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Zur Aussagekraft der HER2
Rezeptorexpression in caninen Mammatumoren als diagnostischer und prognostischer Faktor
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Christiane Kott
aus Salzgitter
Hannover 2004
Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. I. Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 13. Mai 2004
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht... 13
2.1 Mammatumoren beim Hund ... 13
2.1.1 Morphologische Vorbemerkungen... 13
2.1.2 Epidemiologie der Mammatumoren... 15
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese... 15
2.1.4 Lokalisation, Rezidive und Metastasen... 17
2.1.5 Therapie... 18
2.1.6 Prognose ... 20
2.1.7 Klassifikation ... 20
2.1.7.1 Maligne Tumoren... 21
2.1.7.1.1 Nichtinfiltratives Karzinom... 22
2.1.7.1.2 Komplexes Karzinom... 22
2.1.7.1.3 Einfache Karzinome... 22
2.1.7.1.4 Spezielle Karzinomtypen ... 23
2.1.7.1.5 Sarkome... 24
2.1.7.1.6 Karzinosarkom ... 25
2.1.7.1.7 Karzinom oder Sarkom in benignen Tumoren... 25
2.1.7.2 Benigne Tumoren... 26
2.1.7.2.2 Fibroadenom... 27
2.1.7.2.3 Benigne Mischtumoren ... 27
2.1.7.2.4 Gangpapillom ... 27
2.2 HER2 Rezeptor ... 28
2.2.1 Nachweismethoden (Hercep, FISH) ... 32
2.2.2 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Frau ... 34
2.2.3 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Hündin ... 35
2.2.4 HER2 Rezeptor bei anderen Tumoren ... 36
2.2.5 HER2 als therapeutisches Ziel ... 37
3 Eigene Untersuchungen ... 39
3.1 Material und Methoden ... 39
3.1.1 Untersuchungsmaterial... 39
3.1.2 Anfertigung der Gewebeschnitte... 39
3.1.3 Klassifizierung der Proben ... 40
3.1.4 Immunhistochemische Reaktionen ... 40
3.1.4.1 Hercep Test ... 40
3.1.4.2 Ki 67... 41
3.1.4.3 Der Multiblock ... 42
3.1.5 Auswertung und Dokumentation ... 43
3.2.1 Hercep Test ... 47
3.2.2 Ki 67... 56
3.2.3 Der Multiblock ... 62
4 Diskussion ... 67
4.1 Hercep Test ... 67
4.2 Ki 67... 70
4.3 Multiblock ... 72
5 Zusammenfassung... 73
6 Summary ... 75
7 Literaturverzeichnis... 77
8 Anhang ... 89
8.1 Rezepte ... 89
8.1.1 Einbettungsprotokoll ... 89
8.1.2 Hämalaun-Eosin-Färbung (H.-E.) ... 89
8.1.3 Versuchsprotokoll Hercep Test... 90
8.1.4 Versuchsprotokoll Ki 67 ... 92
8.1.5 Citratpuffer ... 95
8.1.6 Versuchsprotokoll Multiblock... 95
8.2.1 Tabelle Untersuchungsmaterial gesamt ... 96
A. Arteria
A1 erster abdominaler Gesäugekomplex A2 zweiter abdominaler Gesäugekomplex
Aa. Arterien
Abb. Abbildung
ADCC Antibody dependent cell mediated cytotoxicity AgNOR Argyophile Nucleolar Organizer Region Aqua bidest. 2fach destilliertes Wasser
Aqua dest. destilliertes Wasser
AR Amphiregulin
BCG Bacillus Calmette-Guerin
bcl-2 B-Zell-Leukämie-Lymphom-2-Gen
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CISH Chromogenic-in-situ-Hybridisation
DAB Diaminobenzidin
DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
DSH Deutscher Schäferhund
DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft
EGF Epidermal Growth Factor
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay et al. et alii ( und andere)
Fa. Firma
FDA Food and Drug Administration FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
g Gramm
ggr. geringgradig
G0-Phase nicht-zyklische Phase
h Stunde(n)
H.-E. Hämalaun und Eosin
H2o2 Wasserstoffperoxid
HER2 Human epidermal growth factor receptor-2
hgr. hochgradig
HRG Heregulin (α und β)
I inguinaler Gesäugekomplex
IHC Immunhistochemie
kD Kilodalton
KHT Kurzhaarteckel
LHT Langhaarteckel
L-MTP-PE Liposomenumhülltes Muramyltripeptidphosphatidylethanolamin
Lsg. Lösung
MAb Monoklonale Antikörper
mgr. mittelgradig
min Minute(n)
ml Milliliter
mm Millimeter
mRNA messenger ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
NaCl Natriumchlorid
Nl. / Nll. Nodus lymphaticus / Nodi lymphatici (Lymphknoten)
NSCLC non-small cell lung cancer (nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom)
o. A. ohne Angaben
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCNA Proliferating cell nuclear antigen
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
RHT Rauhaarteckel
RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SABC/SAB Streptavidin-Biotin-Complex
S-Phase Synthese-Phase, Phase, in der die Zelle DNA synthetisiert T1 erster thorakaler Gesäugekomplex
T2 zweiter thorakaler Gesäugekomplex
Tab. Tabelle
TGF-α Transforming Growth Factor-α
u. und
Westi Westhighland-White-Terrier WHO World Health Organisation
z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
° C Grad Celsius
µl Mikroliter
µm Mikrometer
1 Einleitung
Das Mammakarzinom ist eine häufige Todesursache bei Frauen. Trotz vielseitiger Therapiemöglichkeiten wird es weiterhin als unheilbar angesehen (McKEAGE u. PERRY 2002). Ca. 20-30 % der Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom weisen eine HER2 Rezeptorüberexpression auf. Ein positiver HER2 Status gilt als prognostischer Indikator für einen schlechten Krankheitsverlauf und ist ein prädiktiver Faktor, da er mit besonders aggressivem Tumorwachstum und einem z. T. schlechten Ansprechen auf bestimmte Chemotherapieprotokolle einhergeht (SLAMON et al. 1987, 1989; BLOOM et al. 2001;
McKEAGE u. PERRY 2002).
Aber genau dieser Rezeptor bietet auch einen neuen Therapieansatzpunkt. In den letzten Jahren wurden in der Humanmedizin mehrere Nachweisverfahren für das HER2 Protein bzw.
HER2 Gen entwickelt. Ein positiver HER2 Status bildet die Voraussetzungen für eine Herceptin-Therapie bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom. Herceptin ist ein neues Agens, das bei HER2 positiven Mammakarzinomen die Proliferation hemmt und so einen positiven Einfluß auf den weiteren Krankheitsverlauf hat (KAUFMANN u. KANZ 2000; GOEL et al. 2002).
Die Mammatumoren des Hundes gehören zu den am häufigsten bei dieser Tierart diagnostizierten neoplastischen Erkrankungen (BRODEY et al. 1983). Die Vielfalt an möglichen Tumordiagnosen, sowie das häufige Fehlen makroskopischer Hinweise bezüglich der Malignität machen histopathologische Untersuchungen notwendig, um eine Prognose stellen zu können. Als Ergänzung zu den routinemäßigen Methoden, wie z. B. die Diagnosestellung am H.-E. Schnitt, hat sich in den letzten Jahren die Immunhistochemie bewährt. Anhand dieser Technik lassen sich Proteinstrukturen wie z. B. Hormonrezeptoren, Proliferationsmarker oder Zellmarker im neoplastischen Gewebe darstellen (GERDES et al.
1986; DONNAY et al. 1993; MANZEL 1995; DONNAY et al. 1996).
Ziel dieser Studie ist die Prüfung einer möglichen Aussagekraft der HER2 Rezeptorexpression in caninen Mammatumorgewebe als diagnostischer und prognostischer Faktor. Das immunhistochemische Nachweisverfahren, bei dem der Grad der HER2 Proteinüberexpression im Tumorgewebe bestimmt werden soll, ist in der Humanmedizin bei
Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebs etabliert und dient als Entscheidungshilfe für den Einsatz der Herceptintherapie. Der immunhistochemische Hercep Test der Firma DakoCytomation sollte in der vorliegenden Arbeit auf seine Anwendbarkeit beim Hund getestet werden. Zu den beschriebenen immunhistochemischen Methoden zum Nachweis von HER2 sollte dessen Anwendbarkeit am Multiblocksystem evaluiert und mit einem lange etablierten Proliferationsmarker (Ki 67) an caninen Mammatumorgeweben verglichen werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Mammatumoren beim Hund
2.1.1 Morphologische Vorbemerkungen
Anatomie und Histologie der Mamma
Das Gesäuge der Hündin besteht aus zwei Leisten, die sich beiderseits an der ventralen Bauchwand von thorakal bis inguinal erstrecken und in der Medianen durch den Sulcus intermammarius getrennt sind. In der Regel sind beim Hund beiderseits 5, seltener 4 oder 6 Drüsenkomplexe vorhanden. Die Anzahl der Komplexe kann auf beiden Seiten unterschiedlich sein. Die Komplexe werden von kranial nach kaudal folgendermaßen bezeichnet: kranialer thorakaler (T1), kaudaler thorakaler (T2), kranialer abdominaler (A1), kaudaler abdominaler (A2) und inguinaler (I) Komplex (CHRISTENSEN 1979; MANN 1984; HABERMEHL 1996).
Ein Mammakomplex besteht aus dem Corpus mammae (Drüsenkörper) und der Papilla mammae (Zitze), die unmittelbar als sog. Eversionszitze aus dem Drüsenkörper hervorgeht.
Die Milchdrüse ist eine zusammengesetzte, modifizierte, apokrine Schweißdrüse, deren Aufbau tubuloalveolär ist. Ihr Parenchym besteht aus Drüsenepithelien und dem interparenchymatösen Bindegewebe, welches sie in Lobuli unterteilt. Das Hohlraumsystem läßt sich einteilen in die Alveolen als Ort der Milchbildung und Milchabgabe. Darauf folgen die vom Drüsengewebe umhüllten interlobulären Ausführungsgänge (Ductus lactiferi), die sich zu größeren Milchgängen vereinigen und schließlich an der Zitze direkt in die Milchzysternen (Sinus lactiferi) münden. Hieran schließen sich die 6 - 20 Strichkanäle (Ducti lactiferi), die mit ihren Zitzenöffnungen (Ostia papillaria) direkt auf der Zitzenkuppe enden.
Hauptbestandteil der Alveolenwand ist ein einschichtiges Epithel aus kubischen, im Stadium der Milchspeicherung abgeplatteten und kurz nach dem Milchentzug auch leicht hochprismatischen Zellen. Die Deckzellen der Alveolarwand werden außen von Myoepithelzellen umgeben, die die Funktion glatter Muskelzellen erfüllen. Sie weisen oberflächlich Oxytocinrezeptoren auf, deren Aktivierung eine Kontraktion der Zelle und
damit eine Verengung der Alveole einleiten. Den Myoepithelien liegt außen die Basalmembran an. Sämtliche Milchgänge werden außen ebenfalls von einem lockeren Netz aus Myoepithelien umgeben, die der Ausschüttung und Weiterleitung der Milch dienen.
Wachstum und Funktion der Drüsenzellen unterliegen hormonellen Einflüssen. Hierbei spielen Östrogene, das Wachstumshormon, Prostaglandine (Wachstum), Progesteron und Prolaktin (Funktion) eine Rolle (CHRISTENSEN 1979; MOSIMANN u. KOHLER 1990;
LIEBICH 1993; HABERMEHL 1996).
Gefäßversorgung
Arteriell versorgt werden die Drüsenkomplexe durch die Rami mammarii der A. thoracica interna und der Aa. intercostales (T1 und T2), der A. epigastrica cranialis superficialis (T2 und A1), der A. epigastrica caudalis superficialis, der A. abdominalis cranialis sowie dem Ramus labialis ventralis der A. pudenda externa (A1, A2 und I). Die Komplexe T1, T2 und A1 führen ihr venöses Blut über die Venae perforantes oder die Vena epigastrica cranialis superficialis in die Vena thoracica interna, die in die Vena cava cranialis mündet. A1, A2 und I entsenden ihr venöses Blut über die Vena epigastrica caudalis superficialis zur Vena pudenda externa, wo es via Vena pudendoepigastrica, Vena iliaca externa und Vena iliaca communis in die Vena cava caudalis gelangt (MICHEL 1994; WAIBL et al. 1996).
Die Lymphdrainage des Gesäuges ist bilateral symmetrisch und hat als Metastasierungsweg primäre Bedeutung. Der Lymphabfluß der ersten drei Komplexe erfolgt über das Lymphocentrum axillare (Nl. axillaris proprius und Nl. axillaris accessorius) in den Truncus jugularis oder Ductus thoracicus oder direkt in den Venenwinkel und in den vorderen Brustbeinlymphknoten (Nl. sternalis cranialis). Das Lymphocentrum inguinale superficiale (Nll. inguinales superficiales) entsorgt die beiden kaudalen Komplexe und teilweise auch den abdominalen kranialen Komplex. Von hier gelangt die Lymphe über die Nll. iliaci mediales und die Nll. lumbales aortici in den Truncus lumbalis. Dieser mündet in die Cysterna chyli und weiter in den Ductus thoracicus. Zwischen beiden Abflußgebieten bestehen Anastomosen (CHRISTENSEN 1979; MICHEL 1994; VOLLMERHAUS 1996).
2.1.2 Epidemiologie der Mammatumoren
Mammatumoren sind mit über 50 % (BRODEY et al. 1983; MANN 1984; BOSTOCK 1986;
BOSTEDT u. TAMMER 1995; GUTBERLET et al. 1998; RAVIKUMAR et al. 2000) die häufigste neoplastische Erkrankung der Hündin. Vergleichend dazu stellt der Anteil der Mammatumoren bei der Frau 27 % aller Neoplasien dar (BRODEY et al. 1983;
RAVIKUMAR et al. 2000). Bei männlichen Hunden sind Mammatumoren sehr selten (FRESE et al. 1989; BOSTEDT 1994). Die Häufigkeitsangaben schwanken zwischen 0,4 und 2,7 % der Mammatumorfälle (ESKENS 1983).
Am häufigsten treten Mammatumoren bei der Hündin in einem Alter zwischen 7-13 Jahren, selten unter 5 Jahren auf. Das Durchschnittsalter liegt bei ca. 9,5 Jahren (DAHME u. WEISS 1958; BOSTEDT u. TAMMER 1995; SIMON et al. 1996; GUTBERLET et al. 1998). Die Ursache für das ab dem 5. Lebensjahr vermehrt auftretende unkontrollierte Wachstum im Gesäuge kann in der für die Hündin eigenen Zyklizität gesehen werden. Lange Östrogen-, Progesteron- und Prolaktinphasen scheinen einen Einfluß auf die Tumorinzidenz zu haben.
Durch die in den Mammakomplexen konzentrierten Progesteron- und Östrogenrezeptoren ist es denkbar, dass die Proliferationsvorgänge in Abhängigkeit von der Hormonlage und Rezeptorenfunktion entarten können und dadurch chronisch zu einer Tumorbildung führen (BOSTEDT u. TAMMER 1995).
Eine Rassedisposition ist nicht eindeutig festzustellen. Jedoch ist zu erkennen, dass vorwiegend kleine Rassen erkranken, z. B. Dackel, Pudel, Spaniel und Terrier. Große Hunde hingegen sind seltener betroffen, wobei die Angaben über den Deutschen Schäferhund, Boxer und Mischlinge in der Literatur deutlich differieren (DAHME u. WEISS 1958; BOMHARD u. DREIACK 1977; SIMON et al. 1996; MacEWEN u. WITHROW 1996; GUTBERLET et al. 1998).
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese
Ätiologisch handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, wobei offensichtlich hormonelle Einflüsse im Vordergrund stehen. Von den Geschlechtshormonen schreiben die meisten Autoren dem Progesteron (endo- oder exogener Herkunft) den größten Einfluß auf
die Mammatumorbildung zu. Die Applikation von Progesteronpräparaten zur Läufigkeitsunterdrückung kann, abhängig von dem Wirkstoff, der Dosis und der Behandlungsdauer, benigne Mammatumoren induzieren. Zum Einfluß auf die Genese maligner Geschwülste gibt es in der Literatur jedoch kontroverse Meinungen (GUTBERLET et al. 1998; NOLTE u. NOLTE 2000). Desweiteren wird eine Beteiligung von Prolaktin und dem Wachstumshormon Somatotropin an der Tumorgenese angenommen. So verkleinern sich laut GUTBERLET et al. (1998) unter Einsatz von Prolaktin-Hemmern zur Unterdrückung der Pseudogravidität klinisch manifeste Neoplasien der Mamma.
Es ist beschrieben, dass während der ersten wenigen Geschlechtszyklen kleine Klone von prä- neoplastischen epithelialen Zellen entstehen, die sich nach einigen Jahren zu echten Tumoren entwickeln können (BOSTOCK 1986). Somit senkt eine Ovarektomie vor dem ersten Zyklus das Gesäugetumorrisiko auf 0,5 %, nach dem ersten Zyklus auf 8 % und wird sie erst nach dem zweiten Zyklus durchgeführt, auf 26 %. Bei späterer Kastration (ab 2,5 Jahren) ist kein protektiver Einfluß mehr festzustellen (BRODEY et al. 1983; MANN 1984; BOSTOCK 1986; MOULTON 1990; GUTBERLET et al. 1998).
Weitere Faktoren sind genetische Prädisposition, virale, immunologische, diätische und umweltbedingte Einflüsse, Zyklusunregelmäßigkeiten und andere cancerogene Faktoren, welche im Einzelnen noch nicht abgeklärt sind (MANN 1984; GUTBERLET et al. 1998).
Pathogenese
Zu Beginn der Tumorgenese steht die Mutation eines Gens, die spontan, durch Einwirkung von chemischen Karzinogenen und physikalischen Noxen oder durch Viren bedingt sein kann. Die Mutation muß ein sogenanntes Proto-Onkogen betreffen, das normalerweise für ein die Zellteilung oder Zelldifferenzierung beeinflussendes Signalprotein kodiert. Ist ein Proto- Onkogen einmal mutiert bzw. aktiviert, so kann es nicht mehr deaktiviert werden und z. B.
eine Zellteilung unkontrolliert fortsetzen. Normalerweise werden zur Unterdrückung der Onkogenwirkung in einer mutierten Zelle Tumorsuppressorgene aktiviert, die entweder durch anhaltende Stimulierung ein unkontrolliertes Wachstum verhindern oder die Apoptose der mutierten Zelle einleiten. Diese Suppressorgene können jedoch infolge einer Mutation inaktiviert werden, weshalb sie eine Umwandlung einer mutierten Zelle zu einer Tumorzelle nicht mehr verhindern können (MEURER 1999; SUTER 2001).
Die Besonderheit bei der Entstehung von caninen Mammatumoren besteht in der häufigen Beteiligung myoepithelialer Zellen an der neoplastischen Proliferation. Dieser Zustand ist bei Mammatumoren anderer Haustiere oder des Menschen seltener zu beobachten (FRESE et al.
1989; BOSTEDT 1994). Klinisch können die Neoplasien der Mamma bei der Hündin einzeln (∼75 %) oder multipel (∼25 %) vorkommen und variieren im Durchmesser. Bei der Palpation erscheinen sie meist als nicht schmerzhafte Gebilde und können als weich-fluktuierend bei zystischen Veränderungen auftreten, sind aber häufiger von derber Konsistenz mit glatter oder unregelmäßig höckriger Oberfläche (MacEWEN u. WITHROW 1996; GUTBERLET et al.
1998; ARNOLD 2001; SIMON et al. 2001 b).
2.1.4 Lokalisation, Rezidive und Metastasen
Die Tumorhäufigkeit (über 80 % der Tumoren treten in den letzten drei, über 60 % in den letzten beiden Komplexen auf) und das Gewicht der Drüsenkomplexe nehmen von thorakal nach inguinal zu. Die bevorzugte Lokalisation in den hinteren Komplexen hängt möglicherweise mit den während des Zyklus größeren morphologischen Umbauprozessen zusammen (KÄLIN et al. 1985; GUTBERLET et al. 1998; SIMON et al. 2001 b). Laut ZANINOVIC und SIMCIC (1994) sind die kranial gelegenen Tumoren meist kleiner als Tumoren der kaudalen Komplexe und stellen eine größere Anzahl benigner und nicht neoplastischer Läsionen dar. Eine Seitendifferenz besteht nicht (GUTBERLET et al. 1998).
Die prozentuale Beteiligung einzelner Mammakomplexe schwankt in der Literatur jedoch erheblich (ESKENS 1983):
1. Kranialer thorakaler Komplex: 3,0 – 14,3 % 2. Kaudaler thorakaler Komplex: 7,0 – 15,6 % 3. Kranialer abdominaler Komplex: 2,0 – 20,0 % 4. Kaudaler abdominaler Komplex: 4,0 – 32,7 %
5. Inguinaler Komplex: 17, 8 – 41,0 %
► Multiple Tumoren: 18,8 – 37,0 %
Die Neoplasien der Mamma können hämatogen, lymphogen oder lymphohämatogen metastasieren, wobei es primär zur lymphogenen Ausbreitung kommt. Vor allem Karzinome sowie der karzinomatöse Anteil von malignen Mischgeschwülsten tendieren zu Metastasenbildung (ARNOLD 2001). Nach einer Literaturzusammenstellung von MOULTON (1990) sind von metastasierenden Mammatumoren der Hündin folgende Organe betroffen: regionäre Lymphknoten (64 %), Lunge (53 %), Gehirn (15 %), Leber (13 %), Niere (11 %), Herz (11 %) und Skelett (10 %).
Als Rezidive werden neugebildete, histologisch gleichwertige Tumoren bezeichnet, die an der selben Stelle entstehen, sie treten in ca. 20 % der operierten Fälle auf (KÄLIN et al. 1985).
Ungefähr die Hälfte der rezidivierenden Tumoren wird als gutartig beurteilt, und eine Reoperation ist zu empfehlen (ARNOLD 2001).
2.1.5 Therapie
Die derzeitigen Methoden der Mammatumorbehandlung erstrecken sich, ähnlich wie in der Humanmedizin, von operativen Maßnahmen über radiologische, immunologische und hormonelle Therapieformen bis hin zur Chemotherapie.
In jedem Fall sollte vor Therapiebeginn röntgenologisch das Vorhandensein von Metastasen in der Lunge durch rechts- und linksanliegende latero-laterale sowie eine ventro-dorsale Aufnahme des Thorax abgeklärt werden. Die chirurgische Exstirpation des betroffenen Mammakomplexes oder der gesamten Gesäugeleiste wird nach wie vor als Therapie der Wahl angesehen, sollte aber nur durchgeführt werden, wenn keine Fernmetastasierung besteht (BOSTOCK u. OWEN 1976; BOSTEDT 1994, GUTBERLET et al. 1998, NOLTE u.
NOLTE 2000).
In der Humanmedizin ist die Strahlentherapie nach der Chirurgie die zweitwichtigste Behandlungsform von Neoplasien. Das Ziel ist es, den Tumor bei maximaler Schädigung möglichst selektiv zu treffen und das umgebende gesunde Gewebe zu schonen (MANN 1984;
KASER-HOTZ 2001). Bei der Entwicklung des Strahleneffektes im Gewebe spielen Anregung und Ionisation von Molekülen und Bildung von Radikalen eine wesentliche Rolle, wobei die Schädigung der DNS für die Zellabtötung entscheidend ist (KASER-HOTZ 2001).
Diese lokale Tumorbehandlung kann alleine oder in Kombination mit der Chirurgie oder der
Chemotherapie angewendet werden (HIRSCHFELD et al. 2001; SIMON et al. 2001 a). In der Veterinärmedizin wird die Radiotherapie nicht routinemäßig zur Behandlung von Mammatumoren genutzt, jedoch ist ein palliativer Einsatz bei inoperablen oder stark entzündlich veränderten Neoplasien der Mamma möglich (SIMON et al. 2001 b). Bei sehr invasiven Tumoren kann die Prognose der chirurgischen Therapie durch eine präoperative Bestrahlung verbessert werden (HIRSCHFELD et al. 2001).
Die Immuntherapie umfaßt einerseits die Stimulation des unspezifischen Immunsystems und andererseits die Elimination von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen aus dem Serum der erkrankten Patienten. Dadurch wird die Effektivität der natürlichen Immunantwort und somit die Tumorabwehr gesteigert (FERGUSON 1985; LOAR 1986; KURTH et al.
2000). Allerdings brachten Untersuchungen, beispielsweise mit dem unspezifischen Immunstimulator Levamisol und der bakteriellen Vakzine aus Bacillus Calmette-Guerin (BCG), im Vergleich zu alleiniger chirurgischer Versorgung der caninen Mammatumoren, keine besseren Ergebnisse. Auch dem liposomenumhüllten Muramyltripeptidphosphatidyl- ethanolamin (L-MTP-PE), eine bakterielle Zellwandeinheit mit makrophagenstimulierender Aktivität, konnte beim Mammatumor des Hundes bisher kein Effekt nachgewiesen werden (LOAR 1986; SIMON 2001 b).
Die häufig in der Humanmedizin angewandte Hormontherapie mit dem nicht steroidalen Antiöstrogen Tamoxifen hat bisher keine überzeugende Wirkung am Hund gezeigt. Das liegt einerseits daran, dass höher maligne canine Mammatumoren häufig rezeptornegativ sind, da mit zunehmender Größe und Entdifferenzierung der Tumoren der Hormonrezeptorstatus sinkt. Somit fehlt gerade bei den höher malignen Tumoren, bei denen zur Chirurgie eine zusätzliche Therapie wünschenswert wäre, der Ansatzpunkt. Andererseits besteht die Gefahr starker Nebenwirkungen wie Harninkontinenz, Infektionen der abführenden Harnwege, Verhaltensänderungen, Alopezien, Vaginalschwellungen, -ausfluß und -blutungen mit dem Risiko einer Pyometra (BOSTEDT 1994; GUTBERLET et al. 1998; WEY et al. 2000;
NOLTE u. NOLTE 2000; SIMON et al. 2001 b).
Bisher gibt es wenig klinische Studien, die die Wirksamkeit einer Chemotherapie bei Hunden mit Gesäugetumoren belegen (FERGUSON 1985; MacEWEN u. WITHROW 1996;
RAVIKUMAR et al. 2000). So wurde die Chemotherapie zur Behandlung caniner
Mammatumoren bisher nur palliativ meist bei inoperablen, metastasierenden Tumoren eingesetzt (NOLTE u. NOLTE 2000; HIRSCHBERGER 2001). Die kurative Therapie, wie sie in der Humanmedinzin durchgeführt wird, ist laut HIRSCHBERGER (2001) hochtoxisch, intensivmedizinisch sehr aufwendig und so bei Hunden schlecht möglich. Doxorubicin, Cyclophosphamid oder Cisplatin sind Wirkstoffe, bei denen eine minimale antitumorale Aktivität bei Hunden mit Gesäugetumoren festgestellt wurde (LOAR 1986; MacEWEN u.
WITHROW 1996; RAVIKUMAR et al. 2000; NOLTE u. NOLTE 2000; SIMON et al. 2001 b). Therapiepläne, die zu einer definitiven Remission oder Lebenszeitverlängerung führen, gibt es gegenwärtig noch nicht. Derzeit laufen Studien der Fachgruppe Kleintierkrankheiten der DVG zur adjuvanten postoperativen Chemotherapie von Hunden mit malignen invasiven Mammatumoren mit den Substanzen Doxorubicin und Docetaxel (SIMON et al. 2001 b).
2.1.6 Prognose
Wichtige Kriterien für die Prognose in der Humanmedizin sind Tumorgröße, Metastasierung in regionäre Lymphknoten sowie das Vorhandensein von Fernmetastasen. Ähnlich wie beim Menschen gibt es auch beim Hund eine signifikante Korrelation zwischen Größe des Primärtumors und der Überlebenszeit. Die weiteren Faktoren zur prognostischen Einschätzung beim Hund sind Anzahl, Lokalisation, histologischer Tumortyp, -größe, -stadium, -grad, steigendes Lebensalter, Lymphknotenbefall und Veränderungen der Haut wie Rötung oder Ulzeration. Demzufolge haben Hündinnen mit kleinen (< 3 cm), gut abgesetzten und differenzierten Tumoren ohne Lymphknotenmetastasen bei positivem Östrogen- oder Progesteronrezeptornachweis eine gute Prognose. Ungünstig sind dagegen schnell wachsende, große, lokal infiltrierende Tumoren mit einer Differenzierungsabnahme der Zellen, Nekrose, Lymphknotenbefall und Ulzeration (MANN 1984; FRESE et al. 1989; MacEWEN u.
WITHROW 1996; GUTBERLET et al. 1998; NOLTE u. NOLTE 2000).
2.1.7 Klassifikation
Klinisch lassen sich Mammatumoren nur vage beurteilen. Da sie in vielen verschiedenen morphologischen und histologischen Erscheinungsformen auftreten können, ist eine eindeutige Einteilung anhand klinischer Kriterien schwer. Vergleichsschwierigkeiten bestehen unter anderem auch darin, dass es von verschiedenen Autoren unterschiedliche
Klassifikationssysteme gibt. Eine einheitliche Tumorklassifikation ist sinnvoll, um z. B.
Diagnosen von verschiedenen Untersuchern miteinander vergleichen zu können (SCHOENBAUER 1984; REINACHER 2001).
Die vorliegende Arbeit orientiert sich an der neuen Klassifikation der WHO (World Health Organisation) (MISDORP et al. 1999). Nachfolgend werden die einzelnen Tumoren kurz beschrieben, wobei die Tumoren, die in die vorliegende Studie einbezogen wurden, mit * gekennzeichnet sind.
2.1.7.1 Maligne Tumoren
Die malignen Tumoren lassen sich wie folgt unterteilen (MISDORP et al. 1999):
- epithelial: - Nichtinfiltratives Karzinom (2.1.7.1.1) - Komplexes Karzinom* (2.1.7.1.2) - Einfaches Karzinom (2.1.7.1.3):
Tubulopapilläres Karzinom*
Solides Karzinom*
Anaplastisches Karzinom
- Spezielle Karzinomtypen (2.1.7.1.4):
Spindelzellkarzinom Plattenepithelkarzinom*
Muzinöses Karzinom
Fettreiches Karzinom
- mesenchymal: - Sarkom (2.1.7.1.5):
Fibrosarkom Osteosarkom
andere Sarkome
- Mischformen: - Karzinosarkom (2.1.7.1.6)
- Karzinom oder andere Sarkome in benignen Tumoren (2.1.7.1.7)
2.1.7.1.1 Nichtinfiltratives Karzinom
Hierbei handelt es sich um eine epitheliale Neubildung, deren neoplastische Zellen nicht bis auf die Basalmembran vordringen. Diese häufig multizentrischen Läsionen können in Gänge oder Lappen, oder in dilatierte Gänge oder Zysten einwachsen. Die Tumorzellen können in verschiedenen Mustern angeordnet sein. Beschrieben sind siebförmige oder solide Wuchsformen mit und ohne zentrale Nekrose sowie enganliegend an den Basalmembranen ausgerichtete Tumorzellen.
2.1.7.1.2 Komplexes Karzinom
Das komplexe Karzinom ist aus zwei Komponenten zusammengesetzt, der luminal epithelialen und der myoepithelialen. Die luminalen Epithelzellen können tubulopapillär oder solide angeordnet sein. Die Myoepithelzellen, meist vom Spindelzelltyp, sind häufig in mehr oder weniger sternförmigen, netzartigen Mustern ausgerichtet. Schuppenförmige Metaplasien kommen gelegentlich vor. Expansives, lobuliertes Wachstum ist ganz häufig, wohingegen Einbrüche in Lymphgefäße eher selten sind. Die Unterscheidung zwischen hochdifferenzierten komplexen Karzinomen und komplexen Adenomen kann sehr schwer sein. Das Fehlen einer Kapsel, infiltratives Wachstum, hohe Zellrate, Nekroseherde und hohe Mitoseraten sind Indikatoren für Malignität. Dieser Tumortyp kommt relativ häufig bei Hunden vor.
2.1.7.1.3 Einfache Karzinome
Unter einem einfachen Karzinom werden die Tumortypen zusammengefaßt, die nur aus einem Zelltyp zusammengesetzt sind. Dies können luminale Epithelzellen oder Myoepithelzellen sein. Die Stromamenge kann dabei erheblich schwanken. Um den Tumor herum treten Lymphozytenansammlungen, in Verbindung mit oder ohne Nekrose auf. Diese Tumoren haben eine starke Tendenz, umliegende Gewebe und Gefäße zu infiltrieren.
Basierend auf ihrer Differenzierung und ihrem biologischen Verhalten, können einfache Karzinome in Kategorien mit steigender Malignität eingestuft werden: tubulopapillär – solide – anaplastisch.
Tubulopapilläres Karzinom:
Dieser Karzinomtyp ist charakterisiert durch die Anordnung von tubulären und/oder papillären Wuchsformen. Diese Gruppe kann unterteilt werden in tubuläre Karzinome, welche keine papillären Elemente besitzen und papilläre Karzinome, welche ohne tubuläre Komponenten sind. Beim Hund kann das tubuläre Karzinom von Wucherungen aus Bindegewebs-Fibroblasten begleitet sein. Der papilläre Typ, bei dem der bindegewebige Anteil normalerweise gering ist, kommt häufig beim Hund vor.
Solides Karzinom:
Das solide Karzinom ist durch die Anordnung von Tumorzellen in soliden Platten, Strängen oder Nestern charakterisiert. Der Anteil des Bindegewebes reicht von gering- bis mittelgradig.
Einige solide Karzinome sind aus Zellen mit stark vakuolisiertem Zytoplasma zusammengesetzt. Dieser Tumor kommt sehr häufig bei Hunden vor.
Anaplastisches Karzinom:
Ein anaplastisches Karzinom ist ein hochinfiltratives Karzinom aus pleomorph neoplastischen Zellen, welches nicht in eine von den anderen Karzinomgruppen eingeordnet werden kann.
Das histologische Bild entspricht einer diffusen infiltrativen Neoplasie, die zusammengesetzt ist aus großen pleomorphen Zellen, meist mit bizarren chromatinreichen Zellen. Das Auftreten von mehrkernigen Zellen ist für diesen Tumor nicht ungewöhnlich.
2.1.7.1.4 Spezielle Karzinomtypen
Spindelzellkarzinom:
Ein maligner Tumor, der aus Spindelzellen zusammengesetzt ist, die häufig in epithelialen Mustern angeordnet sind. Einige Spindelzellen sind solide angeordnet, während andere auch Kanälchen einschließen können. Es ist wahrscheinlich, dass einige Spindelzellkarzinome myoepithelialen Ursprungs sind. Dieser Tumor ist relativ selten bei Hunden.
Plattenepithelkarzinom:
Ein Plattenepithelkarzinom besteht aus soliden Platten und Strängen epithelialer Zellen, die fokale Differenzierung zu Keratinlamellen und Hornperlen aufweisen. Basalzellen sind
überwiegend in den peripheren Teilen der Platten. Der zentrale Teil besteht aus lamellenartigem Keratin mit erkennbaren, nekrotischen Tumorzellen. Die meisten Plattenepithelkarzinome sind vom hochinfiltrativen Typ, lymphatische Einbrüche sind häufig.
Einige der Plattenepithelkarzinome scheinen vom Strichkanal auszugehen. Da Plattenepithelkarzinome auch eine starke Infiltration mit Neutrophilen aufweisen können, müssen sie von schuppigen Metaplasien der großen Gänge, verursacht durch Entzündungen, unterschieden werden. In der peripheren Zellschicht der Karzinome finden sich häufig atypische Zellen, die in das Nachbargewebe eindringen.
Muzinöses Karzinom:
Das muzinöse Karzinom kommt als einfacher oder komplexer Typ vor und ist durch reichlich Muzinproduktion charakterisiert, die oft schon makroskopisch erkennbar ist. Der Schleimanteil kann hierbei epithelialer oder myoepithelialer Natur sein. Dieser Tumor kommt selten bei Hunden vor.
Fettreiches Karzinom:
Dieser Karzinomtyp ist durch das Auftreten von Zellen mit reichlich vakuolisiertem Zytoplasma, das eine große Menge von neutralem Fett beinhaltet, charakterisiert. Es handelt sich um einen bei Hunden seltenen Tumortyp.
2.1.7.1.5 Sarkome
Fibrosarkom:
Hierbei handelt es sich um einen von Fibroblasten ausgehenden malignen Tumor, der eine variable Kollagenmenge enthalten kann. Solche Tumortypen sind aus Spindelzellen zusammengesetzt, die Retikulin- und Kollagenfasern bilden. Die Fasern können parallel oder willkürlich angeordnet sein. In einigen Tumoren sind konzentrische Anordnungen der Fasern um proliferierte Blutgefäße, ähnlich dem Hämangiopericytom, zu sehen. Fibrosarkome und Osteosarkome sind die häufigsten bei Hunden vorkommenden Mammasarkome.
Osteosarkom:
Ein Sarkom ist charakterisiert durch neoplastische Zellen in Osteoid- und/oder Knochenformation. Diese Sarkome sind entweder nicht kombinierte reine Osteosarkome oder kombinierte Tumoren, die aus malignen knöchernen und knorpeligem Gewebe zusammengesetzt sind. Außerdem kann malignes fibröses Gewebe und/oder adipöses Gewebe vorhanden sein. Im allgemeinen erscheint das Zentrum der Matrix dicht, während die zellreichen Bereiche in der Peripherie lokalisiert sind. Pleomorphismus und mitotische Aktivität stehen hier im Vordergrund.
Andere Sarkome:
Reine Chondrosarkome und Liposarkome sind in der Mamma sehr selten.
2.1.7.1.6 Karzinosarkom
Ein Karzinosarkom ist ein morphologisch sowohl durch maligne epitheliale Komponenten (luminal und/oder myoepithelial) als auch durch maligne mesenchymale Anteile charakterisierter Tumor. Ein Gemisch von allen Arten von karzinomatösen und sarkomatösen Komponenten kann vorkommen. Dieser Tumor zeigt eine starke Variabilität sowohl seiner epithelialen als auch der mesenchymalen Anteile.
2.1.7.1.7 Karzinom oder Sarkom in benignen Tumoren
Hierbei handelt es sich um Tumoren mit maligne erscheinenden Zellherden oder einzelnen Knoten von solchen Zellen, die in benignen Mischtumoren vorkommen. Häufig ist schwer zu unterscheiden, ob die maligne Komponente aus einem benignen Tumor entstanden ist oder in diesen eingebrochen ist. Die Malignität kann zum Zeitpunkt der histologischen Untersuchung den benignen Tumor größtenteils ersetzt haben.
2.1.7.2 Benigne Tumoren
Die benignen Tumoren lassen sich wie folgt unterteilen (MISDORP et al. 1999):
- epithelial: - Adenom (2.1.7.2.1):
Einfaches Adenom*
Komplexes Adenom*
Basaloides Adenom
- Mischformen: - Fibroadenom (2.1.7.2.2):
zellarmes Fibroadenom
zellreiches Fibroadenom
- Benigne Mischtumoren* (2.1.7.2.3) - Gangpapillom (2.1.7.2.4)
2.1.7.2.1 Adenome
Einfaches Adenom:
Ein einfaches Adenom stellt eine benigne Neoplasie aus gut differenzierten luminalen Epithelzellen vom einfach tubulären Typ oder aus myoepithelialen Zellen dar.
Komplexes Adenom:
In komplexen Adenomen hingegen bestimmen luminale epitheliale Zellen und myoepitheliale Zellen das Zellbild. Komplexe Adenome kommen häufiger vor als einfache und stellen oft Übergangsformen zu benignen Mischtumoren dar. Sie sind schwierig gegenüber Hyperplasien, Papillomen und malignen Mischtumoren abzugrenzen.
Basaloides Adenom:
Basaloide Adenome bestehen aus einheitlichen basalen Epithelzellen, die in gleichförmigen Strängen und Nestern angeordnet sind. Die peripheren Zellen sind palisadenartig an der dünnen Basallamina orientiert, während die zentral liegenden Zellen schuppige und drüsige Differenzierungen zeigen können. Diese Tumoren sind normalerweise klein, gut umschrieben und neigen nicht zur Metastasierung.
2.1.7.2.2 Fibroadenom
Ein aus einem Gemisch von luminalen epithelialen Zellen und Bindegewebszellen bestehender benigner Tumor, dem manchmal myoepitheliale Zellen beigemischt sein können.
Diese peri- und intrakanalikulären Tumoren sind relativ selten.
2.1.7.2.3 Benigne Mischtumoren
Dieser Tumor ist zusammengesetzt aus benignen Zellen mit morphologisch gleichen epithelialen Komponenten (luminalen und/oder myoepithelialen) und mesenchymalen Zellen, die Knorpel und/oder Knochen und/oder Fett eventuell in Kombination mit fibrösem Gewebe produzieren. Sie wachsen langsam und sind im allgemeinen von einer bindegewebigen Kapsel umgeben.
2.1.7.2.4 Gangpapillom
Ein Gangpapillom ist ein in einem dilatierten Gang vorkommender, verzweigter oder lobulierter, einfacher oder komplexer benigner Tumor. Diese Tumoren kommen nicht sehr häufig vor.
2.2 HER2 Rezeptor
Das Proto-Onkogen HER2 (Humaner Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2), auch als c- erbB-2 oder HER2/neu-Gen bezeichnet, wurde zuerst in Neuroblastomen der Ratte nachgewiesen, daher die Bezeichnung neu. Beim Menschen ist es auf dem Chromosom 17 q11.2-q21 lokalisiert (POPESCU et al. 1989; NAKOPOULOU et al. 1996) und kodiert für den membranständigen Rezeptor HER2, der von zahlreichen epithelialen Zellen exprimiert wird. Hierbei handelt es sich um ein transmembranes Glykoprotein mit einer Größe von 185 Kilodalton (kD), das aus einer äußeren cysteinreichen Domäne, einer einzelnen lipophilen Transmembrandomäne und einer intrazellulären Domäne mit Tyrosinkinaseaktivität besteht.
Der Rezeptor ist für die Regulation verschiedener Aspekte des Zellwachstums verantwortlich, und gilt als ein Verstärker epithelialer Wachstumsfaktoren und wichtiger Regulator der Proliferation und Differenzierung epithelialer Zellen. Er gehört zur EGFR-Familie (Epidermal Growth Factor Receptor), die aus 4 Mitgliedern besteht: EGFR/erbB-1/HER1, erbB- 2/neu/HER2, erbB-3/HER3 und erbB-4/HER4. Alle Mitglieder sind transmembrane Tyrosinkinase-Rezeptoren, die als Monomere in der Plasmamembran existieren und wichtige Regulatoren für Zellwachstum, Überleben, Differenzierung und Migration der Zellen sind.
Die HER-Aktivierung ist gewöhnlich von der Präsenz von sog. Liganden und anderen Rezeptoren der HER-Familie abhängig. Nach der Ligandenbindung können die vier Rezeptoren untereinander zehn unterschiedliche Rezeptor-Dimere bilden, entweder Homodimer (z. B. HER1-HER1) oder Heterodimer (z. B. HER1-HER2). Trotz der strukturellen Homologie haben die Mitglieder der HER-Familie unterschiedlich spezielle Liganden. HER1 bindet hauptsächlich EGF, TGF-α und AR, während HER3 und HER4 überwiegend HRG und seine Isoformen binden. Ein Ligand, der speziell mit HER2 interagiert ist bisher nicht identifiziert (AKIYAMA et al. 1986; SLAMON et al. 1987; HYNES u.
STERN 1994; NAKOPOULOU et al. 1996; KAUFMANN u. KANZ 2000; KLAPPER et al.
2000; WANG u. HUNG 2001; KUMAR u. YARMAND-BAGHERI 2001; YARDEN 2001;
CIARDIELLO u. NORMANNO 2002; MENARD et al. 2003).
Definition von HER2:
In der Literatur findet sich keine einheitliche Nomenklatur für das HER2 Gen und Protein.
Eine Aufstellung der gebräuchlichen Bezeichnungen ist in Tabelle 1 dargestellt. In dieser Arbeit wird nicht die jeweils vom Autor der zitierten Literaturstelle verwendete Nomenklatur benutzt, sondern die einheitliche Bezeichnung HER2 Gen und HER2 Protein bzw. HER2 Rezeptor verwendet.
Tabelle 1: Gebräuchliche Bezeichnungen für HER2 Gen und Protein
HER2 Gen HER2 Protein
HER2 Proto-Onkogen HER2 Rezeptor
HER2/neu HER2
c-erbB-2 ErbB-2
neu Neu
p185HER2
HER2 Wirkmechanismus:
Die HER-Liganden sind bivalente Moleküle. Sie haben eine N-terminale Seite, die mit einer hohen Affinität und engen Spezifität direkt an die Rezeptoren HER1, HER3 oder HER4 bindet. Während die C-terminale Seite mit einer niedrigen Affinität und geringen Spezifität ein Homo- oder Heterodimerisationspartner rekrutiert, welches in den meisten Fällen HER2 ist (YARDEN 2001). Durch die Interaktion des extrazellulären Teils des Rezeptors mit dem Liganden (z. B. EGF, AR) kommt es zu einer Dimerisierung zweier Rezeptoren und zu deren Aktivierung. Daraufhin werden in der Zelle Transkriptionsfaktoren aktiviert, die die normale Zellproliferation beeinflussen (Abb. 1).
HER1 kann sowohl mit dem HER1 Rezeptor interagieren und diesen homodimerisieren, als auch mit HER2, HER3 oder HER4 zu einem Heterodimer führen. Hierbei gibt es eine Präferenz für die Interaktion mit HER2 als Bindungspartner für alle anderen HER Rezeptoren. Diese Präferenz für HER2 als Co-Rezeptor für ein Heterodimer hängt mit der
geringen Spezifität des Rezeptors und der Abwesenheit von HER2 spezifischen Liganden zusammen. HER2 als Bindungspartner eines solchen Heterodimers zeichnet sich durch besondere Stabilität aus, da der Ligand langsamer vom Komplex abdissoziiert und dadurch die Signalgebung deutlich stärker ist und länger dauert, als Signale aus einem HER1 Rezeptor-Homodimer (KAUFMANN u. KANZ 2000; KLAPPER et al. 2000; BLOOM et al.
2001; WANG u. HUNG 2001; YARDEN 2001; YU 2001; CIARDIELLO u. NORMANNO 2002).
Abb. 1: HER – Rezeptor Signalübertragungsweg. Durch die Bindung des Liganden an den extrazellulären Teil des Rezeptors kommt es zu einer Dimerisierung zweier Rezeptoren und damit zu deren Aktivierung. Daraufhin werden in der Zelle Transkriptionsfaktoren aktiviert, welche die normale Zellproliferation beeinflussen.
Nachdem der Ligand an den Rezeptor gebunden ist und die Signalübertragung stattgefunden hat, wird das Rezeptordimer in die Zelle aufgenommen und dieses Vesikel bildet das erste Endosom. Im Endosom wird der Ligand vom Rezeptor getrennt, entweder gelangt der Rezeptor nun zurück zur Zelloberfläche, oder er wird mit dem Ligand zum Lysosom transportiert und dort abgebaut. Ein HER1/HER2 Heterodimer dissoziiert leicht in einem Endosom bei einem pH-Wert von 5,5 und ermöglicht dadurch eine schnelle Wiederkehr des Rezeptors an die Zelloberfläche. Ein HER1/HER1 Homodimer dagegen besitzt eine größere Stabilität unter diesen Bedingungen und wird dann im Lysosom abgebaut (KLAPPER et al.
2000).
Unter normalen Bedingungen arbeitet das HER-Signal wie ein Netzwerk, welches die Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen vermittelt, wie z. B. die Wechselwirkung zwischen Neuron und Muskelzelle an der neuromuskulären Synapse. Diese Interaktion ist im untergehenden maligne transformiertem Gewebe unkontrolliert. Der HER1 Rezeptor ist im Verhältnis zum HER2 Rezeptor in Tumorzellen häufig unterpräsentiert, was dazu führt, dass HER2 häufiger in ein Dimer rekrutiert wird und demzufolge ein stärkeres Signal entsteht, welches den Zellzyklus antreibt (KLAPPER et al. 2000; KAUFMANN u. KANZ 2000).
Gründe für eine HER2 Überexpression:
Die Mehrheit der Mammakarzinompatientinnen mit einer HER2 Proteinüberexpression zeigt auch eine HER2 Genamplifikation. Allerdings kommt bei ca. 3-5 % dieser Patientinnen mit HER2 Proteinüberexpression keine HER2 Genamplifikation vor, was auf eine transkriptionale oder posttranskriptionale Dysregulation hinweisen würde (SLAMON et al. 1989; BLOOM et al. 2001).
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die zu einer Überexpression des HER2 Proteins führen können. Auf genetischer Ebene kann es z. B. durch Mutation zu einer Vermehrung des HER2 Gens (Genamplifikation) kommen. Das bedeutet, dass im Nukleus mehr als die üblichen zwei Kopien des HER2 Gens zu finden sind, wodurch es dementsprechend zu einer höheren Konzentration von mRNA kommt und damit zu einer verstärkten Synthese und Überexpression des Rezeptors an der Zelloberfläche.
Auch eine transkriptionale Aktivierung (verstärkte Aktivierung des HER2 Gens/Genexpression) ohne genetische Veränderungen ist möglich, bei der es aufgrund eines Transkriptionfaktors zu einer gesteigerten Transkription kommt. Hierbei wird mehr mRNA als üblich produziert, woraufhin mehr HER2 Rezeptoren synthetisiert werden können.
Als metabolischen Grund könnte man hier noch die schon erwähnte schnellere Wiederkehr des Rezeptors nach der Signalübertragung zur Zelloberfläche anführen, was allerdings keine Überexpression im eigentlichen Sinne darstellt (SLAMON et al. 1989; HYNES u. STERN 1994; KLAPPER et al. 2000; BLOOM et al. 2001; NEVE et al. 2001; VAN DE VIJVER 2001).
2.2.1 Nachweismethoden (Hercep, FISH)
Die HER2-Überexpression lässt sich auf allen Ebenen nachweisen, von der genomischen Ebene über die Transkription und Translation bis zum funktionsfähigen Rezeptor. Die Genamplifikation kann durch Southern blot (SLAMON et al. 1989), PCR (OKUYAMA et al.
1999), FISH (PAULETTI et al. 1996; FIELD et al. 2001; LEHR et al. 2001) und CISH (TANNER et al. 2000) bestimmt und hohe mRNA-Level durch Northern blot (SLAMON et al. 1989) und RT-PCR (BIECHE et al. 2003) erkannt werden. Die Rezeptorexpression kann durch Western blot (SLAMON et al. 1989; LEITZEL et al. 1992) oder durch die Immunhistochemie (FIELD et al. 2001; LEHR et al. 2001) bestimmt werden. Fragmente des Rezeptors lassen sich mittels ELISA (LEITZEL et al. 1992; VAN DE VIJVER 2002) im Serum feststellen. Indikatoren für den HER2 Status demonstriert Abb. 2 (SLAMON et al.
1989; JARDINES et al. 1993; ROSS u. FLETCHER 1999; DIAZ 2001; HANNA 2001;
ONODY et al. 2001; VAN DE VIJVER 2001; YAMAUCHI et al. 2001; BILOUS et al.
2003).
(modifiziert nach VAN DE VIJVER 2001) Abb. 2: HER2 Status. Darstellung einer normalen und einer Zelle mit Amplifikation des HER2 Gens, erhöhter Konzentration der HER2-mRNA und Überexpression des HER2 Rezeptors.
Im Folgenden werden die zur Zeit in der Humanmedizin gängigen HER2 Nachweismethoden näher erläutert.
Immunhistochemische Methode: Der Hercep Test
Bei der Immunhistochemie (IHC) werden farbmarkierte Antikörper eingesetzt, um die HER2- Überexpression auf den Tumorzellen im Gewebe zu zeigen. Anschließend wird die Intensität der Membranfärbung sowie die Anzahl der angefärbten Zellen mikroskopisch beurteilt. Die Lokalisation des Rezeptors auf der Zelloberfläche bildet dabei die Basis für dieses Verfahren.
Ein zur Zeit kommerziell verfügbarer und von der FDA zugelassener Test für diese immunhistochemische Methode ist der standardisierte Hercep TestTM-Kit der Firma DakoCytomation. Dieser Kit ist ein semi-quantitatives immunohistochemisches Testsystem zur Bestimmung der Überexpression des HER2 Proteins im unzerstörten Tumorgewebe.
Hierbei handelt es sich um eine indirekte Nachweismethode der HER2 Proteinüberexpression, bei der der enzymkonjungierte sekundäre Antikörper die Position des unkonjungierten Primärantikörpers im Gewebe markiert.
Der Vorteil der IHC gegenüber anderen Testverfahren ist die Tatsache, dass sie leicht an formalinfixiertem, in Paraffin eingebetteten Geweben durchgeführt werden kann, und dies auch der üblichen Probenverarbeitung und -aufbewahrung entspricht (HANNA 2001; DIAZ 2001). Ein positives Ergebnis der Tests bildet die Voraussetzung für eine Therapie mit Herceptin.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Hierbei wird die HER2 Genamplifikation mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Bei dieser Methode lässt sich feststellen, ob im Zellkern die üblichen zwei Kopien des HER2 Gens oder aber eine Vielzahl von HER2 Genkopien vorkommen. Jede Kopie des HER2 Gens ist als fluoreszierendes Signal nach der Färbereaktion unter dem Fluoreszenzmikroskop zu erkennen.
Bei dieser Technik muß die Ziel-DNA, die im Präparat erkannt werden soll, als Einzelstrang vorliegen, was durch Hitzedenaturierung erreicht wird. Im folgenden Renaturierungsschritt wird die Ziel-DNA mit der durch Markermolekülen markierten Sonden-DNA wieder zu einem Doppelstrang vereint. Die markierten Nukleotide werden dann durch speziell für diese
Markermoleküle spezifischen Antikörper sichtbar gemacht (FIELD et al. 2001; LEHR et al.
2001). Diese Methode kann notwendig werden, wenn die immunhistochemischen Ergebnisse nicht eindeutig sind oder wenn die Ursachen genau bestimmt werden sollen.
2.2.2 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Frau
Brustkrebs kommt bei ca. jeder achten Frau in den USA vor und ist eine häufige Todesursache. Seit 1987 ist in den USA und Großbritannien zwar eine deutliche Abnahme der Mortalitätsraten des Mammakarzinoms zu beobachten, was vermutlich auf frühzeitigere Diagnose und verbesserte Behandlungsmethoden zurückzuführen ist. Dennoch steht es in der Todesursachenstatistik der Frauen in den USA an zweiter Stelle hinter dem Lungenkrebs (JARDINES et al. 1993; NAKOPOULOU et al. 1996; McKEAGE u. PERRY 2002).
Das HER2 Protein ist an der normalen Brustentwicklung und am Brustwachstum beteiligt (MENARD et al. 2001 b). In normalen epithelialen Zellen ist die HER2 Expression gering, aber eine Reihe von verschiedenen epithelialen Tumoren zeigen eine bemerkenswert zunehmende Rezeptor-Expression bis zu dem 100-fachen Normalwert (KLAPPER et al.
2000; NEVE et al. 2001). Die normale Expression auf der Zelloberfläche einer Mammaepithelzelle liegt zwischen 20.000 – 100.000 Rezeptoren/Zelle (BLOOM et al. 2001).
Bei 20-30 % der Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom läßt sich eine Überexpression des HER2 Proteins an den Tumorzellen nachweisen (SLAMON et al. 1987, 1989; BLOOM et al. 2001; KUMAR u. YARMAND-BAGHERI 2001). Die Überexpression des HER2 Proteins und die HER2 Genamplifikation sind sowohl für den Krankheitsbeginn als auch den –verlauf verantwortlich. Ein positiver HER2 Status gilt als ein unabhängiger prognostischer Indikator für einen schlechteren Krankheitsverlauf und ist ein prädiktiver Faktor. So geht er mit besonders aggressivem Tumorwachstum und einem z. T. schlechteren Ansprechen auf bestimmte Chemotherapieprotokolle einher. Aufgrund dessen haben Patientinnen mit solchen Tumoren eine verkürzte Gesamtüberlebenszeit und damit eine schlechtere Prognose (SLAMON et al. 1987, 1989; HYNES u. STERN 1994; BLOOM et al. 2001; SCHOLL et al.
2001; WANG u. HUNG 2001; McKEAGE u. PERRY 2002).
Speziell für solche Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebs wurde in der Humanmedizin der Hercep Test zum HER2 Rezeptornachweis entwickelt und dient als
Entscheidungshilfe für eine Herceptintherapie. Zahlreichen Studien zufolge profitieren Patientinnen mit einer HER2-Überexpression vom Grad 3+ im IHC-Test oder einem positiven HER2 Ergebnis im FISH-Test mehr von einer Trastuzumab-Therapie, als Patientinnen mit einer Überexpression vom Grad 2+ ohne HER2 Genamplifikation (VOGEL et al. 2001;
McKEAGE u. PERRY 2002; BILOUS et al. 2003).
2.2.3 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Hündin
Das HER2 Protein wurde bereits in früheren Studien bei epithelialen Tumorzellen in caninen Mammatumoren nachgewiesen.
AHERN et al. (1996) untersuchte bei caninen Mammatumoren mit Hilfe eines Nukleinsäure Dot Blots, ob Malignität mit oder ohne lokale Invasion oder regionale Metastasen in Verbindung mit einer HER2 Genüberexpression stehen. Es wurden sowohl Mammatumorgewebeproben als auch Mammatumorzelllinien in die Untersuchung einbezogen, um den potentiellen Nutzen einer HER2 Genexpressionsmessung, durch Bestimmung der mRNA Menge, als diagnostisches Hilfsmittel oder prognostischen Indikator bezüglich der Malignität zu prüfen. Der HER2 mRNA Level wurde durch die Anlagerung einer radioaktiven Sonde über einen Dot Blot bestimmt und mittels autoradiographischer Dichtemessung quantifiziert. Eine Genüberexpression, bzw. erhöhter mRNA Level wurde bei 17 von 23 malignen Tumoren, 0 von 5 benignen und 2 von 7 Mammatumorzelllinien entdeckt.
So konnte eine Beziehung zwischen der HER2 Genüberexpression und der Malignität, aber keine zwischen HER2 Genüberexpression und lokaler Invasion oder regionalen Metastasen festgestellt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine HER2 Genüberexpression vor der Entstehung von Metastasen vorkommt und eine Rolle bei der Entwicklung der Malignität spielt. Die Tatsache, dass bei einigen malignen Tumoren keine HER2 Genüberexpression festgestellt wurde, spricht dafür, dass auch eine maligne Transformation unabhängig von einer HER2 Genüberexpression vorkommen kann.
RUNGSIPIPAT et al. (1999) hingegen führte immunhistochemische Untersuchungen durch.
Er benutzte eine modifizierte SABC-Methode, bei der polyklonale Antikörper (Kaninchen Anti-Human HER2) gegen das HER2 Protein eingesetzt wurden. Auf einer Skala von 1+ bis
4+ fand anschließend eine Bewertung der Membranfärbung statt. Es wurde bei 79 untersuchten Mammatumoren eine HER2 Überexpression bei 50 % der benignen und 19,1 % der malignen Tumoren festgestellt. Der Prozentsatz der caninen malignen Tumoren, die in dieser Studie eine Überexpression zeigten, ist gleich dem der humanen Mammatumoren (20- 30 %), aber geringer als bei caninen Mammatumoren, die von anderen Arbeitsgruppen beschrieben wurden (AHERN et al. 1996; MOKBEL u. HASSANALLY 2001).
Über die Lokalisation des HER2 Gens beim Hund gibt es in der Literatur im Gegensatz zum Menschen allerdings unterschiedliche Aussagen. Laut TAP et al. (1998) ist das canine HER2 Gen auf Chromosomen 23 lokalisiert. YANG et al. (1999) stellte eine Homologie zwischen dem humanen Chromosom 17, auf welchem das HER2 Gen lokalisiert ist, und den caninen Chromosomen 5 und 9 fest. ESCOBAR et al. (2001) hingegen konnte aufgrund seiner FISH Untersuchungen keine Signale an diesen Chromosomen entdecken. Er lokalisierte das HER2 Gen auf Chromosom 1q13.1, für das YANG et al. (1999) jedoch keine Homologie zum humanen Chromosom 17 nachweisen konnte.
2.2.4 HER2 Rezeptor bei anderen Tumoren
Eine HER2 Überexpression wird in unterschiedlicher Häufigkeit auch bei anderen epithelialen Tumoren, wie in Tabelle 2 dargestellt, beobachtet. Zum Beispiel bei dem Wilms- Tumor, dem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) oder dem Ovarial-, Blasen-, Speicheldrüsen-, Endometrium-, Gastrointestinal- und Pankreaskarzinom. Laut MENARD et al. (2001 a) zeigt der Wilms-Tumor mit 51 % die höchste HER2 Expressionsrate. Der Tumor mit der größten Anzahl an HER2 Scorewerten vom Grad 3+ ist laut KOEPPEN et al. (2001) das infiltrative duktale Mammakarzinom.
Bei den Brust-, Eierstocks- und Magenkarzinomen korreliert die Häufigkeit der HER2 Genamplifikation gut mit dem HER2 mRNA Level und der HER2 Proteinüberexpression. Bei den anderen epithelialen Tumoren ist der Level der HER2 Genamplifikation gewöhnlich niedriger als die HER2 Proteinüberexpression. Die Beziehung zwischen HER2 Genamplifikation/Rezeptorüberexpression und einer schlechten Prognose ist nicht nur auf den Brustkrebs begrenzt. Basierend auf der beschriebenen Wirksamkeit der anti-HER2 MAb- Therapie bei Brustkrebspatientinnen und den zunehmenden Beweisen, die zeigen, dass das
HER2 Gen eine signifikante Rolle in der Pathogenese anderer epithelialer Tumoren spielt, ist anzunehmen, dass die anti-HER2 MAbs auch eine therapeutische Wirksamkeit bei den anderen Tumortypen besitzen (KLAPPER et al. 2000; SCHOLL et al. 2001).
Tabelle 2: HER2 Überexpression bei verschiedenen Tumortypen
Tumortyp HER2 Überexpression
Wilms-Tumor 51 %
Blase 44 %
Pankreas 26 %
Brust 25 %
Lunge (NSCLC) 14 %
Ovar 14 %
Endometrium 14 %
(nach MENARD et al. 2001 a) 2.2.5 HER2 als therapeutisches Ziel
Der HER2 Rezeptor ist ein idealer therapeutischer Ansatzpunkt, da er außen an der Zelloberfläche sitzt und somit leicht zugänglich ist. Außerdem wird er nur von Tumorzellen überexprimiert. Damit bieten nur Tumorzellen ein Ziel und normale, bzw. gesunde Zellen werden nicht beschädigt. Die Erkenntnis, dass HER2 ein Hauptregulator der zur Epithelzellproliferation führenden Signalkette ist, macht dieses Protein als ein Ziel für eine Krebstherapie interessant.
Ein neuartiges Agens (Herceptin) wurde speziell mit dem Ziel entwickelt, die Funktion der HER2 Rezeptoren in HER2 positiven Tumoren zu antagonisieren. Der Hauptbestandteil von Trastuzumab (Herceptin) ist ein rekombinanter, humanisierter (95 % humane Proteine), monoklonaler Antikörper, der mit hoher Spezifität an die extrazelluläre Domäne des HER2 Rezeptors bindet. Er hemmt die Proliferation von humanen Tumorzellen, die eine
Überexpression des HER2 Proteins aufweisen, durch eine Veränderung der rezeptorabhängigen Signaltransduktion. Darüber hinaus stimuliert er eine zellvermittelte Toxizität (ADCC: antibody dependent cell mediated cytotoxicity), die zur Vernichtung der Tumorzelle führt.
Herceptin wird bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom eingesetzt, wenn auf den Tumorzellen eine HER2 Überexpression nachgewiesen werden kann. Gegenwärtig kann Trastuzumab als Monotherapeutikum bei Patientinnen mit einer vorangegangenen erfolglosen Chemotherapie oder in Kombination mit Paclitaxel (Taxol) bei Patientinnen, die noch nicht mit einem Chemotherapeutikum vorbehandelt sind, eingesetzt werden (SHEPHARD et al. 1991; KLAPPER et al. 2000; LEYLAND-JONES u. SMITH 2001;
MOKBEL u. HASSANALLY 2001; SCHOLL et al. 2001; YU 2001; RENNER et al. 2002;
GOEL et al. 2002; MENARD et al. 2003).
Die Zugabe von Trastuzumab zu einem Behandlungsschema bewirkt eine signifikante Verlängerung der Zeit bis zum Fortschreiten der Erkrankung. Bei mit Trastuzumab behandelten Patientinnen wurde darüber hinaus eine höhere objektive Ansprechrate (Voll- oder Teilremission), eine längere Ansprechdauer und eine längere Überlebenszeit sowie eine niedrigere Mortalitätsrate innerhalb des ersten Jahres beobachtet, als bei den ausschließlich chemotherapeutisch behandelten Patientinnen. Die objektiven Ansprechraten gegenüber einer Trastuzumab-Therapie bei unvorbehandelten Patientinnen fallen höher aus als bei Patientinnen, die bereits eine umfangreiche Chemotherapie erhalten haben (KAUFMANN u.
KANZ 2000; BASELGA 2001; McKEAGE u. PERRY 2002). Laut MENDELSOHN u.
BASELGA (2000) steigert Trastuzumab die antitumorale Aktivität von Paclitaxel und Doxorubicin, sowie die zytotoxischen Effekte einer Radiotherapie.
Ausblick in die veterinärmedizinische Nutzung:
Da es bisher nur wenig klinische Studien über die Wirksamkeit von Chemotherapien bei Hunden mit Gesäugetumoren gibt, wäre Trastuzumab als ein neues Agens eine interessante Perspektive. Gerade bei inoperablen, metastasierenden hormonrezeptornegativen Tumoren mit einem schlechten Ansprechen auf die in der Veterinärmedizin üblichen Therapien, gäbe es hier sicher einen neuen Ansatzpunkt.
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Untersuchungsmaterial
Insgesamt wurden 91 Mammatumorgewebeproben aus dem Einsendematerial der umliegenden Göttinger Tierarztpraxen untersucht. Die Proben wurden zur histologischen Untersuchung in einem Zeitraum von 1994 bis 2004 in die Abteilung Infektionspathologie (früher Tiermedizin und Primatenhaltung) des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen (Leiter: Prof. Dr. F.-J. Kaup) gesandt. Es handelt sich hierbei um weibliche Tiere, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme zwischen 2 und 15 Jahren alt waren. Genauere Angaben zu den Tieren siehe Anhang Tabelle 1.
Diese Proben wurden nach laborüblichem Protokoll in Paraffin eingebettet, geschnitten und gefärbt. Anhand der Hämalaun und Eosin (H.-E.) gefärbten Schnittpräparate wurde eine morphologische Diagnose erstellt und eine Einteilung nach der neuen WHO Klassifikation (MISDORP et al. 1999) vorgenommen.
3.1.2 Anfertigung der Gewebeschnitte
Die Proben wurden nach Eingang im Labor zugeschnitten und in Einbettkassetten gelegt. Die Entwässerung und Einbettung erfolgte dann mit Hilfe eines Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter XP, Fa. Shandon, Frankfurt am Main) nach dem im Anhang unter Punkt 8.1.1 aufgeführten Protokoll.
Mit dem Schlittenmikrotom HM 400 (Fa. Microm, Walldorf) wurden 3-4 µm dicke Schnitte angefertigt, die mit Hilfe eines im Eiswasser angefeuchteten Durchschlagpapierstreifens aufgenommen und dann in einem 40° C warmen Wasserbad gestreckt wurden. Von dort wurden sie auf Adhäsionsobjektträger (HistoBond, Fa. Marienfeld) aufgezogen. Anschließend fand über Nacht eine Trocknung der Schnitte bei 37° C statt.
Zur histologischen Beurteilung wurde von jeder Probe ein Paraffinschnitt im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) mit Hämalaun und Eosin gefärbt (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.2).
3.1.3 Klassifizierung der Proben
Die mit Hämalaun und Eosin gefärbten Präparate wurden mit Hilfe eines Standard-Biokular- Lichtmikroskop „Axioskop“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) pathohistologisch beurteilt und nach der derzeit gültigen WHO Klassifikation (MISDORP et al. 1999) in sechs verschiedene Tumorgruppen eingeteilt, wie in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Untersuchte Tumorgruppen
Tumor Probenanzahl
Einfaches Adenom 12
Komplexes Adenom 14
Benigne Mischtumoren 16 benigne
Plattenepithelkarzinom 12
Einfaches Karzinom (tubulopapillär, solide)
24
Komplexes Karzinom 13
maligne
3.1.4 Immunhistochemische Reaktionen
3.1.4.1 Hercep Test
Bei dem Hercep Test handelt es sich um eine indirekte Nachweismethode der HER2 Proteinüberexpression im Tumorgewebe. Der enzymkonjugierte sekundäre Antikörper (Detektionsreagenz) markiert hierbei die Position des unkonjungierten Primärantikörpers
(Kaninchen Anti-Human HER2) direkt im Gewebe. Die zur Durchführung dieses manuellen Testes benötigten Reagenzien sind, einschließlich positiver Zelllinien, die zur Validierung und Kontrolle der Färbeprozedur dienen sowie ein genaues Färbeprotokoll, im Hercep TestTM – Kit(No. K5204) der Firma DakoCytomation enthalten.
Die Vorversuche wurden an acht Mammatumoren nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach erfolgreicher Durchführung wurde eine kleine Änderung des Protokolls vorgenommen, die den Versuchsablauf vereinfachte, aber gleiche Ergebnisse brachte. An Stelle der feuchten Kammer wurden die Objektträger in Coverplates (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) eingelegt, wodurch ein Austrocknen der Schnitte, welchen Effekt die feuchte Kammer haben sollte, ebenfalls verhindert wurde. Unter Verwendung der Coverplates konnten allerdings innerhalb der vorgeschriebenen Zeitintervalle zwischen den Testschritten mehr Proben untersucht werden als in der feuchten Kammer.
Der Hercep Test wurde nach den Angaben des Herstellers (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.3) an entparaffinierten und rehydrierten Schnitten durchgeführt. Für jeden Versuchsdurchlauf wurden je zwei Schnitte pro Patient (pos.- und neg.-Probe) und ein Kontrollschnitt (mit drei Zelllinien 0, 1+, 3+) (Abb. 3 a - c) aus dem Test benötigt. So konnten pro Versuchsdurchlauf neun Patientenproben à zwei Objektträger untersucht werden.
Zur Antigen-Demaskierung wurden die Schnitte zuerst in der Epitope Retrieval-Lösung einer Hitzevorbehandlung im Wasserbad unterzogen. Die anschließende Blockierung der endogenen Peroxidase diente der Vermeidung falsch positiver Ergebnisse. Danach wurde der Primärantikörper (wie im Kit vorliegend), bzw. für die Negativkontrolle das Negativ-Reagenz aufgetropft. Im nächsten Schritt folgte der Sekundärantikörper und danach die DAB Substrat- Chromogenlösung. Abschließend wurde für 30 sek. eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt.
3.1.4.2 Ki 67
An ausgewählten Proben wurde eine Ki 67 Untersuchung durchgeführt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen das Ki-67 Antigen sollten die Kerne proliferationsaktiver Zellen in den Mammatumoren immunhistochemisch dargestellt werden. Unter Verwendung
des monoklonalen Antikörpers CONFIRMTM Anti-Ki67 (Clone K-2) von der Firma VENTANA wurden die Proben im NexES-IHC-Färbemodul der Firma VENTANA markiert.
Der Antikörper Ki 67 Test wurde nach den Angaben des Herstellers (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.4) an entparaffinierten und rehydrierten Schnitten durchgeführt. Zur Antigen- Demaskierung wurden die Schnitte in Citratpuffer (siehe Anhang Punkt 8.1.5) im Schnellkochtopf einer Hitzevorbehandlung unterzogen. Anschließend wurden die Schnitte ins NexES-IHC-Färbemodul eingespannt, wo alle weiteren Reaktionen stattfanden. Pro Versuchsdurchlauf wurden 18 Proben (ein Schnitt pro Patient), sowie eine Positiv- und eine Negativkontrolle im NexES-IHC-Färbemodul untersucht. Als Positivkontrolle wurde eine Tonsille vom Hund verwendet, da in lymphatischen Geweben regelmäßig Proliferationsaktivität anzutreffen ist.
3.1.4.3 Der Multiblock
Als Multiblock bezeichnet man einen Paraffinblock, der multiple Gewebeproben enthält.
Anhand dieses Paraffinblocks ist dann eine gleichzeitige Untersuchung vieler verschiedener Gewebeproben möglich. Dadurch werden nicht nur Reagenzien und Zeit gespart, sondern auch die Vergleichsmöglichkeiten der einzelnen Proben untereinander verbessert. Darüber hinaus liegen standardisierte Bedingungen für alle Proben vor. Dieses Verfahren wurde etabliert und hinsichtlich seiner Anwendbarkeit evaluiert.
Zur Erstellung eines Multiblocks wurde bei jedem Tumor eine repräsentative Stelle auf dem H.-E.-Schnitt markiert und diese Markierung auf den Paraffinblock übertragen. Danach wurde aus diesem Bereich ein Gewebezylinder mit Hilfe einer Stanze (∅ 3mm) ausgestanzt und zusammen mit den anderen Gewebezylindern in einem neuen Paraffinblock ausgegossen (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.6). Anschließend wird wie oben beschrieben eine H.-E.
Färbung, der Hercep Test und der Ki 67 Test durchgeführt.
3.1.5 Auswertung und Dokumentation
Die Auswertung des Hercep Tests wurde mit Hilfe des Fotomikroskops „Axiophot“ (Fa.
Zeiss, Oberkochen) durchgeführt. Als Leitfaden zum HER2-Scoring der Proben diente der Atlas for Interpretation of Hercep TestTM Staining (DakoCytomation-Broschüre Nr. 20210), in dem von 0 bis 3+ gewertet wird. Die Scorewerte 0 und 1+ gelten als negativ, 2+ und 3+ als positiv. Es wurde sowohl die Anzahl der gefärbten Tumorzellen (mehr oder weniger als 10
%), als auch die Vollständigkeit (unvollständig oder komplett) und die Stärke der Färbung beurteilt. Bewertet wurden hierbei nur die Markierungen der Zellmembran, Zytoplasmafärbungen wurden nicht berücksichtigt. Intraduktale Anfärbungen wurden ebenfalls nicht bewertet. Sie sind für die Bewertung irrelevant, da diese Strukturen nicht auf eine Herceptintherapie ansprechen. In der Übersicht galten also folgende Kriterien:
0 : Keine Färbung, oder weniger als 10 % der Tumorzellen zeigen eine membranständige Färbung.
1+ : Eine schwache, oder kaum sichtbare Membranfärbung ist in mehr als 10 % der Tumorzellen zu sehen. Die Zellen zeigen eine unvollständige Membranfärbung.
2+ : Eine schwache bis moderate komplette Membranfärbung wird in mehr als 10 % aller Tumorzellen festgestellt.
3+ : Eine starke, die komplette Membran umfassende Färbung, wird in mehr als 10 % aller Tumorzellen beobachtet.
Die Bewertung des Ki 67 wurde ebenfalls am Fotomikroskop „Axiophot“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde hier die Tonsille des Hundes, bzw. als Negativkontrolle normales Mammagewebe benutzt. Anhand einer Skala von - bis +++ konnte dann die Markierung der Kerne proliferationsaktiver Zellen beurteilt werden.
- : keine, oder kaum positive Zellen + : geringgradige Anzahl positiver Zellen ++ : mittelgradige Anzahl positiver Zellen
+++ : hochgradige Anzahl positiver Zellen
Die fotografische Dokumentation wurde mit Hilfe des Fotomikroskops „Axiophot“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) unter Verwendung von Farbfilmen des Typs Kodak Ektachrome 160T durchgeführt. Zusätzlich wurden Bilder mit dem Digitalkameraaufsatz Olymps DP 50 (Fa.
OLYMPUS Optical, Hamburg) angefertigt, in den PC übertragen und mit dem Programm analySIS (Fa. SIS, Münster) bearbeitet.
Der Multiblock wurde, wie oben beschrieben, im Hercep Test und Ki 67 Test beurteilt.
Anschließend fand ein Vergleich zwischen den Ergebnissen des Multiblocks und denen des Hercep Tests und Ki 67 Tests am Gesamttumorschnitt statt.
3a
3b
3c
Abb. 3 a - c: Kontrollschnitt aus dem Hercep Test mit drei humanen Brustkrebszelllinien.
(Scalebar = 50 µm).
a) Score 0: Keine Färbung oder weniger als 10 % der Tumorzellen zeigen eine membranständige Färbung.
b) Score 1+: Eine schwache oder kaum sichtbare unvollständige Färbung (Pfeile) ist in mehr als 10 % der Tumorzellen zu sehen.
c) Score 3+: Eine starke, die komplette Membran umfassende Färbung wird in mehr als 10 % aller Tumorzellen beobachtet.
3.2 Ergebnisse
Alle 91 Mammatumorproben wurden pathohistologisch untersucht und in sechs Tumorgruppen unterteilt, wobei 42 (46,15 %) als benigne und 49 (53,85 %) als maligne eingestuft wurden. Das unterschiedliche Wachstum der caninen Mammatumoren mit fokalen Herden, die sich hinsichtlich Malignität und Morphologie stark voneinander unterscheiden, erschwerte die Auswertung des Hercep Tests. So zeigte sich im Gegensatz zu dem invasiven Mammakarzinom der Frau bei den caninen Mammatumoren ein eher heterogenes Bild.
Die lichtmikroskopisch an H.-E. Schnitten ermittelten Diagnosen beruhten auf den in der WHO Klassifikation festgelegten morphologischen Kriterien. Es handelt sich dabei um die in Tabelle 4 aufgeführten Tumorentitäten. Auf eine ausführliche Beschreibung der morphologischen Veränderungen, die zu der jeweiligen Tumordiagnose geführt hatten, wurde verzichtet, da sie der oben aufgeführten und im Literaturteil dargestellten WHO Klassifikation entsprachen. Einzelne Abweichungen werden allerdings in der nachfolgenden Ergebnisdarstellung berücksichtigt.
3.2.1 Hercep Test
Von den untersuchten Mammatumorproben sind im Hercep Test insgesamt 78 Proben negativ und 13 positiv bewertet worden, wobei die negativen Proben entweder keine (Abb. 4 a/b) oder nur eine geringgradige Markierung aufwiesen (0, 1+). Bei den positiven Proben zeigten sich Markierungen von 2+ bis 3+, wie in Tabelle 4 dargestellt.
Der Prozentsatz der caninen malignen Tumoren (20,41 %), die hier eine Überexpression des HER2 Proteins zeigen, entspricht dem der humanen Mammatumoren (20-30 %), allerdings zeigten auch die benignen Tumoren (7,41 %) eine geringe Menge an HER2 in den Arealen der beginnenden Entdifferenzierung.
