Détermination de la teneur en ATP des sols
Version 1.2 (2020)
Code B-BM-ATP
Secteurs d’utilisation possibles
Secteur d’utilisation
Conseil de fumure
Grandes cultures et herbage Légumes (en pleine terre et sous serre)
Viticulture, Arboriculture, Culture de baies, Plantes aromatiques et médicinales
Caractérisation du site x
Appréciation des polluants
Analyse de fertilisants
Engrais de recyclage
Compost Digestat solide Digestat liquide Boue d’épuration Engrais de ferme Fumier
lisier Engrais minéraux
Charbon végétal Recherche
Méthodes
correspondantes
Prélèvement de l’échantillon Préparation de l’échantillon extraction
mesure
Domaine de concentration
Résultat
Données en mg d’ATP / g de matière séche (TS). Degré de précision: 3 dédimales.
Remarques sur méthodes équivalentes
Sécurité / environnement
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1. Principe
Extraction de l’adénosine-triphosphate (ATP) du sol frais avec H2S04 0,6 N combinée à un traitement mécanique (bain à ultrasons). Après filtration du sol, le filtrat est neutralisé. Après avoir ajouté un extrait de vers luisants (luciférine/luciférase) dans une aliquote, on mesure la bioluminescence. Par réaction enzymatique, l’ATP contenu dans le filtrat est entièrement utilisé comme source d’énergie.
L’impulsion de photons libérée (relative light units = RLUs) est directement proportionnelle à la quantité d’ATP. La conversion de l’impulsion de photons en ng d’ATP se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage.
Pour calculer les pertes d’ATP (dues en particulier par l’adsorption aux particules du sol), on réalise des déterminations parallèles avec le même sol après adjonction d’une quantité d’ATP connue.
2. Exécution
Appareils et ustensiles:
(A) Photomètre ultrasensible (biocounter) (B) Autoclave
(C) Spectrophotomètre (D) Agitateur rotatif (E) Bain à ultrasons
(F) Instrument de réglage automatique du pH (G) Flacons en polypropylène de 50 ml
(H) Microtubes "Eppendorf" (pp) munis de bouchons (I) Filtres: Schleicher et Schüll 520B 125 mm (J) Filtres stériles 0,45 m
(K) Filtres stériles 0,2 m (L) Flacons de 10 ml et 30 ml
(M) Cuvettes spéciales adaptées au photomètre (Lumacuvette P) (N) Bouteilles en polyéthylène de 250 ml
(O) Billes d’agate 2 cm
(P) Entonnoirs à décantation de 100 ml avec supports appropriés (Q) Filtres à plis: Schleicher et Schüll 512½ Ø 185 mm
(R) Cylindres en plastique, 27 x 50 mm Réactifs:
(1) Eau déminéralisée (H2O, conductibilité < 2S/cm); autoclaver une portion pendant 20 minutes à 121 °C.
(2) Solution d’extraction: 5 l
Transvaser environ 2 l d’eau dans une fiole jaugée de 5 l, ajouter 83,3 ml H2SO4 concentré
4,85 g Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane (= Tris),
33,05 g Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane hydrochloride (= Tris HCl), et remplisser d’eau jusqu'à la marque.
(3) Solution tampon pH 7.4: 1 l
Ajouter de l’eau dans un bécher de 1 l, puis 1,2 g Tris,
6,61 g Tris HCl, 1,2 g EDTA 2 Na, 0,86 g Mg SO4 . 7 H2O.
Contrôler le pH et amener à pH 7,4. Transvaser dans une fiole jaugée de 1 l et ajouter de l’eau jusqu’à la marque. Conserver la solution dans le réfrigérateur 1 semaine au maximum.
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(4) Solutions de neutralisation
a) Ethanolamine d’environ 15 %: 250 ml
Transvaser, dans une fiole de 250 ml, 38 ml d’éthanolamine 99 % et ajouter de l’eau jusqu’à la marque.
b) Ethanolamine d’environ 2 %: 250 ml
Transvaser, dans une fiole de 250 ml, 5 ml d’éthanolamine 99 % et ajouter de l’eau jusqu’à la marque.
(5) Azide de potassium 2 %: 100 ml
Peser, dans une fiole jaugée de 100 ml, 2,02 g NaN3 99 % et ajouter de l’eau jusqu’à la marque.
(6) Résine échangeuse d’ions
Sécher la résine (Dowex 50W x 8; 16 - 40 maille; H.+-form) dans un bécher pendant 3 à 4 jours à 80
°C. Conserver dans un dessicateur.
(7) Solution mère d’ATP 10-3 M, stérile (pour une longue conservation) Préparer 1 l (ou une plus petite quantité):
Dissoudre, dans un bécher, 3,3 g de Tris HCl dans de l’eau et ramener à pH 5,5 avec du tampon Tris pH 7,4 (3). Transvaser dans une fiole jaugée de 1 l et ajouter de l’eau jusqu’à la marque. Autoclaver pendant 15 minutes à 121 °C. Préparer une solution d’ATP 10-3 M avec du tampon Tris pH 5,5.
Déterminer par spectrophotométrie (259 nm) la concentration exacte de la solution d’ATP, la corriger si nécessaire (le coefficient d’extinction ainsi que la concentration effective de l’ATP sont donnés dans la notice d’emballage livrée par le fabricant).
Transvaser la solution mère d’ATP 10-3 M dans des microtubes (H) stériles de 1,1 ml et stocker à - 20
°C.
(8) Solution d’ATP 10-5 M, stérile (pour une courte conservation, jusqu’à 2 mois) Décongeler environ 4 à 5 microtubes d’ATP 10-3 M (7).
Ajouter au moyen d’une pipette 1 ml d’ATP 10-3 M dans des fioles jaugées de 100 ml et ajouter du tampon Tris pH 7,4 (3) jusqu’à la marque; déterminer par spectrophotométrie (259 nm) la
concentration exacte de la solution d’ATP, la corriger si nécessaire (le coefficient d’extinction ainsi que la concentration effective de l’ATP sont donnés dans la notice d’emballage livrée par le fabricant).
Ajouter 12 ml dans les flacons stériles (G) et conserver à - 20 °C.
(9) Solutions d’étalonnage Solution de base: 100 ml
Transvaser dans un bécher 25 ml de solution d’extraction (2), 25 ml de tampon Tris pH 7,4 (3),
5 ml éthanolamine 15 % (4a).
Ajuster le pH à 7,4 avec de l’éthanolamine 2 % (4b).
Ajouter 5 ml de NaN3 2 % (5), transvaser dans une fiole jaugée de 100 ml et ajouter du tampon Tris pH 7,4 (3), jusqu’à la marque.
Avec la solution de base, diluer la solution d’ATP 10-5 M pour l’obtention des standards d’ATP suivants:
10-6 M: 1,0 ml de solution 10-5 M + 9,0 ml de solution de base
2 x 10-7 M: 1,0 ml de solution 10-6 M + 4,0 ml de solution de base 10-7 M: 1,0 ml de solution 10-6 M + 9,0 ml de solution de base
5 x 10-8 M: 2,5 ml de solution 10-7 M + 2,5 ml de solution de base 10-8 M: 1,0 ml de solution 10-7 M + 9,0 ml de solution de base
5 x 10-9 M: 2,5 ml de solution 10-8 M + 2,5 ml de solution de base 2 x 10-9 M: 1,0 ml de solution 10-8 M + 4,0 ml de solution de base
Si les solutions ne sont pas utilisées tout de suite, les congeler à - 20 °C. La solution de base sert de solution témoin.
(10) Solution d’enzyme (préparation le soir précédant le jour de mesure)
Ajouter au moyen d’une pipette environ 10 ml d’eau stérile dans le flacon d’enzyme (FLE-50), agiter doucement 3 x 1 minute (pour éviter la formation de mousse) et laisser reposer 1 - 2 minutes entre chaque agitation. Pour éliminer les particules en suspension, filtrer la solution dans un bécher sur un filtre (I) préalablement rincé avec de l’eau stérile. Pour éliminer les particules plus fines ainsi que les impuretés d’origine bactérienne, on procède à une filtration en 2 étapes:
a) filtrer le filtrat au moyen d’une seringue à usage unique munie d’un filtre stérile de 0,45 m (J)
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b) filtrer une seconde fois le filtrat (0,45 m) dans un flacon stérile avec une seringue à usage unique
munie d’un filtre stérile de 0,2 m (K).
Laisser reposer à 4 °C pendant une nuit au moins. Conservation: 3 à 4 jours dans le réfrigérateur.
Remarques:
Suite à cette préparation, toutes les particules en suspension dans la solution d’enzyme sont éliminées, ce qui évite une obstruction trop rapide des tuyaux d’injection du photomètre.
Ne jamais congeler les solutions d’enzyme.
Mode opératoire:
Processus d’extraction Remarques générales:
réaliser 2 extractions par échantillon de sol:
a) sans ajout d’ATP b) avec ajout d’ATP
La procédure d’extraction doit se dérouler sans interruption dans un délai de 2 à 2½ heures. Toutes les étapes d’extraction doivent être réalisées simultanément pour a et b.
Peser, dans des flacons de polyéthylène de 250 ml (N) que l’on peut fermer, les quantités de sol suivantes:
- pour l’extraction a: 2 à 2,5 g de sol frais (= Ta) - pour l’extraction b: 3 à 3,5 g de sol frais (= Tb) Relever le poids du sol!
Extraction a: ajouter 50 ml de solution d’extraction (2)
Extraction b: ajouter 48 ml de solution d’extraction (2) et 2 ml d’ATP 10-5 M (8) Placer 2 billes d’agate dans chaque flacon (O).
Bien fermer les flacons, les placer sur un agitateur (D) et agiter avec 395 RPM pendant 3 minutes.
Placer les flacons dans un bain à ultrasons (E) pendant 3 minutes, pendant ce temps préparer l’installation de filtration.
Placer les entonnoirs à décantation de 100 ml (P) sur des supports; poser un filtre à plis (Q) sur chaque entonnoir.
Ajouter, dans les cylindres en plastique de 25 ml (R), 2 cuillères de résine (1 à 2 g de réactif 6) et les placer sous l’entonnoir à décantation.
Verser l’extrait sur le filtre et filtrer jusqu’à l’obtention de 15 à 20 ml de filtrat. Ouvrer les robinets des entonnoirs à décantation, laisser s’écouler le filtrat sur la résine contenue dans le cylindre en
plastique. Bien fermer les cylindres et agiter manuellement pendant 3 2 minutes.
Ajouter au moyen d’une pipette, dans un cylindre en plastique de 25 ml, 5 ml de tampon Tris pH 7,4 (3), 5 ml de filtrat de sol sans résine et 1 ml d’éthanolamine 15 % (4a).
Ajuster automatiquement (F) le pH des solutions à 7.4 avec de l’éthanolamine 2 %, pH 7.4 (4b), puis transvaser dans des fioles jaugées de 20 ml.
Ajouter 0,1 ml de NaN3 2 % (5) et remplir avec du tampon Tris pH 7.4 (3) jusqu’à la marque.
Retransvaser les solutions dans des cylindres en plastique de 25 ml, fermer les cylindres et stocker à - 20 °C jusqu’au jour de la mesure.
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Remarque:
L’ATP soluble est stable à température ambiante pendant 24 heures seulement; si les mesures ne peuvent pas être réalisées immédiatement, congeler les extraits, les solutions étalons et la solution de base à - 20 °C.
Mesure Préparation:
Si la mesure n’a pas lieu le même jour que l’extraction, décongeler les extraits et les solutions d’étalonnage et bien agiter; pour la mesure, ajouter au moyen d’une pipette 100 l d’une solution d’ATP ou d’extrait dans des cuvettes adaptées (M) au photomètre (A).
Tempérer la solution d’enzyme (10) à température ambiante pendant ½-¾ h.
Mesure des solutions d’étalonnage:
Mesurer le bruit (background) de la cuvette vide utilisée.
Mesurer la solution standard 2·10-7 M qui ne doit pas dépasser 100 000 RLU; si les valeurs sont plus élevées, diluer la solution d’enzyme avec de l’eau stérile.
Déterminer le témoin (BW) à l’aide de 100 l de solution de base, BW ne doit pas dépasser 20 %la valeurRLU de la solution standard 2·10-9 M; dans le cas contraire, la qualité de l’enzyme est
diminuée.
Mesurer ensuite les standards.
Mesure des extraits:
Après avoir mesurer les extraits, on refait une mesure des solutions d’ATP standards vu que l’on observe fréquemment des variations dans les mesures. Une fois tempérée, la solution d’enzyme doit être utilisée dans un délai de 2½ h. Au-delà de ce délai, l’activité de l’enzyme diminue. Il est donc recommandé de prévoir une série de mesures, incluant les extraits et les standards. La durée des mesures ne doit pas dépasser 2½ h, une fois l’enzyme tempérée.
3. Calcul
Données de calcul
données connues: données inconnues:
x et y = valeurs mesurées pour les extractions a et b (ng ATP / ml)
A et B = teneur en ATP dans l’extrait quand les pertes d’ATP = 0 (ng ATP / ml)
Ta et Tb = pesées du sol en g de matière sèche (TS) pour les extractions a et b
=
coefficient d’adsorption pour l’ATP dans le solda et db = ajouts d’ATP pour les extractions a et b (ng ATP / ml); da = 0 Relations entre les données
A d ax(A d a)3Ta (1)
B d b y (B d b)3Tb (2)
B T Tb A
a (3)
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de (1) et (2):
A d x A d T
B d y B d T
a
a a
b
b b
( )3 ( )3
(4)
Remplacer B par la relation (3):
(A d x)(T ) ( )( )
T A d T T
T A d y A d T
a b
a b b b
a b a a
3 3
ce qui donne:
A T2 b(3Tb3Ta)
(5)A d Tb a(3Tb3Ta)d Ta b(3Tb3Ta)yT Ta3 axT Tb3 b
d d Ta b a(3Tb3Ta)yd T Ta a3 axd T Tb a3 b0
Cette expression correspond à une équation quadratique de type: aA2 bA c 0 avec la formule A b b ac
a24 2
D’après cette formule, A est calculé à partir de (5). A correspond à la teneur en ATP dans 1 ml d’extrait où les pertes en ATP = 0
La teneur en ATP dans 1 g de sol sec correspond à: A Ta
200
(mg ATP / g TS)
Le coefficient d’adsorption est calculé à partir de (4) selon la détermination de la valeur A.
4. Résultat
Données en mg d’ATP / g de matière séche (TS). Degré de précision: 3 dédimales.
5. Bibliographie
Maire N. (1982). Méthode de mesure de l’adénosine triphosphate (ATP) dans les sols. Bulletin de la Société
Suisse de Pédologie 6, 88 - 94.
Maire N. (1984). Extraction de l’adénosine triphosphate dans les sols: une nouvelle méthode de calcul des pertes en ATP. Soil. Biol. Biochem., 16, 361 - 366.
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6. Histoire
Version Type du changement nouveau avant
Version 1 (1995) établissement de la méthode
Version 1.1 (1996) Autorisation de la méthode
Version 1.2 (2020) éditorial Publication électronique avec nouveau layout
Impressum
Éditeur Agroscope
Reckenholzstrasse 191 8046 Zürich
www.agroscope.ch/referenzmethoden Renseignements Diane Bürge
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