Transformation des obligat biotrophen Rostpilzes Uromyces fabae
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
Vorgelegt von
Alma Djulić
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
Tag der mündlichen Prüfung: 14. Dezember 2012 1. Referent: Prof. Dr. Ralf Vögele 2. Referent: Prof. Dr. Kurt Mendgen
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-0-265491
„Die Erfahrung hat mich gelehrt, dass das, was man sich selbst nicht erklären kann, anderen gesagt werden muss.
Ein Selbst kann getäuscht werden, durch Teile der Bilder die sich aufdrängen, schwer aussprechbarem Gefühl weil es sich vor der Qual der Erkenntnis versteckt und flüchtet in den Nebel, in den Rausch der keinen Sinn sucht. Ein anderer verlangt nach genauem Wort, deshalb suchst du es, fühlst es irgendwo in dir und jagst es, das Wort oder sein Schatten, erkennst es am Gesicht des anderen, im Blick des anderen, wenn er beginnt zu begreifen. Zuhörer ist die Hebamme bei schwieriger Geburt des Wortes.
Oder noch Wichtigeres. Sollte der andere begreifen wollen.“
(Bosnischer Schriftsteller) Mesa Selimovic – Die Festung
"Iskustvo me naučilo da ono što se ne može objasniti samome sebi, treba govoriti drugome. Sebe možeš obmanuti nekim dijelom slike koji se nametne, teško izrečivim osjećanjem, jer se skriva pred mukom saznavanja i bježi u omaglicu, u opijenost koja ne traži smisao. Drugome je neophodna tačna riječ, zato je i tražiš, osječas da je negdje u tebi, i loviš je, nju ili njenu sjenku, prepoznaješ je na tuđem licu, u tuđem pogledu, kad počne da shvata. Slušalac je babica u teškom porođaju riječi. Ili nešto još važnije. Ako taj drugi želi da razumije."
Meša Selimović - Tvrdjava
Folgende Publikation ist aus dieser Arbeit hervorgegangen:
Djulic A., Schmid A., Lenz H., Sharma P., Koch C., Wirsel S. G., Voegele R. T. (2011).
Transient transformation of the obligate biotrophic rust fungus Uromyces fabae using biolistics. Fungal Biol. 117: 633-642.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1 Rostpilze ... 1
1.2 Uromyces fabae ... 2
1.2.1 Sporenarten und Verbreitung ... 2
1.2.2 Interaktion mit der Wirtspflanze ... 3
1.2.3 Bekämpfungsmethoden in der Praxis ... 6
1.3 Genetische Modifikation obligat biotropher Pilze ... 6
1.3.1 Transformationsmethoden ... 7
1.3.1.1 Biolistik ... 7
1.3.1.2 Agrobacterium vermittelte Transformation ... 9
1.3.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens als Pathogen ... 9
1.3.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pilzen ... 10
1.4 Zielsetzung ... 11
2. Material und Methoden ... 12
2.1 Chemikalien ... 12
2.2 Verwendete Organismen ... 12
2.2.1 Bakterienstämme ... 12
2.2.1.1 Escherichia coli ... 12
2.2.1.2 Agrobacterium tumefaciens ... 13
2.2.2 Verwendete Kulturmedien ... 13
2.2.2.1 Für E. coli ... 13
2.2.2.2 Für A. tumefaciens ... 13
2.2.3 Pilz- und Pflanzenmaterial ... 14
2.2.3.1 Pilzmaterial ... 14
2.2.3.2 Keimung von U. fabae Uredosporen auf künstlichen Oberflächen ... 14
2.2.3.3 Bestimmung der Uredosporen-Anzahl ... 15
2.2.3.4 Pflanzenmaterial ... 15
2.2.3.5 Kultivierung und Inokulation von V. faba ... 15
2.3 Verwendete Plasmide ... 16
2.3.1 Konstruktion der Plasmide für Biolistik ... 17
2.3.2 Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ... 18
2.4 Transformationsmethoden ... 18
2.4.1 Biolistik ... 18
2.4.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) ... 19
2.4.3 Ausbringung von Sporen in planta und Selektionsschema ... 20
2.5 Molekularbiologische Methoden ... 21
2.5.1 DNA-Präparation ... 21
2.5.1.1 Aus Pflanzenmaterial ... 21
2.5.1.2 Aus ungekeimten Sporen ... 21
2.5.1.3 Aus gekeimten Sporen ... 21
2.5.1.4 Amplifikation genomischer DNA mit REPLIg ... 22
2.5.1.5 Plasmidpräparation aus E. coli ... 22
2.5.1.6 DNA-Konzentrationsmessungen ... 22
2.5.2 PCR-Methoden ... 22
2.5.2.1 Oligonukleotide ... 23
2.5.2.2 Standard und Nested-PCR ... 24
2.5.2.3 Nested-PCR ... 25
2.5.2.4 Kolonie-PCR ... 25
2.5.2.5 SNP-PCR ... 25
2.5.2.6 Reinigung von PCR Produkten und DNA aus Restriktionsansätzen ... 26
2.5.2.7 Sequenzierung von PCR Produkten ... 26
2.5.3 Agarosegel-Elektrophorese ... 26
2.5.4 Klonierung von DNA ... 27
2.5.4.1 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen... 27
2.5.4.2 Ligation verdauter DNA ... 28
2.5.5 Kompetente Zellen und Transformation ... 28
2.5.5.1 E. coli SEM-kompetente Zellen ... 28
2.5.5.2 Hitzeschocktransformation ... 29
2.5.5.3 Agrobacterium tumefaciens elektrokompetente Zellen ... 29
2.5.5.4 Transformation durch Elektroporation ... 29
2.5.6 Southern Blot ... 30
2.5.6.1 Herstellung von DIG-markierten Sonden ... 30
2.5.6.2 32P-markierte Sonden ... 30
2.5.6.3 Vorbereitung und DNA-Transfer ... 31
2.5.6.4 Hybridisierung und DNA Detektion ... 31
2.6 Mikroskopische Methoden ... 32
2.6.1 Durchlichtmikroskopie ... 32
2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie ... 33
2.7 Verwendete Software ... 33
3. Ergebnisse ... 34
3.1 Auswahl der Methoden für die Transformation von Uromyces fabae ... 34
3.2. Plasmidkonstrukte für die Transformation ... 34
3.3 Biolistische Transformation von U. fabae ... 36
3.4 Detektion der Transformationsereignisse in vitro ... 36
3.4.1 Farbmarker Selektion ... 37
3.4.1.1 GUS-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae ... 37
3.4.1.2 GFP-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae ... 38
3.4.1.3 DsRed-Farbmarker für die biolistische Transformation von U. fabae ... 39
3.4.1.4 Fungizidmarker für die biolistische Transformation von U. fabae ... 41
3.4.1.5 Kombination der Farb- und Fungizidmarker bei Biolistischer Transformation von U. fabae ... 43
3.5 Etablierung der Selektion in planta ... 44
3.5.1 Fungizidmarker ... 45
3.5.1.1 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin ... 45
3.5.1.2 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps mit Benomyl ... 46
3.5.1.3 Selektionsschema in planta ... 47
3.6 U. fabae Transformanten-Linien, Selektion und molekulare Analyse ... 48
3.6.1 Selektion mit Benomyl ... 49
3.6.2 Selektion mit Carboxin ... 50
3.6.2.1 Biolistische Transformation mit den Plasmidkonstrukten pRV111 und pRV113 ... 50
3.6.2.2 Biolistische Transformation mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed ... 52
3.6.2.3 Biolistische Transformation mit Kassette aus pRV111 und pRV113 ... 54
3.7 Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation von U. fabae ... 60
3.7.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die Transformationseffizienz... 61
3.7.1.1 Induktion mit Acetosyringon ... 61
3.7.1.2 Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen ... 63
3.7.1.3 Weitere Faktoren für die ATMT ... 64
3.7.1.4 Einfluss der Agrobakterien-Stämme ... 65
3.7.2 ATMT Transformantenlinien in vitro ... 65
3.7.3 Selektion der ATMT-Transformanten mit Fungiziden in planta ... 67
3.7.3.1 Selektion mit Benomyl ... 67
3.7.3.2 Selektion mit Carboxin ... 68
3.7.4 Molekularer Nachweis der Transformation in den ATMT-Linien ... 69
3.8 Southern Blot Nachweis der Transformation ... 71
4. Diskussion ... 72
4.1 Etablierung der Transformation von U. fabae in vitro ... 72
4.1.1 Ermittlung der optimalen Parameter für die Biolistik ... 73
4.1.2 Regulatorische Elemente ... 73
4.1.3 Farbmarker ... 74
4.2 Transformationsansätze für in planta Versuche ... 76
4.2.1 Fungizidmarker ... 76
4.2.2 Selektionsschema ... 78
4.2.2.1 Problematik der ersten Selektion (S1) ... 78
4.2.2.2 Propagation der Transformantenlinien in planta... 79
4.3 Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation (ATMT) ... 80
4.3.1 Parameter für die ATMT von U. fabae ... 80
4.4 Mögliche Ursachen der Problematik bei der Propagation von
Transformantenlinien ... 84
4.5 Analyse der Transformation auf molekularer Ebene ... 85
4.5.1 Southern Blot Analyse ... 90
4.6 Stabilität der transformierten Uredosporen ... 91
4.7 Vergleich der Transformationsmethoden Biolistik und ATMT ... 92
4.8 Ausblick ... 94
4.8.1 Anwendung weiterer molekulare Methoden ... 94
4.8.2 Modifizierung und Erweiterung der Plasmidkonstukte ... 95
4.8.3 Optimierung der Propagation bei der Selektion in planta ... 95
5. Zusammenfassung ... 96
6. Summary ... 98
7. Literatur ... 100
8. Anhang ... 112
8.1 Propagation einzelner Uredia aus S1 für S2 ... 112
8.2 Zählungen einzelner Uredia (Biolistik) aus S1 ... 113
8.3 Zählungen einzelner Uredia (ATMT) aus S1 ... 115
8.4 Abbildungen verschiedener Selektionen in planta ... 118
8.5 Southern Blot Analysen ... 120
8.5.1 Verschiedene DNA-Menge und –Präparation für DIG-Markierung ... 120
8.5.2 Vergleich von DIG und 32P Sonden-Markierung ... 121
8.5.3 32P Markierung... 122
9. Danksagung ... 123
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: U. fabae Lebenszyklus ... 3
Abbildung 1.2: Infektionsstrukturen von U. fabae ... 5
Abbildung 1.3: Biolistik Apparatur ... 8
Abbildung 1.4: Interaktion Agrobacterium – Pflanzenzelle ... 10
Abbildung 2.1: Bombardierungs-Prozess mit PDS-1000/He Particle Delivery System ... 19
Abbildung 2.2: Selektionsschema in planta... 20
Abbildung 3.1: GUS Transformation in vitro ... 37
Abbildung 3.2: iGFP Transformanten in vitro ... 38
Abbildung 3.3: DsRed Transformanten in vitro ... 40
Abbildung 3.4: DsRed-NLS Transformanten von U. fabae ... 41
Abbildung 3.5: Keimung von Uredosporen auf angerauter PE-Folie ... 42
Abbildung 3.6: Transformation mit Doppelkonstrukt pRV111::DsRed ... 44
Abbildung 3.7: In genomische U. fabae DNA eingeführte Punktmutationen ... 45
Abbildung 3.8: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin in planta... 46
Abbildung 3.9: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps in planta durch das Fungizid Benomyl 47 Abbildung 3.10: Selektionsschema für Transformanten von U. fabae in planta ... 48
Abbildung 3.11: Aufbringen von Benomyl auf Bohnenblätter ... 50
Abbildung 3.12: Selektion und molekularer Nachweis der biolistischen Transformation ... 52
Abbildung 3.13: PCR Nachweis von selektionierten Sporenlinien nach Transformation mit pRV111::DsRed ... 53
Abbildung 3.14: Plasmidkassette tPMA1-mut-SucDH1-pPMA1 ... 54
Abbildung 3.15: PCR Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien in der S1 ... 56
Abbildung 3.16: PCR-Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien von S2 bis S9 ... 57
Abbildung 3.17: Möglichkeiten der Integration von Transgenen in das U. fabae Genom ... 58
Abbildung 3.18: Nachweis des Einbaus in das Genom von U. fabae mittels SNP-PCR (Single nucleotid polymorphism-PCR) ... 59
Abbildung 3.19: Nachweis der Punktmutation in den Transformantenlinien ... 60
Abbildung 3.20 Einfluss der Induktionsdauer auf die Transformationseffizienz ... 62
Abbildung 3.21: Einfluss von Acetosyringon (AS) auf die Transformationseffizienz ... 63
Abbildung 3.22: Einfluss des Verhältnisses von Agrobakterien : Uredosporen auf die Transformationseffizienz ... 64
Abbildung 3.23: Einfluss des Agrobacterium-Stammes auf die Transformationseffizienz... 65
Abbildung 3.24: Mikroskopische Screens nach ATMT von U. fabae in vitro ... 66
Abbildung 3.25: ATMT-Transformanten von U. fabae aus S1 und S2 mit Carboxin ... 69
Abbildung 3.26: ATMT-Linien S2 bis S8 ... 69
Abbildung 3.27: PCR-Nachweis des pBIN20-Backbone ... 70
Abbildung 3.28: Southern Blot-Analyse von Uf-SucDH1 ... 71
Abbildung 4.1: Übersicht über die Propagation von Transformantenlinien während der Selektion in planta ... 83 Abbildung 4.2: Nested-PCR Modell für den Nachweis der transgenen SucDH1 in U. fabae
Transformanten ... 86 Abbildung 4.3: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom nach
der Biolistik ... 87 Abbildung 4.4: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom bei
Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens ... 89 Abbildung 8.1: Ausbringung von Einzelrostpusteln auf Ackerbohnenblätter ... 112 Abbildung 8.2: Gradient-PCR für SNP-PCR Primer. ... 114 Abbildung 8.3: Zeitlicher Unterschied in der Keimung zwischen WT und Transformanten ... 118 Abbildung 8.4: Erste Selektion (S1) mit Carboxin ... 118 Abbildung 8.5: Propagierte Transformationslinien in planta nach ATMT ... 119 Abbildung 8.6: Propagierte Transformationslinien in planta nach Biolistik ... 119 Abbildung 8.7: Southern Blot mit verschiedenen Mengen und Präparationen von U. fabae
WT-DNA ... 120 Abbildung 8.8: Southern Blot-Vergleich der Sonden-Markierung DIG / 32P ... 121 Abbildung 8.9: 32P-Markierung von genomischer und Plasmid DNA ... 122
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Herkunft verwendeter Chemikalien ... 12
Tabelle 2.2: Verwendetes E. coli Stamm ... 12
Tabelle 2.3: Agrobakterien-Stämme für Transformation von U. fabae ... 13
Tabelle 2.4: Schrittweise Auszählung von Uredosporen nach einzelnen Behandlungsschritten ... 15
Tabelle 2.5: Plasmide und ihre Verwendung bei Transformation von U. fabae ... 16
Tabelle 2.6: Parameter für biolistische Transformation von U. fabae ... 18
Tabelle 2.7: Verwendete Oligonukleotide ... 23
Tabelle 2.8: Standardprotokoll für PCR-Reaktion ... 24
Tabelle 2.9: PCR Univ Programme... 25
Tabelle 2.10: Verwendete Restriktionsenzyme ... 27
Tabelle 2.11: Herstellung 32P-markierter Sonden ... 30
Tabelle 2.12: Auflistung der verwendeten Software... 33
Tabelle 3.1: Verwendete Plasmidkonstrukte für die Transformation von U. fabae ... 35
Tabelle 3.2: Parameter für Transformation von U. fabae mittels Biolistik ... 36
Tabelle 3.3: Anzahl iGFP Transformanten von U. fabae in vitro ... 39
Tabelle 3.4: Anzahl selektionierten DsRed-Transformanten in vitro ... 39
Tabelle 3.5: Anzahl von pRV111::DsRed-Transformanten in vitro... 43
Tabelle 3.6.: Selektion von U. fabae Transformanten durch Benomyl in planta ... 49
Tabelle 3.7: Selektion von U. fabae Transformanten durch Carboxin in planta ... 51
Tabelle 3.8: Transformanten-Linien mit pRV111:DsRed in planta ... 53
Tabelle 3.9: Erste Selektion in planta nach Beschuss mit der Kassette aus pRV111 und pRV113 ... 55
Tabelle 3.10: Zweite Selektion nach biolistischer Transformation ... 55
Tabelle 3.11: Selektionierte Transformantenlinien nach Biolistik in planta ... 56
Tabelle 3.12: Parameter für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ... 61
Tabelle 3.13: Selektionierte Transformantenlinien nach der ATMT in planta ... 67
Tabelle 3.14: S1 nach ATMT mit drei Agrobacterium-Stämmen ... 68
Tabelle 3.15: Selektionierte S2- bis S8-Transformantenlinien (ATMT) in planta... 68
Tabelle 4.1: Biolistik und Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) im Vergleich 93 Tabelle 8.1: Biolistische Transformation mit pRV111 und pRV113 ... 113
Tabelle 8.2: Biolistische Transformation mit dem Doppelkonstrukt pRV111::DsRed ... 113
Tabelle 8.3: Biolistische Transformation mit der Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 113 Tabelle 8.4: Biolistische Transformation mit der Kassette aus pRV111 und pRV113 ... 114
Tabelle 8.5: Auszählung der Uredosporenlager in der S1 nach Transformation mit pRV101 Plasmid durch ATMT ... 115
Tabelle 8.6: Einfluss von Acetosyringon auf die Induktion der Agrobacterium-Stämme ... 115
Tabelle 8.7: Einfluss des Verhältnisses Agrobakterien zu Uredosporen bei ATMT ... 116
Tabelle 8.8: ATMT mit drei verschiedenen Stämmen ... 117
Abkürzungen
ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ATPase Adenosintriphosphatase
bp Basenpaar(e)
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
CSPD Dinatrium 3-(4-methoxyspiro {l,2-dioxetan-3,2'-(5'chloro)tricyclo[3.3.1.1 3,7]- decan}-4-yl) phenylphosphat
DIG Digoxigenin DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) DsRed Red Fluorescent Protein
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraacetat
glm generalized linear model (Generalisierte Lineare Modelle) GUS β-Glucuronidase
iGFP intron Green fluorescent protein kb Kilobasen(paare)
OD optische Dichte
PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaktion)
RT Raumtemperatur
SB Southern Blot
Sx Selektionsrunde x Tx Transformantenlinie x
üN über Nacht
UV ultraviolettes Licht
WT Wildtyp
95%CI 95% confidence interval
1. Einleitung
1.1 Rostpilze
Rostpilze, die durch ihre unterschiedlich großen Pusteln mit rostbraunen bis schwarzen Sporen auch als „Rost“ bezeichnet werden, sind mit über 7000 beschriebenen Arten (Maier et al. 2003) die größte Gruppe der Basidiomyceten. Sie bilden die Ordnung Uredinales. Diese obligat biotrophen Pilze sind wichtige Pflanzenpathogene mit einem breiten Spektrum an Wirtspflanzen, insbesondere auch an wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen, und verursachen weltweit dramatische Verluste in der Pflanzenproduktion. Die beiden für die menschliche Ernährung wichtigsten Pflanzenfamilien Poaceae (Getreide) und Fabaceae (Leguminosen) sind bedeutende Wirte der Rostpilze (Voegele, 2006). Neben dem im Ackerbau ständig präsenten Getreiderost Puccinia graminis sind Kaffeerost (Hemileia vastatrix) und der vor allem in den USA auftretende asiatische Sojabohnenrost Phakopsora pachyrhizi (Schneider et al. 2005) von großer ökonomischer Bedeutung. Verschiedene Vertreter der Gattung Uromyces, z.B.: U. appendiculatus (Gemeiner Bohnenrost), U. fabae (Ackerbohnenrost), U. striatus (Alfalfarost) und U. vignae (Kuhbohnenrost), (Agrios 2005), haben weltweit große Bedeutung für die Forschung und die Entwicklung neuer Bekämpfungsstrategien im Leguminosenanbau.
Als Modellorganismen für die Erforschung der Infektionsmechanismen, der biochemischen und molekularbiologischen Vorgänge während der Wirt-Pathogen-Interaktion Interaktion sowie der Möglichkeiten der genetischen Modifikation, haben sich hauptsächlich fünf Vertreter der Rostpilze etabliert (Voegele 2006). Bereits 1956 wurde von Flor für die Aufstellung der Gen-für-Gen Hypothese (Flor 1956) das Modellsystem Melampsora lini – Linum usitatissimum genutzt. Zahlreiche der nachfolgenden Erkenntnisse über die Lebens- weise und Verbreitung der Rostpilze wurden an den Modellsystemen U. fabae–Vicia faba (Deising et al. 1991; Hahn und Mendgen 1997; Voegele 2006) sowie U. appendiculatus auf Phaseolus vulgaris (Harder und Mendgen 1982; Mendgen et al. 1996) gewonnen. Des Weiteren wurde Puccinia gramminis in zahlreichen zytologischen und physiologischen Arbeiten zur Aufklärung vieler in Rostpilzen vorkommender Prozesse herangezogen (Zhou et al. 1991; Leonard und Szabo 2005).
1.2 Uromyces fabae
Der Ackerbohnenrost U. fabae und seine Wirtspflanze V. faba dienten bereits zur Aufklärung vieler Vorgänge hinsichtlich der Biochemie, Zytologie sowie Molekularbiologie während der Wirt-Pathogen Interaktion (Freytag und Mendgen 1991; Deising et al. 1991; Mendgen und Deising 1993; Mendgen et al. 1996; Hoffmann und Mendgen 1998; Hahn und Mendgen 2001; Voegele et al. 2001; Wirsel et al. 2004; Voegele 2006). Die obligat biotrophe Lebensweise des Pilzes mit einem Wirtspflanzenspektrum von über 50 anderen Vicia sowie 20 Lathyrus Arten (Conner und Bernier 1982) ist ein wichtiger Aspekt zur Analyse der Wirt- Pathogen-Interaktionen und Entwicklung möglicher Bekämpfungsstrategien in der Praxis.
Auf seiner bedeutendsten Wirtspflanze V. faba, ist der Ackerbohnenrost autözisch und bildet alle fünf für Rostpilze bekannte Sporenarten: Basidiosporen, Pyknosporen, Aecidiosporen, Uredosporen und Teleutosporen (Mendgen 1997).
1.2.1 Sporenarten und Verbreitung
Während einem vollständigen Lebenszyklus werden alle fünf Sporenarten von U. fabae auf einer Pflanze (autözisch) gebildet. Die als Überwinterungsform gebildeten diploiden Teleutosporen keimen im Frühjahr mit einem Metabasidium aus, wo unter Reduktionsteilung vier haploide Basidiosporen entstehen. Diese Basidiosporen besitzen zwei unterschiedliche Paarungstypen: (plus (B+) und minus (B–, Abb. 1.1)) welche bei gegenseitigen Paarung das Pflanzenblatt infizieren und die Fruchtkörper Pyknidien, mit ebenfalls verschieden gepaarten Pyknosporen bilden. Das haploide Myzel durchdringt das Blatt und bildet auf der Unterseite nach Plasmogamie Aecidiosporenlager mit dikaryotischen Aecidiosporen. Nach einer Infektion neuer Pflanzenblätter keimen Aecidiosporen aus und es werden Uredosporenlager (Uredia) mit diploiden Uredosporen gebildet. Diese stellen die Hauptverbreitungsform dar und werden während der Vegetationsperiode in großer Zahl produziert. Urdosporen können leicht mit dem Wind und über längeren Distanzen verbreitet werden. Im Herbst, kommt es unter Umwelteinflüssen wie Tageslänge und niedrigere Temperatur zur Bildung von Teleutosporenlagern aus der Uredia. Die Zellkerne verschmelzen während der Sporogenesis und einzellige diploide Teleutosporen werden als Überwinterungsform gebildet (Voegele 2006). Aufgrund der schnellen und hohen Produktion von Uredosporen während der Vegetationsperiode, wurden die Uredosporen und die von
ihnen ausgehenden Infektionsstrukturen für die meisten biochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen genutzt (Voegele 2006). Auch im Rahmen dieser Arbeit wurden Uredosporen für die Transformation von U. fabae verwendet.
Abbildung 1.1: U. fabae Lebenszyklus. Teleutosporen (T), Metabasidium (M), Basidiosporen (B), Pyknidium (P); Aecidiosporen (A) und Uredosporen (U). 2n = diploid; n = haploid. Verändert nach Mendgen 1997.
1.2.2 Interaktion mit der Wirtspflanze
Uredosporen sind die Hauptform der asexuellen Vermehrung von Rostpilzen und werden durch wiederholte Infektion der Wirtspflanzen während Sommers in großen Mengen produziert (Voegele 2006). Eine mäßige Infektion resultiert in Produktion von 1012-1013 Uredosporen pro Tag und Hektar (Deising et al. 2002). Die Verbreitung erfolgt mit der Windströmung über große Distanzen, so dass eine interkontinentale Übertragung, wie am Beispiel von Hemileia vastatrix (Kaffeerost) beschrieben (Bowden et al. 1971), auch in anderen Regionen vorkommen kann (Brown und Hovmøller, 2002). Auf der Wirtspflanze haften sich die Sporen meistens als Cluster (Clement 1994) oder vereinzelt an die
M B+ P B‒
A U
T
Frühling
Winter
Herbst
Sommer
Blattoberfläche an und bilden bei genügend hoher Luftfeuchtigkeit durch Sekretion glykolisierter Polypeptide, niedermolekularer Kohlenhydrate (Clement 1993) sowie von Cuticula-abbauenden Enzymen wie Esterasen und Cutinasen ein Adhäsionskissen (Deising et al. 1992). Anschließend beginnt die Keimung. Dabei orientiert sich der Keimschlauch an topographischen Signalen und differenziert bei einer Erhebung welcher der Vorhofleiste der Spaltöffnung entspricht, zu einem Appressorium und arretiert in diesem Stadium bis das Stoma sich öffnet. Daraufhin wird eine Penetrationshyphe gebildet, die in die Atemhöhle eindringt und dort ein substomatäres Vesikel ausbildet. Von den Polen dieser Infektionsstruktur differenzieren Interzellularhyphen, die benachbarten Zellen des Blattmesophylls penetrieren. Dabei wird eine Haustorienmutterzelle gebildet aus der das Haustorium in die Pflanzenzelle eingesenkt wird. Diese Einsenkung erfolgt mittels Durchdringung der Zellwand und Einstülpung der Plasmamembran wodurch ein sehr enger Kontakt zwischen pflanzlichem und pilzlichen Zytoplasma entsteht. Diese sind lediglich durch die pilzliche Zellmembran (Haustorienmembran), die modifizierte Zellmembran der Pflanze (extrahaustorielle Membran) sowie durch den Zwischenraum, die extrahaustorielle Matrix, getrennt. Die Ausbildung von Haustorien ist ein komplexer Prozess für den bisher unbekannte Signale der Wirtspflanze essentiell sind (Mendgen et al. 2000).
Auf künstliche Oberflächen aufgesprüht bilden Uredosporen an befeuchteten Unterlagen Keimschläuche, die sich in alle Richtungen antasten. Bei Vorhandensein von künstlichen Erhebungen, z.B. Kratzer auf der Oberfläche einer Polyethylen-Folie, werden diese von keimenden Uredosporen erkannt und es wird die Bildung von Appressorien eingeleitet. Auf einem künstlichen Blattabdruck mit dreidimensionaler Struktur können die Uredosporen bis zur Haustorienmutterzelle differenzieren. Demnach können die Infektionsstrukturen in der Penetrationsphase bis zur Haustorienmutterzelle auf künstlichen Oberflächen in vitro induziert werden (Deising et al. 1991), jedoch verhindern fehlende pflanzlichen Signale die Ausbildung von Haustorien. Verglichen mit Uredosporen besitzen Basidiosporen (Abb. 1.2 B) eine dünne Zellwand und eine glatte Oberfläche. Es gibt keine Hinweise auf eine topographische Erkennung der Wirtsoberfläche. Basidiosporen infizieren die Pflanze durch direkte Penetration der Epidermiszellen (Mendgen 1997). Die Infektionsstrukturen wie das Appressorium, das substomatäres Vesikel und das Haustorium sind vorhanden, jedoch im Vergleich zu Uredosporen wesentlich schwächer differenziert (Abb. 1.2).
[A] [B]
Abbildung 1.2: Infektionsstrukturen von U. fabae. Ausgehend von Uredosporen (A) und Basidiosporen (B). Spore (S); Keimschlauch (KS); Appressorium (A); Penetrationshyphe (P);
substomatäres Vesikel (SV); Interzellularhyphen (I); Haustorienmutterzelle (HM); Haustorium (H).
Haustorien haben eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der parasitischen Interaktion durch die Unterdrückung pflanzlicher Abwehr während der biotrophen Phase (Mendgen et al. 2000). Die meisten biochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen an U.
fabae betreffen daher die Aufklärung der Haustorienfunktion (Voegele 2006). Es wurden u.a.
mehrere Aminosäuretransporter in der Haustorienmembran gefunden (Hahn et al. 1997;
Struck et al. 2002). Ebenso konnte eine H+-ATPase identifiziert werden, welche durch das Zusammenspiel mit einem Hexose-Symporter eine wesentliche Rolle der Haustorien in der Nährstoffaufnahme offenbart (Struck et al. 1996; Voegele et al. 2001). Die Interaktion mit der Pflanze und die Unterdrückung der Abwehrreaktion wird auch durch eine Reihe sekretierter Proteine beeinflusst (Link und Voegele 2008). Die Charakterisierung von Rust Transferred Protein 1 (RTP1p) zeigte einen Übergang eines pilzlichen Proteins vom Haustorium in die pflanzliche Wirtszelle, was in Zusammenhang mit der Unterdrückung der pflanzlichen Abwehr in Zusammenhang stehen könnte (Kemen et al. 2005). Es konnte eine Reihe von RTPp-Homologen in anderen Rostpilzen identifiziert werden, welche möglicherweise eine Funktion als Protease-Inhibitor haben (Pretsch 2012). Zudem sind verschiedene sekretierte Proteine identifiziert worden, die das Potenzial besitzen, die pflanzliche Abwehr während der biotrophen Interaktion zu beeinflussen (Link 2009).
1.2.3 Bekämpfungsmethoden in der Praxis
Beim Befall von V. faba durch U. fabae an handelt es sich um eine kompatible Interaktion, ein Resistenzmechanismus ist bisher unbekannt, so dass die Züchtung U. fabae resistenter Bohnensorten bisher nicht erfolgreich war.
Die Ackerbohne (Vicia faba), auch als Saubohne, Dicke Bohne, Faberbohne oder Puffbohne bekannt, ist der wirtschaftlich bedeutendste Vertreter der Gattung Vicia. Mit einem Ertrag von 4,1 Millionen Tonnen pro Jahr und 2,5 Millionen ha Anbaufläche weltweit (Akibode und Maredia 2011) zählt die Ackerbohne zu den 10 ökonomisch wichtigsten Körnerleguminosen.
Die größten Erzeuger im weltweiten Vergleich in den Jahren 2006-2008 waren China (930 000 ha) sowie Frankreich (60 000 ha) und UK (50 000 ha) in Europa (Akibode und Maredia 2011). Der Ackerbohnenrost ist neben dem Falschen Mehltau (Peronospora viciae var.
fabae), der Wurzelhals- und Stängelfäule (Rhizotonia solani), der Schokoladenflecken- krankheit (Botrytis fabae) und der Weißstängeligkeit (Sclerotonia trifoliorum) eine der wichtigsten Krankheiten der Ackerbohne. Demnach nimmt die Bekämpfung von U. fabae eine wichtige Stellung im Pflanzenbau ein. Ein derzeit zugelassenes Fungizid gegen den Ackerbohnenrost ist Folicur (Wirkstoff Tebuconazol, Bayer, Leverkusen). Gegen andere Roste im Getreideanbau wird der Wirkstoff Carbendazim (Harvesan, DuPont, Wilmington, USA) eingesetzt. Die potentielle Gefahr einer Resistenzbildung seitens des Pathogens ist ständig präsent und stellt eine große Herausforderung in der Fungizidforschung und -ent- wicklung dar. Die Entwicklung neuer Wirkstoffe, die allen heutigen Anforderungen der Gesetzgebung gerecht werden, ist mit der Erforschung von essentiellen Stoffwechselwegen verbunden, die eine Wirt-Pathogen-Interaktion aufrechterhalten. Hierfür ist vor allem die Etablierung neuer Methoden zur Aufklärung molekularer und genetischen Vorgänge im Pathogen das primäre Ziel.
1.3 Genetische Modifikation obligat biotropher Pilze
Obligat biotrophe Pilze wie der Fasche Mehltau und die Rostpilze liegen aufgrund einer Reihe ungeklärter Prozesse während der Wirt-Pathogen-Interaktion, im besonderen Interesse der Forschung. Die Schwierigkeiten bei der Erforschung der Mechanismen berühren hauptsächlich auf zwei Tatsachen: 1) die fehlende Möglichkeit zur Erzeugung einer
authentischen Wirt-Pathogen-Interaktion in vitro und 2) das Fehlen einer erfolgreichen Methode zur stabilen Transformation von obligat biotrophen Pilzen.
Es gab zwar bereits Veröffentlichungen über eine stabile Transformation von Erysiphe graminis (Chaure et al. 2000), bislang jedoch keine weiteren Publikationen über den Erfolg dieser Methode bei anderen Pilzen. In jüngster Vergangenheit ist es Lawrence et al.
gelungen, ein System für die Transformation von Melampsora lini, den Erreger des Flachs- rostes, zu etablieren (Lawrence et al. 2010). Dieses System basiert auf einer Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation unter Ausnutzung des RNAi Silencing eines Avirulenzgens als Selektionsmarker. Demnach ist diese Methode nur in gut charakterisierten Systemen wie der Flachs-Flachsrost Interaktion anwendbar. Im System Ackerbohnenrost- Ackerbohne, sowie in zahlreichen anderen Wirt-Pathogen-Interaktionen, bei denen wenig über Avirulenzgene bekannt ist, ist dieses System bislang nicht anwendbar. Verschiedene Berichte über die genetische Modifikation der obligat biotrophen Rostpilze beziehen sich auf eine transiente Transformation. Beispiele für die Transformation von Uromyces appendiculatus beruhen auf der Mikroinjektion von Antisense Primern (Barja et al. 1998) oder biolistischem Beschuss mit dem -Glucuronidase (GUS)-Gen als Farbmarker (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993). Auch für Puccinia graminis f. sp. tritici wurde eine transiente Transformation beschrieben (Schillberg et al. 2000). Allen gemeinsam war die Benützung von in vitro erzeugten Infektionsstrukturen und somit die fehlende Möglichkeit, einen vollständigen Lebenszyklus oder die Propagation der gewonnenen Transformanten zu erzeugen. Um das Ziel zu verfolgen, ein System für eine stabile Transformation von U. fabae zu etablieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Transformationsmethoden gewählt: 1) Biolistik, die in den meisten Fällen für eine transiente Transformation der Rostpilze als erfolgreich beschrieben wurde (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993; Schillberg et al. 2000) und 2) Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation als bedeutende Methode für die Transformation zahlreicher filamentöse Pilze (Michielse et al. 2005; Frandsen 2011).
1.3.1 Transformationsmethoden 1.3.1.1 Biolistik
Die Particle oder Gene Gun (Genkanone), ursprünglich für Transformation von Pflanzen entwickelt (Stanford et al. 1987) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genetische
Modifikation nahezu aller Zelltypen und richtet sich nicht nur auf Zellkerne sondern auch andere Organellen wie Mitochondrien (Johnston et al. 1988) oder Chloroplasten (Boynton et al. 1988). Diese Methode, meistens als Bioballistik oder Biolistik bezeichnet, fand sehr schnell ihre Anwendung bei der Transformation von Bakterien und Pilzen (Smith et al. 1992, Johnston et al. 1988, Armaleo et al. 1990). Der Mechanismus basiert auf einem Beschuss von Zielzellen oder –Organellen unter hohem Druck mit Partikeln (Microcarrier), meistens Gold (0,6 µM oder 1,0 µM Durchmesser) oder Wolfram (0,4 µM oder 0,7 µM) die mit Plasmid- DNA, welche die Zielgene enthält, umhüllt sind. Aufgrund ihrer einheitlichen Größe und chemischen Inertheit werden als Microcarrier bevorzugt Goldpartikel benutzt. Zusätzlich werden die Partikel für eine bessere Adsorption der DNA mit Spermidin beschichtet. Für die Erzeugung des hohen Drucks wird das Gas Helium verwendet. Die Etablierung einer Reihe von Parametern ist für jeden Zielorganismus notwendig um eine effiziente Transformation mittels Biolistik (Abb. 1.3) zu erreichen. Dazu gehört der entsprechende Helium-Druck, um eine Beschädigung der beschossenen Zellen zu vermeiden, die passende Größe und Art der Microcarrier sowie die Beschussdistanz zwischen „Stopping Screen“ und Zielzellen (s.a. Abb.
2.1 Abschnitt 2.4.1). Die Vorteile der biolistischen Methode sind eine leichtere Handhabung
Abbildung 1.3: Biolistik Apparatur (Manual Bulletin, Bio-Rad Laboratories).
und Durchführung im Vergleich zu arbeitsaufwändigeren Methoden, die eine Protoplastierung der Zellen oder eine Mikroinjektion erfordern. Die beschossenen Zellen werden nur wenig beschädigt und es sind geringe Mengen an DNA notwendig um sowohl eine transiente als auch stabile Transformation zu erreichen. Ein Nachteil sind lediglich hohe Anschaffungskosten der Biolistik Apparatur. Die Patentrechte für Genkanone wurden im Jahr 1990 an die Firma DuPont (Wilmington, USA) verkauft und der Vertrieb wurde an die Firma Bio-Rad übertragen.
1.3.1.2 Agrobacterium vermittelte Transformation
Agrobakterien sind bodenbürtige gramnegative Bakterien aus der Klasse der Alphaproteobacteria. Die meisten Agrobacterium-Spezies leben saprophytisch, einige sind pathogen und verursachen neoplastische Erkrankungen wie Wurzelhalsgallen (A.
tumefaciens) oder die Haarwurzelkrankheit (A. rhizogenes) bei einem breiten Spektrum an dikotyledonen und manchen monokotyledonen Pflanzen (DeCleene and DeLay, 1976).
1.3.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens als Pathogen
Die Bildung von Tumoren wird durch die artübergreifende Genübertragung (horizontaler Gentransfer) des bakteriellen Ti-Plasmid in die Pflanze verursacht. Die Induktion der Virulenzmaschinerie von Agrobacterium (vir-Gene) wird durch sekundäre Pflanzenstoffe wie Acetosyringon und andere phenolischen Verbindungen ausgelöst (Stachel et al. 1986). Die zu übertragende bakterielle T-DNA (transferred DNA) ist Teil des ca. 200 kb großen Tumor induzierenden (Ti) Plasmids und kodiert Gene für die Auxin- und Cytokininsynthese, die ein unkontrolliertes Zellwachstum und schließlich die Tumorbildung in der Pflanze auslösen.
Neben Auxin- und Cytokinin- kodierenden Sequenzen trägt die T-DNA Gene für die Synthese von Opinen, stickstoffreichen Molekülen, welche von der Pflanze produziert und in die Umgebung sekretiert werden und von Agrobacterium als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle genutzt werden. Flankierende kurze, repetitive Sequenzen (25 bp) der T-DNA werden als left und right border (LB, RB) bezeichnet. Vor einem T-DNA-Transfer wird die ca. 20 kb große T- DNA durch einen durch Endonukleasen (VirD, Abb. 1.4) verursachten Einzelstrangbruch innerhalb der RB, für den Transfer vorbereitet. (Lacroix 2006; Citovsky 2007; Frandsen 2011).
Der Transfer der einzelsträngigen T-DNA erfolgt über das bakterielle Typ IV-
Sekretionssystem (Christie 2004). In der Wirtszelle entsteht der „mature T-complex“, der mit Hilfe verschiedener bakterieller und pflanzlicher Faktoren (Tzfira und Citovsky 2002) entlang des Cytoskeletts in den pflanzlichen Zellkern transportiert wird. Die Integration der T-DNA ins pflanzliche Genom ist bis heute nicht gänzlich verstanden (Tzfira 2004; Lacroix 2006), erfolgt jedoch eher unspezifisch, begünstigt durch bestimmte Tandemwiederholungen.
Abbildung 1.4: Interaktion Agrobacterium – Pflanzenzelle. Abbildung aus Citovsky et al. (2007). Dar- stellung der wichtigsten molekularen Vorgänge bei der Übertragung und Integration der T-DNA von Agrobacterium in das Pflanzengenom.
1.3.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pilzen
Die natürliche Fähigkeit der Agrobakterien zur Übertragung von genetischem Material in die Wirtspflanze wird in der Forschung seit 1977 gezielt für genetische Modifikation von Pflanzen zur Erzeugung einer ortsspezifischen oder zufälligen Mutagenese („random mutagenesis“) und zur heterologen Expression genutzt (Schell und Van Montagu 1977).
Durch die Modifikation des Ti-Plasmids und Konstruktion binärer Vektoren (Bevan 1984), konnte eine erhöhte Effizienz dieser Transformationsmethode unter Laborbedingungen auch bei vielen Pilzen (Bundock et al. 1995; de Groot et al. 1998; Michielse et al. 2005; Frandsen
2011) erreicht werden. Inzwischen sind eine Reihe von Agrobakterien-Stämmen verfügbar, die für die Transformation von Pilzen eingesetzt werden, z.B. LBA1100 (Beijersbergen et al.
1992), EHA105 (Hood et al. 1993), GV3101 (Koncz and Shell, 1986) oder AGL1 (Lazo et al.
1991). Die Zahl der mittels Agrobacterium transformierbaren Pilze nimmt ständig zu (Frandsen 2011). Neben den Ascomyceten: Botrytis cinerea (Rolland et al. 2003), Aspergillus sp. (Gouka et al. 1999; Michielse et al. 2008; Sugui et al. 2005), Colletotrichum sp. (Münch et al. 2011; Talhinhas et al. 2008), Fusarium sp. (Mullins et al. 2001; Liu et al. 2009) u.a., gehören zahlreiche Vertreter der Basiodiomyceten wie: Agaricus bisporus (de Groot et al.
1998; Chen et al. 2000), Laccaria bicolor (Kemppainen et al. 2008), Melampsora lini (Lawrence et al. 2010), Rhizoctonia solani (Wu and O’Brien 2009) oder Ustilago maydis (Ji et al. 2010) zu den durch Agrobacterium transformierbaren Pilzen. Auch die Transformation von Oomyceten wie Phytophthora infestans wurde mittels Agrobacterium erreicht (Vijn and Govers, 2003).
1.4 Zielsetzung
Die molekularbiologische Untersuchung des Rostpilzes Uromyces fabae und damit die Erforschung der biotrophen Lebensweise ist bislang erschwert, da kein System für eine stabile Transformation verfügbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mittels zweier unterschiedlicher Methoden, Biolistik und Agrobacterium tumefaciens-vermittelter Transformation (ATMT) die Möglichkeit geschaffen werden, U. fabae genetisch zu modifizieren. Für die Visualisierung der Transformationsereignisse in vitro, sollten die Farbmarker iGFP, DsRed bzw. GUS verwendet werden, um optimale Parameter für beide Transformationsmethoden in vitro zu etablieren. Einzelne Punktmutationen in bereits charakterisierten Genen für Tubulin (Uf-TBB1) und die Succinat Dehydrogenase (Uf-SucDH1), die eine Resistenz gegenüber den Fungiziden Benomyl bzw. Carboxin vermitteln, sollten als Marker benutzt werden, um eine Propagation und Selektion der U. fabae-Transformanten in planta zu ermöglichen. Unter diesen Bedingungen sollten möglichst viele Transformantenlinien in V. faba Pflanzen unter Selektionsdruck propagiert werden.
Desweiteren sollten molekularbiologische Methoden wie PCR und Southern Blot für die Analyse der selektionierten Transformanten von U. fabae, etabliert werden.
2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien und ihre Herkunft sind im Text angegeben. Die Hersteller-Liste ist Tabelle 2.1 zu entnehmen.
Tabelle 2.1: Herkunft verwendeter Chemikalien.
Firma Firmenstandort
Becton Dickinson GmbH Heidelberg
Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe
Chem Service Inc West Chester, USA
GE Healthcare München
Invitrogen Karlsruhe
Merck KGaA Darmstadt
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH Taufkirchen SERVA Electrophoresis GmbH Heidelberg
2.2 Verwendete Organismen
Die in dieser Arbeit verwendeten Organismen sowie ihre Kultivierung sind den folgenden Abschnitten zu entnehmen.
2.2.1 Bakterienstämme
2.2.1.1 Escherichia coli
Für Klonierung und Plasmidvermehrung wurde der in Tabelle 2.2 beschriebene E. coli-Stamm verwendet.
Tabelle 2.2: Verwendetes E. coli Stamm.
Stammbezeichnung Genotyp Herkunft
DH5 F-, ϕ80lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44 λ-, thi-1 gyrA96, relA1
Invitrogen
2.2.1.2 Agrobacterium tumefaciens
Die für die Transformation von U. fabae verwendeten Agrobacterium-Stämme sind in Tabelle 2.3 aufgelistet.
Tabelle 2.3: Agrobakterien-Stämme für Transformation von U. fabae.
Stamm Genotyp Referenz
AGL-1 AGL0 (C58 pTiBo542) recA::bla, T-region deleted
Mop(+); RifR, CbR Lazo et al. 1991
GV3103 C58-C1 pTiC58; GmR Holsters et al. 1980
LBA1100 C58-C1 with a disarmed octopine-type pTiB6
plasmid; SpR Beijersbergen et al. 1992
2.2.2 Verwendete Kulturmedien
Im Folgenden wird Zusammensetzungen der Flüssigmedien für Bakterienkulturen angegeben. Wenn nicht anders angegeben wurden für Kulturplatten Flüssigmedien mit 1,5% (w/v) Agar angesetzt.
2.2.2.1 Für E. coli
LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) (Sambrook und Russell, 2001) Bacto Trypton 1,0 % (w/v)
Hefeextrakt 0,5 % (w/v)
NaCl 171,1 mM
Der pH wurde mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt.
Zur Herstellung von Selektivmedien wurden nach dem Autoklavieren zusätzlich folgende Antibiotika zugegeben:
Ampicillin 100 µg/ml Kanamycin 50 µg/ml
2.2.2.2 Für A. tumefaciens LBMC-Medium
Zum LB-Medium wurde zusätzlich zugegeben:
MgSO4 2,5 mM CaCl2 2,5 mM
Antibiotika für die Selektion der entsprechenden Agrobacterium-Stämme:
AGL-1 Rifampicin 10 µg/ml Carbenicillin 75 µg/ml LBA1100 Spectinomycin 100 µg/ml GV3103 Gentamycin 25 µg/ml
Für die Vermehrung von Agrobakterien welche die Plasmide für die Transformation tragen wurde zusätzlich Kanamycin (25 µg/ml) zugegeben.
Induktionsmedium (AS-Medium)
MgCl2 10 mM
MES/KOH pH5,6 10 mM Acetosyringon 200 µM
2.2.3 Pilz- und Pflanzenmaterial
2.2.3.1 Pilzmaterial
Für alle Experimente wurde der Ackerbohnenrost, Uromyces fabae (PERS.) SCHROETER (Rasse I2) verwendet.
2.2.3.2 Keimung von U. fabae Uredosporen auf künstlichen Oberflächen
Wenn nicht anders angegeben wurden die Uredosporen für in vitro Untersuchungen in 0,01
% Tween20 für 2 h unter starkem Rühren hydriert. Nach der Vakuum-Filtration wurden die trockenen Sporen vorsichtig in einem entsprechenden Flüssigkeitsvolumen aufgenommen und mit einer Airbrush-Pistole (HP-200, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) auf in Petrischalen eingebettete Objektträger (1976 mm2) mit oder ohne PE Membran gesprüht.
Die luftdichten, feuchten Petrischalen (Ø 9 cm) wurden für 16-22 h bei 24°C im Dunkeln inkubiert. Zur Differenzierung der Infektionsstrukturen wurden die PE-Folien zusätzlich mittels einer Stahlbürste angeraut.
2.2.3.3 Bestimmung der Uredosporen-Anzahl
Bei der Vorbereitung von Sporen für Transformationsansätze wurden mehrere Präparations- schritte von Hydrierung über Filtration, gefolgt vom Beschuss während der Biolistik und schließlich dem Aufsprühen notwendig. Dabei entstanden jeweils Verluste an Sporenmaterial. Um die genaue Sporenzahl bei jeden Schritt zu bestimmen wurden diese vor dem Aufsprühen in einer Neubauer Zählkammer (BRAND GmbH + Co KG, Wertheim) bzw.
nach Aufsprühen auf dem Objektträger bestimmt. Die Sporenzahlen für jeden Schritt sind in Tabelle 2.4 dargestellt.
Tabelle 2.4: Schrittweise Auszählung von Uredosporen nach einzelnen Behandlungsschritten. 350 mg Sporen wurden hydriert und filtriert. Pro Beschuss und Objektträger (Pflanzenblatt) wurden 23,3 mg verwendet. Anzahl der Sporen I: nach Hydrierung; II: nach Filtration; III: nach Biolistik; IV: nach Aufsprühen auf Objektträger (1976 mm2).
Sporenmenge I II III IV
350 mg 1,1 x 108 4,6 x 107 -- --
23,3 mg -- -- 2,67 x 106 4,4 x 105
1 g 3,1 x 108 1,3 x 108 1,1 x 108 1,9 x 107
2.2.3.4 Pflanzenmaterial
Saatgut von Vicia faba 'Witkiem Manita' wurde von agri-Saaten GmbH, Bad Essen bezogen.
Die Aussaat der Ackerbohnen erfolgte in gedämpftem Substrat (Einheitserde Typ T, Gebrüder Patzer GmbH & Co. KG, Buchenberg) und anschließender Anzucht für 21 Tage bei 21°C, 90% rel. Luftfeuchtigkeit und Tag-/Nacht-Periode von 16/8 h in einer Phytokammer (Heraeus Vötsch Typ VVZPHQ 200/S).
2.2.3.5 Kultivierung und Inokulation von V. faba
Für die Inokulation mit U. fabae Uredosporen wurden für alle Versuche drei Wochen alte Ackerbohnenpflanzen verwendet. Bei größeren Sporenmengen und für eine Vermehrung in größerem Maßstab wurden Uredosporen (350 mg/100 ml) in 0,01% Tween20 für 2 Stunden unter ständigem Rühren hydriert. Nach Filtration wurde eine Suspension mit einer Sporendichte von 155 mg/ml in 0,01% Tween20 angesetzt und mittels der Airbrush Pistole (HP-200, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) auf die Pflanzen gesprüht. Für eine optimale
Sporenkeimung wurden so behandelte Pflanzen für 24 h bei hoher Luftfeuchtigkeit und 21°C inkubiert. Anschließend wurden die mit U. fabae infizierte Pflanzen im Gewächshaus bei fol- genden Bedingungen kultiviert: Heiztemperatur Tag 20°C / Nacht 16°C, Lüftung Tag 25°C / Nacht 22°C, Zusatzbeleuchtung 18-22 Uhr. Die Ernte der Uredosporen erfolgte nach 10 bis 15 Tagen durch Schütteln der infizierten Pflanzen. Die Lagerung der Sporen erfolgte bei -70
°C.
2.3 Verwendete Plasmide
Alle für die Transformation von U. fabae verwendeten Plasmide sind in Tab. 2.5 angegeben.
Tabelle 2.5: Plasmide und ihre Verwendung bei Transformation von U. fabae.
Bezeichnung Gen Selektion Verwendung Referenz
pBluescript II KS – AmpR Vektor Short et al., 1988
pBIN20 – KanR Vektor Hennegan und Danna, 1998
pPgpd-DsRed DsRed AmpR DsRed-Marker Mikkelsen et al. 2003
pSW3386 mut-TBB1
(TBB1-E198A) AmpR Biolistik Stefan Wirsel
pSW3534 GFP AmpR Biolistik Stefan Wirsel
pRV101 (4) mut-TBB1
(TBB1-E198A) KanR ATMT Heike Lenz
pRV102 GFP KanR ATMT Ralf Vögele
pRV103 GUS AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV111 mut-SucDH1
(SucDH1-H254Y) AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV112 mut-SucDH1
(SucDH1-H254Y) KanR ATMT Ralf Vögele
pRV113 mut-SucDH1
(SucDH1-H254L) AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV114 mut-SucDH1
(SucDH1-H254L) KanR ATMT Ralf Vögele
pRV115 DsRed AmpR Biolistik Heike Lenz
pRV115-NLS DsRed-NLS AmpR Biolistik Diese Arbeit
pRV116 DsRed KanR ATMT Heike Lenz
pRV116-NLS DsRed-NLS KanR ATMT Diese Arbeit
pRV117 iGFP AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV111-DsRed SucDH1-H254Y-
DsRed AmpR Biolistik Heike Lenz
pRV112::DsRed SucDH1-H254Y-
DsRed KanR ATMT Heike Lenz
2.3.1 Konstruktion der Plasmide für Biolistik
Für die Konstruktion der Plasmide für die biolistische Transformation wurde der pBluescript II KS-Vektor (X52327) verwendet (Größe 2961 bp, Short et al., 1988).
Für die Kontrolle der Expression der verwendeten Markergene wurden endogene regulatorische Elemente, die Promoter (p)- und Terminator (t)-Sequenzen der U. fabae Plasmamembran-ATPase (Uf-PMA1), verwendet, welche in allen von Uredosporen ausgehenden Infektionsstrukturen konstitutiv exprimiert wird (Struck et al., 1998).
Farbmarker
Insgesamt vier verschiedene Farbmarker, GUS, eGFP, iGFP und DsRed wurden in den pBluescript II KS Vektor eingefügt. Das erste Konstrukt wurde mit einheitlichen Restriktionsschnittstellen versehen, die ein späteres Austauschen der einzelnen Markergen- kassetten erleichterten. So wurden bei tPMA1 Schnittstellen für NotI (5‘) und SacI (3‘) eingeführt, bei pPMA1 XmaI (5‘) und NcoI (3‘). Der Farbmarker eGFP (aus dem Plasmid pEFGF-N1, Clontech, Mountain View, CA) wurde in das oben beschriebenen Konstrukt zum Plasmid pSW3534 ligiert. Für alle anderen Farbmarker wurde von Plasmid pSW3534 ausgehend durch den Austausch der Markergene über die einheitlichen Schnittstellen gearbeitet und somit die Plasmide pRV103 (GUS), pRV115 (DsRed) und pRV117 (iGFP) konstruiert. Ein Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal, NLS) basierend auf dem SV40 Large T-antigen NLS (PKKKKRKV), (Kalderon et al., 1984) wurde mit den Oligonukleotiden NLS-Rev und NLS-Fwd (Tab. 2.7) amplifiziert. Nach der Dephosphorylierung wurde die NLS-Sequenz in das mit dem Enzym NcoI linearisiete pRV115 Plasmid ligiert. Das entstandene Plasmid wurde mit pRV115-NLS bezeichnet.
Fungizidmarker
Die bereits modifizierte Uf-SucDH1 mit jeweils einer Punktmutation in SucDH1-H254Y (pRV111) und SucDH1-H254L (pRV113), wurde für die Selektion mit dem Fungizid Carboxin verwendet. Für die Selektion mit Benomyl wurden Plasmide mit dem modifizierten Tubulin Gen (TBB1-E198A) verwendet (pSW3386, Wirsel et al. 2004).
2.3.2 Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation
Als Ausgangsvektor für die ATMT-Plasmidkonstrukte wurde der binäre Vektor pBIN20 (Hennegan und Danna 1998) verwendet (Größe 12040 bp). Analog zu Plasmidkonstruktion für die Biolistik wurden die Markergene durch Austausch über einheitliche Restriktionsschnittstellen zwischen Left- und Right-Border von pBIN20 eingefügt.
2.4 Transformationsmethoden
2.4.1 Biolistik
Für die Transformation von U. fabae mittels Biolistik wurde die PDS-1000/He Particle Delivery System (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) verwendet.
Hydrierte Uredosporen (350 mg, 4,6 x 107) wurden in 2,25 ml 0,01% Tween20 resuspendiert und 150 µl der Sporensuspension in der Mitte einer Petrischale (Ø 9 cm) pipettiert. Die Plasmid DNA, linearisiert oder zirkulär, wurde wie folgt mit Goldpartikeln gekoppelt (Microcarrier) und auf Macrocarrier gegeben: 0,06 g Gold (1 µM Durchmesser) wurden nach Hersteller Anleitung gewaschen und in 1 ml sterilem 50 % Glycerin resuspendiert. Nach gründlichen Vortexen wurden 50 µl der Goldsuspension unter weiterem kontinuierlichen Vortexen mit 5 µl Plasmid-DNA (1 µg/ml), 50 µl 2,5 M CaCl2 und 20 µl 0,1 M Spermidin gemischt. Die Ansätze wurden kurz zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit 140 µl 70 % Ethanol gewaschen. Dieser Waschschritt wurde mit 100 % Ethanol wiederholt, das Pellet in 50 µl 100 % Ethanol resuspendiert und 8 µl Aliquots auf die Macrocarrier pipettiert. Der Beschuss erfolgte unter den in Tabelle 2.6 angegebenen Parametern.
Tabelle 2.6: Parameter für biolistische Transformation von U. fabae. Optimale Parameter sind hervorgehoben.
Parameter Variation
Microcarrier (Typ und Durchmesser) [µm] Gold, 1
Wolfram 0,4 / 0,7
Heliumdruck [bar] 62, 93, 107, 138, 152
Target-Distanz [cm] 3, 6, 9, 12
Vakuum in der Kammer [bar] 0,153
Für die Veranschaulichung des Bombardierungsprozesses dient Abbildung 2.1.
Abbildung 2.1: Bombardierungs-Prozess mit PDS-1000/He Particle Delivery System. Distanz von Rupture Disk zu Macrocarrier (A, konstant), Macrocarrier-Distanz zum Stopping Screen (B, konstant), Distanz zwischen Stopping Screen und Target Cells (Uredosporen), (C, veränderbar). (Verändert nach Manual Bulletin, Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland)
Nach dem Beschuss wurde die Sporensuspension (3 x 106 Uredosporen) mit 300 µl 0,01% Tween20 von der Petrischale gewaschen und zum Aufsprühen auf die Pflanzen oder für in vitro Versuche verwendet.
2.4.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT)
Transformierte Agrobakterien wurden von Kulturplatten in Flüssigkultur umgesetzt. Dazu wurde eine Kolonie in 10 ml LBMC Medium überführt und für 24 h bei 28°C und 250 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch eine Zentrifugation (15 min, 4000 rpm, RT) pelletiert und das Pellet in 5 bis 10 ml Induktionsmedium (AS-Medium) schonend resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in sterile 50-100 ml Kolben überführt und für 6 Stunden bei 28 °C und 200 rpm inkubiert. Durch eine OD600-Messung wurde die Bakterienzahl bestimmt und die Zellen mit den hydrierten Uredosporen in gegebenem Verhältnis (1 : 38,5; 1 : 100 oder 1 : 200 Uredosporen : Agrobakterien) gemischt. Die Uredosporen-Agrobakterien-Suspension wurde anschließend wie beschrieben (2.2.3.2 und 2.4.3.) auf Objektträger oder Pflanzen wie beschrieben aufgesprüht.
Pflanze 1 Pflanze 2 Pflanze 3
Keine Selektion 1. Fungizid-Selektion 2. Fungizid-Selektion 2.4.3 Ausbringung von Sporen in planta und Selektionsschema
Das Aufsprühen der Sporensuspension auf V. faba Blätter nach der biolistischen Transformation, richtete sich nach der Sporendichte die für in vitro Screens benutzt wurde (3 x 106 Sporen pro Objektträger). Nach 10 bis 15 Tagen (s. 2.2.2.5) wurden die Uredosporen durch Schütteln der Pflanzenblätter geerntet, wobei Wildtyp- und potentiell transformierten Sporen nicht getrennt wurden (Abb. 2.2). Für eine Selektion in einem weiteren Schritt wurden die zu inokulierenden Ackerbohnenblätter mit Fungizid besprüht und zum Abtrocknen stehen gelassen. Für eine Selektion mit Carboxin wurden 400 µl (50 µg/ml) und für Benomyl 400 µl (10 mg/ml) des Fungizids pro Blatt aufgesprüht.
Die vorhydrierten Sporen wurden wie beschreiben auf die mit Fungizid vorbehandelten Blätter gesprüht. Zur Ausbringung von einzelnen Rostpusteln (Pflanze 2) für eine weitere Selektion (Pflanze 3) wurden die Sporen trocken auf mit Fungizid vorbehandelte Blätter gegeben und mit einer Pipettenspitze oder einem Laborlöffel auf dem Blatt verteilt.
Abbildung 2.2: Selektionsschema in planta. Ausführliche Erklärung siehe Abb. 3.10.
2.5 Molekularbiologische Methoden
2.5.1 DNA-Präparation
2.5.1.1 Aus Pflanzenmaterial
Die DNA Isolation aus gesundem oder mit U. fabae infiziertem Blattmaterial wurde mittels Chelex-Methode durchgeführt. Dafür wurde das Pflanzenmaterial in flüssigem N2 10 min gemörsert und anschließend mit 500 µl 10 % Chelex100 (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) versetzt. Die Proben wurden für 60 min bei 65°C inkubiert und anschließend für 5 min auf 95°C erhitzt. Nach einer Zentrifugation bei 14 000 rpm (Eppendorf-Tischzentrifuge, Vmax) wurde der Überstand abgenommen und die DNA-Konzentration in BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Die Aufbewahrung der Proben für die weitere Verwendung erfolgte bei 4°C.
2.5.1.2 Aus ungekeimten Sporen
Bei kleineren Sporenmengen wurden die Sporen in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und in einer Kugelmühle homogenisiert. Dafür wurden je 2 Keramikkugeln (5 mm Durchmesser) pro Reaktionsgefäß verwendet und die Proben für 3 bis 4 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Kugelmühle (Retch MM, 1/30 S) geschüttelt. Der Homogenisierungsgrad bzw. das Aufbrechen der Sporen wurde mikroskopisch überprüft. Die DNA-Präparation aus aufgebrochenen Sporen wurde mit dem InnuPREP Plant DNA Kit (Analytik Jena) nach dem Standardprotokoll durchgeführt. Die Proben wurden nach der Elution der DNA in einer SpeedVac eingeengt und eine DNA-Konzentrationsmessung durchgeführt.
2.5.1.3 Aus gekeimten Sporen
Bei größeren Sporenmengen (> 100 mg) wurde die Präparation genomischer DNA nach der von Hahn und Mendgen etablierten Methode (1997) durchgeführt.
Nach Hydrierung für mehrere Stunden unter starkem Rühren wurden gekeimte Sporen für 10 min in flüssigem Stickstoff im gekühlten Mörser zu einem feinen Pulver zerrieben und in SS34 Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zugabe von 5 ml TES (100 mM Tris-HCl, 10
