Staphylococcus epidermidis Biofilmbildung in Gegenwart von Serum

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Staphylococcus epidermidis Biofilmbildung

in Gegenwart von Serum:

genetische Charakterisierung funktioneller Determinanten

INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Christina Wiechmann

Hamburg

Hannover 2016

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand Institut für Mikrobiologie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Prof. Dr. H. Rohde

Medizinische Mikrobiologie, Virologie und Hygiene

Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand Prof. Dr. H. Rohde

2. Gutachter: Prof. Dr. M. von Köckritz-Blickwede

Tag der mündlichen Prüfung: 21. April 2016

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Meinen Eltern und meinem Bruder

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I Inhaltsverzeichnis

II Abbildungsverzeichnis ...

III Tabellenverzeichnis ...

IV Abkürzungsverzeichnis ...

1 Einleitung ... 1

2 Literatur ... 2

2.1 Staphylococcus epidermidis ... 2

2.1.1 Taxonomie und Vorkommen ... 2

2.1.2 Epidemiologie ... 2

2.2 Bakterielle Biofilmbildung ... 3

2.2.1 Allgemeines ... 3

2.2.2 Phasen der Biofilmbildung und beteiligte Faktoren ... 4

2.3 Regulatorische Einwirkungen auf die Biofilmbildung ... 9

2.4 Biofilmbildung - eine Strategie zum Schutz vor Phagozytose ...10

2.5 Problematik der Behandlung von Biofilm-assoziierten Infektionen und Ansätze für neue Therapieformen ...11

3 Material und Methoden ...13

3.1 Allgemeine Materialien für das mikrobiologische Arbeiten ...13

3.1.1 Medien und Zusätze ...13

3.1.2 Stämme, Vektoren, Oligonukleotide und Sonden ...15

3.1.3 Antikörper ...19

3.2 Anreicherungsverfahren und Aufbewahrung der Kulturen ...20

3.2.1 Anreicherungsverfahren ...20

3.2.2 Aufbewahrung der Kulturen ...20

3.3 Allgemeine mikrobiologische Methoden ...21

3.3.1 Biofilmtest in Mikrotiterplatten ...21

3.3.2 Wachstumskurven ...21

3.3.3 Zellzahlbestimmung mittels Kultur-basiertem Verfahren ...22

3.3.4 Aggregationstest ...22

3.3.5 Resistenztestung ...22

3.4 Molekularbiologische Techniken ...24

3.4.1 Präparation von Ganzzell-DNA ...24

3.4.2 RNA-Präparation und cDNA-Synthese ...25

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3.4.3 DNA-Aufreinigung ...28

3.4.4 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Reinheit ...28

3.4.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR)...29

3.4.6 Quantitative real-time PCR nach dem TaqMan-Prinzip ...29

3.4.7 Agarose-Gelelektrophorese...32

3.4.8 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) ...33

3.4.9 DNA-Sequenzanalyse ...36

3.5 Klonierung von DNA-Fragmenten ...37

3.5.1 Enzymatischer Verdau von Plasmid-DNA ...37

3.5.2 Ligation und Hitzeschock - Transformation in chemisch kompetente E. coli ...37

3.5.3 Elektrokompetente Zellen ...38

3.5.4 Elektroporation ...39

3.6 Phagentransduktion ...40

3.6.1 Präparation ...40

3.6.2 Titration ...40

3.6.3 Transduktion ...41

3.7 Proteinanalytische Methoden ...41

3.7.1 Oberflächenproteinpräparation ...41

3.7.2 SDS-Gelelektrophorese (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamidegelelektrophorese)...42

3.7.3 Western Blot Analyse ...42

3.7.4 Dot Blot ...43

3.7.5 Antikörperfärbung von Western Blots und Dot Blots ...43

3.8 Mikroskopie ...44

3.8.1 Biofilmwachstum unter statischen Bedingungen ...44

3.9 Statistische Auswertungen ...45

3.10 Software ...45

4 Ergebnisse ...46

4.1 Untersuchungen zur Biofilmbildung von S. epidermidis in Gegenwart von Serum 46 4.1.1 Biofilmbildung unter dem Einfluss von Serum in NunclonΔ Mikrotiter Platten ..46

4.1.2 Untersuchung der S. epidermidis Biofilmmorphologie in Gegenwart von Serum ...48

4.2 Analyse biofilmnegativer Transposonmutanten und Ermittlung des dafür verantwortlichen Genorts ...51

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4.2.1 Erstellung von biofilmnegativen Transduktanten und Untersuchung der

klonalen Identität zum Ausgangsstamm ...52

4.2.2 Beeinflussung des Wachstums des Wildtyps und der Transduktante in TSB und in Ziegenserum ...55

4.2.3 Identifizierung der Tn917-Insertionsorte in den Mutanten M25, M55, M66 und M151 ...57

4.2.4 In trans Komplementierung von srr...60

4.2.5 Untersuchung der differentiellen Expression von srr, SERP0158 und SERP0159 ...68

4.2.6 Einfluss des Regulators Srr auf die Expression des Extracellular matrix binding protein (Embp), des Small basic protein (Sbp) und des Autolysin E (AtlE) ...70

4.2.7 Untersuchung der Aggregationsfähigkeit in Gegenwart von Ziegenserum...79

4.3 Vergleichende Betrachtung von S. epidermidis 1585 und 1585-M66 auf die Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Substanzen ...81

4.3.1 Untersuchung der Empfindlichkeit gegenüber verschiedener Antibiotika in Abhängigkeit von srr ...81

4.3.2 Einfluss von srr auf das Wachstumsverhalten bei Zugabe von unterschiedlichen Antibiotika ...82

5 Diskussion ...87

6 Zusammenfassung ...98

7 Summary ... 101

8 Literaturverzeichnis ... 103

9 Anhang ... 117

A Wachstunskurven ... 117

B Geräte ... 118

C Chemikalien und Materialien ... 119

D Kits ... 122

E Software ... 123

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II Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Phasen der Biofilmbildung (modifiziert nach (ROHDE et al. 2006)). ... 4 Abbildung 2: Untersuchung der Biofilmbildung von S. epidermidis in Gegenwart von

Ziegenserum. (A) Quantitative Biofilmbildung der S. epidermidis Stämme 1457 und 1585 nach Wachstum in 96 Well Mikrotiterplatten in TSB und verschiedenen

Serumkonzentrationen (% [vol/vol]). (B) Bestimmung der Absorption bei 600 nm als

Ausdruck des bakteriellen Wachstums in TSB und verschiedenen Serumkonzentrationen von S. epidermidis 1457 und 1585. (C) Relative Biofilmbildung von S. epidermidis 1457 und 1585. Die Menge der oberflächenadhärenten Bakterien (A₅₇₀) wurde hierbei in Beziehung zur erreichten Bakterienkonzentration (A₆₀₀) gesetzt. Die Balken entsprechen dem Mittelwert der Ergebnisse aus drei biologischen und jeweils 8 technischen Replikaten. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. S. epidermidis 1457-M10 diente als Negativkontrolle. 48 Abbildung 3: Analyse oberflächenadhärenter S. epidermidis Konsortien nach Kultur in TSB oder Serum-supplementiertem TSB mittels konfokaler Laserscanning Mikroskopie (CLSM).

S. epidermidis 1457xpCM29 und 1585xpCM29 wurden in TSB (A, C) oder TSB + 50%

Ziegenserum (B, D, E) kultiviert. Die mikroskopischen Aufnahmen zeigen die unterste Ebene des Biofilms und ermöglichen einen Blick auf die Sagittalebene des Biofilms. Sichtbar war die aufgelockerte Biofilmstruktur von S. epidermidis 1457xpCM29 in 50 % Ziegenserum (B;

Pfeil) im Vergleich zum Wachstum in TSB (A), sowie der Phänotypwechsel von

biofilmnegativ (C) zu biofilmpositiv bei S. epidermidis 1585xpCM29 in Gegenwart von 50 % Ziegenserum (D). Abbruchkante von S. epidermidis 1585xpCM29 in Gegenwart von 50 % Ziegenserum (E; weißer Pfeil). Improvision Spinning Disc Mikroskop (Perkin Elmer,

Waltham, USA). 630-fache Vergrößerung. Maßstabsleiste 8 µm. ...50 Abbildung 4: Quantitative Auswertung des Biofilmvolumens (A) und der Biofilmhöhe (B). Die Höhe wurde jeweils mindestens an drei unabhängigen Positionen der Zellkulturschale bestimmt. Es wurden die Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten gebildet, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Die statistische Signifikanz wurde mittels Mann-Whitney-Test bei einem Konfidenzintervall von 95 % ermittelt. ...51 Abbildung 5: Analyse der klonalen Identität von S. epidermidis 1585 und in dieser Arbeit erzeugten Transduktanten mittels Pulsfeldgelelektrophorese. Nach Spaltung chromosomaler DNA mittels SmaI wurden resultierende DNA-Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt und durch SYBR®Safe DNA gel stain (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) sichtbar gemacht. M, Marker (Midrange PFG Marker I; New England BioLabs, Ipswich, USA). ...52 Abbildung 6: Quantitative Analyse des Biofilmphänotyps von S. epidermidis 1585, den

Mutanten M25, M26, M55, M66 und M151 sowie korrespondierenden Transduktanten in TSB und Serum-supplementiertem TSB. Dargestellt ist das Biofilmwachstum der S. epidermidis Stämme 1457wt und 1585wt mit den dazugehörigen Transposonmutanten und

Transduktanten in TSB (A) und 23 % Ziegenserum (B). Die Mutanten und Transposonmutanten zeigten, bis auf M26 und 1585-M26, den zu erwartenden biofilmnegativen Phänotyp. Es wurde jeweils der Mittelwert von 12 Werten aus drei

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unabhängigen Experimenten ermittelt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Die gestrichelte Linie stellt die Grenze zur Biofimbildung dar...53 Abbildung 7: Indirekte Bestimmung des Wachstums von 1585 sowie korrespondierenden Mutanten und Transduktanten in TSB und Serum-supplementiertem TSB. Absorption gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm als Zeichen des mikrobiellen Wachstums in TSB (A) und 23 % Ziegenserum (B). Die S. epidermidis Stämme zeigten kein stark

voneinander abweichendes Wachstum, was die reduzierte Biofilmbildung erklären würde. Es wurde jeweils der Mittelwert von 12 Werten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt.

Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. ...54 Abbildung 8: Vergleichende Untersuchung der Wachstumskinetik von S. epidermidis 1585, Mutante M66 und Transduktante 1585-M66. (A) Wachstumskurven von S. epidermidis 1585wt, Transduktante und Mutante in TSB. (B) Wachstumskurven von S. epidermidis 1585wt, Transduktante und Mutante in 30 % Ziegenserum. Kulturen wurden in 96-well Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One, Österreich) in 200 µl des jeweiligen Mediums angesetzt und bei 37 °C inkubiert. Die Absorption der Kulturen wurde stündlich bei einer Wellenlänge von 600 nm aufgezeichnet. Dargestellt ist der Mittelwert von 12 Werten aus 3 biologischen Replikaten. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. ...56 Abbildung 9: Bestimmung der Zellzahl von S. epidermidis 1585, 1585-M66 und M66. Nach 20 Stunden Kultur in 20 ml TSB bei 37 °C wurden Verdünnungen der Kulturen auf BHI-Agar ausplattiert und die Koloniebildenden Einheiten durch manuelle Auszählung bestimmt.

Basierend auf drei unabhängigen Experimenten stellen die Balken die durchschnittliche Zellzahl nach 20 Stunden Kultur dar. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

...57 Abbildung 10: Lokalisation der Tn917 Insertionen im Genom von S. epidermidis 1585. Alle Tn917-Insertionen (Raute) befinden sich in einem einzigen offenen Leserahmen (schwarzer Pfeil; SERP0157). Bei Mutanten M25, M55 und M66 konnte die Tn917 Insertion an einem identischen bp (nt 377) identifiziert werden. Bei diesen Mutanten war die Insertionsstelle von 6 bp direct repeats (fette Buchstaben) flankiert. Hinter der Tn917 Insertion in Mutante M151 fand sich eine 523 bp Deletion (roter Balken). Die Transkriptionsrichtung der auf Tn917 lokalisierten ermB Resistenzkassette (kleine schwarze Pfeile) befindet sich antiparallel zur Transkriptionsrichtung von SERP0157. ...58 Abbildung 11: Nachweis der flankierenden Bereiche am Insertionsort von Tn917 in

SERP0157 mittels der Primerpaare GntR+26for / Tn917 613 rev und GntR-28rev / Tn917 5219for. Die Amplifikate wurden in einem 1 % igen Agarosegel aufgetrennt und durch RedSafe (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) sichtbar gemacht. M, Marker (Quick- Load® DNA Marker, Broad Range; New England BioLabs, Ipswich, USA)...59 Abbildung 13: Vergleichende Betrachtung der Biofilmbildung von S. epidermidis 1585, 1585- M66 und dem srr-komplementierten Stamm 1586-M66pRBsrr in TSB und Serum-

supplementiertem TSB. Als Positivkontrolle diente S. epidermidis 1457 und als Negativkontrolle S. epidermidis 1457-M10. Der Biofilm wurde mittels Gentianaviolett angefärbt. (A) Makroskopische Darstellung eines repräsentativen Biofilmassays. (B) Quantitative Bewertung des Biofilmphänotyps durch Bestimmung der Absorption bei einer

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Wellenlänge von 570 nm. Die Balken entsprechen dem Mittelwert der Ergebnisse aus drei biologischen und jeweils 8 technischen Replikaten. Die Fehlerbalken stellen die

Standardabweichung dar. ...62 Abbildung 14: Vergleich des Wachstums von S. epidermidis 1585, 1585-M66 und dem srr- komplementierten Stamm 1585-M66xpRBsrr bei Kultur in TSB und Serum-supplementiertem TSB. Messung mittels Plattenleser Infinite M200 bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Balken entsprechen dem Mittelwert der Ergebnisse aus drei biologischen und jeweils 8 technischen Replikaten. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. ...63 Abbildung 15: Visuelle Betrachtung des Wachstums in ibitreat µ-Slide der Stämme

S. epidermidis 1585xpCN57tetM::gfp, 1585-M66xpCM29 und dem srr-komplementierten Stamm 1585-M66xpRBsrrxpCN57tetM::gfp jeweils in TSB und TSB + 50 % Ziegenserum.

Die Färbung oberflächenadhärenter Bakterien erfolgte mittels Gentianaviolett. ...65 Abbildung 16 Mikroskopische Darstellung der Biofilmbildung von S. epidermidis

1585xpCN57tetM::gfp, 1585-M66xpCM29 und 1585-M66xpRBsrrxpCN57tetM::gfp in TSB und 50 % Ziegenserum. S. epidermidis 1585xpCN57tetM::gfp TSB (A), S. epidermidis 1585xpCN57tetM::gfp 50 % Ziegenserum (B), S. epidermidis 1585-M66xpCM29 TSB (C), S. epidermidis 1585-M66xpCM29 50 % Ziegenserum I (D), S. epidermidis 1585-M66xpCM29 50 % Ziegenserum II (E), S. epidermidis 1585-M66xpCM29 50 % Ziegenserum III (F), S.

epidermidis 1585-M66xpRBsrrxpCN57tetM::gfp in TSB (G), S. epidermidis 1585- M66xpRBsrrxpCN57tetM::gfp 50 % Ziegenserum I (H) und S. epidermidis 1585-

M66xpRBsrrxpCN57tetM::gfp 50 % Ziegenserum II. Aufgenommen mit dem Improvision Spinning Disc Mikroskop (Perkin Elmer, Waltham, USA). 630-fache Vergrößerung.

Maßstabsleiste 8 µm. ...67 Abbildung 17 Quantitative Auswertung des Biofilmvolumens (A) und der Höhe (B) der

S. epidermidis Stämme 1585xpCN57tetM::gfp, 1585-M66xpCM29 und 1585-

M66xpRBsrrxpCN57tetM::gfp. Der Auswertung des Volumens ging eine Korrektur des Hintergrunds mit Hilfe der Software FIJI voraus. Es wurden die Mittelwerte von sechs

unabhängigen Experimenten gebildet, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Die statistische Signifikanz wurde mittels Mann-Whitney-Test bei einem Konfidenzintervall von 95 % ermittelt. ...67 Abbildung 18: Embp Expression in S. epidermidis 1585 und der 1585-M66. (A) Kultur in TSB.

(B) Kultur in TSB + 50 % Ziegenserum. Die Oberflächenproteine wurden nach 6 h beziehungsweise 20 h Wachstum im jeweiligen Medium unter statischen Bedingungen präpariert. Die Präparation wurde geometrisch in PBS verdünnt und 10 µl der resultierenden Verdünnung wurden auf eine PVDF-Membran aufgetragen. Als Primär-Antikörper diente ein im Kaninchen erzeugtes, polyklonales anti-Embp Antiserum (α-rEmbp7762), als

Sekundärantikörper ein Peroxidase-konjuguierter anti-Kaninchen IgG-Antikörper.

Belichtungszeit 10 Sekunden. ...72 Abbildung 19: Sbp Expression von S. epidermidis 1585 und der Transduktante 1585-M66 bei Kultur in TSB. (A) Oberflächenproteinpräparation nach 6 Stunden Kultur. (B)

Oberflächenproteinpräparation nach 20 Stunden Kultur. Verdünnungen der

Oberflächenproteinpräparationen wurden elektrophoretisch im SDS-PAGE aufgetrennt, auf

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PVDF Membranen geblottet und mit einem anti-Sbp Kaninchenantikörper (α-rSbp) inkubiert.

Gebundene Antikörper wurden schließlich mittels eines Peroxidase-konjuguierten anti-

Kaninchen IgG-Antikörper nachgewiesen. Belichtungszeit 10 Sekunden. ...74 Abbildung 20: Sbp Expression von S. epidermidis 1585 und der Transduktante 1585-M66 bei Kultur in Serum-supplementiertem TSB. (A) Oberflächenproteinpräparation nach 6 Stunden Kultur. (B) Oberflächenproteinpräparation nach 20 Stunden Kultur. Verdünnungen der Oberflächenproteinpräparationen wurden elektrophoretisch im SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF Membranen geblottet und mit einem anti-Sbp Kaninchenantikörper (α-rSbp) inkubiert.

Gebundene Antikörper wurden schließlich mittels eines Peroxidase-konjuguierten anti- Kaninchen IgG-Antikörper nachgewiesen. Belichtungszeit 10 Sekunden. ...75 Abbildung 21: Aggregationstest der S. epidermidis Stämme 1585wt, 1585-M66, 1585-

66xpRBsrr in TSB und 50 % Ziegenserum zu drei verschiedenen Zeitpunkten (0 h, 2 h, 6 h) ...80 Abbildung 22: Einfluss von Daptomycin auf das Wachstum von S. epidermidis 1585 und 1585-M66. (A) Wachstum in Calcium-supplementierter Müller-Hinton (MH)-Brühe. (B) Wachstum in Calcium-supplementiertem TSB. Die OD₆₀₀als Zeichen des

Bakterienwachstums wurde nach 24-stündigem Wachstum in NunclonΔ Mikrotiterplatten erhoben. Es wurden jeweils drei unabhängige Experimente durchgeführt und die Mittelwerte erhoben. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. ...83 Abbildung 23: Einfluss von Vancomycin auf das Wachstum von S. epidermidis 1585 und 1585-M66. (A) Wachstum in Müller-Hinton (MH)-Brühe. (B) Wachstum in TSB. Die OD₆₀₀als Zeichen des Bakterienwachstums wurde nach 24-stündigem Wachstum in NunclonΔ

Mikrotiterplatten erhoben. Es wurden jeweils drei unabhängige Experimente durchgeführt und die Mittelwerte erhoben. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. ...85 Abbildung 24: Einfluss von Tigecyclin auf das Wachstum von S. epidermidis 1585 und 1585- M66. (A) Wachstum in Müller-Hinton (MH)-Brühe. (B) Wachstum in TSB. Die OD₆₀₀als Zeichen des Bakterienwachstums wurde nach 24-stündigem Wachstum in NunclonΔ Mikrotiterplatten erhoben. Es wurden jeweils drei unabhängige Experimente durchgeführt und die Mittelwerte erhoben. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. ...86 Abbildung 25: Mögliche Effekte von srr auf S. epidermidis 1585 und die Fähigkeit zur

Biofilmbildung. Srr ist ein Transkriptionsfaktor, der Gntr-like Familie, der vermutlich als positiver Regulator auf die Expression von pdxS und pdxT wirkt, die als Komplex Vitamin B₆ synthetisieren. Vitamin B₆, beziehungsweise seine aktive Form, Pyridoxal-5'-Phosphat, ist als Ko-Faktor an einer Vielzahl von enzymatischen Vorgängen beteiligt und spielt

möglicherweise auch eine Rolle im Rahmen der bakteriellen Stressantwort. Zudem wird auch eine Beteiligung an der Aminosäuren-Synthese und somit auch an der Peptidoglykan-

/Zellwand-Synthese angenommen. Dies könnte auch die Auswirkungen auf die Antibiotika- Resistenz und die Adhärenz erklären. Auch haben sich Hinweise ergeben, dass die Embp- Synthese durch srr beeinflusst sein könnte. Dies könnte, wie auch Veränderungen in der Zellwand, eine verminderte Adhärenz zur Folge haben, was sich auf die Biofilmbildung und somit Virulenz auswirkt. ...97

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Abbildung 26: Wachstumskurven S. epidermidis 1585wt, 1585-M25, 1585-M55 und 1585- M151, sowie die korrespondierenden Mutanten vergleichend in TSB und 30 % Ziegenserum.

Wachstum in TSB (A, C, E), Wachstum in 30 % Ziegenserum (B, D, F). Dargestellt ist der Mittelwert von 12 Werten aus drei biologischen Replikaten. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. ... 117

(13)

III Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Eingesetzte Antibiotika in ihrer Endkonzentration ...14

Tabelle 2: Benutzte Stämme ...15

Tabelle 3: Benutze Vektoren ...17

Tabelle 4: Kulturbedingungen ...20

Tabelle 5: Ansatz DNase-Verdau ...27

Tabelle 6: Ansatz cDNA-Synthese ...27

Tabelle 7: Reaktionsansatz PCR ...29

Tabelle 8: PCR-Programm ...29

Tabelle 9: Rezept Ladepuffer ...32

Tabelle 10: Rezept TBE-Buffer (5 x) ...32

Tabelle 11: Benutzte Restriktionsenzyme und Puffer ...37

Tabelle 12: Reaktionsprotokoll des Restriktionsverdaus ...37

Tabelle 13: Ansatz In-Fusion HD EcoDry Cloning ...38

Tabelle 14: Elektropuls Einstellungen ...39

Tabelle 15: Rezept SDS-Gel ...42

Tabelle 16: Untersuchung der differentiellen Expression von srr, SERP0158 und SERP0159 durch Vergleich der Kultur in TSB mit der in Serum-supplementiertem TSB in S. epidermidis 1585 und 1585-M66. ...68

Tabelle 17: Vergleich der Expression von SERP0158 und SERP0159 in S. epidermidis 1585 mit 1585-M66 bei Kultur in TSB oder Serum-supplementiertem TSB. ...70

Tabelle 18: Untersuchung der differentiellen Expression von embp in S. epidermidis 1585 und 1585-M66 bei Kultur in TSB oder Serum-supplementiertem TSB. ...72

Tabelle 19: Vergleich der embp-Expression in S. epidermidis 1585 mit der in 1585-M66 bei Kultur in TSB oder Serum-supplementiertem TSB. ...73

Tabelle 20: Relative Expression von sbp in S. epidermidis 1585 und 1585-M66. ...76

Tabelle 21: Vergleichende Betrachtung der Expression von sbp in S. epidermidis 1585 mit 1585-M66 bei Kultur in TSB und in Serum-supplementiertem TSB. ...76

Tabelle 22: Untersuchung der differentiellen Expression von atlE durch Vergleich der Kultur in TSB mit der in Serum-supplementiertem TSB in S. epidermidis 1585 und 1585-M66. ...77

Tabelle 23: Vergleich der atlE Expression in S. epidermidis 1585 und 1585-M66 bei Kultur in TSB oder Serum-supplementierten TSB...78 Tabelle 24: Analyse der Antibiotikaempfindlichkeit von S. epidermidis 1585 und 1585-M66. 82

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IV Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

µl Mikroliter

µm Mikrometer

A₅₇₀ Absorption gemessen bei einer Wellenlänge von 570 nm A₆₀₀ Absorption gemessen bei einer Wellenlänge von 570 nm

Aap Accumulation associated protein

aqua ad. inject aqua ad injectabilia aqua bidest. aqua bidestillata

AtlE Autolysin E

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin (englisch: bovine serum albumin)

bzw. beziehungsweise

ca. circa

cDNA komplementäre DNA (englisch: complementary DNA)

Chl Chloramphenicol

cm Zentimeter

DNA Desoxyribonukleinsäure (englisch: desoxyribonucleic acid) Embp Extracellular matrix binding protein

Ery Erythromycin

g Gramm

GlcNAc N-Acetylglucosamin

h Stunde

HK Hauptkultur

KBE Koloniebildende Einheiten

kDA Kilodalton

l Liter

MHK Minimale Hemm-Konzentration

Min Minute

ml Milliliter

mRNA Boten-RNA (englisch: messenger RNA)

ng Nanogramm

nm Nanometer

OD Optische Dichte

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (englisch: phosphate bufferd saline) PCR Polymerase-Kettenreaktion (englisch: polymerase chain reaction)

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pg Pikogramm

quantitative RT-PCR quantitative real-time PCR

RNA Ribonukleinsäure (englisch: ribonucleic acid)

rpm Umdrehungen pro Minute (englisch: rounds per minute)

RT Raumtemperatur

Sbp Small basic protein

Srr Serum response regulator

Tet Tetracyclin

Tn917 Transposon917

U Unit

üN über Nacht

VK Vorkultur

vol/vol Volumen pro Volumen

Wt Wildtyp

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1 1 Einleitung

Staphylococcus epidermidis wird in die Gruppe der Koagulase-negativen Staphylo- kokken eingeordnet und gehört zur normalen Flora der Haut und Schleimhaut von Menschen und Tieren (BECKER et al. 2014; KLOOS 1980). Pathogenität entwickelt S. epidermidis im Zusammenhang mit implantierten Fremdmaterialen, wie zum Bei- spiel künstlichen Herzklappen, künstlichen Hüftgelenken, wie auch intravaskulären Kathetern (ROHDE et al. 2007; CHU et al. 2009; RUPP u. ARCHER 1994). Dies beruht vor allem auf der Fähigkeit, auf abiotischen und biotischen Oberflächen mehrschichtige Bakterienzellkonsortien, sogenannte Biofilme, zu bilden (BECKER et al.

2014; COSTERTON et al. 1999; DAROUICHE 2004). Der Biofilmphänotyp wurde in bisherigen experimentellen Untersuchungen vornehmlich unter artifiziellen Bedin- gungen analysiert. Allerdings unterscheiden sich diese Bedingungen in vielen Punk- ten von der Situation der natürlichen Habitate von S. epidermidis (BROEKHUIZEN et al. 2008). Es existieren jedoch klinische S. epidermidis Isolate, die je nach Kulturbe- dingungen, einen unterschiedlichen Phänotyp aufweisen. So ist das klinische Isolat S. epidermidis 1585 in Gegenwart von einen künstlichen Medium (TSB) biofilmnega- tiv. Durch Zugabe von 50 % Ziegenserum und somit Annäherung an in vivo-ähnliche Bedingungen, lässt sich aber in diesem Isolat ein biofilmpositiver Phänotyp induzie- ren (CHRISTNER et al. 2010). Im Rahmen einer Transposonmutagenese mit S. epidermidis 1585 konnten Mutanten isoliert werden, bei denen in Gegenwart von Serum keine Biofilmbildung mehr induziert werden konnte (HECTOR, ROHDE, un- veröffentlicht). Ziel dieser Arbeit war es, den Biofilmphänotyp bei Wachstum von S. epidermidis in Gegenwart von Serum morphologisch näher zu charakterisieren, durch Analyse der oben genannten Mutanten Genorte zu identifizieren, die offenbar Bedeutung für die Expression eines biofilmpositiven Phänotyps in Serum aufweisen, und deren Funktion detailliert zu beschreiben.

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2 2 Literatur

2.1 Staphylococcus epidermidis 2.1.1 Taxonomie und Vorkommen

Staphylococcus epidermidis wird zu der Gruppe der Koagulase-negativen Staphylo- kokken gezählt und ist ein Kommensale der Haut und Schleimhaut von Menschen und Tieren (BECKER et al. 2014; KLOOS 1980). Unter anderem wurde S. epidermidis bei Rindern, Pferden, Ziegen, Schweinen, Hunden, Katzen und Goril- las nachgewiesen (BECKER et al. 2014). S. epidermidis besiedelt bevorzugt feuchte Bereiche (GRICE et al. 2009; COSTELLO et al. 2009), wie den Axillarbereich, die Kniekehle, den Bauchnabel und, wie auch Staphylococcus aureus den vorderen Na- senbereich (WOS-OXLEY et al. 2010).

2.1.2 Epidemiologie

Die Virulenz von S. epidermidis beruht vor allem auf die Fähigkeit, auf abiotischen und biotischen Oberflächen Biofilme zu bilden (BECKER et al. 2014; COSTERTON et al. 1999). Als Biofilm werden mehrschichtige Bakterienzellkonsortien bezeichnet, die sich auf einer Oberfläche bilden und von einer extrazellulären Matrix umgeben sind. Hierdurch entsteht eine charakteristische dreidimensionale Struktur. Das ubiqui- täre Vorkommen von S. epidermidis auf der Haut und der rasant zunehmende Ein- satz von Fremdmaterialen in der Medizin führen dazu, dass Koagulase-negative Sta- phylokokken, zusammen mit S. aureus, in zwei Drittel der fremdmaterial-assoziierten Infektionen isoliert werden können (DAROUICHE 2004). Von den Koagulase- negativen Staphylokokken ist Staphylococcus epidermidis für die meisten Infektionen verantwortlich(ROGERS et al. 2009; UÇKAY et al. 2009). So ist S. epidermidis in allen Bereichen fremdmaterial-assoziierter Infektionen von großer Bedeutung (BE- CKER et al. 2014), beispielsweise bei Infektionen künstlicher Knie- und Hüftgelenke (PHILLIPS et al. 2006; ROHDE et al. 2007), künstlicher Herzklappen (CHU et al.

2009), intravaskulärer Katheter (RUPP u. ARCHER 1994) und nosokomialer Bakteri- ämie (WISPLINGHOFF et al. 2003). Eine Infektion kann mit weitreichenden Folgen für den Patienten einhergehen und bei Scheitern einer antibiotischen Therapie die

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3

Entfernung des Fremdmaterials erforderlich machen. Aus diesem Grund führt jede Fremdmaterial-assoziierte Infektion zu einer Zunahme von Morbidität und auch Mor- talität (ROHDE et al. 2006). Nosokomiale Infektionen durch biofilmbildende Bakterien stellen eine große Herausforderung für das Gesundheitssystem dar, alleine in den USA werden pro Jahr ca. 240.000 Fremdmaterial-assoziierte Infektionen gezählt (ROHDE et al. 2006; DAROUICHE 2004). Auch in der Veterinärmedizin spielen Koagulase-negative Staphylokokken eine Rolle. Vor allem im Zusammenhang mit bovinen Mastitiden wurde S. epidermidis isoliert und mit, hauptsächlich subklini- schen, Mastitiden in Verbindung gebracht (THORBERG et al. 2006; TAPONEN et al.

2006).

2.2 Bakterielle Biofilmbildung 2.2.1 Allgemeines

Neben Staphylokokken sind auch viele andere Bakterienspezies in der Lage, Biofilme zu bilden. Hierzu zählen Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae und En- terokokken (RYBTKE et al. 2015; WATNICK u. KOLTER 1999; MOHAMED u.

HUANG 2007; COSTERTON et al. 1999). Die Organisation der Bakterien in Biofil- men bringt, im Gegensatz zur planktonischen Lebensweise der Bakterien, viele Vor- teile mit sich. So sind Bakterien eines Biofilms weniger empfindlich gegenüber Anti- biotika (NISHIMURA et al. 2006; KNOBLOCH et al. 2002) und entgehen der Phago- zytose durch das Immunsystems des Wirts (VUONG et al. 2004d, KRISTIAN et al.

2008, 2008). Gerade diese Aspekte führen dazu, dass es sich bei biofilmassoziierten Infektionen regelhaft um chronisch-persistierende Krankheitsverläufe handelt (COSTERTON et al. 1999).

Neben den Bakterien selbst besteht der Biofilm aus von den Bakterien produzierter extrazellulärer Matrix. Diese besteht hauptsächlich aus Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden und erfüllt verschiedene Aufgaben. Durch sie stehen die Bakterienzellen in enger Verbindung zueinander und können somit interagieren. Da- neben schützt die Matrix vor Austrocknung, dem Eindringen von Antibiotika und dem Angriff durch das Immunsystem (FLEMMING u. WINGENDER 2010).

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4

Der Biofilm besteht aus mehreren Bakterienschichten, wobei nur die unteren Schich- ten mit der Oberfläche verbunden sind. Bei S. epidermidis finden sich zusätzlich pilz- artige-Fortsätze und Kanäle, wobei bei letzeren vermutet wird, dass sie zur Versor- gung von Nährstoffen beitragen (MACK et al. 2006).

2.2.2 Phasen der Biofilmbildung und beteiligte Faktoren

Die Biofilmbildung lässt sich in mindestens drei Phasen aufteilen. In der Phase der primären Adhärenz kolonisieren die Bakterien zunächst die Oberfläche. Es schließt sich die Akkumulationsphase an, in der es zur Bildung der dreidimensionalen Bio- filmstruktur kommt. Darauf folgt die Phase, in der es zur Ablösung von Bakterienzel- len kommt, was den Zellen die Möglichkeit gibt andere Bereich zu kolonisieren (MACK et al. 2009; OTTO 2009; BÜTTNER et al. 2015).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Phasen der Biofilmbildung (modifiziert nach (ROHDE et al. 2006)).

Über eine Vielzahl von Faktoren und ihre Bedeutung in den Phasen der Biofilmbil- dung und regulatorische Prozesse konnten umfangreiche Erkenntnisse gesammelt werden.

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5 2.2.2.1 Die Phase der primäre Adhärenz

S. epidermidis kann über verschiedene Mechanismen mit der zu besiedelnden Ober- fläche in Kontakt treten und an diese binden. Die Fähigkeit der Bakterienzellen, an unmodifizierten künstlichen Oberflächen zu adhärieren, wird zum einen durch physi- kochemische Kräfte, zum Beispiel hydrophobe Wechselwirkungen, wie auch durch das Autolysin E (AtlE), das an Polystyrenoberflächen binden kann, vermittelt (BE- CKER et al. 2014; HEILMANN et al. 1997). Wand-Teichonsäuren, die bei Staphylo- kokken mit der Peptidoglykanschicht der Zellwand verbunden sind, und Liptoteichonsäuren, die mit der Zytoplasmembran verbunden sind, vermitteln die Hydrophobizität der Zelloberfläche, die eine Adhäsion an Fremdmaterialien ermög- licht (XIA et al. 2010; KRASOWSKA u. SIGLER 2014). Die Oberflächen von medizi- nischen Implantaten werden direkt nach Insertion von extrazellulärer Matrix des Pati- enten bedeckt. Hierzu zählen zum Beispiel Fibronektin, Fibrinogen, Vitronektin, Kol- lagen und auch Thrombozyten (MACK et al. 2009). Proteine, die mit Komponenten der extrazellulären Matrix spezifische Bindungen eingehen, werden zu der Familie der microbial surface components recognising adhesive matrix molecules (MSCRAMM) - Proteine gezählt (PATTI et al. 1994). Neben dem Protein SdrG / Fbe, das an Fibrinogen bindet, und der Lipase GehD, die an Kollagen bindet (BOWDEN et al. 2002; NILSSON et al. 1998; HARTFORD et al. 2001), konnte auch bei Teichonsäuren eine Beteiligung durch Fibronektinbindung bestätigt werden (HUS- SAIN et al. 2001). Im Weiteren sind auch das bereits erwähnte AtlE und das extracellular matrix binding protein (Embp) beteiligt.

Auch AtlE, ein 148 kDa großes Oberflächenprotein, das zu der Gruppe der Hydrola- sen gezählt wird, spielt durch seine Vitronektin-bindenden Eigenschaften eine Rolle bei der Wechselwirkung mit extrazellulären Matrixproteine (HEILMANN et al. 1997;

QIN et al. 2007; CHRISTNER et al. 2012).

Das 1 MDa Protein Embp besitzt wiederum die Fähigkeit zur Bindung an Fibronektin (WILLIAMS et al. 2002), genauer die Fibronektin Typ III Domäne, vermutlich Domäne III12. Bioinformatische Auswertungen ergaben, dass Embp am N-terminalen Ende ein Exportsignal, inklusive eines YSRIK-Motivs besitzt, dem sich ein nicht eingeord- neter Bereich von ca. 2500 Aminosäuren anschließt. Es folgen 21 found in various

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architectures (FIVAR)-Module sowie 38 G-related albumin binding (GA)- Module, welche alternierend mit FIVAR-Modulen assoziiert vorliegen. Am C-terminalen Ende befinden sich vier Domänen mit unbekannter Funktion (DUF1542) und ein mögliches Transmembranprotein, das vermutlich mit in die Zellmembran inseriert ist (CHRISTNER et al. 2010).

2.2.2.2 Die Phase der Biofilm-Akkumulation und -Reifung

Nachdem die Bakterienzellen an der Oberfläche adhäriert sind, vermehren sie sich und akkumulieren zu Zellaggregaten, vermittelt durch interzelluläre Adhäsion. Als Adhäsine sind an der Biofilmbildung von S. epidermidis verschiedene Polysaccharide und Proteine, wie auch eDNA beteiligt und wirken wie ein Klebstoff (BECKER et al.

2014; BÜTTNER et al. 2015).

a) Das interzelluläre Polysaccharid-Adhäsin (PIA)

Das interzelluläre Polysaccharid-Adhäsin PIA ist ein lineares Homoglykan bestehend aus 130 β-1-6-verknüpften 2-Amino-2-Deoxy-D-Glucopyranosyl-Resten. 80-85 % der Reste sind N-acetyliert, während die übrigen 10-15% nicht N-acetyliert sind, was ih- nen eine positive Ladung verleiht (MACK et al. 1996). Polysaccharide, die PIA in ih- rem Aufbau ähneln oder sogar identisch sind, konnten neben Staphylococcus aureus auch in Escherichia coli und Actinobacillus pleuropneumoniae, der beim Schwein Pleuropneumonien verursacht, gefunden werden (KAPLAN et al. 2004b; CRAMTON et al. 1999). PIA wird durch Produkte des intercellular adhesion (ica)ADBC-Operons synthetisiert. IcaA kodiert für eine N-Acetylglukosaminyltransferase, die zur Synthese von β-1-6-verknüpten GlcNAc-Oligosacchariden führt. Da die Acetylglukosamino- amintransferase allein aber nur eine niedrige Aktivität besitzt, wird erst durch die Ko- Expression von icaD die Aktivität gesteigert und langkettige N-Acetylglukosamin- Oligomere synthetisiert (GERKE et al. 1998). IcaC ist ein Membranprotein, das an der Externalisierung und Verlängerung der Polysaccharide beteiligt zu sein scheint.

Das Enzym IcaB gehört zu der Familie der Deacetylasen und katalysiert die teilweise Deacetylierierung der N-Glukosamin-Reste, was von großer Wichtigkeit für die Bio- filmbildung und Virulenz von S. epidermidis zu sein scheint, da PIA in einem icaB- Mutanten, aufgrund der nicht erfolgten Deacetylierung, nicht mehr an der Zelloberflä- che haftete (VUONG et al. 2004b).

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7

b) Proteinfaktoren mit interzellulär adhäsiven Eigenschaften

Epidemiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass neben PIA auch weitere, unabhängige Oberflächenstrukturen von S. epidermidis an der Vermittlung interzellu- lärer Adhäsion beteiligt sein müssen (ROHDE et al. 2004; ROHDE et al. 2007). Ori- entierende Untersuchungen weisen darauf hin, dass es sich bei den funktionell rele- vanten Strukturen um Proteine handeln muss (ROHDE et al. 2007). Eines der ersten, näher charakterisierten S. epidermidis Oberflächenproteine mit biofilminduzierenden Eigenschaften ist das accumulation associated protein (Aap), (HUSSAIN et al. 1997;

ROHDE et al. 2005). Aap ist in klinischen Isolaten weit verbreitet und auch in der La- ge, in PIA-negativen Stämmen Akkumulation Biofilmbildung zu vermitteln (ROHDE et al. 2005). Aap ist ein Zellwandprotein, das aus einer N-terminal lokalisierten A- Domäne und einer B-Domäne besteht (GRUSZKA et al. 2012; ROHDE et al. 2005;

HUSSAIN et al. 1997; SCHAEFFER et al. 2015). Die A-Domäne umfasst eine unter- schiedliche Anzahl von 16 Aminosäuren-Wiederholungen und ermöglicht die Adhäsi- on an abiotischen Oberflächen. Sie wird gefolgt von einer 212 Aminosäuren großen Domäne, die strukturelle Ähnlichkeit mit Lektinen aufweist (SCHAEFFER et al.

2015). Die B-Domäne besteht aus einer variablen Anzahl repetitiver, 128 Aminosäu- ren großer Domänen (sogenannte G5 Domänen), die zur interzellulären Adhäsion und somit Akkumulation beitragen (BATEMAN et al. 2005; ROHDE et al. 2005). Da die G5-Domänen an N-Acetylglukosamine binden, könnte dadurch auch die Bindung an PIA erklärt werden und ein Beispiel für das Zusammenwirken von Polysacchari- den und proteinartigen Adhäsinen darstellen (BATEMAN et al. 2005). Auch für die Domäne-B von SasG in S. aureus wurde eine Beteiligung an der Akkumulation nachgewiesen (GEOGHEGAN et al. 2010). Damit Aap interzelluläre Adhäsion vermitteln kann, ist eine proteolytische Prozessierung des vollständigen Proteins notwendig. Hierbei kommt es zu einer Abspaltung der Domäne-A, wodurch die interzel- lulär-adhäsiven Eigenschaften der Domäne-B aktiviert werden. Neben der Wichtig- keit von Aap für die Akkumulation von S. epidermidis spielt das Protein auch eine Rolle bei der primären Adhärenz, sowohl an biotischen als auch abiotischen Oberflä- chen (SCHAEFFER et al. 2015; ROHDE et al. 2005).

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8

Von funktioneller Bedeutung für die Aap-vermittelte Biofilmbildung ist das 18 kDa Small basic protein (Sbp). Sbp stellt eine neue funktionelle Klasse von Matrixprotei- nen von S. epidermidis dar, da es an der Biofilmbildung beteiligten Adhäsinen als Ko- Faktor dient. So bindet an der Zelloberfläche gebundenes Sbp an abiotische Ober- flächen und lagert sich am Übergang von Bakterienzellen und künstlicher Oberfläche an. Gleichzeitig wird Sbp in die extrazelluläre Matrix integriert, wodurch das Protein ein Gerüst bildet, welches die PIA- und Aap-vermittelte Integration der Bakterien in die Biofilmarchitektur unterstützt. Hierbei spielen auch direkte Wechselwirkungen zwischen Aap Domäne-B und Sbp eine funktionelle Rolle (DECKER et al. 2015).

2.2.2.3 Die Phase der Biofilmauflösung und der Freisetzung von Bakterienzellen

Es wird angenommen, dass sich der Akkumulationsphase eine Phase anschließt, in der es zur Ablösung von Bakterien und somit zu einer Metastasierung der Infektion kommt (BECKER et al. 2014). Welche Faktoren an diesen Prozessen bei S. epidermidis beteiligt sind, ist noch weitestgehend unklar. Allerdings wurden erste Erkenntnisse gesammelt, die darauf hindeuten, dass sogenannte phenol soluble modulins (PSMs) an diesem Schritt beteiligt sind (WANG et al. 2011). Die Expression dieser Peptide wird durch den agr-Locus reguliert und ist damit an eines der überge- ordneten Quorum sensing Systeme von S. epidermidis gekoppelt (VUONG et al.

2004a). Zunächst als proinflammatorische Polypeptide beschrieben, konnte kürzlich gezeigt werden, dass PSMs Surfactant-ähnliche Eigenschaften aufweisen, die in vitro und in vivo an der Loslösung von biofilmständigen Bakterien beteiligt sind (MEHLIN et al. 1999; WANG et al. 2011).

Auch die Beteiligung von extrazellulären Enzymen wie Hydrolasen, Proteasen und Nukleasen an der Ablösung von Bakterien vom Biofilm wird angenommen. So produziert Actinobacillus actinomycetemcomitans das Exoenzym Dispersin B (DspB), eine Hydrolase, die in der Lage ist, S. epidermidis Biofilme durch Abbau von PIA aufzulö- sen. Allerdings gibt es keine Hinweise, dass Dispersin B oder verwandte Enzyme endogen von S. epidermidis produziert werden können (KAPLAN et al. 2004a; ITOH

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9

et al. 2005; BECKER et al. 2014). Auch dass durch einen Protease-abhängigen Me- chanismus die Ablösung vom Biofilm vermittelt wird, wie es für S. aureus beschrie- ben wurde, scheint für S. epidermidis zwar wahrscheinlich, konnte aber ebenfalls noch nicht bestätigt werden (BOLES u. HORSWILL 2008; BECKER et al. 2014).

2.3 Regulatorische Einwirkungen auf die Biofilmbildung

Die Biofilmbildung in S. epidermidis unterliegt bestimmten regulatorischen Prozes- sen. Eine große Rolle spielen in diesem Zusammenhang sogenannte Quorum sensing Systeme, die der Zell-Zell-Kommunikation dienen und eine Genregulation abhängig von Populationsgröße und Umweltbedingungen ermöglichen (LE u. OTTO 2015). Das Quorum sensing System accessory gene regulator (Agr) der Staphylo- kokken setzt sich aus zwei Transkriptionseinheiten zusammen, RNAII und RNAIII, die über den P2 beziehungsweise P3 Promoter gesteuert werden. RNAII beinhaltet die Gene agrB, agrD, agrC und agrA, deren Expression ein auto-feedback vermittelt (NOVICK et al. 1995). Das AgrD-Pro-Peptid des extrazellulären Quorum Signals, das sogenannte autoinducing peptide (AIP), wird durch AgrB, eine Transmembran- Endopeptidase, prozessiert und exportiert (ZHANG et al. 2002; LE u. OTTO 2015).

Die Bindung von AIP an AgrC, führt folgend über Aktivierung von AgrA zur Hochre- gulation des eigenen Promoters P2 und zusätzlich bindet AgrA an die Promoterregion P3 (KOENIG et al. 2004). Außerdem vermittelt AgrA die Transkripti- on der phenoble soluble molecules (PSM) PSMα und PSMβ über einem RNAIII- unabhängigen Mechanismus (QUECK et al. 2008). RNAIII stellt den eigentlichen Re- gulationsfaktor des Agr-Systems dar und wirkt vornehmlich inhibitorisch auf die Zielgene (NOVICK et al. 1993; BOISSET et al. 2007). So hemmt RNAIII die Synthe- se von Oberflächenproteinen und inhibiert zugleich den Repressor of toxin (Rot), was zur Hochregulation von Proteasen und Toxinen führt (LE u. OTTO 2015; BOISSET et al. 2007; LAUDERDALE et al. 2009). Dies ermöglicht es Staphylokokken sich an die verschiedenen Phasen während einer Infektion anzupassen. So kommt es zu Beginn einer Infektion aufgrund niedriger Zelldichte zu einer geringen Expression von Agr, was zur vermehrten Synthese von Oberflächenproteinen führt und die Kolonisation unterstützt. Insgesamt scheint sich Agr divergierend auf die Biofilmbildung auszuwir- ken. Agr wird eine Rolle bei Strukturierung des Biofilms zuteil und wird zudem zur

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10

Disseminierung benötigt, aber gleichzeitig scheint sich eine Dysfunktion von Agr, über eine verstärkte Biofilmbildung, als Vorteil zu erweisen (VUONG et al. 2004c;

OTTO 2013; LE u. OTTO 2015).

Eine Aktivierung von Agr ist nicht nur durch AIPs möglich, auch der Staphylococcal accessory regulator (SarA) ist in der Lage, auf das Agr-System einzuwirken (HEIN- RICHS et al. 1996). Zudem gilt SarA als positiver Regulator der Biofilmbildung in S. epidermidis durch Bindung an die Promoterregion von icaA und beeinflusst somit die Expression des icaADBC-Operon (TORMO et al. 2005). Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass SarA die Expression von embp und der Metalloprotease SepA negativ reguliert, was zu einer Verminderung der Embp-Synthese und aufgrund re- duzierter AtlE-Prozessierung zu verminderter eDNA-Freisetzung führt. Auf diese Weise ermöglicht SarA S. epidermidis zwischen den an der Biofilmbildung beteiligten funktionellen Molekülen zu wechseln (CHRISTNER et al. 2012).

2.4 Biofilmbildung - eine Strategie zum Schutz vor Phagozytose

Schon in vor längerer Zeit konnte gezeigt werden, dass S. epidermidis Zellen, die sich in einem Biofilm organisieren, besser in der Lage sind, der Phagozytose zu entgehen als planktonisch lebende Bakterienzellen (JOHNSON et al. 1986). Dieser Be- fund steht in Einklang mit der klinischen Beobachtung, dass es sich bei Biofilm- assoziierten Infektionen regelhaft um chronisch verlaufende Krankheitsbilder handelt, die durch ein Versagen der wirtseigenen Immunabwehr gekennzeichnet sind. Unter normalen Umständen ist das angeborene Immunsystem durch Phagozytose in der Lage akute, planktonische Infektionen, verursacht durch Staphylokokken, erfolgreich zu bekämpfen. So wird die Wirkung der Neutrophilen Granulozyten über die Sezer- nierung von Lysozymen, Defensinen, Cathelicidinen und reaktive Sauerstoffspezies vermittelt. Makrophagen tragen neben ihrer Beteiligung an der Phagozytose, durch Sezernierung von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen auch zu der Ak- tivierung der speziellen adaptiven Immunantwort bei (SCHERR et al. 2014). Dane- ben sind sterbende Neutrophile Granulozyten und Makrophagen fähig durch Freiset- zung von extrazellulärer DNA sogenannte extrazelluläre Fallen (neutrophil / macrophage extracellular nets - NET bzw. MET) zu bilden, die zudem eine hohe

(27)

11

Konzentration lytischer Enzyme beinhalten und sind auf diese Weise in der Lage auch extrazellulär Bakterien zu bekämpfen (BRINKMANN et al. 2004; CHOW et al.

2010). Durch die Organisation der Bakterien in einem Biofilm gelingt es den Bakteri- en, dem Immunsystem zu entgehen. So wird angenommen, dass eine unzureichen- de durch NF-kB vermittelte Makrophagen-Anwort, eine reduzierte IL-1β-Freisetzung und somit nur eine schwache proinflammatorischen Anwort zur Folge hat (SCHOM- MER et al. 2011). Und auch eine alternative Aktivierung der Makrophagen, die zu einer vermehrten Produktion von Urea und Ornithin führt, begünstigt die Kollagenbildung, die sich positiv auf die Biofilmbildung auswirkt (MOSSER 2003).

2.5 Problematik der Behandlung von Biofilm-assoziierten Infektionen und An- sätze für neue Therapieformen

Die Behandlung von Biofilminfektionen stellt eine große Herausforderung an die heu- tige Medizin dar. Da die Organisation in einem Biofilm zu einer erhöhten Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen führt, ist in vielen Fälle eine Entfernung des Fremdmaterials oft unvermeidlich (ROHDE et al. 2006). Es wird angenommen, dass die verminderte Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Substanzen zum einen dadurch vermittelt wird, dass sich Bakterienzellen innerhalb des Biofilms in einem Zustand mit verminderter Wachstumsrate befinden, in dem die Zellen weniger empfindlich gegenüber Antibiotika sind (COSTERTON et al. 1999). Zum anderen konnten auch sogenannte Persister Zellen identifiziert werden, eine Subpopulation, die bei der Resistenz gegenüber Antibiotika beteiligt zu sein scheint (LEWIS 2005).

Es wird von verschiedenen Richtungen ausgehend probiert, Biofilm-assoziierte Infek- tionen zu bekämpfen. Ein Ansatz zielt darauf ab, in das globale Regulationssystem agr einzugreifen. So könnte sich eine Herunterregulation des Agr-Systems durch verminderte Toxinsynthese positiv auf akute S. aureus-Infektionen auswirken, ande- rerseits ist zu beachten, dass dies gleichzeitig zu einer Hochregulation von Adhäsinen und somit zu einer Zunahme der Biofilmbildung führt (OTTO 2004). Des- weiteren wird versucht, den Biofilm direkt aufzulösen. In diesem Zusammenhang konnten mit dem Enzym DispersinB des gramnegativen Bakteriums Actinobacillus actinomycetemcomitans, einer β-1,6-Hexosaminidase, die eine PIA auflösende Wir-

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12

kung besitzt, erste Erfolge erzielt werden. Allerdings bleibt hierbei zu bedenken, dass bei S. epidermidis auch eine PIA-unabhänige Biofilmbildung stattfindet (KAPLAN et al. 2004a; ROHDE et al. 2006). Auch die Einführung einer aktiven oder passiven Immunisierung steht im Vordergrund vieler Studien. So konnten bereits mit einem monoklonalen Antikörper gegen Lipoteichonsäuren Erfolge für S. epidermidis- Infektionen nachgewiesen werden (GÖTZ 2004) und ein weiterer Ansatz zielt auf die Entwicklung einer multivalenten Vakzine, die mehrere sezernierte und Zellwand- assozierte Virulenzfaktoren beinhaltet (SCHERR et al. 2014).

Es ist demnach sehr wichtig weitere Erkenntnisse über die Biofilmbildung von S. epidermidis zu erlangen, um aus diesem Wissen neue therapeutische Ansätze entwickeln zu können.

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13 3 Material und Methoden

3.1 Allgemeine Materialien für das mikrobiologische Arbeiten 3.1.1 Medien und Zusätze

Alle folgenden Medien wurden für 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Alle hitzeinsta- bilen Zusätze und Antibiotika wurden steril filtriert und, nach Abkühlung des Mediums auf 56 °C, hinzugegeben.

3.1.1.1 Trypticase Soy Brühe (TSB) und -Agar

Trypticase Soy Broth 30 g für Agarplatten Zugabe von 15 g Agar

aqua bidest. ad 1000 ml

3.1.1.2 Luria-Bertani (LB)-Brühe und -Agar

Pepton 10 g für Agarplatten Zugabe von 15 g Agar

Hefeextrakt 5 g

NaCl 5 g

3.1.1.3 Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe und -Agar

Brain-Heart Infusion Medium 30 g für Agarplatten Zugabe von 15 g Agar für Softagarplatten Zugabe von 7 g Agar

3.1.1.4 BHI+-Brühe

Brain-Heart Infusion Medium 3 g

NaCitrat 1M 1,76 g

3.1.1.5 Staphylococcus Typing (ST)-Agar und -Softagar

Nutrient Broth No. 2 20 g für Agarplatten Zugabe von 15 g Agar NaCl 5 g für Softagarplatten Zugabe von 7 g Agar

CaCl2 0,4 g

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14 3.1.1.6 NB2+-Brühe

Nutrient Broth No. 2 20 g

CaCl2 0,4 g

3.1.1.7 B2-Brühe

Caseinhydrolysat 10 g

Hefeextrakt 25 g

Di-Kaliumhydrogenphosphat 1 g

D-+Glukose 5 g

NaCl 25 g

3.1.1.8 Müller-Hinton-Brühe

Mueller Hinton Broth 21 g

3.1.1.9 20 x Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)

NaCl 159,54g

KCl 3,95g

Na2HPO4 23,57g

KH2PO4 7,2 g

aqua bidest. ad 1000ml

pH 7,4

3.1.1.10 Zusätzliche Bestandteile

Alle benutzten Antibiotika sind in Tabelle 1 in ihrer Endkonzentration aufgelistet.

Tabelle 1: Eingesetzte Antibiotika in ihrer Endkonzentration

Zusätze Antibiotika Endkonzentration Lösungsmittel

Ampicillin 100 µg/ml Methanol

Chloramphenicol 10 µg/ml Methanol

Daptomycin 9,759 ng/ml - 10 µg/ml 0,9 % NaCl

Erythromycin 10 µg/ml Methanol

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15

Tetracyclin 10 µg/ml Methanol

Tigecyclin 9,759 ng/ml - 10 µg/ml aqua bidest.

Vancomycin 9,759 ng/ml - 10 µg/ml 40 % Methanol

3.1.2 Stämme, Vektoren, Oligonukleotide und Sonden 3.1.2.1 Bakterienstämme

Tabelle 2: Benutzte Stämme

Stamm Eigenschaften Quelle

E. coli Stellar

F–, ara,Δ(lac-proAB) [Φ80d lacZΔM15], rpsL(str), thi, Δ(mrr- hsdRMS-mcrBC), ΔmcrA, dam, dcm

Clontech (Mountain View, California, USA)

S. epidermidis 1457 Wildtyp, PIA-, Aap-positiv, biofilmpositiv

Isoliert aus fremdmaterial- assoziierter Infektion (UKE, Hamburg)

S. epidermidis Mutante M12

Stamm für Elektroporation und Phagentransduktion in

S. epidermidis

MACK et al. 2000

S. epidermidis 1457xpCM29

S. epidermidis 1457 transduziert mit pCM29, konstititive Gfp-Expression;

Chl^R,

DECKER et al. 2015

S. epidermidis 1457-M10 Tn917-Insertion in icaA, PIA-

und biofilmnegativ; Ery^R MACK et al. 2000

S. epidermidis 1585 icaADBC-negativ, biofilmposi- tiv, Embp-positiv

CHRISTNER et al. 2010 CHRISTNER et al. 2012

S. epidermidis 1585xpCM29

S. epidermidis 1457 transduziert mit pCM29, konstititive Gfp-Expression;

Chl^R

DECKER et al. 2015

S. epidermidis

1585xpCN57tetM::gfp

biofilmpositiv, Embp-positiv,

gfp;Tet^R diese Arbeit

Transposonmutante des Stammes 1585hc, Tn917- Insertion in SERP0157; Ery^R

AG Rohde, UKE, Hamburg

(32)

16 S. epidermidis Mutante M26

Transposonmutante des Stammes 1585hc, Tn917- Insertion unbekannt; Ery^R

S. epidermidis 1585-M25 Transduktante, Tn917-Insertion

in SERP0157; Ery^R diese Arbeit

unbekannt; Ery^R diese Arbeit

S. epidermidis 1585- M66xpRBsrr

S. epidermidis 1585-M66 transduziert mit Plasmid

pRBsrr; in trans Expression von srr unter Kontrolle des natürli- chen Promoters; Chl^R, gfp

diese Arbeit

S. epidermidis 1585- M66xpRBsrr

xpCN57::tetM::gfp

S. epidermidis 1585-

M66xpRBsrr transduziert mit pCN57::tetM::gfp; konstitutive Gfp-Expression; Tet^R

diese Arbeit

S. epidermidis 1585- M66xpCM29

S. epidermidis 1585-M66 transduziert mit pCM29; konstitutive Gfp-Expression; Chl^R

diese Arbeit

(33)

17 3.1.2.2 Vektoren

Tabelle 3: Benutze Vektoren

Vektor Eigenschaften Quelle

pCN57tet(M)::gfp konstitutive Gfp-Expression;

Tet^R

CHARPENTIER et al. 2004

pCM29 konstitutive Gfp-Expression;

Chl^R,

MALONE et al.

2009

pRB473

E. coli - Staphylokokken Shuttle Vektor zur Klonierung von DNA Fragmenten; Chl^R

BRÜCKNER 1992

3.1.2.3 Oligonukleotide und Sonden 3.1.2.3.1 Oligonukleotide

a) Oligonukleotide zum Integrationsnachweis von Tn917

gntR_+26_for: 5´-GTAATGTATCGTAACAATAATTAAAGC-3´

gntR_-28_rev: 5´-GATTAAATATATTTTACGAGATAAACTG-3´

Tn917_613rev: 5´-CTGTTTAAAAAGTCATAAGATTAGTCAC-3´

Tn917_5219for: 5´-GTATAAATTTGACTTGTTATCTATTCCTA-3´

b) Oligonukleotide zur Klonierung von gntR in pRB473

gntR-759_inf_for: 5´-CAGTGCAGCGGAATTCCCTAATTCCATCATTAGTGC-3´

gntR+231_inf_rev: 5´-TACCGAGCTCGAATTCGTTGCCAGGCAAATATCGT-3´

c) Oligonukleotide zur Detektion von srr Transkripten in der quantitativen real-time PCR gntr for: 5´-TCGAGTAACTGGCTTGTTGATGATCC-3´

gntr rev: 5´-TGCCAGTGATACATCGACAAACAAATCA-3´

d) Oligonukleotide zur Detektion von SERP0158 Transkripten in der quantitativen real-time PCR

SERP0158 for: 5´-CGGCGATGTTGCGTACGAAAG-3´

SERP0158 rev: 5´-TTCCATCATTAGTGCTGCATCC-3´

(34)

18

e) Oligonukleotide zur Detektion von SERP0159 Transkripten in der quantitativen real-time PCR

SERP0159 for: 5´-TGTTGAGCGTAATTCATTCGGTAGAC-3´

SERP0159 rev: 5´-TGGAAAGAAACACCGAGGTATTGTCC-3´

f) Oligonukleotide zur Detektion von embp Transkripten in der quantitativen real-time PCR

embp for: 5´-CACCTGGTGCTGTGCGTAATATAC-3´

embp rev: 5´-GCAGTTCCGTTATTTGTTGGTCCG-3´

g) Oligonukleotide zur Detektion von sbp Transkripten in der quantitativen real-time PCR

sbp for: 5´-ACGTTAAGATAGGCGAATCAATGAAGA-3´

sbp rev: 5´-GTACACGACTTATAGCTTTATGACCAAG-3´

h) Oligonukleotide zur Detektion von atlE Transkripten in der quantitativen real-time PCR

atlE for: 5´-GATCACGCTGACCCTCACCAAT-3´

atlE rev: 5´-GCAACACCACGATTAGCAGACAC-3´

i) Oligonukleotide zur Detektion von gyrB Transkripten in der quantitativen real-time PCR

gyrB for: 5´-TGGTCTGCGTTCATTTCACCAAGAC-3´

gyrB rev: 5´-CTTGCCGATGTTGATGGTGCACA-3´

j) Oligonukleotide zur Detektion von tpiA Transkripten in der quantitativen real-time PCR

tpiA for: 5´-GTGTGCTCACGTACGTCAAACA-3´

tpiA rev: 5´-TGCACCTTCTAACAATTGTACCAAATC-3´

(35)

19

3.1.2.3.2 Sonden für real-time PCR nach dem TaqMan-Prinzip a) Sonde für srr

5´-TCCCCTTGACGCTCGCTCGCCTCGTTGTAATAGT-3´

b) Sonde für SERP0158

5´-TTGCAGCTGGTGGTGGTGCTACGCC-3´

c) Sonde für SERP0159

5´-CTAAAGTGGATAACGGAGTGGAAATAC-3´

d) Sonde für embp

5´-ATGGTCGTTGGACTGTTGAAACTGGGTC-3´

e) Sonde für sbp

5´-GCCCTTCATACAAAGCCGTAAAACAACA-3´

f) Sonde für atlE

5´-GCAAGTAGCACCTTGGGGCACAACATC-3´

g) Sonde für gyrB

5´-GGCGGCTGAGCAATATAAACGTAGCCCGC-3´

h) Sonde für tpiA

5´-CGATGGCGCTCTTGTAGGTGGCGC-3´

3.1.3 Antikörper

3.1.3.1 Primärantikörper

- Kaninchen anti-rEmbp7762 Antiserum (CHRISTNER et al. 2010) - Kaninchen anti-rSbp Antiserum (DECKER et al. 2015)

3.1.3.2 Sekundärantikörper

- Peroxidase-konjuguierter anti-Kaninchen IgG-Antikörper

(36)

20

3.2 Anreicherungsverfahren und Aufbewahrung der Kulturen

Die Anreicherungsbedingungen von allen verwendeten Bakterienstämmen sind in Tabelle 4 aufgelistet

3.2.1 Anreicherungsverfahren

Tabelle 4: Kulturbedingungen

Bakterienstamm Temperatur [°C] Schüttler [rpm] Inkubationszeit Alle Staphylococcus und

E. coli Stämme auf Agarplatten

30 oder 37 0 1 bis 3 Tage

Alle Staphylococcus und E. coli Stämme in

Flüssigkulturen

30 oder 37 180 – 200 6 Stunden oder bis zu 18 Stunden (= üN)

Als Vorkultur (VK) wurden 2-5 ml Medium mit einer Kolonie inokuliert und unter den gewünschten Bedingungen inkubiert. Wenn notwendig, wurde zusätzlich ein Antibio- tikum hinzugefügt.

3.2.2 Aufbewahrung der Kulturen

Bakterienstämme auf Agarplatten wurden im Kühlschrank bei 4 °C bis zu 4 Wochen gelagert.

Für die Langzeitaufbewahrung wurden die Bakterienkulturen in Kryoröhrchen (Mast Diagnostica GmbH, Reinfeld) bei -80 °C eingefroren.