern als Risikopatienten identifiziert werden können, umso früher sind ein tierärztliches Eingreifen und der Erhalt der Herdengesundheit möglich.
In dieser Arbeit soll geprüft werden, ob die Zuordnung von Kühen anhand einer einzelnen Blutprobe in der Hochträchtigkeit zu einer IGF-I Gruppe („hoch“ – „niedrig“) vertretbar ist.
Es soll überprüft werden, ob die Tiere, die anhand einer einzigen Blutprobe ausgewählt
Einleitung
worden sind, sich im überwachten Zeitraum weiterhin konstant in der IGF-I-Konzentration unterscheiden.
Weiterführend soll der Konzentrationsverlauf wichtiger Stoffwechselhormone (GH, Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4), Insulin, 17β-Östradiol, Progesteron) verglichen werden, um Differenzen und Parallelen zwischen Tieren mit hoher und niedriger antepartaler IGF-I-Konzentration im Serum zu ermitteln. Das Zusammenwirken zwischen den Schilddrüsenhormonen und IGF-I soll mit Hilfe der Bestimmung der Leber-Expression der Iodothyronin-Deiodinase (DIO-1) genauer untersucht werden. Das Zusammenspiel zwischen IGF-I, den IGFBPs, sowie dem GH und dessen Rezeptor (GHR) soll zusätzlich auf mRNA- Ebene beleuchtet werden.
Literatur
2 Literatur
2.1 Transitperiode
Das Zeitintervall von drei Wochen vor bis drei Wochen nach der Geburt wird gemeinhin als Transitperiode definiert (Grummer 1995). Die Festlegung des genauen Intervalls schwankt von Autor zu Autor um einige Wochen, allerdings besteht Einigkeit darin, dass der peripartale Zeitraum sich durch die höchste Inzidenz an auftretenden Krankheiten und den Beginn ihrer schwerwiegenden Folgen für v.a. die Fruchtbarkeit auszeichnet (Grummer 1995, Doepel et al.
2002, Lucy 2008). In diesem Zeitraum finden die größten metabolischen, hormonellen und immunologischen Veränderungen der hochleistenden Milchkuh statt (Mallard et al. 1998).
Auf Grund von Problemen und Krankheiten im Abkalbezeitraum verlassen etwa ein Fünftel aller Kühe und Färsen den landwirtschaftlichen Betrieb (Zieger 2013). Das weitere Verbleiben einer Kuh im Betrieb und der von ihr eingebrachte wirtschaftliche Profit für den Landwirt hängen somit entscheidend von ihrer Fähigkeit ab nach der Kalbung ohne Probleme wieder in einen balancierten Hochleistungszustand zurückzukehren.
2.2 Das Insulin-like Growth Factor-System
Das IGF-System besteht aus den Liganden IGF-I, IGF-II und Insulin, den korrespondierenden Rezeptoren sowie sechs hochaffinen Bindungsproteinen (IGFBPs) und zehn niedrigaffinen IGFBP-verwandten Proteinen (IGFBP related proteins/ IGFBP-rPs) (Rajaram et al. 1997). Als ebenfalls dem IGF-System zugehörig werden die IGFBP-Proteasen sowie die IGFBP- und IGFrP-Rezeptoren betrachtet (Hwa et al. 1999) (siehe Abbildung 1).
Literatur
Abbildung 1: Die Komponenten des IGF-Systems: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) und IGF-II, IGF-Bindungsprotein (IGFBP) IGFBP-1 bis IGFBP-6, IGFBP related proteins (IGFBP-rPs), IGFBP Protease Typ I und Typ II, IGF Rezeptoren, sowie potentielle IGFBP(s) und IGFBP-rP Rezeptoren.
(Mannose-6-phosphate (M6P)) (aus Hwa et al. 1999).
2.2.1 Insulin-like Growth Factor I
Das Polypeptid IGF-I wird überwiegend (> 70%) in der Leber produziert (Sjögren et al.
1999). Die Bezeichnung „Insulin-like Growth Factor“ (IGF) wurde zuerst von Rinderknecht und Humbel (1978) verwendet, davor wurde IGF-I als Somatomedin C (SM-C) bezeichnet.
Die IGF-Struktur ist innerhalb der Säugetiere hoch konserviert, zeigt eine Sequenzhomologie von etwa 50% zu Insulin und eine dem Proinsulin ähnliche Struktur (Frago und Chowen 2005, Bowman et al. 2010). Zwischen bovinem und humanen IGF-I besteht eine vollkommene Sequenzhomologie, bei IGF-II dagegen sind drei von 67 Aminosäuren nicht
Literatur
Mit Insulin und IGF-II ergänzt sich IGF-I bei Stoffwechsel- und Wachstumsprozessen. Seine Hauptwirkung zeigt IGF-I hierbei vor allem nach der Geburt, wohingegen IGF-II während des foetalen Wachstums seine Hauptregulationswirkung entfaltet (Gluckman und Butler 1983, Listrat et al. 1994).
Im Gegensatz zu Insulin, das seine Wirkung direkt entfaltet, wird die Konzentration von freiem IGF-I und IGF-II zusätzlich durch Bindungsproteine kontrolliert. Freies IGF-I ist in der Lage sowohl an seinen eigenen Rezeptor (Typ 1 IGF-Rezeptor/IGF-1R), als auch mit geringerer Affinität an IGF-II- und Insulin-Rezeptoren zu binden (IGF-2R, InsR) (siehe Tabelle 1). Die beiden Rezeptoren IGF-1R und InsR zeigen zudem eine hohe Sequenzhomologie, eine Bildung von Hybridrezeptoren aus den α- und β-Untereinheiten beider Rezeptoren wurde beschrieben (Jones und Clemmons 1995).
Der Hauptsyntheseort von IGF-I sowie IGFBP-3 liegt in der Leber (Chin et al. 1984). Nicht nur durch Untersuchungen an Labortieren (Ratten, Mäusen), sondern auch bei Studien am Rind wurde die Synthese von IGFs in der Leber bestätigt (Rhoads et al. 2008). Neben der Leber sind fast alle Körpergewebe, wenn auch in geringerer Menge, zur Synthese von IGFs und IGFBPs befähigt (Roberts und Le Roith 1988, Le Roith et al. 2001) (siehe Tabelle 1).
Abgesehen von endokrinen Wirkungen zeigt IGF-I in den verschiedenen Geweben zusätzlich sowohl para- als auch autokrine Funktion (D’Ercole et al. 1984).
Literatur
Tabelle 1: Hauptaufgaben, Lokalisation, Herstellungsort, Affinitäten und Antagonisten von Insulin- like Growth Factor I (IGF-I), IGF-II sowie Insulin; Abkürzungen: IGF-I Rezeptor (IGF-1R), IGF-II Rezeptor (IGF-2R), Insulin-Rezeptor (InsR), IGF-Bindungsprotein (IGFBP) (Tabelle modifiziert nach O´Connor et al. 2008).
Ligand Hauptaufgabe Lokalisation: Herstellungsort
IGF-I und IGF-II fördert Metabolismus, Proliferation, Differentiation
alle Körperflüssigkeiten: alle Gewebe
Insulin Ausrichtung des Nährstoff-
Stoffwechsel zur Speicherung Kreislauf: Pankreas
Rezeptor Relative Affinität Lokalisation
IGF-1R IGF-I > IGF-II >> Insulin 1:2:200
einer oder beide auf den meisten, wenn nicht allen, Zellen des Körpers InsR
(a/b Isoformen)
Insulin ≥ IGF-II > IGF-I 1:2:30
Natürliche
Antagonisten Relative Affinität Lokalisation: Herstellungsort IGFBP 1 bis 6 IGF-II ≥IGF-I ≠ Insulin Körperflüssigkeiten,
Zelloberflächen: alle Gewebe IGF-2R IGF-II >>>> IGF-I ≠ Insulin
IGF-I unterliegt nicht nur der Kontrolle von GH, Prolaktin und Zytokinen (Sara und Hall 1990), sondern auch einer Vielzahl von zusätzlichen Einflüssen, unter denen das Immunsystem (Auernhammer und Strasburger 1995, Buul-Offers und Kooijman 1998) und der Ernährungszustand als die wichtigsten zu betrachten sind (Formigoni und Trevisi 2003).
Die IGF-I-Konzentration zeigt hierbei eine enge Kopplung mit dem Energiestatus (Fenwick et al. 2008). So ist z.B. eine stark negative Energiebilanz (NEB) bei peripartalen Milchkühen mit einem Absinken der IGF-I-Konzentration im Blut verbunden (Wathes et al. 2007b). Kühe mit ausgeprägter NEB und niedrigen IGF-I-Konzentrationen zeigen hierbei eine erhöhte Inzidenz für postpartale Krankheiten (Wathes et al. 2009).
Literatur
Eine hohe IGF-I-Konzentration fördert die Zellproliferation und Wundheilung, ist im Gegenzug allerdings invers mit der Lebensdauer assoziiert (Kenyon 2005). Die durch IGF-I geförderten Vorgänge, wie u.a. Zellproliferation und Wundheilung sind mehrtägige Prozesse, die durch die Aufrechterhaltung einer bestimmten IGF-I-Konzentration über einen längeren Zeitraum begünstigt werden. Wie Ronge et al. (1988) zeigten, ist IGF-I demgemäß keinen signifikanten tageszeitlichen oder – im Gegensatz zu Insulin – fütterungsbedingten Schwankungen unterworfen.
Für das Rind konnte durch Kawashima et al. (2007) ein Zusammenhang zwischen antepartalen IGF-I-Konzentrationen und der Fruchtbarkeit der Tiere (zyklisch/anöstrisch) nach der Geburt beschrieben werden. Ein hoher IGF-I-Wert ist hierbei mit besseren Erstbesamungserfolgen und höheren Trächtigkeitsraten verbunden. Niedrige IGF-I- Konzentrationen dagegen können mit einer verlängerten Zeit bis zum Zykluseintritt und ovariellen Entartungen (inaktive Ovarien, Zysten oder persistierende Gelbkörper) in Verbindung gebracht werden (Taylor et al. 2004, Falkenberg et al. 2008). Auch Pushpakumara et al. (2003) fanden bei Kühen mit niedrigen IGF-I-Werten im Frühpuerperium ein höheres Risiko für eine Störung der Wiederherstellung der zyklischen Ovarienaktiviät. Velazquez et al. (2008) weisen darauf hin, dass Untersuchungen an Ovarzellen gezeigt haben, dass bovine und ovine Zellen wesentlich geringere Mengen an IGF-I produzieren als von Mäusen gewonnene Zellen. Dies könnte laut den Autoren auf eine größere Abhängigkeit des Ovars der Wiederkäuer von endokrin gebildetem IGF-I hindeuten.
Bei tragenden Kühen unterscheiden sich die IGF-I-Konzentrationen ab der 15ten Trächtigkeitswoche signifikant von denen nicht tragender Kühe, zirkulierendes IGF-I steigt bis zum dritten Trimester an und sinkt danach langsam ab (Velazquez et al. 2008). Die Beobachtungen zahlreicher Autoren bestätigen diesen Verlauf: Vega et al. (1991) berichten von einem 2/3 Abfall der IGF-I-Konzentration bei Holstein Friesian innerhalb der letzten Trächtigkeitswoche bis zur Geburt. Radcliff et al. (2003a) beschreiben einen graduellen Abfall der IGF-I-Konzentration von Tag 14 antepartum bis Tag 3 antepartum, gefolgt von einem starken Abfall bis zur Kalbung und einem langsamen Anstieg nach der Geburt.
Shrama et al. (1994) fanden bei Holstein Friesian Kühe in der Trockenstehphase, im Vergleich zum restlichen Laktationsverlauf, die höchsten IGF-I-Konzentrationen. Taylor et al.
(2004) sowie Wathes et al. (2007a) zeigten weitergehend, dass bei primiparen Kühen die IGF-
Literatur
I-Konzentration im Blut signifikant höher ist als bei pluriparen Kühen. Beide Autoren vermuten eine Verbindung mit dem noch nicht abgeschlossenen Wachstum der primiparen Kühe. In adulten Milchkühen gelten Hormonveränderungen, Futteraufnahme, Energiebilanz sowie Pansenkapazität als maßgebend für Veränderungen des IGF-I Niveaus (Velazquez et al.
2008).
Ausschlaggebend für den IGF-I-Verlauf sind, neben Alter und Ernährungszustand, ebenfalls die Rasse/der Genotyp (Roberts et al. 2005) sowie die Höhe der Milchleistung (Taylor et al.
2004). Rinderrassen, deren Hauptzweck die Fleischproduktion ist (Fleischrassen), zeigen höhere IGF-I-Werte als Rassen, deren Schwerpunkt auf Milchleistung ausgerichtet ist (Lucy 2008). Taylor et al. (2004) fanden dazu passend bei Milchkühen mit hoher Milchleistung eine niedrigere IGF-I-Plasmakonzentration als bei Tieren mit niedrigerer Leistung. Der genetische Einfluss auf die endokrine IGF-I-Konzentration wird bei Rindern mit im mittleren bis hohen Bereich der Heritabilität liegenden Werten von 0,23 bis 0,52 angegeben und könnte somit potentiell bei Züchtungen Beachtung finden (Velazquez et al. 2008).
2.2.2 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine
Die biologische Aktivität der IGFs wird durch Bindungsproteine reguliert. Diese haben eine höhere Affinität zu IGF-I und IGF-II als die IGF-Rezeptoren selbst und regeln so maßgeblich deren Verfügbarkeit und Halbwertszeit (Hwa et al. 1999). Im Blut tritt IGF-I hauptsächlich in gebundener Form auf, nur etwa 1% des IGF-I liegt frei im Blut vor. Die Bindung erfolgt hauptsächlich durch die hochaffinen IGF-Bindungsproteine IGFPB-1 bis IGFBP-6, weitere IGFBP-rPs und IGFBPs werden beschrieben (Hwa et al. 1999). Die Bindungsproteine haben untereinander eine Sequenzhomologie von ca. 50 % und sind in der Lage sowohl an IGF-I als auch IGF-II zu binden (Clemmons et al. 1995). Die Bindungsproteine IGFBP-1, IGFBP-3 und IGFBP-4 zeigen hierbei eine gleichrangige Affinität für IGF-I und IGF-II, während IGF-II mit höherer Affinität an IGFBP-2, IGFBP-5 und IGFBP-6 bindet (Jones und Clemmons 1995).
Im Gegensatz zu den stimulierenden/anabolen Effekten (Zellproliferation, Differentiation, Verhinderung von Apoptose) von IGF-I fördern ungebundene IGFBPs größtenteils die Apoptose und verhindern die Zellvermehrung (Hwa et al. 1999). Die Korrelation zwischen
Literatur
Tabelle 2: Korrelation zwischen den Insulin-like Growth Factors (IGF-I, IGF-II) und IGF- Bindungsproteinen (IGFBP-1 bis IGFBP-6) in menschlichem Serum (aus Rajaram et al. 1997).
IGFBPs IGF-I IGF-II
IGFBP-1 negativ negativ
IGFBP-2 negativ negativ
IGFBP-3 positiv positiv
IGFBP-4 nicht signifikant nicht signifikant
IGFBP-5 positiv positiv
IGFBP-6 unbekannt unbekannt
Die Produktion der IGFBPs wird sowohl durch systemische Hormone als auch durch lokale Regulatoren bestimmt (Mohan und Baylink 2002). So wird zum Beispiel die Expression von IGFBP-4 und IGFBP-5 in Osteoblasten durch eine Vielzahl von systemischen Hormone (u.a.
GH, Parathormon, Glukokortikoid, 1,25-Dihydroxyvitamin D3) sowie lokalen Faktoren (u.a.
IGFs, Bone Morphogenic Proteine, Transforming Growth Factor beta (TGF-ß), Interleukine) geregelt (Mohan und Baylink 2002). Die Expression der IGFBPs wird ebenfalls durch unterschiedlich physiologische Zustände wie Ernährung, Trächtigkeit, Krankheit oder Training beeinflusst (Rajaram et al. 1997, Gross et al. 2011). In den letzten Jahren haben sie deswegen in der Humanmedizin als wichtige Biomarker in Studien über Diagnose- und Behandlungsverfahren Bedeutung gewonnen (Mesotten und Berghe 2006, Konev 2015, Wirthgen et al. 2016). Bei Nutztieren zeigen IGFBPs nach Wirthgen et al. (2016) ein großes Potential als wichtige Biomarker für eine Verbesserung der Phenotypselektion, Haltungsbedingungen und evtl. für eine Überwachung des Gesundheitszustandes. Die Untersuchungen von Wirthgen et al. (2016) zeigen auf, dass bei verschiedenen Schaf-, Ziegen- und Rinderrassen die IGFBP-2-, IGFBP-3- und IGFBP-4-Konzentrationen im Serum in zum Teil unterschiedlichen und teilweise vergleichbaren Konzentrationen aufzufinden sind und so unterschiedliche Profile erstellt werden können. So zeigten die untersuchten Holstein Friesian Kühe signifikant höhere IGFBP-2- und IGFBP-4-Serumwerte als die untersuchten Fleischrassenkreuzungen, jedoch wurden keine signifikanten Unterschiede für IGFBP-3 gefunden.
Literatur
Das im Blut der Säugetiere in der höchsten Konzentration vorliegende Bindungsprotein ist IGFBP-3 (Hwa et al. 1999). Sowohl IGF-I und als auch IGF-II zeigen dabei beide eine vergleichbare Bindungsaffinität zu IGFBP-3 (Martin und Baxter 1986). Unabhängig von IGFs sind die Bindungsproteine selbst in der Lage Zellreaktionen zu beeinflussen, es ist z.B.
bekannt, dass IGFBP-3 unabhängig von IGF die Apoptose von Zellen stimuliert (Rajah et al.
2002).
Die Bildung von IGFBP-3 wird von Growth Hormone (GH) stimuliert (Writhgen et al. 2016), während die Bioverfügbarkeit und Bindungskapazität von IGFBPs, neben ihrer Regulation durch den Phosphorylierungsgrad und der Bindung an extrazelluläre Matrixproteine, hauptsächlich durch Proteasen bestimmt wird (Hwa et al. 1999, Mohan und Baylink 2002).
Die Proteolyse der Bindungsproteine durch spezifische Proteasen führt entweder zu ihrer Deaktivierung oder einer Abschwächung ihrer Bindungskapazität. Einige der ersten Untersuchungen in den 50er Jahren, die sich mit den proteolytischen Aktivitäten von IGFBPs befassten, beschäftigten sich mit der Proteolyse von IGFBP-3 bei schwangeren Frauen, durch welche ab dem ersten Trimester eine Verschiebung der Bindungsaffinität von IGF-I in Richtung IGF-II bewirkt wird, ohne hierbei die Protease selbst isolieren zu können (Giudice et al. 1990, Binoux et al. 1993).
Bei Menschen wurde gezeigt, dass die Affinität von IGFBP-3 zu IGF-I während der Schwangerschaft 10x niedriger als bei nicht schwangeren Frauen (Lassare und Binoux 1994).
Andere Autoren (Baxter et al. 1997) konnten allerdings diese Affinitätsänderung von IGFBP- 3 nicht bestätigen. Neuere in-vitro Untersuchungen von Monget und Oxvig (2016) zeigen auf, dass das u.a. bei schwangeren Frauen auftretende Pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) eine Metalloprotease ist, die hauptsächlich auf IGFBP-4, sowie in geringerem Umfang auf IGFBP-2 und IGFBP-5, ihre proteolytische Wirkung entfaltet. Das für die Proteolyse von IGFBP-3 verantwortliche PAPP-A2 ist zum jetzigen Zeitpunkt weniger erforscht als PAPP-A (Oxvig 2015). Neben IGFBP-3 ist jedoch IGFBP-5 eindeutig als Substrat für PAPP-A2 identifiziert worden (Overgaard et al. 2001).
Eine Besonderheit, die IGFBP-3 mit nur einem anderen Bindungsprotein (IGFBP-5) teilt, ist die Fähigkeit zur Bildung eines Tertiärkomplexes mit einer weiteren Untereinheit:
Literatur
Mehr als 80% des IGF-I werden in einem Komplex mit IGFBP-3 und einer säurelabilen Untereinheit (Acid labile subunit, ALS) im Blut bereitgehalten (Baxter 1988, Lewitt et al.
1994). Die Verbindung mit ALS erhöht die Halbwertszeit des IGF-I/IGFBP-3-Komplexes durch die Bildung eines 150 kDa großen stabileren Komplexes (Baxter und Martin 1989, Ueki et al. 2009). Durch die Komplexbildung wird IGF-I im Blut als Reservoir bereitgehalten, da der 150 kDa Komplex nicht in der Lage ist die vaskuläre endotheliale Barriere zu überwinden (Baxter 2000). Neben IGFBP-3 ist nur IGFBP-5, wenn auch in wesentlich geringerem Maß, in der Lage mit ALS und IGF-I einen Komplex zu bilden (Baxter et al.
2002). Bei Ratten erhöht sich die Halbwertszeit von IGF-I durch die Komplexbildung von 4 auf 20 Stunden (Zapf et al. 1986).
Vorwiegend wird ALS von der Leber sekretiert, allerdings zeigen auch andere Gewebe, wie z.B. Lunge, Herz, Niere und Fettgewebe eine ALS-Produktion (Kim et al. 2006). Sowohl die Bildung von IGF-I, IGFBP-3 als auch von ALS durch die Leber wird über das im Hypophysenvorderlappen gebildete GH reguliert und durch Feedbackmechanismen gesteuert (Juul et al. 1998). Freies ALS zirkuliert im Blut in zwei-dreifachen molaren Überschuss zur gebundenen Form und steht deswegen uneingeschränkt zur Komplexbildung zur Verfügung (Baxter 1990, Zapf et al. 1990). Futterrestrektion bewirkt eine Senkung des ALS- Plasmaspiegels (Oster et al. 1996, Flannery et al. 2013). Oster et al. (1996) konnten bei Ratten zeigen, dass eine länger anhaltende Unterernährung (3 Wochen) zu einer signifikanten Reduzierung der Serumkonzentration von sowohl ALS, als auch IGF-I und IGFBP-3, führt.
Die beobachtete Reduzierung war bei jüngeren Tieren signifikant höher als bei älteren. Im Gegensatz dazu, zeigte ein kurzzeitiger vollständiger Futterentzug (3 Tage) eine deutliche Reduzierung der untersuchten Parameter ohne signifikanten Unterschied bei den Altersgruppen. In einem anderen Fütterungsversuch fanden Flannery et al. (2013) ein vergleichbares Ergebnis: Mäuse, die über einen Zeitraum von neun Tagen reduziert gefüttert wurden, zeigten ebenfalls eine signifikante Reduktion der ALS-Konzentration.
Gross et al. (2011) zeigten bei Untersuchungen an Holstein Friesian Kühen am etwa 100ten Laktationstag, dass bei restriktiver Fütterung (3 Wochen) die mRNA-Expression in der Leber von sowohl IGF-I und InsR als auch von IGFBP-1, IGFBP-2 und IGFBP-3 ansteigt. In der gleichen Studie wurde gezeigt, dass in der Leber sowohl die IGFBP-3 mRNA Expression als
Literatur
auch die IGF-I mRNA Expression drei Wochen antepartum bis eine Woche postpartum absinken (Gross et al. 2011).
Die Höhe der IGFBP-2 Konzentrationen im Blut ist im Allgemeinen negativ mit dem der Höhe der Konzentrationen von IGFBP-3 und IGF-I korreliert (Hwa et al. 1999). Bei einigen Tumorerkrankungen wurde eine Erhöhung des IGFBP-2-Levels beschrieben (Blum et al.
1993, Boulle et al. 2001, Kashyap 2015). In letzter Zeit wird jedoch auch den tumorsuppressiven Eigenschaften von IGFBP-2 Aufmerksamkeit geschenkt (Pickard und McCance 2015). Bei Menschen ist die Konzentration von IGFBP-2 gegen Ende der Schwangerschaft auf Grund von IGFBP-2 spezifischen Proteasen erniedrigt (Giudice et al.
1990).
Bei Rindern zeigten Wirthgen et al. (2016), dass Holstein Friesian Kühe im Vergleich mit Kreuzungen aus Fleischrindrassen signifikant höhere IGFBP-2-Konzentrationen haben. Die Studien von Shrama et al. (1994) fanden bei an Holstein Friesian Kühen durchgeführten Untersuchungen eine negative Korrelation von IGFBP-2 mit IGF-I im Serum. Die Konzentration von IGF-I stieg im Laktationsverlauf an und war am höchsten in der Trockenstehphase. Die IGFBP-2 Serumkonzentration hingegen war während der Frühlaktation erhöht und sank im Verlauf der Laktation umgekehrt proportional zum Anstieg der IGF-I-Konzentration ab. Fenwick et al. (2008) fanden bei Kühen mit hoher NEB nach der Geburt eine Erhöhung der Expression von IGFBP-2. Dementsprechend fanden verschiedene Autoren bei Fütterungsversuchen an Wiederkäuern bei restriktiver Fütterung und Phasen von NEB eine Erhöhung des zirkulierenden IGFBP-2, verbunden mit einem Absinken von IGFBP-3 (Vicini et al. 1991, Gallaher et al. 1992 u. 1995, Roberts et al. 1997).
Die Untersuchungen von Piechotta et al. 2015 zeigen auf, dass antepartal erniedrigtes IGFBP- 2 bei Milchkühen postpartal mit dem erhöhten Auftreten von Nachgeburtsverhaltung und Ketose assoziiert ist.
Bei Holstein Friesian Kühen sind neben den IGFBP-2 auch die IGFBP-4 Serumwerte höher als bei den untersuchten Fleischrassenkreuzungen (Wirthgen et al. 2016). Lokal produziertes IGFBP-4 unterdrückt die IGF-Wirkung auf lokaler Ebene (Miyakoshi et al. 1999). Durch IGFBP-4 wird u.a. der mitotischen Effekt von IGF auf Knochenzellwachstum abgeschwächt.
Literatur
Bei Mäusen wurde gezeigt, dass eine erhöhte Expression von IGFBP-4 in Muskelzellen zur Muskelhypoplasie führt (Wang et al. 1998). Durch die Bindung von IGF an IGFBP-4 wird die Spaltstelle für PAPP-A exponiert und so die Proteolyse des Bindungsproteins gefördert (Qin et al. 2000). Die Proteolyse durch PAPP-A führt zu zwei charakteristischen Spaltprodukten, die seit einigen Jahren in der Humanmedizin aufgrund ihres Potentials als Biomarker für Herzkrankheiten vermehrt erforscht werden (Konev 2015).
2.2.3 Insulin
Der Kohlenhydrat-Stoffwechsel wird vorwiegend von Insulin und seinem Gegenspieler Glukagon gesteuert. Die Vorstufe des Insulins – das Proinsulin – wird in den β-Zellen des Pankreas gebildet; die β –Zellen sind in den Langerhans-Inseln lokalisiert. Die Freisetzung des, in Form eines zinkhaltigen Hexamers im Pankreas gespeicherten, Insulins erfolgt hauptsächlich durch die Erhöhung des Blutzuckerspiegels. Cortisol, Adrenalin sowie die Schilddrüsenhormone haben, genau wie Glukagon eine Erhöhung der Blutglukose zur Folge;
Insulin senkt als einziges Hormon den Blutglukosespiegel und fördert die Aufnahme von Glukose in Zellen, sowie die Glykogensynthese in der Leber und den Muskeln. Weitere Funktionen hat Insulin – gemeinsam mit IGF-I und IGF-II – im Hinblick auf Zellwachstum und Proliferation (siehe Kapitel 2.2.1). Nach Wathes et al. (2009) führt eine anhaltende Erniedrigung der Glukose-Konzentration im Blut zu einer Reduktion der IGF-I und Insulin- Konzentration.
Kühe in der Endphase der Trächtigkeit haben einen erhöhten Bedarf an Glukose, da die Milchdrüse mit der Synthese von Laktose beginnt und hierfür vermehrt Glukose als Rohstoff benötigt (Bell 1995). Kühe in der Transitperiode entwickeln, um dem dadurch auftretenden Energiemangel entgegenzuwirken, eine Insulinresistenz (Lucy et al. 2001). Durch diese Insulinresistenz wird die Glukoneogenese in der Leber gefördert und die Aufnahme von Aminosäuren in Muskel- und Fettzellen reduziert. Begleitend zur Insulinresistenz sinken in der Spätphase der Trächtigkeit die Insulinkonzentrationen im Blut kontinuierlich ab (Hammon et al. 2009), dies führt zu einer Hemmung der Proteinsynthese und einer Erhöhung der Proteolyse, die beide dazu betragen den steigenden Bedarf der Milchdrüse an Aminosäuren zu decken (Bell 1995).
Literatur
Bei Holstein Friesian Kühen beschreiben Radcliff et al. (2003a) bis zur Geburt hohe Insulinkonzentrationen, die ab dem Tag der Geburt für etwa fünf Tage abfallen, bevor sie wieder ansteigen. Grummer (1995) hingegen beschreibt einen Abfall der Insulinkonzentration in Verbindung mit einem Anstieg der GH-Konzentration beim Übergang von Trächtigkeit zur Laktation mit akuten Anstiegen beider Hormone bei der Geburt.
2.3 Somatotrope Achse
2.3.1 Wachstumshormon
Die Somatotrope Achse ist einer der Hauptregelmechanismen, der bei Milchkühen den metabolischen Übergang von der späten Trächtigkeit zur frühen Laktation regelt (Lucy 2008).
Diese Achse umfasst das vom Hypophysenvorderlappen ausgeschüttete GH und die in der Leber gebildeten IGFs, sowie die GH-regulierenden Hormone. Das namensgebende Hormon für die Somatotrope Achse ist das auch unter der Bezeichnung Somatotropin oder Somatropin bekannte Growth Hormone (GH). Das Peptidhormon besteht aus 191 Aminosäuren (human), wirkt im Allgemeinen anabol und stimuliert Wachstum, Zellvermehrung und Zellregeneration (Renaville et al. 2002).
Die auf durch Salmon und Daughaday (1957) in den 50iger Jahren durchgeführten Versuchen beruhende Somatomedin Hypothese beschäftigt sich mit den Auswirkungen der Hypophyse auf den Organismus über einen GH-abhängigen „Mediator“. Erst 1972 wurde die Bezeichnung „Somatomedin“ für den Mediator selbst eingeführt (Kaplan und Cohen 2007).
Die Hypothese besagte in ihren Anfängen, dass durch die Einwirkung von GH auf die Leber ein „Somatomedin“ – ein Mediator – freigesetzt wird und dieser direkt eine stimulierende Wirkung auf Knochenzellen ausübt (Salmon und Daughaday 1957). Erst etwa 20ig Jahre später wurden die Somatomedine selbst identifiziert: Somatomedin C (SM-C), das heutzutage meist als IGF-I bezeichnet wird und das früher als Somatomedin A (SM-A) bekannte IGF-II.
In den 80igern entdeckten D’Ercole et al. (1984), dass die IGF-I-Produktion nicht – wie davor postuliert – alleine auf die Leber beschränkt ist. Die erste Hypothese (GH => Leber =>
Somatomedin => Knochen/Organismus) wurde daraufhin modifiziert, um autokrine und
Literatur
parakrine Funktionen von IGF-I einzuschließen. Zu diesem Zeitpunkt wurde allerdings immer noch davon ausgegangen, dass IGF-I, unabhängig von seinem Ursprungsort, ausschließlich durch GH kontrolliert wird. Erst die jetzige erweiterte Somatomedin-Hypothese zieht nicht nur freies IGF-I und zusätzliche Wechselwirkungen mit in Betracht, sondern stellt auch die Leber als Hauptquelle von IGF-I in Frage (Roith et al. 2001, Kaplan und Cohen 2007).
Bildungs – und Speicherort des GHs ist der Hypophysenvorderlappen. Die Ausschüttung des GHs aus der Hypophyse wird durch den Hypothalamus gesteuert. Das im Hypothalamus gebildete Growth Hormone Releasing Hormone GHRH (Somatocrinin) fördert die Freisetzung, während das Growth Hormone Inhibiting Hormone GHIH (Somatostatin) sie hemmt. Im Blut liegt GH z.T. im Komplex mit einem Bindungsprotein (GHBP) vor, das einen Einfluss auf Halbwertszeit und Verfügbarkeit ausübt (Renaville et al. 2002).
Auf den Hypothalamus selbst wirkt GH über einen negativen Feedbackmechanismus ein: eine erhöhte GH-Konzentration senkt die GHRH- und fördert die GHIH-Ausschüttung. Des Weiteren fördert GH über GH-Rezeptoren die Freisetzung von IGF-I v.a. aus der Leber. IGF-I wiederum übt einen direkten Einfluss auf die Hypophyse aus und senkt die GH-Sekretion (Lucy 2008). Insulin zeigt einen gleichartigen Einfluss wie IGF-I auf die Hypophyse und senkt ebenfalls die GH-Sekretion. Die Reduktion der GH-Konzentration wiederum stimuliert die Freisetzung von IGF von seinen Bindungsproteinen durch Proteasen (Clemmons 1997) (siehe Abbildung 2).
In der Humanmedizin sind Gigantismus und Akromegalie die beiden bekanntesten Erkrankungen, die mit einer Fehlregulation von GH in Verbindung stehen. Bei beiden zeigt sich eine deutliche direkte Korrelation zwischen GH und IGF-1 (Sönksen et al. 1991).
Literatur
Abbildung 2: Regelmechanismus der Somatotropen Achse; Abkürzungen: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), IGF-Bindungsprotein (IGFBP), Acid labile subunit (ALS), Growth Hormone (GH), Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH), Growth Hormone Inhibiting Hormone (GHIH), Growth Hormone Binding Protein (GHBP).
Das Zusammenspiel von GH und IGF-I selbst ist komplex. Die Effekte von GH und IGF-I im Metabolismus sind vielfältig und zum Teil einander entgegengerichtet (Kaplan und Cohen 2007). Während GH z.B. die Lipolyse und Glukoneogenese fördert, fördert das von GH stimulierte IGF-I die Lipogenese und unterdrückt die Glukoneogenese. Auch kann GH sowohl insulin-ähnliche als auch insulin-antagonistische Wirkung entfalten. Einen Überblick über das Zusammenspiel bietet die nachfolgende Abbildung 3 (aus Kaplan und Cohen 2007).
Literatur
Abbildung 3: Wirkungen von Growth Hormone (GH) und Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) auf Wachstum und Metabolismus; (+) stimulierende Wirkung; (-) inhibierende Wirkung, AN: anaboler Effekt; GLU: Glukoseverwendung, LIP Lipogenese; Abkürzungen: Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH), Somatostatin (SMS) (aus Kaplan und Cohen 2007).
Die Ausschüttung des Wachstumshormons ist einem circadianen, pulsatilen Rhythmus unterworfen, der durch die beiden Neuropeptide gesteuert wird. Die Hauptausschüttung beim Menschen erfolgt nachts – etwa eine Stunde nach Beginn des Schlafes – während die Ausschüttung tagsüber stark von vielen unterschiedlichen Faktoren abhängig ist (Frago und Chowen 2005). Auch beim Rind beschreibt Loevendahl (2004) die GH-Sekretion als stark schwankend („very noisy“) in Amplitude und Frequenz.
Bei Kühen (und Hühnern) wird GH ebenfalls durch das Thyreotropin-Releasinghormon (TRH) freigesetzt (Loevendahl 2004). Bei Milchkühen mit hohem Leistungspotential wird von einer stärkeren GH-Sekretion als Reaktion auf TRH berichtet, Tiere mit weniger Milchleistungspotential zeigen hingegen eine geringere GH-Ausschüttung. Lapierre et al.
Literatur
(1990a+b) beschreiben eine additive synergistische Wirkung zwischen TRH und GHRH bei der Freisetzung von GH bei Milchkühen.
Die ersten Untersuchungen bei Rindern im Zusammenhang mit GH fanden bereits 1937 (Azimov und Kourze 1937) statt. Damals wurde laktierenden Kühen ein aus dem Hypophysenvorderlappen gewonnenes Extrakt gespritzt und nach dessen Injektion eine mehrtägige, etwa 20%ige Erhöhung der Milchleistung beobachtet (Loevendahl 2004).
Nachfolgende Untersuchungen mit synthetisch gewonnenem bovinen GH bekräftigten die damaligen Ergebnisse (Loevendahl 2004).
Die Abhängigkeit der GH-Sekretion vom Geschlecht konnte beim Rind bestätigt werden, es wurden in der Hypophyse von adulten Bullen nur 10% der beim weiblichen laktierenden Rind vorkommenden Zellen gefunden (Kineman et al. 1992). Bei Kühen in der Transitphase ist die Entkopplung der Somatotropen Achse von besonderem Interesse (Lucy 2008): In der Leber kommt es zu einer Reduzierung der GHR-1A mRNA Expression verbunden mit einem Absinken der GHR-1A-Proteinkonzentration (Kim et al. 2004), zeitnah wird die IGF-I- Bildung der Leber verringert und es kommt zu einem Absinken des zirkulierenden IGF-I (Lucy 2008). Da das hemmende Feedback von IGF-I auf den Hypophysenvorderlappen fehlt, steigt die GH-Konzentration im Blut parallel an. Die Leber ist in der Transitphase, insbesondere kurz nach der Geburt, refraktär gegenüber GH und somit für die Entkopplung der Somatotropen Achse verantwortlich (Kim et al. 2004, Lucy 2008). Bei Fleischrassen findet keine Reduktion der GHR-1A Expression der Leber statt, dies könnte nach Lucy (2008) bedeuten, dass entweder keine oder nur eine minimale Entkopplung der Somatotropen Achse erfolgt.
Die Untersuchungen von Radcliff et al. (2003a+b) zeigten, dass die Expression der GHR-1A mRNA zwei Tage vor Kalbung anfängt abzusinken, ihren tiefsten Wert am dritten bis vierten Tag nach der Geburt erreicht und danach wieder ansteigt. Innerhalb derselben Studie sank die Expression von IGF-I mRNA am ersten Tag nach der Geburt ab, blieb von Tag zwei bis fünf niedrig und stieg dann wieder an.
Lucy et al. (1998) zeigten, dass beim Rind GHR-1A mRNA ausschließlich in der Leber von adulten Tieren exprimiert wird. Alle anderen Gewebe exprimieren ausschließlich GHR-1B mRNA, nur die Leber selbst exprimiert sowohl GHR-1A als auch GHR-1B mRNA. Die
Literatur
höchste Konzentration an GHR-1B mRNA findet sich neben der Leber im Fettgewebe. In fetalen Geweben, einschließlich der Leber, wurde nur die Expression der GHR-1B mRNA gefunden. Ebenfalls beobachteten Lucy et al. (1998), dass das Absinken der Expression der IGF-I mRNA zeitlich leicht versetzt nach dem Absinken der GHR-1A mRNA stattfand.
Die leichte zeitliche Verzögerung des Abfalls der IGF-I mRNA, sowie das exklusive Vorkommen von GHR-1A mRNA auf der Leber könnten nach Lucy (2008) die Abhängigkeit der Leber-IGF-I von GH und GHR-1A wiederspiegeln.
2.3.2 Suppressor of Cytokine Signaling
Die Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) Proteine gehören einer Familie von Proteinen an, die Zytokin-induziert negativ regulierend auf den Zytokinsignalweg einwirkt. Es gibt acht bekannte Mitglieder dieser SOCS-Familie: SOCS-1 bis SOCS-7 und das Cytokine-inducible SH2-containing protein (CISH). Sie sind vor allem mit dem Janus Kinase (JAK)/Signal Transducers and Activators of Transcription (STAT)-Signalsystem verbunden. Es wurde gezeigt, dass SOCS-Proteine durch eine Vielzahl von Kaskaden bei Wachstumsfaktoren und Zytokinen aktiviert werden und den Signalweg inhibieren (Bramnert 2003). Neben JAK/STAT interagieren verschiedene SOCS-Proteine mit GHR um in den Zytokinsignalweg einzugreifen (Winkelman et al. 2008).
So zeigen z.B. SOCS-2 Knockout Mäuse Riesenwuchs in Verbindung mit einem gesteigerten IGF-I mRNA Level in Herz, Lunge und Milz (Metcalf et al. 2000). Da die gleichen phänotypischen Veränderungen u.a. bei GH-transgenen Mäusen und bei IGF-I-transgenen Mäusen gefunden werden, führte das Greenhalgh et al. (2005) zu der These, dass SOCS-2 eine Komponente der Somatotropen Achse reguliert. Greenhalgh et al. (2005) bestätigen in ihrer Arbeit die Bindung von SOCS-2 an zwei spezifische phosphorylierte Tyrosine des GHR und belegen die Hypothese, dass SOCS-2 ein negativer Regulator des GH-Signalwegs ist.
Bei Untersuchungen an Zelllinien konnten Leung et al. (2003) nachweisen, dass die SOCS-2- Expression durch 17β-Östradiol hochreguliert wird und so den GH-Signalweg inhibiert.
Winkelman et al. (2008) untersuchten die Expression der SOCS-2 mRNA in der Leber bei Milchkühen im peripartalen Zeitraum, da sie eine Verstärkung der Entkopplung der Somatotropen Achse durch 17β-Östradiol-induziertes SOCS-2 vermuteten. Für die Untersuchungen wurden die Holstein Friesian Kühe 45 Tage antepartal in zwei
Literatur
Fütterungsgruppen eingeteilt und bis zur Geburt unterschiedlich gefüttert (restriktiv/ad libitum). Die Autoren konnten einen Anstieg der SOCS-2 mRNA zum Zeitpunkt der Geburt hin feststellen, der am zweiten Tag postpartum stärker bei der restriktiv gefütterten Gruppe ausgeprägt war. Ebenfalls waren bei der restriktiv gefütterten Gruppe die Anstiege der 17β- Östradiol- und der GH-Konzentration im Serum höher, während die Expression der GHR-1A mRNA zwischen beiden Gruppen keinen Unterschied zeigte, aber postpartal bei beiden Gruppen einen Abfall aufwies.
Piechotta et al. (2014) verglichen die SOCS-2 mRNA Expression in der Leber von zwei Gruppen Holstein Friesian Kühen mit bewusst unterschiedlichen IGF-I-Serumwerten. Die Autoren konnten jedoch bei der Expression von SOCS-2 keinen Unterschied zwischen den Gruppen feststellen. Im Gegensatz zu Winkelman et al. (2008) konnte die Autoren zwischen den vor (Tag 264 ± 1 nach KB) und den direkt nach der Kalbung gewonnenen Proben keinen Unterschied in der SOCS-2 Expression feststellen, was nach Piechotta et al. (2014) auf den unterschiedlichen Zeitpunkt der Probennahme postpartum zurückzuführen sein kann.
2.4 Cortisol
Das Steroidhormon Cortisol wird von der Nebennierenrinde gebildet. Cortisol wirkt katabol und fördert den Proteinabbau und die Umwandlung von Aminosäuren in Glukose. Der Hypothalamus setzt das Corticotropin-releasing Hormone (CRH) frei, welches wiederum die Freisetzung des Adrenokortikotropen Hormons (ACTH) aus dem Hypophysenvorderlappen stimuliert. Die Freisetzung von Cortisol aus der Zona fasciculata der Nebennierenrinde wird durch ACTH stimuliert.
Langfristige Cortisolerhöhungen wirken hemmend auf das Immunsystem (Möstl und Palme 2002). Neben den Katecholaminen – Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin – ist Cortisol ein wichtiges Stresshormon. Beim Menschen ist bekannt, dass für eine optimale IGF-I Sekretion normale Glukokortikoidkonzentrationen nötig sind, während erhöhte Konzentrationen die IGF-I-Sekretion unterdrücken und Wachstum unterbinden (McCusker 1998). Durch diesen Mechanismus wird sichergestellt, dass Nährstoffe erst dann zu anabolischen Vorgängen und zur Differenzierung verwendet werden, wenn ein stressfreies Umfeld besteht (McCusker 1998). Eine kurzzeitige Erhöhung der Glukokortikoide führt somit durch die Bereitstellung
Literatur
Cortisolspiegel, z.B. bei Langzeitstress, zu Immunsuppression und Gewebeatrophie führen können (Möstl und Palme 2002).
Auch für die Geburtseinleitung beim Rind ist Cortisol von Bedeutung. Beim Wiederkäuer stimuliert der steigende Cortisol-Level des Fetus kurz vor Ende der Trächtigkeit die Bildung des Enzyms 17α-Hydroxylase und darüber die Synthese von Prostaglandinen (v.a. PGF2α), welches zur vollständigen Luteolyse des Gelbkörpers führt.
Die Untersuchungen von Eissa und el-Belely (1990) zeigen bei Kühen einen starken Anstieg der Gesamtkortikosteroide sechs Tage und 24 Stunden vor Kalbung. Edgerton und Hafs (1973) hingegen beschreiben einen Anstieg der Glukokortikoide nur direkt am Tag der Geburt selbst.
Die Studien von Peter und Bosu (1987) konnten bei Kühen mit Nachgeburtsverhaltung einen Zusammenhang mit antepartal erhöhtem Cortisol aufweisen, Kühe mit höheren Cortisol- Plasmakonzentrationen am sechsten Tag vor der Geburt zeigten vermehrte Plazentaretention.
Da jedoch beim Rind die Ausschüttung von Cortisol im Tagesverlauf durch die Nebenniere pulsatil ist, einen Tagesrhytmus zeigt und große interindividuelle Schwankungen hat (Thun et al. 1981), wird Cortisol gemeinhin nur mit Einschränkungen als geeignet für eine Beurteilung des momentanen metabolischen Zustandes angesehen (Huzzey et al. 2011). Lefcourt et al.
(1993) fanden zusätzlich zu dem Tagesrhytmus noch einen stärker ausgeprägten ultradianen, 120 minütigen Rhythmus.
2.5 Sexualhormone
Östrogene und Progesteron sind wichtige Vertreter der Sexualhormone. Das Steroidhormon Progesteron gehört hierbei zu den Gelbkörperhormonen (Gestagene). Östrogene dagegen werden den Follikelhormonen zugerechnet. Zu den natürlichen Östrogenen zählen u.a. 17β- Östradiol (Estradiol = E2), Östron (Estron = E1) und Östriol (Estriol = E3).
Die Hauptaufgabe des Corpus luteum (Gelbkörpers) beim Rind ist die Produktion des Progesterons. Progesteron hemmt die Synthese des Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) und verhindert dadurch die Auslösung eines neuen Zyklus durch den Hypothalamus über das Luteinisierende Hormon (LH) und das Follikelstimulierende Hormon (FSH). Die Aufrechterhaltung einer Trächtigkeit ohne Progesteronproduktion durch das Corpus luteum
Literatur
graviditatis ist beim Rind erst ab dem 180 Tag der Trächtigkeit möglich (Chew et al. 1979).
Erst dann ist die Progesteronproduktion durch die Plazenta ausreichend hoch, um die Trächtigkeit zu erhalten (Meinecke 2005). Die Freisetzung von fetalem Cortisol führt durch die Bildung von PGF2α zur Luteolyse des Gelbkörpers, wodurch es zu einem Abfall der Progesteronkonzentration kommt. Durch die Umwandlung von Progesteron zu Östrogenen durch 17α-Hydroxylase (ebenfalls durch fetales Cortisol gebildet) wird der Progesteronspiegel zeitgleich weiter gesenkt. (Eissa und el-Belely 1990).
Östrogene hingegen sind während der Trächtigkeit erst wieder in der Phase der Geburtsvorbereitung von entscheidender Bedeutung. Sie fördern u.a. die Bildung von Oxytocinrezeptoren am Uterus, verstärken das Wachstum des Myometriums und fördern die Bildung von Aktomyosin um die Kontraktilitätsfähigkeit des Uterus zu erhöhen (Kindahl et al. 2004). Für die Umwandlung von Progesteron zu Östrogen in der Plazenta ist das Enzym 17α-Hydroxylase verantwortlich, dieses Enzym wird durch den Anstieg von Cortisol induziert (Kindahl et al. 2004).
Bei in vivo Untersuchungen an Schafen konnten Scaramuzzi et al. (1999) nach IGF-I-Infusion eine Erhöhung der Östradiolproduktion in der Follikelphase beobachten. Der Verlauf der Sexualhormone während der Trächtigkeit bei Rindern wurde von Eissa und el-Belely (1990) genauer untersucht: Während der ersten drei Monate der Trächtigkeit konnten die Autoren keine wesentlichen Veränderungen der Progesteron- und Gesamtöstrogenkonzentration beobachten, erst ab dem vierten Monaten sanken die Progesteronkonzentrationen signifikant ab und blieben bis zum neunten Monat konstant. Im Gegenzug stieg Gesamtöstrogen vom vierten bis zum sechsten an Monat an und blieb danach konstant. Erst kurz vor der Geburt konnten wieder Veränderungen beobachtet werden: Östrogen stieg stark innerhalb der letzten fünf Tage vor der Kalbung an, gefolgt von einem rapiden Absinken der Progesteronkonzentration zwei Tage später. Ähnliche Beobachtungen machten Radcliff et al.
(2003a). Die Autoren beschrieben einen langsamen Anstieg des Östradiolkonzentration in den letzten zwei Trächtigkeitswochen mit einem starken Anstieg innerhalb der letzten vier Tage, verbunden mit einem Abfall der Progesteronkonzentration vier Tage vor der Geburt.
Literatur
2.6 Schilddrüsenhormone
Die Schilddrüsenhormone Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (Tetraiodthyronin, T4) werden von den Follikelepithelzellen der Schilddrüse gebildet. Sie bestehen aus der Aminosäure Thyronin an deren aromatischen Ring an drei (Triiodthyronin) bzw. vier (Thyroxin) Positionen Iod gebunden ist.
Die Bildung der Hormone wird durch den Hypothalamus und die Hypophyse gesteuert. Das vom Hypothalamus gebildete Neurohormon Thyreotropin-Releasinghormon (Thyreoliberin, TRH) regt den Hypophysen-Vorderlappen zur Ausschüttung von Thyroidea-stimulierendem- Hormon (Thyreotropin, TSH) an. Das in den Blutkreislauf freigesetzte TSH fördert in der Schilddrüse die Freisetzung und Produktion der Schilddrüsenhormone. Die Freisetzung von T3 und T4 wiederrum hemmt, mittels eines einen negativen Feedbackmechanismus, die Freisetzung und Ausschüttung von TSH.
Von der Schilddrüse wird T4 in den höchsten Konzentrationen freigesetzt, T3 dagegen wird nur in geringem Maße direkt von der Schilddrüse entlassen. Sowohl T3 als auch T4 müssen durch Lipidmembranen in das Innere von Zellen transportiert werden. Sobald die Schilddrüsenhormone im Zellinneren sind, können sie von einer der drei Deiodinasen (DIO-1, DIO-2, DIO-3) deiodiert werden. Nur DIO-1 und DIO-2 sind für die Umwandlung des Prohormons T4 zum aktiven T3 zuständig, DIO-3 hingegen deiodiert T3 und T4 in eine inaktive Form (reverses T3 = rT3). Im Serum sind beide Hormone v.a. an Bindungsproteine gebunden und nur freies T3 (fT3) bzw. T4 (fT4) ist biologisch aktiv.
Hauptsächlich in Leber und Niere wird T4 durch DIOs zu T3 deiodiniert und dadurch 80%
des T3 im Kreislauf produziert. Die höchste Expression von DIO-1 wird in Leber, Niere und Schilddrüse gefunden (Xu et al. 2014). Im Gegensatz zu DIO-2, die T3 hauptsächlich zur lokalen Verwendung produziert, ist DIO-1 für den größten Teil der T3-Konzentration im Serum verantwortlich (Jesus et al. 2001, Schneider et al. 2001). Es ist jedoch bekannt, dass die Schilddrüse bei DIO-1 und DIO-2 Mangel in der Lage ist durch erhöhte Freisetzung von T3 einen normalen T3-Blutspiegel aufrecht zu erhalten (Panicker 2011).
Gegen Ende der Trächtigkeit wurde bei Kühen beobachtet, dass die T3- und T4- Konzentrationen im Blut absinken (Grummer 1995). Zwischen Anfangslaktationsleistung und T4-Konzentration besteht hierbei eine negative Korrelation. Eine verringerte DIO-Aktivität in der Leber führt zu einem Absinken der T3-Konzentration. Dem entgegengesetzt steht eine
Literatur
gesteigerte Aktivität und Leistung der Milchdrüse – mit erhöhter T3-Konzentration und DIO- Aktivität (Pezzi et al. 2003).
Es ist schon lange bekannt, dass das Auftreten von Hypothyreose beim Menschen mit erniedrigten IGF-Werten verbunden ist (D’Ercole 1987). In Versuchen an Mäusen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass niedrige Schilddrüsenhormonkonzentrationen einen negativen Einfluss auf die Immunantwort haben (Klein 2006). Blum et al. (1985) beschrieben bei Stieren unter Futterrestriktion ein Absinken von T4, T3, Insulin und Glukose verbunden mit einem Anstieg von GH und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA). Dagegen zeigten die rT3- Konzentrationen bei den damaligen Untersuchungen keinen Unterschied zu normal gefütterten Tieren. Bei Milchkühen unter Futterrestriktion während den ersten zwei Laktationsmonaten beobachteten Kunz et al. (1985) vergleichbares: höhere Konzentrationen von NEFA und Ketonkörpern verbunden mit erniedrigten Insulin-, T3- und T4 Konzentrationen. Die Autoren beschreiben ebenfalls ein langsames Absinken der T4- Konzentration während der späten Trächtigkeit, einen 50% Abfall bei der Geburt gefolgt von einem Anstieg. In dieser Studie beobachteten die Autoren bei T3 einen ähnlichen, wenn auch weniger ausgeprägten Verlauf wie bei T4.
2.7 Energiestoffwechsel
β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und NEFA werden als die zwei aussagekräftigsten labordiagnostischen Parameter für den Energiestoffwechsel bei Rinder angesehen (Russel und Wright 1983). Die Bestimmung ihrer Konzentrationen wird labordiagnostisch zum Nachweis einer subklinischen und klinischen Ketose verwendet. Die Ketose ist ein typisches Problem von Kühen in der Transitperiode und tritt hauptsächlich kurz nach der Kalbung auf (Grummer 1993). Eine antepartale ausgeprägte negative Energiebilanz (NEB) ist mit einer deutlichen Reduktion von IGF-I im Blut verbunden (Zulu et al. 2002, Taylor et al. 2004).
Während freie Fettsäuren (NEFA) Indikatoren für kurzfristig anhaltenden Energiemangel sind, und akut durch Fettmobilisation bei reduzierter Futteraufnahme ansteigen, ist BHBA ein Indikator für einen länger anhaltenden Energiemangel. Der Bestimmung von BHBA kommt hierbei in der Praxis nur in Verbindung mit dem Gesamtkrankheitsbild eine prognostische
Literatur
Bedeutung zu, da ihre Konzentration im Blut auch fütterungsabhängig ist und nur unter genauer Beachtung der Fütterungsanamnese beurteilt werden kann (Dargel 1987).
Grummer (1995) beschreibt bei Milchkühen eine Verdopplung der NEFA-Konzentration zwischen dem 17ten und zweiten Tag antepartum, mit einem schnellen Anstieg am Tag der Geburt. Als Mitursachen für gesteigerte NEFA-Konzentrationen werden die verringerte Futteraufnahme, die reduzierte Pansenkapazität und der gesteigerte Energiebedarf angesehen, wobei Grummer (1995) auch einen fütterungsunabhängigen Anstieg bestätigt. Edgerton und Hafs (1973) beschreiben am Tag der Geburt einen deutlichen Anstieg von Glukokortikoiden und Prolactin. Der deutliche Anstieg der NEFA-Konzentration am Tag der Geburt selbst wird von Grummer (1995) auf den Geburtsstress und die damit verbundene, durch Cortisol induzierte, Lipolyse zurückgeführt.
Es wurde von Piechotta et al. (2012) gezeigt, dass Kühe mit antepartal hoher NEFA- Konzentration in Kombination mit niedriger IGF-I-Konzentration im Plasma anfälliger für Krankheiten postpartum sind.
Material und Methode
3 Material und Methode
3.1 Versuchstiere
Alle an den Tieren durchgeführten Maßnahmen wurden durch Absprache des Tierschutzbeauftragten der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mit dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-09/1696).
Die hier vorliegende Arbeit ist Teil eines Großprojektes, in dem weitere Forschungsarbeiten eingebunden waren. Um Untersuchungsmaterial für die angeschlossenen Projekte zu gewinnen, wurde an den Versuchstieren an Tag 275 nach künstlicher Besamung (KB) ein Kaiserschnitt durchgeführt und die Probennahme für diesen Abschnitt beendet.
3.1.1 Herkunftsbetrieb
Die für diese Dissertation verwendeten Tiere stammten aus dem Großbetrieb der Agrargenossenschaft Siedenlangenbeck in Wöpel, Sachsen-Anhalt. Es handelte sich um weibliche, multipare, trockenstehende Rinder der Rasse „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein Friesian. In dem Betrieb werden ca. 700 Kühe ganzjährig in einem Laufstallsystem mit Liegeboxen ohne Fressgitter gehalten. Die Fütterung der Rinder erfolgte im Betrieb vollautomatisch über ein computergesteuertes Fütterungssystem, Wasser war jederzeit frei zugänglich. Im Trockensteherbereich erhielten die Tiere durch eine computergesteuerte Bandfütterungsanlage eine Totale Mischration (TMR, Zusammensetzung der Ration der Trockensteher siehe Anhang: Tabelle 16 bis Tabelle 19) und Mineralfutter (PANTO®- Mineral R 66, Hamburger Leistungsfutter GmbH).
In Absprache mit dem Leiter des landwirtschaftlichen Betriebes wurden nur Kühe untersucht und für weiterführende Versuche verwendet, die in der vorangegangenen Laktation eine Leistung unter 10000 Litern erbrachten.
3.1.2 Auswahl
Für die Auswahl der Versuchstiere wurde der Betrieb in regelmäßigen Abständen besucht und
Material und Methode
254 Tag nach erfolgreicher KB befanden, klinisch untersucht. Alle Tiere waren zu diesem Zeitpunkt trockengestellt (erste bis maximal dritte Laktation abgeschlossen), und befanden sich in einem von den laktierenden Tieren abgetrennten Bereich des Laufstalls. Der übliche Zeitpunkt des Trockenstellens auf dem Betrieb war zwischen dem 225 – 240 Tag nach KB (6 bis 8 Wochen antepartum). Die klinische Untersuchung umfasste eine allgemeine Beurteilung des Habitus, der Haltung und des Verhaltens, sowie eine Beurteilung des Gangbildes.
Lahmheiten ≥ Grad 2 führten zum automatischen Ausschluss des Tieres von der Studie. Euter und Gelenke wurden beurteilt und ggf. palpiert. Der Ernährungszustand wurde mit Hilfe des von Edmondson et al. (1989) beschriebenen Body Condition Score (BCS) beurteilt.
Bei unauffälligem klinischem Befinden wurde den Tieren aus der Schwanzvene (V. coccygea mediana) 3 ml Blut für einen Glutaraldehyd-Test (GAP-Test), sowie je 10 ml in ein Serum- Röhrchen und 10 ml aufgeteilt auf zwei 5ml EDTA-Röhrchen entnommen.
Es wurde ein verkürzter GAP-Test (3min) durchgeführt. Bei negativem Befund wurde das gewonnene Blut nach 30 Minuten zentrifugiert (10min, 5000g), das gewonnene Serum und EDTA-Plasma in 1,5ml Eppendorf Gefäße aliquotiert und auf Eis zur Klinik für Rinder transportiert. Dort wurden die Proben bis zur weiteren Verwendung bei – 20°C eingelagert.
Für die Bestimmung der IGF-I-Konzentration wurde pro Tier je ein Plasma-Aliquot über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt und am nächsten Tag mit dem DSL-10-5600 ACTIVE® Insulin-like Growth Factor (IGF-I) ELISA Kit von Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Texas, USA die IGF-I-Konzentration im Plasma bestimmt.
Unter Berücksichtigung eines für den landwirtschaftlichen Betrieb erstellten IGF-I-Profils wurden 20 klinisch gesunde Tiere mit vergleichbarem BCS aber bewusst unterschiedlichen hohen versus niedrigen IGF-I Konzentrationen ausgewählt und in die Klinik für Rinder verbracht.
Material und Methode
3.2 Versuchszeitraum
3.2.1 Haltung der Versuchstiere
Die ausgewählten Tiere wurden nach Auswahl sobald als möglich in die Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, verbracht, um ihnen vor Beginn des Versuches eine möglichst lange Phase der Eingewöhnung zu gestatten.
Nach Überführung in die Klinik wurden die Versuchstiere ad libitum mit Heu gefüttert, zusätzlich erhielten sie täglich 2 x 1 kg Kraftfutter (St.Mv.18 III Pell.; ForFarmers Bela GmbH) sowie Maissilage (FLI Braunschweig) nach Bedarf. Wasser stand den Rindern durch Selbsttränken jederzeit zur freien Verfügung.
Der Gesundheitsstatus der Tiere wurde mehrmals täglich kontrolliert und jeden Morgen protokolliert. In der Klinik erfolgte die Überwachung der Stoffwechsellage durch tägliche Kontrolle der Ketonkörper im Harn; nach Erfordernis erhielten die Kühe ergänzend 1- 2mal täglich 200 ml Propylengykol per os sowie Erhöhungen der Silagerationen.
Die Haltung der Rinder erfolgte in Übereinstimmung mit den gültigen Tierschutzgesetzen der Bundesrepublik Deutschland (Aktenzeichen der Behörde: 33.9-42502-04-09/1696).
3.2.2 Blutentnahmen
Bei den in die Klinik für Rinder verbrachten Versuchstieren wurde am Tag der Einstallung in der Klinik für Rinder aus der Vena jugularis Blut entnommen, ein klinisches Profil erstellt und auf Auffälligkeiten überprüft.
Nach einer Eingewöhnungszeit von mindestens fünf Tagen wurde bei den Versuchstieren von Tag 261 bis Tag 275 nach KB täglich zum gleichen Zeitpunkt (8 Uhr) aus der Schwanzvene Blut in Serum- und EDTA- Röhrchen (je 10ml) entnommen.
Serum und Plasma wurden nach 30 min bei Raumtemperatur durch Zentrifugation (5000 x g, 15 Minuten, 4°C) abgetrennt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Tiere, die innerhalb des Zeitraums der Blutentnahme klinische Erkrankungen zeigten, wurden vom weiteren Versuch und der Auswertung ausgeschlossen.
Material und Methode
3.2.3 Leberbiopsien
Bei 6 Kühen der Gruppe IGF-Low und bei 4 Kühen der Gruppe IGF-High wurde zwischen Tag 269 – 272 nach KB eine Leberbiopsie entnommen (Tag 270 ±1).
Unter lokaler Infiltrationsanästhesie (5 ml Isocain 2%, Firma WDT) wurde unter Ultraschallkontrolle mit Hilfe des Biopsieentnahmegerätes Magnum 1522 (Firma Bard, Karlsruhe) Lebergewebe entnommen. Das gewonnene Gewebe wurde sofort tiefgefroren und bis zur Auswertung bei -70°C gelagert.
3.3 Bestimmung der endokrinologischen Parameter
3.3.1 Insulin-like Growth Factor I
Für die Bestimmung der Konzentration von IGF-I wurde der DSL-10-5600 ACTIVE® Insulin-like Growth Factor (IGF-I) ELISA Kit von Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Texas, USA verwendet.
Hierbei wurde IGF-I durch Säure-Ethanol-Extraktion aus der Bindung mit den IGF-I- bindenden Proteinen freigesetzt. Das ungebundene IGF-I wurde nach anschließender Neutralisation mittels eines Sandwich ELISA bestimmt. Die Konzentration der Proben wurde durch Vergleich gegen eine Standardkurve ermittelt. Die optische Dichte wurde mittels Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) bei 450 nm gemessen und mit dem Programm Magellan Software (Magellan 3.11, Dortmund) mit Cubic Spline Mode ausgewertet.
Die Nachweiskriterien des DSL-10-5600 ACTIVE® Kits sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt:
Material und Methode
Tabelle 3: Nachweiskriterien des Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) DSL-10-5600 ACTIVE® Kits (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Texas, USA; Produktinformationen.
Parameter Absoluter Messbereich
Analytische Sensitivität
Intra-Assay- Varriationskoeffizent
[%]
Inter-Assay- Varriationskoeffizent
[%]
IGF-I 0,03 – 600 ng/ml 0,03 ng/ml 4,5 – 7,1 4,8 – 8,8
3.3.2 Schilddrüsenhormone und Cortisol
Die Bestimmung von T3, T4 sowie von Cortisol wurden mittels des Analysenautomaten IMMULITE® (Siemens Diagnostics, Deerfield, USA) im Endorinologischen Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, durchgeführt.
Das zugrunde liegende Messprinzip ist bei allen bestimmten Hormonen ein kompetitiver, Festphasen-, enzymmarkierter Chemilumineszens-Immunoassay:
Monoklonale Antikörper, die gegen das zu untersuchende Antigen gerichtet sind, sind an einer Festphase (Polystyrolkugel) adsorbiert. Zu dieser Polystyrolkugel werden das zu untersuchende Material (Serum) und der zweite, mit alkalischer Phosphatase markierte
„Detector“-Antikörper gegeben. Bei sequenziellen kompetitiven Assays liegt zwischen der Zugabe des zu untersuchenden Materials und des zweiten Antikörpers eine zusätzliche Inkubationszeit von 30 Minuten. Nach den jeweils spezifischen Inkubationszeiten werden die ungebundenen Komponenten entfernt und der gebundene Marker durch die Umsetzung eines lumineszierenden Substrates (Adamantyl 1,2-dioxetanearylphosphate (ADPP)) quantifiziert.
Die jeweilige Art des Assays, der Messbereich, die analytische Sensitivität, sowie der Intra- und Inter-Assay- Varriationskoeffizenten sind in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgeführt:
Material und Methode
Tabelle 4: Nachweiskriterien der Chemilumineszenz-Immunoassays Cortisol, Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) (Siemens Immulite® Produktinformationen).
Art des Assays
Mess- bereich
Analytische Sensitivität
Intra-Assay- Varriations- koeffizent
[%]
Inter-Assay- Varriations- koeffizent
[%]
Immulite®1000 Cortisol (LKCO1)
kompetitiv 0,2 – 20
ng/ml 0,2 ng/ml 5,8 – 8,8 6,3 – 10,0 Immulite®1000
Total T3 (LKT35)
kompetitiv, sequenziell
40 – 600
ng/dL 35 ng/dl 7,0 – 13,2 9,7 – 15,6 Immulite®1000
Canine Total T4 (LKCT5)
kompetitiv,
sequenziell 0,5 µg/dl 0,12 µg/dl 4,4 – 10,8 6,8 – 13,8
3.3.3 Wachstumshormon
Für die Bestimmung von GH wurde vom Endokrinologischen Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, ein in diesem etablierter kompetetiver Enzymimmunoassay (ELISA) verwendet. Der Test beruht auf einer Modifikation der von Roh und Kawashima (Roh et al. 1997, Kawashima et al. 2007) veröffentlichen Methode und ist im Labor etabliert und validiert.
Ein aus Kaninchen gewonnener Antikörper wurde zu bovinem GH gegeben (100 µl, x150000, D Schams, TU-Munich, Weihenstephan) und in mit Anti-Rabbit-γ-Globulin Antiserum beschichtete Mikrotiterplatten einpipettiert. Es folgte eine 24 stündige Inkubation mit anschließendem Verwerfen des Überstandes.
Nach der Zugabe von 100 µl Chicken Serum (1%, verdünnt in Assay Puffer) wurden 15µl GH Standard (0.78–100 ng/ml, NIDDK-bGH, AFP-9984C in Assay-Puffer oder Plasma gelöst) hinzugefügt und die Platten für weitere 24 Stunden inkubiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde biotinylisiertes GH hinzugefügt. Nach 3 Stunden Inkubation wurden
Material und Methode
abschließende kolorimetrische Behandlungen durchgeführt, die optische Dichte bei 450 nm mittels Tecan gemessen und mit Magellan Software (Magellan 3.11, Dortmund) ausgewertet.
Tabelle 5: Nachweiskriterien des Growth Hormone (GH) – Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), (Laboreigene Bestimmungen), Abkürzung: Effektivdosis (ED).
Parameter
Unterer
Messbereich ED50
Intra-Assay- Varriationskoeffizent
[%]
Inter-Assay- Varriationskoeffizent
[%]
GH 1,0 ng/ml 6,2 ng/ml 8,1 8,5
3.3.4 Progesteron und 17β-Östradiol
Progesteron und 17β-Östradiol wurden mittels Festphasenimmunoassays durch das Endokrinologische Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, bestimmt.
Für die Bestimmung von Progesteron wurde der Coat-A-Count Progesterone-Kit von Siemens (TKPG5), Los Angeles, USA eingesetzt. Für die Bestimmung von 17β-Östradiol wurde der Coat-a-Count® Estradiol RIA von Siemens Diagnostics, Deerfield, USA verwendet.
Beide Assays verwenden 125I-markierte Antigene. Diese radioaktiv markierten Antigene konkurrieren mit den zu messenden Analyten aus der Probe um die Antikörper- Bindungsstellen an der Röhrchenwandung. Nach Dekantieren wurde die an den Antikörper gebundene Radioaktivität wird mittels eines Gamma-Counters (Perkin Elmar, Waltham Massachusetts, USA) gemessen, die Konzentration ist umgekehrt proportional zur Anzahl der gemessenen Counts per Minute.
Messbereich, analytische Sensitivität, sowie Intra- und Inter-Assay-Varriationskoeffizenten beider Assays sind in der nachfolgenden Tabelle 6 aufgeführt:
