Neurochemistry International
Vol.2, pp.243-250.P e r g a m o n Press Ltd. 1980. P r i n t e d in Great Britain.
P H Y S I C A L F A C T O R S D E T E R M I N I N G G A T E D F L U X F R O M O R I N T O S E A L E D M E M B R A N E F R A G M E N T S
J. B e r n h a r d t and E . N e u m a n n
M a x - P l a n c k - I n s t i t u t f ~ r B i o c h e m i e , D - 8 0 3 3 M a r t i n s - r i e d b e i M 0 n c h e n , F R G
I N T R O D U C T I O N
T r a n s p o r t o f m e t a l i o n s a c r o s s b i o l o g i c a l m e m b r a n e s i s f r e q u e n t l y m e d i a t e d b y g a t i n g p r o t e i n s w h i c h o p e n a n d c l o s e m e m b r a n e c h a n n e l s . T h e g a t i n g m e c h a n i s m o f t e n i n v o l v e s t h e b i n d i n g o f a c t i v a t o r m o l e - c u l e s . A w e l l - s t u d i e d e x a m p l e o f s u o h a n i o n f l u x c o n t r o l s y s t e m is t h e a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r o f e l e c t r i c f i s h e l e c t r o p l a x a n d o f s k e l e t a l m u s c l e s .
U n e q u i v o c a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e g a t i n g m e c h a n i s m c o n t r o l l i n g c h a n n e l o p e n i n g a n d c l o s i n g c a n b e o b t a i n e d f r o m a s t u d y o f t h e t r a n s m e m b r a n e f l o w o f i o n s ( N e u m a n n a n d B e r n h a r d t , 1 9 7 7 ) . T r a n s p o r t o f i o n s c a n b e i n d i c a t e d e l e c t r i c a l l y ( e . g . , c o n d u c t a n c e m e a s u r e m e n t ) , o r c h e m i c a l l y , b y d i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f i o n c o n c e n t r a t i o n s . V e r y p r o m i s i n g a r e e l e c t r i c a l m e a s u r e m e n t s w i t h p l a n a r b i l a y e r s i n t o w h i c h i s o l a t e d g a t i n g p r o t e i n s h a v e b e e n i n c o r p o r a t e d ( S c h i n d l e r a n d Q u a s t , 1 9 8 0 ; N e l s o n e t a l . 1 9 8 0 ) .
I n t h e p a s t t h e t r a c e r i o n f l u x t e c h n i q u e h a s b e e n u s e d e x t e n s i v e l y a s a q u a l i t a t i v e i n d i c a t o r f o r g a t i n g p r o c e s s e s . T r a c e r i o n f l u x e s f r o m o r i n t o s e a l e d m e m b r a n e f r a g m e n t s , v e s i c l e s o r e n t i r e c e l l s m a y b e m e a s u r e d . I n t h e c a s e o f t h e a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r g a t i n g
s y s t e m , s e a l e d m e m b r a n e f r a g m e n t s ( m i c r o s a c s ) r i c h i n r e c e p t o r s c a n b e p r e p a r e d f r o m t h e h o m o g e n a t e o f n a t i v e t i s s u e ( K a s a i a n d
C h a n g e u x , 1 9 7 1 ) ; f l u x p r o p e r t i e s c a n a l s o b e s t u d i e d w i t h l i p i d v e s i c l e s in w h i c h i s o l a t e d r e c e p t o r s a r e r e c o n s t i t u t e d . T h e p r i m e m e a n s o f i n v e s t i g a t i n g g a t i n g p r o c e s s e s i s t h e n t h e d e p e n d e n c e o f t h e f l u x r a t e u p o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a c t i v a t o r m o l e c u l e s w h i c h a c t i v a t e o r i n a c t i v a t e t h e g a t i n g s y s t e m .
I n a p o i n e e r i n g s t u d y K a s a i a n d C h a n g e u x ( 1 9 7 0 ) s h o w e d t h a t , f o r m i c r o s a c s f r o m E l e c t r o p h o r u s e l e c t r i c u s , a p h e n o m e n o l o g i c a l f l u x p a r a m e t e r b a s e d o n t h e h a l f - t i m e f o r t r a c e r i o n e f f l u x e x h i b i t s a l i g a n d c o n c e n - t r a t i o n d e p e n d e n c e w h i c h p a r a l l e l s i n v i v o d o s e - r e s p o n s e m e a s u r e m e n t s o f t h e e l e c t r o p l a x . S i n c e t h e n t h e r e h a v e b e e n c o n s i d e r a b l e a d v a n c e s i n b o t h e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e a n d t h e o r e t i c a l a n a l y s i s o f f l u x d a t a ( H e s s e t a l . 1 9 7 5 , 1 9 7 8 ; P o p o t e t a l . 1 9 7 6 ; B e r n h a r d t a n d N e u m a n n ,
243
244 J. B e r n h a r d t a n d E. N e u m a n n
1 9 7 8 , 1 9 8 0 ; M o o r e e t a l . 1 9 7 9 ) . M o s t p r o m i s i n g a p p e a r s t h e r e c e n t d e v e l o p m e n t o f r a p i d q u e n c h - f l o w m e t h o d s f o r f l u x m e a s u r e m e n t i n t h e m s t i m e r a n g e ( H e s s e t a l . 1 9 7 9 ; A o s h i m a e t a l . , 1 9 8 0 ; N e u b i g a n d C o h e n , 1 9 8 0 ) .
T h e o r e t i c a l l y , t h e i n t r o d u c t i o n o f i n t e g r a t e d f l u x r a t e c o e f f i c i e n t s ( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 7 8 ) i n t o t h e a n a l y s i s o f f l u x m e a s u r e m e n t s p r o v i d e s a r i g o r o u s t o o l f o r t h e s t u d y o f g a t i n g m e c h a n i s m s . T h e r e c e n t a p p l i c a t i o n o f t h i s m e t h o d t o t h e a c e t y l c h o l i n e s y s t e m h a s r e v e a l e d t h a t t h e r e c e p t o r i n i s o l a t e d m e m b r a n e f r a g m e n t s o f T o r p e d o m a r m o r a t a a p r i o r i e x i s t s i n t w o c o n f o r m a t i o n s : a n a c t i v a t a b l e
s t r u c t u r e l e a d i n g t o i o n f l o w u p o n a c t i v a t o r b i n d i n g a n d a n i n - a c t i v a t e d , d e s e n s i t i z e d c o n f o r m a t i o n . T h e f u n c t i o n a l l y r e l e v a n t , i o n - c o n d u c t i n g s t r u c t u r e i s a t r a n s i e n t , m e t a s t a b l e s t a t e ; in t h e p r e s e n c e o f a c t i v a t o r t h e i n a c t i v a t e d s t r u c t u r e i s t h e m o s t s t a b l e s t a t e . T h e f o r w a r d r a t e c o n s t a n t f o r i n a c t i v a t i o n i s m u c h l a r g e r t h a n t h e b a c k w a r d r a t e c o n s t a n t . I n a c t i v a t i o n o c c u r s v i a t h e
t r a n s i e n t , s h o r t - l i v e d c o n d u c t i n g c o n f o r m a t i o n b u t a l s o ( t o a b o u t 2 0 % ) v i a d i r e c t b i n d i n g o f a c t i v a t o r m o l e c u l e s t o t h e i n a c t i v a t e d s t r u c t u r e
( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 7 8 ; s e e a l s o N e u m a n n , 1 9 7 9 ) .
T H E O V E R A L L F L U X
A d e t a i l e d d e r i v a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n f o r t h e t o t a l a m o u n t o f t r a c e r i o n s , X ( t ) , h a v i n g f l o w n i n t o o r f r o m a s e t o f m i c r o s a c s a s a f u n c t i o n o f t i m e , t, h a s b e e n p r e s e n t e d e l s e w h e r e ( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 7 8 , 1 9 8 0 ) . S t a r t i n g f r o m t h e k i n e t i c e q u a t i o n f o r s i n g l e m i c r o s a c f l u x i t c a n b e s h o w n t h a t f l u x g a t i n g p r o c e s s e s o c c u r i n g o n t h e s a m e t i m e s c a l e a s t h e f l u x i t s e l f , r e q u i r e i n t r o d u c t i o n o f a n i n t e g r a t e d a m p l i t u d e f a c t o r
t
K t) = k f ~ ( T ) d T (i)
o
w h e r e k i s t h e i n t r i n s l c r a t e c o n s t a n t f o r i o n t r a n s p o r t t h r o u g h a s i n g l e c h a n n e l , a n d ~ ( t ) i s t h e ( t i m e - d e p e n d e n t ) f r a c t i o n o f c h a n n e l s o n a m i c r o s a c t h a t a r e o p e n a t t i m e t. T h e a m o u n t o f t r a c e r i o n s x. (t) , w i t h i n t h e i - t h m i c r o s a c i n a t r a c e r e f f l u x e x p e r i m e n t i s g l v e n 1 b y
x. (t) : x. (0) . e x p [ - n i < ( t ) ] (2)
l 1
w h e r e n. i s t h e t o t a l n u m b e r o f c h a n n e l s o n t h e ' i - t h m i c r o s a c , a n d x (0) i ~ t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f i n t e r n a l t r a c e r i o n s . T h e t ~ t a l n u m b e r o f t r a c e r i o n s , i n a c o l l e c t i o n o f m i c r o s a c s i s t h e n
X ( t ) = Z x (t) (3)
i 1
F o r p r a c t i c a l r e a s o n s i t i s d i f f i c u l t t o p r e p a r e a p e r f e c t l y h o m o - g e n e o u s p o p u l a t i o n o f m i c r o s a c s . O n e o b t a i n s i n s t e a d , a m i x t u r e o f v e s i c l e s , d i f f e r i n g i n s i z e a n d t h u s i n t o t a l n u m b e r o f a c t i v a t a b l e
245 c h a n n e l s . I n t r o d u c i n g t h e p r o b a b i l i t y P , t h a t a g i v e n m i c r o s a c h a s a t o t a l o f n a c t i v a t a b l e c h a n n e l s , o n e c a n r e w r i t e n t h e s u m m a t i o n i n E q . ( 3 ) :
n = n
X ( t ) = V x ( 0 ) ~ m a x p e x p [ - n K (t)] (4)
n = o n
w h e r e 9 i s t h e t o t a l n u m b e r o f m i c r o s a c s , a n d x ( 0 ) i s t h e a v e r a g e i n i t i a l t r a c e r c o n t e n t o f a m i c r o s a c . ~ M O 4 e l l i n g ~ b y a n o r m a l d i s t r i b u t i o n , i . e . P = P ( n ) d n = ( 2 ~ u z ) - I / Z e x p ~ - ~ n - n ) 2 / ( 2 ~ O 2 ) ~ d n ,
n .
a n d s u b s t i t u t i n g l n t e g r a t l o n o v e r n f o r t h e s u m m a t i o n , o n e o b t a i n s f o r e f f l u x :
2
X ( t ) = ~ x ( 0 ) e x p { - n < ( t ) [ 1 -O--- ~ ( t ) ] } (5)
2 ~
A n a n a l o g o u s d e r i v a t i o n y i e l d s t h e c o r r e s p o n d i n g e q u a t i o n f o r o v e r a l l i n f l u x :
~ ( t ) = v ~ ( 0 )
2
1 - e x p { n K ( t ) [ I - U__..__
<(t)'] } ).
2 n
(6)
E X P E R I M E N T A L D E T E R M I N A T I O N O F F L U X P A R A M E T E R S
T h e f u n d a m e n t a l E q s . (5) a n d (6) c a n b e r e c a s t t o i l l u s t r a t e t h e c o n n e c t i o n w i t h m e a s u r a b l e q u a n t i t i e s . F o r e f f l u ~ o n e o b t a i n s :
2
X ( t ) = D V C ~ e x p { - n K ( t ) ![ i - O___ K ( t ) I } (7)
o 2~
w h e r e
D = d e n s i t y o f t h e s u s p e n s i o n ( m i c r o s a c s / u n i t v o l u m e ) V = v o l u m e o f s u s p e n s i o n
C = i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f t r a c e r i o n s o
= a v e r a g e v o l u m e o f a m i c r o s a c
= m e a n t o t a l n u m b e r o f c h a n n e l s p e r m i c r o s a c 02 = v a r i a n c e i n n u m b e r o f c h a n n e l s p e r m i c r o s a c
T h e i n f o r m a t i o n o n t h e m e c h a n i s m o f t h e g a t i n g p r o c e s s i s c o n t a i n e d i n K (t) , g i v e n b y E q . (i) . A s r e c e n t l y s h o w n ( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 7 8 ) f o r l i g a n d - i n d u c e d i n a c t i v a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e
r e c e p t o r s , t h e t i m e - d e p e n d e n t f r a c t i o n o f o p e n c h a n n e l s ~ ( t ) , c a n b e d e t e r m i n e d f r o m t h e t i m e c o u r s e o f t h e f l u x d a t a .
A s i d e f r o m < ( t ) , a l l v a r i a b l e s i n e q u a t i o n (7) a r e f u n c t i o n s o f t h e m a t e r i a l s u s e d , a n d t h e m e t h o d o f p r e p a r a t i o n . I t i s n o t n e c e s s a r y
246 J. B e r n h a r d t and E. N e u m a n n
t o d e t e r m i n e t h e p r e - e x p o n e n t i a l f a c t o r s ; t h i s p r o d u c t i s g i v e n b y X ( 0 ) = D V C v. I t i s n o w c o n v e n i e n t t o e x p r e s s t h e m e a s u r e d f l u x d a t a a t a g i v e n t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f t h e a c t i v a t o r l i g a n d , A, i n t e r m s o f a d i m e n s i o n l e s s q u a n t i t y P ( t ) . F o r i n s t a n c e , i n a n e f f l u x e x p e r i m e n t ,
P ( t ) : X ( O ) X ( t ) (8)
~:(o) ~(~, s)
w h e r e X ( ~ , s ) i s t h e m i n i m u m a m o u n t o f t r a c e r i o n s w i t h i n t h e v e s i c l e s a t t ÷ ~ u n d e r s a t u r a t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t h e a c t i v a t o r :
[A] >>[RT') . F o r e f f l u x i n t o a l a r g e v o l u m e o f s o l u t i o n , a t t + c~,, u s u a l l y X ( ~ , s ) = X ( ~ ) < < X ( 0 ) . I f n o w d u r i n g t h e t i m e o f t h e f l u x m e a s u r e m e n t s , c h a n n e l s i n a c t i v a t e ( d e s e n s i t i z e ) , t h e n X ( t )
a p p r o a c h e s a c o n s t a n t l e v e l X ( ~ ) ! X ( ~ , s ) c o r r e s p o n d i n g t o
< ( ~ ) ~ < ( ~ , s ) ; t h e v a l u e o f X ( ~ ) a n d t h u s K ( ~ ) d e p e n d s o n t h e a c t i v a t o r c o n c e n t r a t i o n . F o r t ÷ ~ , c h a n n e l i n a c t i v a t i o n t h e r e f o r e l e a d s t o p a r a l l e l e f f l u x ( o r i n f l u x ) c u r v e s w h i c h a r e a c c e s s i b l e t o a p a r t i c u l a r l y s i m p l e f l u x a m p l i t u d e a n a l y s i s ( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 7 8 ) . N o t e t h a t w i t h E q . (5) , X ( 0 ) = D V C ~ : \Ix(0) , t h e f r a c t i o n P ( t ) i s i n d e p e n d e n t o f X ( 0 ) a n d t h a t 0 5 ° P ( t ) ~ i.
T h e p a r a m e t e r s n a n d d 2 c a n b e d e t e r m i n e d u s i n g a t e c h n i q u e f i r s t e m p l o y e d b y M o o r e e t a l . ( 1 9 7 9 ) . T h r o u g h c o n t r o l l e d a d d i t i o n o f a n i r r e v e r s i b l y a c t i n g i n h i b i t o r o f t h e g a t i n g s y s t e m , o n e c a n s u c c e s s - i v e l y r e d u c e t h e n u m b e r o f c h a n n e l s c o n t r i b u t i n g t o f l u x . H o w e v e r , a s s h o w n r e c e n t l y ( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 8 0 ) , a b r o a d d i s t r i - b u t i o n o f f r a c t i o n a l l y i n h i b i t e d m i c r o s a c s r e s u l t s . T h e p r o b a b i l i t y U In) t h a t t h e i - t h m i c r o s a c h a s m o f i t s n t o t a l c h a n n e l s i n h i - b i t e d i s g i v e n b y :
(n) ~ m n - m
P m : ( ) ( I - ~ ) (9)
N o t e t h a t n o w ~ = Z m / ~ n i s t h e f r a c t i o n o f a l l i r r e v e r s i b l y i n h i b - i t e d c h a n n e l s o n a l l t ~ e m i c r o s a c s o f t h e s u s p e n s i o n : i . e . , m o l e s o f i n h i b i t o r a d d e d d e v i d e d b y m o l e s o f c h a n n e l s ; (~) : n ! / r n ! ( n - m ) !]
i s t h e b i n o m i a l c o e f f i c i e n t .
F o r e f f l u x d a t a , t h e d e p e n d e n c e o f X ( t ) o n d i s g i v e n b y : n (n) - m < (t)
X(O~,t) = x ( O ) f P ( n ) ~ !4 e
m = o m d n (i0)
= x(0) 1 [ ~ - ( ° ~ / 2 ) l n l ]
w h e r e
l ( ~ , t ) = e - < ( t ) + ~ ( 1 - e - < ( t ) )
I n o r d e r t o d e t e r m i n e n a n d 02 i t i s n e c e s s a r y t o m e a s u r e t h e d - d e p e n d e n c e o f t h e r e l a t i v e f l u x a m p l i t u d e
Physical Factors D e t e r m i n i n g Gated Flux 247
~ ( 0 ) - ~ ( ~ , = )
~ ( ~ , = ) =
~ ( 0 ) - ~ ( 0 , ~ , s )
( t l )
d e r i v e d b y a p p l y i n g E q . (I0) t o E q . (8) w i t h X ( d , 0 ) = X ( 0 ) a t t = 0 . M e a s u r e m e n t s a c c o r d i n g t o E q . (11) w e r e i m p l i c i t e l y c a r r i e d o u t b y M o o r e e t a l . ( 1 9 7 9 ) ; t h e i r f i g u r e 3 is e s s e n t i a l l y a p l o t o f P ( ~ , ~ ) v e r s u s ~, w i t h K ( ~ ) = < ( ~ , s ) = k / k d w h e r e k is t h e f l u x r a t e c o n s t a n t
( s e e E q . (i)) a n d k ~ is t h e f o r w a r d r a t e c o n s t a n t f o r t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s ( B e r n h a r d t - a n d N e u m a n n , 1 9 7 8 ) .
1.0 ¸
0.8
n = 5 fl=lO
Pc=-1
06-
0.;~.
fl=l
0.2.
o ~ Q~. d6 o~
Fig. "1
R e d u c t i o n i n t h e f l u x a m p l i t u d e P ( ~ , ~ ) , w i t h i n c r e a s i n g f r a c t i o n 5, o f t o t a l c h a n n e l s i r r e v e r s i b l y b l o c k e d b y i n h i b i t o r( s e e t e x t ) , a c c o r d i n g t o E q . (10) . T h e c a s e s n = I , 5 , I 0 , 2 5 a n d 50, w i t h 0 2 = 0 a n d
< ( ~ , s ) = l , a r e d e p i c t e d .
I n F i g u r e I, t h e d e p e n d e n c e o f P ( ~ , ~ ) o n ~ is s h o w n f o r v a r i o u s v a l u e s o f n w i t h < ( ~ , s ) = l a n d 0 2 = 0 . I t is r e a d i l y s e e n t h a t t h e c u r v e f o r n S l 0 r e p r e s e n t s a g o o d f i t t o t h e f l u x d a t a o f M o o r e e t a l . I t is t h e r e f o r e n o t n e c e s s a r y a d h o c t o i n v o k e e x c e s s o r s p a r e r e - c e p t o r s ( M o o r e e t a l . 1 9 7 9 ; N e u b i g a n d C o h e n , 1 9 8 0 ) in o r d e r t o
248 J. B e r n h a r d t and E. N e u m a n n
u n d e r s t a n d t h e c u r v a t u r e i n P ( d , ~ ) v e r s u s ~ c u r v e s . T h e r e a s o n f o r t h e c u r v a t u r e w h e n n > 1 i s s o l e l y d u e t o t h e p o w e r l a w d e p e n d e n c e o n
i n E q . (i0) . H o w e v e r , a s i n g l e e x p o n e n t i a l ( s e e E q . (5) o f M o o r e e t a l . ) c a n n o t a d e q u a t e l y a p p r o x i m a t e Z h e s u m m a t i o n i m p l i c i t i n E q . (I0) o f t h i s s t u d y ; f o r e x a m p l e , i t w o u l d n o t a c c o u n t f o r t h e f r a c t i o n ~ ( n ) = ~ [ ~ - ( O 2 / 2 ) I n ~ ] o f m i c r o s a c s w i t h a l l c h a n n e l s i n - h i b i t e d w h i c h D n o l o n g e r c o n t r i b u t e t o f l u x ( B e r n h a r d t a n d N e u m a n n , 1 9 8 0 ) .
D e t e r m i n a t i o n o f n a n d 02 r e q u i r e s f i t t i n g o f P ( ~ , ~ ) v e r s u s ~ d a t a a c c o r d i n g t o E q . (i0) . D e v i a t i o n s f r o m c 2 = 0 c a n b e u s e d t o d e t e r m i n e 02 f r o m t h e d - d e p e n d e n c e o f t h e t e r m ( U 2 / 2 ) i n ~ ( ~ , ~ ) in E q . (I0) ; B e r n h a r d t , M o s s , a n d N e u m a n n , i n p r e p .
T H E I N T R I N S I C F L U X R A T E C O N S T A N T
T h e t r a c e r i o n s m a y t r a n s i e n t l y b i n d t o s i t e s w i t h i n t h e c h a n n e l . T h e f l u x p r o c e s s c a n t h e n b e r e p r e s e n t e d b y t h e r e a c t i o n s c h e m e ( o f m i n i m u m c o m p l e x i t y ) :
k b k t k b
N + R ~___T N R _ " N R ~ " N + R (12)
k k k
- b - t - b
w h e r e R d e n o t e s t h e u n o c c u p i e d c h a n n e l s i t e , N d e n o t e s t r a c e r i o n s i n s i d e t h e m i c r o s a c , N R d e n o t e s t r a c e r i o n s b o u n d t o i n t e r n a l c h a n n e l s i t e s , a n d t h e s t a r r e d q u a n t i t i e s a r e t h e c o r r e s p o n d i n g s ~ e c i e s ~ n t h e e x t e r i o r o f t h e m i c r o s a c s . T h e q u a n t i t i e s k , k _ b , k b a n d k _ b a r e , r e s p e c t i v e l y , t h e r a t e c o n s t a n t s f o r i n t e r n a l a n d e x t e r n a l b i n d i n g a n d d i s s o c i a t i o n , a n d k t a n d k _ t a r e t h e r a t e c o n s t a n t s f o r t r a n s p o r t t h r o u g h t h e c h a n n e l . T h e c o r r e s p o n d i n g e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s f o r c h a n n e l i o n - s i t e b i n d i n g a n d f o r t r a n s p o r t a r e d e f i n e d b y K b = k _ b / k b a n d K b = k _ b / k b , a n d K t = k _ t / k t , r e s p e c t i v e l y . A c c o r d i n g t o E q . (12) t h e f l u x k i n e t i c s is g e n e r a l l y c h a r a c t e r i z e d b y t h r e e d i s t i n c t r e a c t i o n m o d e s . D e p e n d i n g o n e x p e r i m e n t a l c o n s t r a i n t s t h e s e m o d e s m a y b e w i d e l y s e p a r a t e d o n t h e t i m e s c a l e . T w o l i m i t i n g c a s e s a r e d i s c u s s e d .
(I) B i n d i n g o f t r a c e r i o n s i s s l o w e r t h a n t r a n s p o r t . I n g e n e r a l t h e r a t e o f b i n d i n g d e p e n d s o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f b o t h t r a c e r i o n s a n d c h a n n e l b i n d i n g s i t e s . T h e e f f e c t i v e t o t a l m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f i n t e r n a l s i t e s i s g i v e n b y [ R T] = n / ( v N A) w h e r e N A is t h e A v o g a d r o n u m b e r . S i n c e t h e t o t a l n u m b e r o f m i c r o s a c s i s g l v e n b ~ g = D - V , s e e E q . (7) , t h e m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f e x t e r n a l s i t e s i s [ R T ] = n g /
[ N A ( I - D v)] . N o t e t h a t i n a g i v e n p r e p a r a t i o n [ R T ] is a l w a y s f i x e d w h i l e [ R T ] d e p e n d s o n t h e v a l u e o f D c h o s e n , a n d i s t h u s a n
e x p e r i m e n t a l v a r i a b l e .
A s s u m i n g s p h e r i c a l s i z e f o r t h e m i c r o s a c s o f a v e r a g e r a d i u s r, o n e o b t a i n s [ R T] = n / [ ( 4 / 3 ) ~ 9 3 , N A I ~ 4 x l 0 - 6 n / r 3 , M, w h e r e ~ i s g i v e n i n
~ m . N o w , r a p i d b i n d i n g e q u i l i b r i a i n v o l v i n ~ a l k a l i m e t a l i o n s a r e u s u a l l y d i f f u s i o n - c o n t r o l l e d ; i . e . k. a n d k, a r e i n t h e o r d e r o f
1 0 1 0 ~ - 1 * - 1 - - D D
M - ~ S a n d K ~ ~ K ~ ~ 10 M. O n e t h e n e s t i m a t e s t h a t
k ~ 1 0 9 s -1 . F o r a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r m i c r o s a c s r i s k - b - b
Physical Factors D e t e r m i n i n g Gated F l u x 249 a b o u t 0 . 1 < r < 1 ~ m , t h e r e f o r e [ R T ] k b < < k _ b m k : b . E x p e r i e n c e w i t h
T o r p e d o m i c r o s a c s i n d i c a t e s t h a t f o r r e l a t i v e l y d e n s e s u s p e n s i o n s , [ R ~ ] < I 0 - 6 M , a n d t h e r e f o r e [ R T ] k b < < k : b ~ k _ b .
F o r i r r e v e r s i b l e t r a n s p o r t a s m o d e l l e d b y s i n g l e m i c r o s a c f l u x i n t o a l a r g e r e s e r v o i r dx. ( t ) / d t = - n . . k : x i ( t ) , E q . (12) r e d u c e s t o
. l ~ < •
N + R . . . - - ~ N R ,~ N * R ~- N * + R , w i t h [ R T ] ~ [R] . W h e n [ R T ] k b < k _ b ~ k _ b a n d [ R T ] k ~ < < k - ~ - b ~ k _ b is v a l i d (as o u t l i n e d a b o v e ) , t h e r e c i p r o c a l r e a c t i o n t l m e s f o r t h e t w o s l o w e s t p r o c e s s e s a r e I/~T4 = R ~ k ~ a n d
+ k * w h e r > > o i ~ • . . u
I / Y 2 = k ~ b / K ~ , e T I T 2 , f r e f f u x ; a n d I / T l = [ R T ] ~ b a n d
- - ; u - u , ~ > .
I/T'2=k b + k , K t, w h e r e T I % 2 ' f o r i n f l u x . T h e i n t r i n s i c f l u x r a t e c o n s t a n t s a p e , f o r e f f l u x :
a n d f o r i n f l u x :
k = k b / ( N A - ~ ) , (13)
k = k b D / [ N A, ( I - D v ) (14)
(II) T r a n s p o r t o f t r a c e r i o n s is f a s t e r t h a n b i n d i n g . R e d u c i n g t h e r e a c t i o n s c h e m e E q . (12) t o t h e f o r m N + R # N R ~ N ~ + R y i e l d s a k i n e t i c e q u a t i o n w h o s e s o l u t i o n is c h a r a c t e r i z e d b y o n e r e a c t i o n t i m e
c o n s t a n t I / T = k t [ R T I / ( K b + [ R _ ] ) f o r e f f l u x , a n d . l < T ~ k _ t [ R T ] / ( K b + [ R T ] ) T" - < K b , a n d [ R T I < K b , o n e o b t a i n s f o r i n f l u x . T h u s , n o t i n g t h a t [ R T J <
f o r e f f l u x :
k = k t / ( N A V K b) , 15)
a n d f o r i n f l u x :
k = k _ t D / [ N A K b ( l - D v ) ] 16)
L i m i t i n g c a s e (I) s h o u l d a p p l y t o s m a l l c a t i o n i c t r a c e r s p e c a s , w h i l e c a s e (II) m a y b e v a l i d f o r l a r g e m o l e c u l e s w i t h l o w t r a n s p o r t r a t e s ( A d a m s e t e l . 1 9 8 0 ; D w y e r e t e l . 1 9 8 0 ) .
O n e i m p o r t a n t m o d i f i c a t i o n in t h e a b o v e t r e a t m e n t is n e c e s s a r y t o a c c o u n t f o r c o m p e t i t i o n w i t h o t h e r p e r m e a n t s p e c i e s . I n o r d e r t o a v o i d c o m p l e x i t i e s d u e t o c o u p l i n g o f t r a c e r i o n f l u x t o n o n - e q u i l i b r i u m f l u x e s o f o t h e r i o n s , i t is a d v i s a b l e t o m a k e t h e i n t e r n a l a n d t h e e x t e r n a l m e d i a o f t h e m i c r o s a c s i d e n t i c a l in t h e c o m p o s i t i o n o f n o n - t r a c e r s p e c i e s ( H e s s e t e l . 1 9 7 5 ) . T r a c e r i o n f l u x w i l l n e v e r t h e l e s s d e p e n d o n t h e e q u i l i b r i u m c o n c e n t r a t i o n o f t h e s e i o n s . T h e f l u x r a t e c o n s t a n t g i v e n b y E q s . ( 1 3 ) - ( 1 6 ) m u s t b e m u l t i p l i e d b y a f a c t o r ~ g i v e n b y
¢ = (i + Z [ ~ ] K $ i)-i (17)
I
w h e r e [ I J is t h e c o n c e n t r a t i o n o f s p e c i e s I, a n d K is t h e e q u i l i - b r i u m c o n s t a n t f o r d i s s o c i a t i o n o f I f r o m t h e c h a n ~ e l . N e g l e c t o f
250 J. B e r n h a r d t a n d E. N e u m a n n
c o m p e t i t i o n o f i o n s I f o r c h a n n e l s i t e s m a y a c c o u n t f o r s o m e o f t h e d i s c r e p a n c i e s f o u n d i n c o m p a r i n g e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l l y m e a s u r e d c h a n n e l c o n d u c t a n c e s t o t r a c e r i o n f l u x r a t e s ( M i l l e r a n d R a c k e r ,
1 9 7 9 ) .
I n s u m m a r y , t h e i n t r o d u c t i o n o f i n t e g r a t e d f l u x r a t e c o e f f i c i e n t s i n t o t h e a n a l y s i s o f f l u x m e a s u r e m e n t h a s p r o v e d t o b e a p o w e r f u l t o o l f o r t h e s t u d y o f a c t i v a t o r - r e c e p t o r m e d i a t e d g a t i n g o f i o n f l o w s . I n p a r t i c u l a r , t h e f a c t t h a t m i c r o s a c s w i t h d i f f e r e n t n u m b e r s o f o p e n c h a n n e l s h a v e d i f f e r e n t f l u x r a t e s r e q u i r e s t h e d e v e l o p m e n t o f a d e t a i l e d f o r m a l i s m i n t e r m s o f t r a n s i e n t t r a c e r i o n b i n d i n g a n d s p e c i f i c g a t i n g p r o c e s s e s . I t t u r n s o u t t h a t t h e d i s - t r i b u t i o n o f m i c r o s a c s a s w e l l a s t h a t o f o p e n c h a n n e l s p e r m i c r o - s a c a r e i m p o r t a n t f a c t o r s i n a r i g o r o u s a n a l y s i s o f f l u x d a t a .
A C K N O W L E D G E M E N T
W e g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e f i n a n c i a l s u p p o r t o f t h e D e u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t , g r a n t N e 2 2 7 .
R E F E R E N C E S
A d a m s , D . J . , D w y e r , T . M . , a n d H i l l e , B. ( 1 9 8 0 ) . J. G e n P h y s i o l . 7 5 , 4 9 3 .
A o s h i m a , H . , C a s h , D . J . , a n d H e s s , G . P . ( 1 9 8 0 ) . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 9 2 , 8 9 6 .
B e r n h a r d t , J . , a n d N e u m a n n , E. ( 1 9 7 8 ) . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 5 , 3 7 5 6 .
B e r n h a r d t , J. a n d N e u m a n n , E. ( 1 9 8 0 ) . J. t h e o r . B i o l . ( i n p r e s s ) . D w y e r , T . M . , A d a m s , D . J . , a n d H i l l e , B. ( 1 9 8 0 ) . J. G e n . P h y s i o l . 7 5 ,
4 6 9 .
H e s s , G . P . , A n d r e w s , J . P . , S t r u v e , G . F . , a n d C o o m b s , S . E . ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 2 , 4 3 7 1 .
H e s s , G . P . , L i p k o w i t z , S . , a n d S t r u v e , G . E . ( 1 9 7 8 ) , P r o c . N a t l . A e a d . S c i . U . S . A . 7 5 , 1 7 0 3 .
H e s s , G . P . , C a s s , D . J . , a n d A o s h i m a , H. ( 1 9 7 9 ) . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 2 , 3 2 9 .
K a s a i , M . , a n d C h a n g e u x , J . - P . ( 1 9 7 1 ) , J. M e m b r . B i o l . 6, I.
M i l l e r , C, a n d R a c k e r , E. ( 1 9 7 9 ~ . T h e R e c e p t o r s ( O ' B r i e n e d . ) V o l . i, C h a p . i, N e w Y o r k , P l e n u m P r e s s .
M o o r e , H . - P . H . , H a r t i g , P . R . , a n d R a f t e r y , M . A . ( 1 9 7 9 ) , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 6 , 6 2 6 5 .
N e l s o n , N . , A n h a l t , R . , L i n d s t r o m , J . , a n d M o n t a l , M. ( 1 9 8 0 ) , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 7 , 3 0 5 7 .
N e u b i g , R . R . , a n d C o h e n , J . B . ( 1 9 8 0 ) , B i o c h e m i s t r y 1 9 , 2 7 7 0 .
N e u m a n n , E. ( 1 9 7 9 ) i n : M o l e c u l a r M e c h a n i s m s o f B i o l o g i c a l R e c o g n i t i o n , e d . M. B a l a b a n , E l s e v i e r , A m s t e r d a m , p. 4 4 9 .
N e u m a n n , E. , a n d B e r n h a r d t , J . ( 1 9 7 7 ) , A n n . R e v . B i o c h e m . 4 6 , i 1 7 P o p o t , J . L . , S u g i y a m a , H. , a n d C h a n g e u x , J . - P . ( 1 9 7 6 ) J. M o l . B i o l .
1 0 6 , 4 6 9 .
S c h i n d l e r , H. , a n d Q u a s t , U. ( 1 9 8 0 ) , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 7 , 3 0 5 2 .
