der Tierärztlichen Hochschule Hannover und
dem Institut für Mikrobiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
Epidemiologie boviner Staphylococcus epidermidis Isolate:
Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene und klonale Verwandtschaft mit humanen Isolaten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Dorothea Pfanzelt
aus Hamburg
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. G.-F. Gerlach
Prof. Dr. J. K.-M. Knobloch
1. Gutachter: Prof. Dr. G.-F. Gerlach 2. Gutachter: Prof. Dr. G. Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2006
Für meine Eltern und Henning
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ...11
2 Schrifttum ...14
2.1 Staphylokokken... 14
2.2 Koagulase-negative Staphylokokken ... 18
2.2.1 Staphylococcus epidermidis... 18
2.2.2 Bedeutung von Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS) bei der bovinen Mastitis.... 18
2.2.3 Pathogenese von Fremdkörper-assoziierten Infektionen ... 23
2.2.3.1 Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis... 24
2.2.3.2 Primäre Adhäsion von Staphylococcus epidermidis... 25
2.2.3.3 Faktoren der akkumulativen Phase ... 28
2.2.3.4 Regulative Faktoren der Biofilmbildung ... 32
2.3 Methicillinresistenz bei Staphylokokken ... 38
2.4 Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene in S. epidermidis... 39
2.5 Molekulare Typisierung und Bestimmung der klonalen Verwandtschaft: Multilocus sequence typing (MLST) und based upon related sequence types (BURST) ... 40
2.5.1 Multilocus sequence typing (MLST)... 40
2.5.2 Based upon related sequence types (BURST) ... 41
2.5.3 MLST-Typisierung in humanen S. epidermidis-Isolaten ... 43
3 Material und Methoden ...45
3.1 Material ... 45
3.1.1 Bakterienstämme... 45
3.1.2 Oligonukleotide... 47
3.1.3 Nährmedien... 49
3.1.4 Datenbanken und Programme ... 49
3.2 Methoden... 50
3.2.1 Anzuchtbedingungen ... 50
3.2.2 ID 32 Staph System zur Identifizierung von Staphylokokken ... 50
3.2.3 Präparation chromosomaler DNS aus S. epidermidis... 51
3.2.4 Polymerasekettenreaktion ... 51
3.2.5 Agarosegelelektrophorese... 55
3.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte... 55
3.2.6.1 Nucleo Spin Extract II ... 56
3.2.6.2 QIAquick ... 56
3.2.7 Bestimmung der DNS-Konzentration in aufgereinigten PCR-Produkten... 56
3.2.8 DNS-Sequenzanalyse... 57
3.2.9 Adhärenztest zur semiquantitativen Bestimmung der Biofilmbildung von Bakterienstämmen an Plastikoberflächen ... 58
3.2.10 Immunfluoreszenztest zur Identifikation von PIA ... 59
3.2.11 Extraktion von PIA ... 59
3.2.12 Quantifizierung mittels Dot Blot... 60
3.2.13 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Oxacillin mittels E(psilon)-Test ... 61
3.2.14 CHI-Quadrat Test zur Bestimmung der statistischen Signifikanz... 61
3.2.15 Herstellung von Phagenlysaten... 62
3.2.16 Phagentitration ... 63
3.2.17 Phagentransduktion... 63
3.2.18 multilocus sequence typing (MLST) ... 64
3.2.19 based upon related sequence types (BURST)... 65
4 Ergebnisse ...67
4.1 Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene bei bovinen S. epidermidis-Isolaten ... 67
4.2 Biofilmbildung boviner S. epidermidis-Stämme... 69
4.3 Assoziation von Biofilm-positivem Phänotyp und Nachweis des icaA-Gens bei bovinen S. epidermidis-Stämmen... 71
4.4 long range PCR des icaADBC-Locus ... 71
4.5 Nachweis von PIA ... 72
4.5.1 Immunfluoreszenztest der icaA-positiven bovinen S. epidermidis-Stämme ... 72
4.5.2 PIA-Dot-Blot der icaA-positiven bovinen S. epidermidis-Stämme... 74
4.6 Die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Oxacillin für bovine S. epidermidis-Stämme... 75
4.7 Multilocus sequence typing der bovinen S. epidermidis-Stämme ... 78
4.8 Geographische Verteilung der MLST-Sequenztypen... 81
4.9 Prävalenz der Virulenz-assoziierten Gene bei unterschiedlichen MLST-Sequenztypen... 82
4.10 Klonale Verwandtschaft der bovinen S. epidermidis-Stämme... 83
4.11 Klonale Verwandtschaft boviner und humaner S. epidermidis-Stämme ... 84
4.12 Präsenz des icaADBC-Operons bei S. epidermidis Sequenztypen ... 87
4.13 Präsenz des mecA-Gens bei S. epidermidis Sequenztypen... 90
4.14 MLST-Analyse mit alternativen Genfragmenten ... 92
4.15 Transduktion von Deletionen des σB-Operons ... 95
5 Diskussion ...97
5.1 Staphylococcus epidermidis und Biofilmbildung ... 97
5.2 Molekulare Typisierung boviner und humaner S. epidermidis-Stämme ... 103
5.3 Schlussbetrachtung... 114
6 Zusammenfassung...116
7 Summary ...118
8 Literaturverzeichnis...120
9 Anhang ...145
9.1 Tabellenanhang... 145
9.2 Rezepte für Lösungen, Puffer und Medien ... 148
9.2.1 Lösungen und Puffer... 148
9.2.2 Nährmedien... 149
9.3 Reagenziensets für molekularbiologische Standardverfahren ... 151
9.4 Enzyme ... 151
9.5 Chemikalien ... 152
9.6 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 154
9.7 Tabellenverzeichnis ... 156
9.8 Abbildungsverzeichnis ... 157
Abkürzungsverzeichnis
aap Gen des Akkumulation-assoziierten Proteins (accumulation associated protein) Abb. Abbildung
ADP Adenosinphosphat
arcC Gen der Carbamatkinase (carbamate kinase)
aroE Gen der Shikimate 5-Dehydrogenase (shikimate 5-dehydrogenase) atlE Gen des Autolysins (autolysin)
bp Basenpaare
BHI Hirn-Herz-Glucose-Bouillon (brain-heart-infusion)
BHIGly Hirn-Herz-Glucose-Bouillon (brain-heart-infusion) mit 1 % Glycin bap Gen des Biofilm-assoziierten Proteins (biofilm-associated protein)
bhp Gen des Bap-homologen Proteins (bap-homologue protein) BURST based upon related sequence types
CFU Kolonie-bildende Einheiten (colony forming units) cpm Einheiten pro Minute (counts per minute)
dest. destilliert
dH2O destilliertes Wasser DIN Deutsche Industrienorm DNS Desoxyribonukleinsäure DNA desoxyribonucleic acid
dNTP Desoxy-Nukleotidyl-Triphosphat ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
embp Gen des Fibronektin-bindenden Proteins (fibronectin binding protein) erm Erythromycinresistenzkassette (erythromycin resistance cassette) fbe Gen des Fibrinogen-bindenden Proteins (fibrinogen binding protein) glpK Gen der Glycerolkinase (glycerol kinase)
gmk Gen der Guanylatkinase (guanylate kinase)
gtr Gen des Amino acid ABC transporter, ATP-binding protein h Stunde
ica Gen des Interzellulären Adhäsins (intercellular adhesin)
IFT Immunfluoreszenztest IS Insertionselement
IUAPC International Union of Pure and Applied Chemistry kDa Kilodalton
KBE Kolonie-bildende Einheiten
KNS Koagulase-negative Staphylokokken
mecA Gen des zusätzlich Penicillin-bindenden Proteins PBP2a ml Milliliter
MHK Minimale Hemmkonzentration
MHK50 Minimale Hemmkonzentration einer Substanz, die mindestens 50 % der getesteten Stämme hemmt
min Minute
MLST multilocus sequence typing
mutS Gen des DNA mismachtch repair protein NCCLS National Committee on Laboratory Standards NB2 nutrient broth no. 2
µl Mikroliter
µm Mikrometer
nm Nanometer
OD570 optische Dichte bestimmt bei einer Wellenlänge von 570 nm PBE Plaque-bildende Einheiten
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PFGE Pulsfeldgelelektrophorese
PIA Interzelluläres Polysaccharid-Adhäsin (polysaccharide intercellular adhesin) pta Gen der Phosphatacetyltansferase (phosphate acetyltransferase)
pyr Gen des Pyrimidine operon repressor chain A rpm Rotationen pro Minute (rotations per minute) rsb Regulator von σB
s Sekunde
SCC Somatische Zellzahl/ml Milch (somatic cell counts)
SCCmec staphylococcal chromosomal casette sigB Sigma B
STA Staphylokokentypisierungsagar (staphylococcus-typing agar) tpi Gen der Triosephosphatisomerase (triosephosphate isomerase) TSB Trypton Soja Brühe (trypticase soy broth)
TSBØ Trypton Soja Brühe ohne Glucose TSBEtOH TSB supplmentiert mit 3 % Ethanol TSBNaCl TSB supplementiert mit 4 % NaCl U Enzymatische Einheiten (units) Upm Umdrehung pro Minute
v/v Volumen pro Volumen
x g x-fache Erdbeschleunigung
yqi Gen der Acetyl-CoA-Acetyltransferase (acetyl-CoA acetyltransferase)
IUPAC-Nukleinsäurecode
A Adenosin C Cytidin G Guanosin T Thymidin
1 Einleitung
Staphylokokken gehören zur physiologischen Haut- und Schleimhautflora warmblütiger Tiere und des Menschen (NOBEL, 1997; NOBEL und NAIDOO, 1986). Typischerweise finden sich bei unterschiedlichen Säugetierspezies unterschiedliche Spezies der Gattung Staphylococcus. Die Spezies Staphyloccus aureus und Staphylococcus epidermidis finden sich jedoch bei Mensch und domestizierten Tieren als Infektionserreger. Hierbei gilt S. epidermidis im Gegensatz zu S. aureus als weniger pathogen. Als potentiell tierpathogener Erreger hat S. epidermidis vor allem bei bovinen subklinischen aber auch bei klinischen Mastitiden eine Bedeutung, wo er zu einer Erhöhung der somatischen Zellzahl (SCC) (CHAFFER et al., 1999; RAINARD et al., 1990; TIMMS und SCHULTZ, 1987) in der Milch und einer Reduktion der Milchproduktion führt (HOLMBERG, 1973; JONES et al., 1984;
LINDE et al., 1975a; LINDE et al., 1975b; LINDE et al., 1975c; LINDE et al., 1980;
NATZKE et al., 1972; POUTREL und RAINARD, 1982; TIMMS und SCHULTZ, 1984).
Andererseits wird eine Schutzwirkung der Infektion durch S. epidermidis gegenüber den Infektionen durch Mastitispathogene wie S. aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis und Escherichia coli diskutiert (BRAMLEY, 1978; HOLMBERG, 1986; LINDE et al., 1975a; LINDE et al., 1975b; LINDE et al., 1975c; LINDE, 1982; MATTHEWS et al., 1991;
POUTREL und LERONDELLE, 1980). In der Humanmedizin wurde S. epidermidis lange Zeit als apathogen eingestuft. Jedoch zählt S. epidermidis heute zu den häufigsten Erregern nosokomialer Bakteriämien und Fremdkörperinfektionen mit erheblicher Morbidität und Mortalität betroffener Patienten (BANERJEE et al., 1991; KLOOS und BANNERMAN, 1994; RUPP und ARCHER, 1994; SCHABERG et al., 1991; VACHEETHASANEE et al., 1998). Wichtigster Pathogenitätsfaktor hierbei ist die Fähigkeit zur Bildung mehrlagiger Biofilme, in denen der Zellkontakt durch das interzelluläre Polysaccharidadhäsin PIA vermittelt wird. PIA ist ein hochmolekulares Polysaccharid aus β-(1,6)-glycosidisch gebundenem N-Acetylglucosamin, welches durch die Genprodukte des icaADBC Locus synthetisiert wird (HEILMANN et al., 1996b; MACK et al., 1996b; MACK et al., 1996a;
MACK, 1999; MACK et al., 1999). Neben dem icaADBC Locus sind eine Reihe weiterer Genorte bekannt, die mit der Biofilmbildung bei S. epidermidis assoziiert sind. Diese besitzen eine unterschiedliche Wertigkeit für die Prädiktion invasiver Isolate (FREBOURG et al.,
2000; GALDBART et al., 2000a,b; MACK, 1999; VANDECASTEELE et al., 2003a). Im Vergleich kommensaler und Infektions-assoziierter Isolate zeigen sich signifikante Unterschiede in der Prävalenz der Biofilm-assoziierten Gene sowie der Resistenz gegenüber Antibiotika. Humane kommensale Isolate gesunder Träger besitzen in der Regel keine Fähigkeit zur Biofilmbildung und sind gegenüber den meisten Antibiotika empfindlich, während Infektions-assoziierte Isolate mehrheitlich den icaADBC Locus sowie das für Methicillinresistenz essentielle mecA Gen tragen (ROHDE et al., 2004; WISPLINGHOFF et al., 2003; KOZITSKAYA et al., 2005; ARCHER und CLIMO, 1994; CHAMBERS, 1997, FRIDKIN et al., 2001). Gleichzeitig konnte eine Assoziation dieser Genorte mit dem Vorkommen des Insertionselementes IS256 festgestellt werden (ROHDE et al., 2004;
ZIEBUHR, et al., 1999; KOZITSKAYA et al., 2004). Die beobachteten Unterschiede der Prävalenz Biofilm- und Resistenz-assoziierter Gene bei kommensalen und Infektions-assoziierten Isolaten legt die Existenz eines nicht humanen Reservoirs für Biofilm-positive Stämme nahe.
Die Zielsetzung dieser Arbeit war, S. epidermidis-Isolate tierischer Herkunft hinsichtlich der Fähigkeit zur Biofilmbildung zu untersuchen und die klonale Verwandtschaft mit humanen Isolaten zu vergleichen. Für die weitergehende genotypische Charakterisierung wurde die Prävalenz der mit der Biofilmbildung assoziierten Gene, des mecA Gens, sowie der Insertionselemente IS256 und IS257 in den tierischen Isolaten mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) untersucht. Hierdurch sollte evaluiert werden, ob S. epidermidis-Isolate tierischer Herkunft möglicherweise ein Reservoir Biofilm-positiver Stämme sind, welche nach Übertragung auf den Menschen Fremdkörper-assoziierte Infektionen verursachen können. Um die epidemiologischen Zusammenhänge zwischen tierischen und humanen Isolaten aufzuklären, sollten die tierischen Isolate mittels multilocus sequence typing (MLST) charakterisiert werden. Durch den Vergleich mit bereits bestehenden Daten von humanen Isolaten (WISPLINGHOFF et al., 2003; KOZITSKAYA et al., 2005) kann evaluiert werden, ob tierische S. epidermidis-Isolate mit humanen Isolaten verwandt sind, oder ob es spezifische bovine S. epidermidis-Klone gibt. In Abhängigkeit von der phänotypischen und genotypischen Charakterisierung der tierischen Isolate sollten die Biofilm-positiven Stämme hinsichtlich ihrer Infizierbarkeit mit transduzierenden S. epidermidis-Phagen untersucht werden. Gegebenfalls sollten durch die Transduktion von
definierten Mutanten des σB-Operons die Regulation der Biofilmbildung bei Isolaten tierischer Herkunft weitergehend untersucht werden.
2 Schrifttum
2.1 Staphylokokken
Staphylokokken sind fakultativ anaerobe, grampositive, unbewegliche Kugelbakterien (Kokken) von 0,5-1,5 µm Durchmesser, die gemeinsam mit den Gattungen Micrococcus, Stomatococcus und Planococcus zur Familie der Micrococcaceae zusammengefasst werden.
Sie besitzen die Fähigkeit zur Katalasebildung und gehören zu den Widerstandsfähigsten unter den nicht sporenbildenden Bakterien. In der Regel können Staphylokokken noch bei Kochsalzgehalten von 10 % wachsen und einige von ihnen für 30 min bei 60° C Hitze überleben. Weiterhin sind Staphylokokken resistent gegenüber einer Vielzahl von Desinfektionsmitteln (NOVICK et al., 1993). Haut, Hautdrüsen und Schleimhäute warmblütiger Tiere und des Menschen sind die typischen Habitate von Staphylokokken (NOBEL, 1997; NOBEL und NAIDOO, 1986).
Im Gegensatz zu den meisten anderen Gattungen der Familie Micrococcaceae liegt der GC-Gehalt der Staphylokokken-DNS mit 30-39 Molprozent sehr niedrig (KLOOS, 1997;
WILKINSON, 1997). Spezifisch für einige Staphylokokkenspezies ist auch, dass das Zellwandpeptidoglycan eine aus multiplen Glycinresten bestehende Interpeptidbrücke besitzt.
Dies führt zu einer Empfindlichkeit gegenüber dem speziell an Glycin-Glycin-Bindungen angreifenden Enzym Lysostaphin.
Im mikroskopischen Präparat fallen Staphylokokken durch ihre traubenartige Anordnung auf.
Sie können einzeln, in Paaren oder Tetraden vorkommen und teilen sich in mehreren Ebenen zu den charakteristischen irregulären Traubenformen (griech. staphyle = Traube), die der Gattung ihren Namen gab.
Zur Anzüchtung der Staphylokokken ist besonders Blutagar geeignet (SELBITZ, 2002). Die Pigmentierung der runden, glänzenden ca. 1-2 mm durchmessenden Kolonien, die von unterschiedlich großen Hämolysezonen umgeben sein können, variiert von grau über weiß bis goldgelb. Selektivmedien wie Chapman-Agar und Vogel-Johnson-Agar kommen vorrangig bei Lebensmitteluntersuchungen zum Einsatz (SELBITZ, 2002).
Derzeit werden über 43 Staphylokokkenspezies anhand ihrer physiologischen, morphologischen, biochemisch-enzymatischen Merkmale und ihrer chemotaxonomischen Zellwandzusammensetzung unterschieden. Einige Staphylokokkenspezies werden auf Subspeziesebene differenziert, so dass insgesamt 64 Taxa bekannt sind (DEVRIESE et al., 2005; KLOOS et al., 1997; KLOOS et al., 1998; LAMBERT et al., 1998; PANTUECK et al., 2005; PLACE et al., 2003; PROBST et al., 1998; SPERGSER et al., 2003, TAKAHASHI et al., 1999; TRULZSCH et al., 2002; VERNOZY-ROZAND et al., 2000).
Anhand der Koagulasereaktion teilt man die Staphylokokken in zwei Klassen ein, die Koagulase-positiven und die Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS) (SCHLEIFER und KLOOS, 1975). Die Koagulase ist ein extrazelluläres Enzym, das durch Bindung an Prothrombin das sogenannte Staphthrombin bildet. Der Komplex wirkt proteolytisch und löst direkt unter Umgehung der Thrombinbildung die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin aus.
Auf diese Weise ist die Koagulase als Virulenzfaktor an der Bildung der charakteristischen Fibrinkapsel um Läsionen durch Koagulase-positive Staphylokokken beteiligt.
Zu den Koagulase-positiven Staphylokokken gehört als bedeutende humanpathogene Spezies S. aureus, die wegen ihrer besonders hohen Pathogenität auch die am ausführlichsten Untersuchte ist. Ein zellwandständiges Protein ist der sogenannte Clumping Factor, der als Rezeptor für Fibrinogen agiert. Als Virulenzfaktor vermittelt der Clumping Factor die Bindung von Staphylokokken an Fibrinogen in verletztem Gewebe, auf medizinischen Implantaten sowie Kathetern, an die sich zuvor Fibrinogen angelagert hat. Diagnostisch sind der Nachweis des Clumping Factor und die Koagulasereaktion für die Speziesbestimmung von S. aureus wichtig (HAHN et al., 2001; SELBITZ, 2002). Bei der Pathogenese wirken zahlreiche weitere Virulenzfaktoren, wie Protein A, Kapselbildung, Staphylokinase, DNase, Lipasen, Hyaluronidase, Hämolysine und Leukozidine. Einige Stämme sind auch in der Lage, durch Toxinbildung Lebensmittelvergiftungen und das Toxic-Shock-Syndrom (TSS) sowie das Staphylococcal-Scalded-Skin-Syndrom (SSSS) hervorzurufen (TENOVER und GAYNES, 2000). Beim Menschen kommt S. aureus aber auch saprophytär vor allem auf den Nasenschleimhäuten vor (KLOOS und BANNERMAN, 1994; NOBEL, 1997). Einige weitere Spezies aus der Gruppe der Koagulase-positiven Staphylokokken sind S. intermedius, S. hyicus und S. schleiferi subsp. coagulans, die man in der Regel nur im Tierreich findet (Tab. 2.1).
Die weitaus größere Gruppe sind Koagulase-negative Staphylokokken, die sich weiter in Novobicin-empfindliche (S. epidermidis-Gruppe) und Novobicin-resistente (S. saprophyticus- Gruppe) Spezies unterteilen lassen. Sie galten mit Ausnahme von S. saprophyticus lange Zeit als apathogen, in den letzten Jahren aber wurden einige KNS als häufige Erreger nosokomialer Infektionen identifiziert (BANERJEE et al., 1991; SCHABERG et al., 1991), die unter normalen Umständen beim gesunden immunkompetenten Menschen nur selten Infektionen hervorrufen (KLOOS, 1997; LOWY und HAMMER, 1983; NOBEL, 1997).
Der häufigste humane Infektionserreger innerhalb der Koagulase-negativen Staphylokokken ist der in dieser Arbeit untersuchte Staphylococcus epidermidis. Koagulase-negative Staphylokokken bilden einen Hauptbestandteil der normalen Haut- und Schleimhautflora bei Mensch und Tier. Nicht selten werden sie auch in verarbeiteten Tierprodukten gefunden, wie z.B. S. carnosus, oder in Umweltproben von Wasser oder Boden.
Einige KNS besitzen eine ausgeprägte Prädilektion für bestimmte Körperregionen wie S. capitis, der fast ausschließlich auf der behaarten Kopfhaut, S. auricularis nur in den äußeren Gehörgängen und S. haemolyticus sowie S. hominis, die meist im Bereich von Schweißdrüsen vorkommen.
Tabelle 2.1 Koagulase-negative und Koagulase-positive Staphylokokken Krankheiten
Art
Mensch Tier Koagulase-positiv
S. aureus Lokalinfektionen
• oberflächlich-eitrig
• tief-invasiv Sepsis, Endokarditis toxinbedingte Syndrome SSS (scalded-skin-syndrom) TSS (toxic-shock-syndrome) Nahrungsmittelintoxikation
lokale und systemische Eiterungsprozesse, Abszesse (viele Tierarten)
Mastitis (Rind, Schaf, Ziege, Pferd)
sporadische Aborte (Rind) Botryomykose (Pferd) Staphylomykose/
Staphylokokkose (Feldhase) Septikämie, Dermatitis, Osteomyelitis, Arthritis, Tendovaginitis, Synovitis,
"bumble foot" (Huhn/Pute)
S. hyicus exsudative Epidermitis
(Ferkelruß) (Schwein)
S. intermedius Pyodermie, Pyometra,
Otitis externa, Wundinfektionen (Hund/Katze) S. schleiferi subsp.
coagulans Otitis externa (Hund)
Koagulase-negativ S. epidermidis-Gruppe
S. epidermidis subklinische und klinische
Mastitis (Rind, Schaf, Ziege) Endoplastitis
Sepsis Peritonitis
S. hominis selten Protheseninfektionen S. haemolyticus selten Bakteriämie,
Endokarditis
S. warneri selten Protheseninfektionen S. capitis selten Protheseninfektionen S. saprophyticus-Gruppe
S. saprophyticus Harnwegsinfektionen S. xylosus selten Protheseninfektionen
S. cohnii selten Protheseninfektionen S. simulans selten Protheseninfektionen
(in Anlehnung an SELBITZ, 1997, HAHN et al., 2001, IGIMI et al., 1990)
2.2 Koagulase-negative Staphylokokken
2.2.1 Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus epidermidis kommt auf der gesamten Körperoberfläche vor, bevorzugt auf Arealen der Haut und der Schleimhäute, die natürliche Körperöffnungen umgeben. Die höchsten Populationsdichten finden sich mit 103-106 CFU/cm² an den Ausgängen von Schweißdrüsen, Haartalgdrüsen und den Nasenschleimhäuten des Menschen. Geringere Populationsdichten von bis zu 103CFU/cm² können an trockeneren Habitaten wie beispielsweise den Außenseiten der Extremitäten nachgewiesen werden (KLOOS, 1997;
KLOOS und BANNERMAN, 1994). In den vergangenen 25 Jahren hat S. epidermidis zunehmend als Erreger nosokomialer Infektionen insbesondere im Zusammenhang mit Kunststoff- und Metallimplantaten an Bedeutung gewonnen (MARTIN et al., 1989; PONCE DE und WENZEL, 1984; STILLMAN et al., 1987). Bei einigen Säugetierspezies, wie Rindern (BROWN, 1973; HOLMBERG, 1973; POUTREL, 1984), Ziegen (DEINHOFER und PERNTHANER, 1993; LEITNER et al., 2004; MORONI et al., 2004; MORONI et al., 2005; POUTREL, 1984) und Schafen (ARIZNABARRETA et al., 2002; BAUTISTA et al., 1986; DEINHOFER und PERNTHANER, 1993; FTHENAKIS und JONES, 1990;
GONZALEZ-RODRIGUEZ et al., 1995; WINTER et al., 2003) besitzt S. epidermidis eine Bedeutung als Mastitiserreger.
2.2.2 Bedeutung von Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS) bei der bovinen Mastitis
Die bovine Mastitis ist eine multifaktorielle Erkrankung, die durch eine Vielzahl von Erregerarten verursacht werden kann. Am häufigsten aber werden aus Milchpoben erkrankter Euterviertel bestimmte Staphylokokken- und Streptokokkenspezies isoliert. Hierbei sind S. aureus, Streptococcus dysgalactiae und Streptococcus uberis in den meisten Ländern die am häufigsten isolierten bakteriellen Erreger (AARESTRUP et al., 1995; JONSSON et al., 1991; MINISTRY OF AGRICULTURE AND FORESTRY MASTITIS COMMITTEE, 1989). Mastitiden können in subklinische und klinische Formen eingeteilt werden.
Subklinische Mastitiden, die ohne merkliche Eutergewebs- oder Milchveränderungen verlaufen und lediglich von einem erhöhten Milchzellgehalt (SCC) begleitet sind, gelten als
weitaus häufigste Euterentzündungen und verursachen durch ihre „Unscheinbarkeit“ enorme Schäden. Neben der Infektionsgefahr für eutergesunde Tiere durch Keimausscheidung und -anreicherung in der Umgebung, besitzen insbesondere die verringerte Milchmenge und die quantitative Veränderung der Milchbestandteile mit Abnahme der wertbestimmenden Inhaltsstoffe (HAMANN und GEDEK, 1995) ökonomische Bedeutung. Im Bereich der Direktvermarktung und der Produktion von Rohmilcherzeugnissen sind vor allem die lebensmittelhygienischen Aspekte zu berücksichtigen.
Koagulase-negative Staphylokokken spielen als schwach pathogene Keime der Milchdrüse bei bovinen Mastitiden eine Rolle (BABA et al., 1980; DEVRIESE, 1979; HODGES et al., 1984), wo sie eine der am häufigsten isolierten Erregergruppen darstellen (AARESTRUP und JENSEN, 1997; BABA et al., 1980; DEVRIESE, 1979; DEVRIESE und DE, 1980;
HUMMEL und LEHMANN, 1994; MYLLYS, 1995). Infektionen mit KNS verlaufen in der Regel milder als solche mit S. aureus, der eine besonders hohe Pathogenität für die Milchdrüse besitzt. Aus Milch mit abnormaler oder hoher somatischer Zellzahl (SCC) werden unter den Koagulase-negativen Staphylokokken am häufigsten S. epidermidis, S. hyicus, und S. chromogenes (BABA et al., 1980; DEVRIESE und DE, 1980; WATTS und OWENS, 1987), in neueren Studien auch S. simulans und S. xylosus isoliert (AARESTRUP et al., 1995;
HARMON und LANGLOIS, 1989; HONKANEN-BUZALSKI et al., 1994; JARP, 1991;
TODHUNTER et al., 1993). In einer kürzlich erschienenen Studie mit 298 KNS aus Fällen boviner subklinischer Mastitis in Deutschland wurden Isolate der Spezies S. chromogenes (32,2 %), S. simulans (23,2 %), S. epidermidis (11,7 %) sowie S. xylosus und S. haemolyticus (je 9,4 %) am häufigsten nachgewiesen (LÜTHJE und SCHWARZ, 2006). Infektionen der Milchdrüse mit S. epidermidis treten vorwiegend bei jungen Kühen während der frühen Laktation auf und verlaufen in der Regel subklinisch (HONKANEN-BUZALSKI et al., 1994). Die Heilungsraten von KNS-Mastitiden sind im allgemeinen hoch (HONKANEN-BUZALSKI et al., 1994). Ohne Behandlung liegen die Heilungsraten von S. epidermidis-infizierten Eutervierteln bei 34 % und in behandelten Fällen bei 72 %, während bei S. aureus-Infektionen trotz Behandlung eine Heilungsrate von nur 36 % erreicht wird (OSTERAS, 1982).
Ein Indiz für eine Infektion der Milchdrüse ist die Erhöhung der somatischen Zellzahl (SCC) in der Milch (NICKERSON et al., 1986). Die mit KNS-Infektionen assoziierten SCC-Werte
liegen bei 4,62 x 10 5 / ml Milch (BABA et al., 1980; BRAMLEY und NEAVE, 1975;
DEVRIESE und DE, 1980). Durch Senkung des Normalwertes der somatischen Zellzahl (SCC) von 5 x 105 / ml Milch auf 5 x 104 / ml Milch (HUSTON und HEALD, 1983; JONES et al., 1984; Anonym, 1980) wurde den Koagulase-negativen Staphylokokken eine größere Bedeutung als Mastitispathogene zugesprochen. Milchmengenverluste traten bereits oberhalb dieses Wertes auf (HOLMBERG, 1973; HUSTON und HEALD, 1983; JONES et al., 1984;
LINDE et al., 1975a; LINDE et al., 1975b; LINDE et al., 1975c; MORONI et al., 2005;
NATZKE et al., 1972; POUTREL und RAINARD, 1982; TIMMS und SCHULTZ, 1987).
Ein möglicher Virulenzfaktor von Koagulase-negativen Staphylokokken bei Infektionen der bovinen Milchdrüse ist die Fähigkeit verschiedene Toxine und Enzyme, wie Hämolysin, Leukozidin, Lipase, Proteasen und DNase zu produzieren (HEBERT und HANCOCK, 1985;
SCHEIFELE et al., 1987; WATTS und OWENS, 1987). KNS-Stämme, die aus Mastitisproben isoliert wurden, besaßen meist eine höhere Protease-, DNase- und Lecitinase-Aktivität als KNS Stämme von gesunden Kühen (KARADZHOV et al., 1981).
Jedoch bleibt die Rolle dieser Enzyme für die Pathogenese von KNS-Infektionen weiter unklar. Ein 34 bis 36 kDa Protein mit zytotoxischer und Casein-hydrolysierender Aktivität wurde bei vielen KNS, vor allem S. chromogenes isoliert (ZHANG und MADDOX, 2000).
Die proteolytische Aktivität konnte durch Zink und metallspezifische Inhibitoren vollständig gehemmt werden und legte nahe, dass es sich bei diesem Protein um eine Metalloprotease handelt. Diese Metalloprotease wird von verschiedenen Bakterienstämmen in unterschiedlicher Menge exprimiert und fungiert als Zytotoxizitätsfaktor bei klinischen und subklinischen bovinen Mastitiden als ein Virulenzfaktor (ZHANG und MADDOX, 2000).
Darüber hinaus konnte eine Reihe weiterer Metalloproteasen bei einigen KNS nachgewiesen werden (AYORA et al., 1994; AYORA und GÖTZ, 1994; TEUFEL und GÖTZ, 1993).
Weitere mögliche Virulenzfaktoren hinsichtlich einer Entzündung der Milchdrüse, wie die Fähigkeit zur Kollagenbindung (MAMÖ et al., 1988; MIEDZOBRODZKI et al., 1989;
WATTS et al., 1990), zur Elastasesynthese (WATTS et al., 1990) und zur Ausbildung eines Biofilms (WATTS et al., 1990) sind bei S. epidermidis, S. hyicus und S. chromogenes heterogen vertreten. Hierbei konnte für S. epidermidis gezeigt werden, dass die Kollagenbindungsfähigkeit ebenso wie die enzymatische Elastinlyse für die Virulenz gegenüber der Milchdrüse keine Rolle spielen (WATTS et al., 1990). Ein Vergleich der
somatischen Zellzahl (SCC) assoziiert mit einem Biofilm-positiven und einem Biofilm-negativen Phänotyp bei S. epidermidis-Stämmen zeigte nur einen geringen Unterschied auf (WATTS et al., 1990). So scheint die Ausbildung eines Biofilms, die bei humanen S. epidermidis-Isolaten den Hauptpathogenitätsfaktor bei Fremdkörper-assoziierten Infektionen darstellt (GÖTZ, 2002; MACK et al., 1996b), als Pathogenitätsindikator bei KNS, die von Mastitiden isoliert wurden, von nachrangiger Bedeutung zu sein. Hingegen konnte für S. aureus-Isolate bovinen Ursprungs gezeigt werden, dass die Ausbildung eines Biofilms mit chronischen bovinen Mastititiden assoziiert ist (CUCARELLA et al., 2001) und hier über das Oberflächenprotein Bap induziert wird. Ein Biofilm-positiver Phänotyp war mit einer signifikant erhöhten Fähigkeit der Kolonisierung und Persistenz der Erreger in der bovinen Milchdrüse in vivo assoziiert (TORMO et al., 2005a). Weiterhin zeigten Bap-positive Isolate eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Antibiotikatherapie, wenn sie in in vitro einen Biofilm-positiven Phänotyp ausbildeten (CUCARELLA et al., 2004). Bei ovinen und caprinen S. epidermidis-Stämmen von Mastitiden konnte ein zum bap-Gen von S. aureus homologes bap-Gen nachgewiesen werden (TORMO et al., 2005a). Jedoch zeigten nur wenige der untersuchten S. epidermidis-Stämme einen Biofilm-positiven Phänotyp (TORMO et al., 2005a), der in diesen Isolaten über einen alternativen PIA-unabhängigen Mechanismus des Oberflächenproteins Bap (biofilm associated protein) vermittelt wurde (TORMO et al., 2005a). Eine frühere Studie von WATTS et al., (1980) hatte gezeigt, dass die Synthese des zytolysierenden δ-Toxins durch S. epidermidis, im Gegensatz zur Biofilmbildung, Elastinsynthese und Kollagenbindung, mit einer stark erhöhten somatische Zellzahl (SCC) assoziiert ist und die Produktion des δ-Toxins ein zuverlässiger Indikator für die Pathogenität der aus Mastitisproben isolierten KNS ist. Weiterhin besitzen S. xylosus, S. hyicus und S. epidermidis die Fähigkeit, durch einen rezeptorvermittelten Mechanismus an Milchdrüsenepithelzellen zu adhärieren und in diese zu internalisieren (ALMEIDA und OLIVER, 2001).
Andererseits wird ein protektiver Effekt von Infektionen der Milchdrüse mit S. epidermidis gegenüber Infektionen mit anderen Mastitispathogenen diskutiert. In den Studien von LINDE et al. (1980) und RAINARD und POUTREL (1988) konnte eine Schutzwirkung von KNS-Infektionen gegenüber experimentellen S. aureus- (POUTREL und LERONDELLE, 1980), Str. agalactiae- und Str. dysgalactiae-Infektionen der Milchdrüse nachgewiesen
werden. Auch gegenüber einer Infektion der Milchdrüse mit Escherichia coli wurde eine solche Wirkung beobachtet.
Man vermutet, dass diese Schutzwirkung auf der mit einer KNS-Infektion einhergehenden Erhöhung der somatischen Zellzahl in der Milchdrüse basiert (BRAMLEY, 1978;
HOLMBERG, 1986). Die zuvor beschriebene Schutzwirkung von KNS-Infektionen konnte durch eine neuere Studie von MATTHEWS et al. (1991), bei der die Prävalenz von Neuinfektionen bei zuvor nicht infizierten Eutervierteln durchschnittlich zweimal so hoch wie bei bereits mit KNS-infizierten Vierteln lag, bestätigt werden. Widersprüchlich waren die Ergebnisse der Arbeitsgruppe um HOGAN et al. (1988), bei denen die Infektionsrate mit Streptokokken in zuvor KNS-infizierten Eutervierteln stieg und die Infektionsraten von Coliformen sowie von S. aureus (DAVIDSON et al., 1992) jedoch nicht beeinflusst wurden.
Das Resistenzverhalten von S. epidermidis-Stämmen aus Milchproben entzündeter Euterviertel gegenüber verschiedenen Antibiotika hat sich in den letzten 20 Jahren kaum verändert. Die Mehrzahl der untersuchten S. epidermidis-Stämme war empfindlich gegenüber den Antibiotika Penicillin, Streptomycin, Chloramphenicol, Erythromycin und Tetracyclin (AARESTRUP et al., 1995; AKAY et al., 1987; KAPUR et al., 1981; NOWAKOWSKI, 1980). Gegenüber Sulfonamiden und dem Antibiotikum Colistin (AKAY et al., 1987) hingegen waren die Stämme weitestgehend resistent (KAPUR et al., 1981; MYLLYS, 1995;
NOWAKOWSKI, 1980). Die gebräuchlichsten Mastitiswirkstoffe Penicillin/Novobocin, Cefalotin, Ceftiofur, Oxacillin, Ampicillin, Erythromycin, Pirlimycin und Clindamycin wurden in einer kürzlich erschienenen Studie von LÜTHJE und SCHWARZ (2006) bei 298 KNS aus Fällen subklinischer Mastitis untersucht. Dabei zeigten die KNS Isolate eine niedrige Resistenz gegenüber allen getesteten antimikrobiellen Wirkstoffen, mit Ausnahme von Ampicillin. Bei einem Vergleich der Antibiogramme von kommensalen S. epidermidis-Isolaten der menschlichen Haut und Isolaten, die aus routinemäßig gezogenen Milchproben von Milchviehherden mit einer hohen Prävalenz subklinischer Mastitiden isoliert wurden, ergaben sich interessanterweise weitgehende Übereinstimmungen hinsichtlich des Resistenzverhaltens (THORBERG et al., 2006).
2.2.3 Pathogenese von Fremdkörper-assoziierten Infektionen
S. epidermidis bildet eine der Hauptursachen für nosokomial erworbene Bakteriämien und Fremdkörper-assoziierte Infektionen, die zu erhöhter Morbidität und Mortalität betroffener Patienten führen (BOYCE, 1997; KLOOS und BANNERMAN, 1994; RUPP und ARCHER, 1994; VACHEETHASANEE et al., 1998). Bei Infektionen von Venenkathetern, intraperitonealen Kathetern der kontinuierlichen ambulanten Peritonealdialyse, Liquorshunts, künstlichen Herzklappen, Gelenkprothesen oder Herzschrittmacherelektroden kommt S. epidermidis mit seiner Fähigkeit zur Biofilmbildung auf Polymeroberflächen eine besondere Bedeutung zu (KLOOS, 1997; KLOOS und BANNERMAN, 1994). Zu den Risikofaktoren für eine nosokomiale Infektion mit KNS gehören die Immunsuppression (vornehmlich Neutropenie), die intravenöse Applikation von Flüssigkeiten und insbesondere implantierte Fremdkörper oder Katheter auch bei immunkompetenten Personen (BOYCE, 1997). Die verursachenden S. epidermidis-Stämme dieser Infektionen stammen meist aus der endogenen Haut- oder Schleimhautflora des Patienten (RUPP und ARCHER, 1994).
Allerdings konnte auch eine Transmission durch das Krankenhauspersonal nachgewiesen werden (BOYCE, 1997). Angesichts der großen Populationsdichte von Staphylokokken auf der menschlichen Haut und der damit verbundenen hohen Kontaminationsgefahr von Patientenmaterial, kommt es bei der Diagnose zu Komplikationen, klinisch signifikante Stämme von Kontaminanten zu unterscheiden (HERWALDT et al., 1996; KLEEMAN et al., 1993; KLOOS und BANNERMAN, 1994). Die trotz Antibiotikaprophylaxe auftretende Infektionsrate bei Implantaten liegt bei 0,5 % bis 1 % (RUPP und ARCHER, 1994). Eine wirksame Therapie von Fremdkörperinfektionen ist häufig schwierig, da sich die meisten im Krankenhaus akquirierten S. epidermidis-Stämme durch eine Vielzahl von Antibiotikaresistenzen auszeichnen und eine Heilung der Fremdkörper-assoziierten Infektion meist nur durch die Entfernung des Fremdmaterials zu erreichen ist (RUPP und ARCHER, 1994). So sind bis zu 80 % der Stämme resistent gegen das Beta-Laktamantibiotikum Methicillin und anderen Substanzen wie Gentamicin (ARCHER und CLIMO, 1994;
CHAMBERS, 1997; FRIDKIN et al., 2001; RUPP und ARCHER, 1994). Die Methicillinresistenz von S. epidermidis ist oft von der Präsenz des Biofilm-vermittelnden icaADBC-Operons begleitet (CHRISTENSEN et al., 1982; FREBOURG et al., 2000;
KOZITSKAYA et al., 2004).
2.2.3.1 Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis
Einen ersten Hinweis darauf, dass bei den Katheter-assoziierten Infektionen ein Biofilm beteiligt ist, brachten elektronenmikroskopische Bilder von infizierten Kathetern (PETERS et al., 1982). Hier zeigte sich die charakteristische Anordnung der S. epidermidis-Zellen in vielschichtigen Lagen, eingebettet in einer amorphen Substanz, vermutlich bestehend aus Exopolysacchariden (FRANSON et al., 1984; MARRIE und COSTERTON, 1984). Stämme, die in einem in vitro-Test in 96-Loch Zellkulturschalen einen Biofilm ausbildeten, waren häufiger mit signifikanten Infektionen korreliert als Biofilm-negative Stämme (BADDOUR et al., 1986; CHRISTENSEN et al., 1985; DAVENPORT et al., 1986; DEIGHTON und BALKAU, 1990; DUNNE, Jr. et al., 1987; ISHAK et al., 1985; YOUNGER et al., 1987;
ZIEBUHR et al., 1997). Die Organisation in einem Biofilm schützt die Bakterienzellen nicht nur vor wirtseigenen Immunmechanismen (HEINZELMANN et al., 1997; PETERS et al., 1982), sondern führt auch zu einer verminderten Antibiotikaempfindlichkeit der Erreger (CHUARD et al., 1991; DUGUID et al., 1992; EVANS und HOLMES, 1987; FARBER et al., 1990; GANDER, 1996; GRISTINA et al., 1989; SHETH et al., 1985; WIDMER et al., 1990).
Die Ausbildung des Biofilms von S. epidermidis verläuft in zwei Phasen (Abb. 2.1) (MACK, 1999). In der ersten Phase kommt es zur Anheftung der Bakterien an die Kunststoffoberfläche, der sogenannten primären Adhäsion. In der zweiten Phase folgt eine Proliferation und Akkumulation der Bakterien in vielschichtigen Zellagen, die in einer extrazellulären, häufig als Schleim oder Glykokalyx bezeichneten Matrix, eingebettet sind.
Diese Akkumulation der Bakterien erfordert eine interzelluläre Adhäsion, um ein Ablösen der Zellen ohne Kontakt zur Polymeroberfläche zu verhindern (MACK et al., 1996b). Insgesamt ist die Biofilmbildung von S. epidermidis ein äußerst komplexer Vorgang, der von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, von denen bisher erst ein Teil erforscht und verstanden ist.
Abb. 2.1 Zwei-Phasen-Modell der Biofilmbildung von S. epidermidis nach MACK et al. (2000a)
2.2.3.2 Primäre Adhäsion von Staphylococcus epidermidis
Die primäre Adhäsion von S. epidermidis ist in vivo ein komplexer Vorgang, da sowohl Polymeroberflächen als auch die Bakterienoberflächen in dem dynamischen System des Wirtes Veränderungen unterworfen sind. Zunächst ist die primäre Phase der Adhäsion von S. epidermidis an unbeschichteten Polymeroberflächen von unspezifischen (Oberflächenbeschaffenheit, Ladung oder Hydrophobizität von Polymer- und Bakterienoberfläche) (HEILMANN et al., 1996a; LUDWICKA et al., 1984) als auch spezifischen Adhäsionsmechanismen abhängig. Ein Faktor dabei ist das verwendete Polymer (HOGT et al., 1985; LUDWICKA et al., 1984). Über hydrophobe oder ionische Wechselwirkungen oder van der Waals Kräfte treten die Bakterienzellen mit ihrer Oberfläche mit dem Polymer in Verbindung (KLOOS, 1997). Untersuchungen in vitro haben gezeigt, dass hydrophobe Stämme besser als hydrophile an verschiedene medizinische Polymere adhärieren (CHRISTENSEN et al., 1994; PASCUAL et al., 1986; VACHEETHASANEE et al., 1998). Dieser Zusammenhang kann zwar häufig, aber nicht in allen Fällen nachgewiesen werden (HOGT et al., 1985; KRISTINSSON, 1989). Um jedoch eine erfolgreiche Kolonisation der Oberfläche zu erreichen, ist vermutlich eine spezifischere Adhäsion zur Festigung der primären Adhäsion notwendig (KLOOS, 1997). Unmittelbar nach Implantation des Polymers kommt es häufig zu Beschichtungen mit Plasmaproteinen, extrazellulären Matrixproteinen, Thrombozyten und anderen Komponenten, die die Adhäsion beeinflussen (KLOOS und BANNERMAN, 1994). Dabei zeigte sich, dass die Anheftung an Polymeroberflächen in Anwesenheit von Serum, Plasma und Albumin deutlich vermindert ist
(MULLER et al., 1991). Die Matrixproteine Fibronektin und Fibrinogen verbessern dagegen die Anheftung (BARTSCHT, 2001; HERRMANN et al., 1988; VAUDAUX et al., 1989).
Bislang sind nur wenige spezifische Faktoren für die primäre Adhäsion von S. epidermidis an beschichteten oder unbeschichteten Polymeren bekannt (Tabelle 2.2).
Tabelle 2.2 Spezifische Adhäsionsfaktoren von S. epidermidis
Adhäsionsfaktor Bindungsmotiv Referenz
Fibrinogen-bindendes Protein (FBE) Fibrinogen NILSSON et al., 1998, PEI et al., 1999
Autolysin (AtlE) Polystyrol HEILMANN et al.,
1996a, HEILMANN et al., 1997
Staphylococcal surface protein (SSP-1) Polystyrol TIMMERMANN et al., 1991, VEENSTRA et al., 1996
Kapsuläres Polysaccharid/Adhäsin (PS/A) Silikonkatheter Nicht Polyethylen
HIGASHI et al., 1998, MULLER et al., 1993a;
TOJO et al., 1988 Extrazelluläres Matrix-bindendes Protein (Embp) Fibronektin
Hyaluronat
Plasminogen Heparin
NILSSON et al., 1998, WILLIAMS et al., 2002
Biofilm-assoziiertes Protein (BHP) Polystyrol CUCARELLA et al., 2001
Durch die Behandlung von S. epidermidis mit Proteasen lässt sich die Adhäsion an Polymeroberflächen inhibieren, was auf eine Beteiligung von Proteinstrukturen hindeutet (HOGT et al., 1986; PASCUAL et al., 1986). Als spezifischer Faktor konnte ein Zellwand-assoziiertes Fibrinogen-bindendes Protein (Fbe) von S. epidermidis ermittelt werden, dessen kodierendes Gen kloniert und sequenziert wurde (HARTFORD et al., 2001;
HERRMANN et al., 1988; NILSSON et al., 1998; PEI und FLOCK, 2001).
Sequenzvergleiche ergaben eine Ähnlichkeit des Fbe-Proteins mit dem Zellwand-gebundenen Fibrinogenrezeptor (ClfA) von S. aureus. Fbe enthält ein für Oberflächen-assoziierte Proteine
typisches LPXTG-Motiv sowie eine charakteristische Transmembranregion. Die funktionelle Beteiligung an der primären Adhäsion wurde experimentell belegt. Sowohl das gereinigte Protein als auch Fbe-spezifische Antikörper sind in der Lage, die Adhäsion von S. epidermidis an immobilisiertes Fibrinogen effektiv zu inhibieren (PEI et al., 1999). Das Protein kodierende fbe-Gen besitzt eine hohe Prävalenz bei klinischen S. epidermidis-Isolaten (ARCIOLA et al., 2004; NILSSON et al., 1998; ROHDE et al., 2004), allerdings scheint dieser Faktor oder seine Expression sehr variabel zu sein, denn viele Stämme weisen nur eine schwache Bindung an Fibrinogen-beschichtete Polymere auf (GALDBART et al., 2000a;
NILSSON et al., 1998).
Weiterhin ist für ein dem Autolysin Atl von S. aureus homologes Protein AtlE eine Beteiligung an der primären Adhäsion an unbeschichteten Oberflächen gezeigt worden (HEILMANN et al., 1996a; HEILMANN et al., 1997). AtlE ist ein 148 kDa großes Multidomänenprotein, das aus zwei bakteriolytisch aktiven Domänen, einer 60 kDa Amidase und einer 52 kDa Glucosaminidase besteht. Eine Transposonmutante von S. epidermidis O-47 (mut1) mit Biofilm-negativem Phänotyp ist adhäsionsdefizient an Polystyrol und weist eine stark verminderte Hydrophobizität im Vergleich zum Wildtyp S. epidermidis O-47 auf. Da der Stamm aber weiterhin in der Lage ist, einen Biofilm an Glas zu bilden, müssen weitere Adhäsionsfaktoren vorhanden sein. In der Mutante mut1 fehlten mehrere Zelloberflächen-assoziierte Proteine. Die initiale Anheftung konnte mit der Subklonierung des 60 kDa Proteins in die Mutante mut1 komplementiert werden und hierdurch AtlE eine Rolle bei der Bindung an die Polymeroberfläche während der frühen Phase der Adhäsion zugesprochen werden (HEILMANN et al., 1996a; HEILMANN et al., 1997). Die Bedeutung von AtlE für die Pathogenese im Infektionsprozess konnte in einem Rattenmodell belegt werden (RUPP und FEY, 2001). Zusätzlich besitzt dieses Zelloberflächenprotein Bindungsmotive für ein in der extrazellulären Matrix und im Serum vorkommendes Protein, das sogenannte Vitronektin (HEILMANN et al., 1997). Die Beteiligung von AtlE an der Adhäsion von Zellen auch an Plasmaprotein-bedeckte Polymeroberflächen konnte durch eine konstante Expression des atlE-Gens während des gesamten Verlaufs Fremdkörper-assoziierter Infektionen bestätigt werden (VANDECASTEELE et al., 2003b).
Ein weiteres 280 kDa-Protein, SSP-1 (staphylococcal surface protein), wurde als Adhäsionsfaktor an unbeschichteten Polystyrolkugeln beschrieben (TIMMERMANN et al.,
1991; VEENSTRA et al., 1996). Spezifische, gegen dieses Protein gerichtete Antikörper inhibierten konzentrationsabhängig die primäre Adhäsion von S. epidermidis 354 an den Kugeln. Durch proteolytische Prozessierung war es möglich, SSP-1 in ein etwa 220 kDa-Protein SSP-2 ohne adhäsive Funktion zu überführen.
Ebenfalls als Adhäsionsfaktor des Biofilm-positiven Stammes S. epidermidis RP62A wurde ein kapsuläres Polysaccharid/Adhäsin (PS/A) isoliert, dessen Zusammensetzung zunächst als aus Galaktose, Glucosamin, Galaktosamin und Uronsäure bestehend beschrieben wurde (TOJO et al., 1988). PS/A vermittelt die Adhäsion an Silikonkatheter (MULLER et al., 1993a) nicht aber an Polyethylen (HIGASHI et al., 1998). Diverse gut charakterisierte S. epidermidis-Stämme zeigten gleiche Reaktivität sowohl mit dem PS/A- als auch mit dem PIA-Antiserum. Nach Reevaluation wurde beschrieben, dass es nun ein Polysaccharid mit β-1,6-verknüpften Glucosamineinheiten, hochgradig substituiert mit Succinat und Acetat ist.
Zudem wird PS/A wie PIA vom icaADBC Genort synthetisiert (MCKENNEY et al., 1998).
Dieses lässt vermuten, dass es sich bei PS/A ebenfalls um ein verwandtes Polysaccharid von PIA, wenn nicht sogar dasselbe handelt (MACK et al., 2000b).
Für die Identifizierung eines Fibronektin-bindenden Proteins bei S. epidermidis wurde eine phage display library der S. epidermidis DNS unter Verwendung des Phagenvektors pG8SAET erstellt und ein Protein Embp (extracellular matrix binding protein) mit Fibronektin-bindender Domäne isoliert. Die Fibronektin-bindende Domäne bindet mit einem geringeren Grad als an Fibronektin auch an andere Matrixkomponenten wie Plasminogen, Heparin und Hyaluronat (NILSSON et al., 1998; WILLIAMS et al., 2002).
Bei humanen S. epidermidis-Isolaten wurde ein zum bap-Gen von S. aureus homologes Gen bhp (biofilm homologue protein) identifiziert, für das ebenfalls eine Beteiligung an der primären Adhäsion als auch der akkumulativen Phase der Biofilmbildung postuliert wird (CUCARELLA et al., 2001).
2.2.3.3 Faktoren der akkumulativen Phase
Innerhalb eines mehrschichtigen Biofilms, in dem nur die wenigsten Bakterien einen direkten Kontakt zur Polymeroberfläche haben, sind Faktoren notwendig, die eine Adhäsion der Bakterienzellen untereinander bewirken. Als wesentlicher Faktor der Adhäsion wird das interzelluläre Polysaccharid-Adhäsin (PIA) angesehen, das die Zell-zu-Zell Adhäsion
innerhalb des S. epidermidis Biofilms vermittelt (MACK et al., 1996b; MACK et al., 1996a).
Dieses Polysaccharid wurde ursprünglich durch seine spezifische Reaktion mit einem Antiserum gegen den Biofilm-bildenden Stamm S. epidermidis 1457 isoliert (MACK et al., 1992). Gemäß seiner Funktion wurde dieses Polysaccharid PIA (polysaccharide intercellular adhesin) genannt (HEILMANN et al., 1996b). Im Vergleich des Wildtyps mit den Biofilm-negativen Transposonmutanten 1457-M10 und 1457-M11 konnte die Funktion von PIA als Faktor, der interzelluläre Adhäsion vermittelt, eindeutig gezeigt werden (MACK et al., 1994). Die PIA-negativen Mutanten, die als Klasse I-IV Mutanten bezeichnet wurden, sind nicht in der Lage in einem Biofilm zu akkumulieren oder größere Zellaggregate zu bilden.
Exopolysaccharide (EPS) sind als ein großer Bestandteil der Matrix von Biofilmen für die meisten Vorteile verantwortlich, die ein Biofilm den Bakterien bietet. Die Exopolysachariden von S. epidermidis können eine Reihe von Schutzmechanismen des Wirtes hemmen und schützen das Bakterium vor Detergentien, Antibiotika, Antikörper und Phagozytose. Neben der direkten Beeinflussung der Phagozytenfunktionen, wie der Wanderung entlang chemotaktischer Gradienten und dem oxidativen Burst sowie der T-Zell-Aktivierung (FALCIERI et al., 1987; GRAY et al., 1984; JOHNSON et al., 1986; SCHWARZMANN und BORING, 1971; VERINGA et al., 1989), kommt es zu einer Stimulation der Monozyten PGF2-Produktion (STOUT et al., 1992), die wiederum die T-Zell-Proliferation hemmt.
Das aus S. epidermidis analysierte Polysaccharid PIA wurde mittels Gelfiltration und Ionenaustauscherchromatographie in zwei sehr ähnliche Polysaccharidfraktionen aufgereinigt, die als Polysaccharide I und II bezeichnet wurden (HEILMANN et al., 1996b).
Polysaccharid I macht mehr als 80 % der Gesamtmenge des gereinigten Polysaccharids aus und ist ein lineares Homoglykan aus durchschnittlich 130 β-(1,6)-verknüpften N-Acetylglucosamin Einheiten. Von diesen sind etwa 15-20 % nicht N-acetyliert und somit positiv geladen. Polysaccharid II ist strukturell eng verwandt und enthält Phosphat und Succinat, wodurch es einen leicht anionischen Charakter erhält. Außerdem sind im Mittel mehr Glucosaminreste N-acetyliert als in Polysaccharid I. Für die Antigenität von PIA erwiesen sich sowohl die β-(1,6)-glycosidischen Bindungen als auch die acetylierten Aminogruppen als notwendig (MACK et al., 1996a). HEILMANN et al. (1996a) isolierten ebenfalls Biofilm-negative Transposonmutanten, Klassen A und B, des Biofilm-positiven
S. epidermidis Stammes O-47 (HEILMANN et al., 1996a). Eine Komplementierung der Klasse B-Mutanten mit einem korrespondierenden Wildtyp-DNS-Fragment auf einem Plasmid führte zur Wiederherstellung der Biofilmbildung und der PIA-Produktion (HEILMANN et al., 1996a). Das auf diesem Fragment identifizierte Operon wurde seiner interzellulären Adhäsion vermittelnden Funktion wegen ica-Operon (intercellular adhesion) genannt. Das ica-Operon besteht aus den vier Genen icaA, icaD, icaB, und icaC (ARCIOLA et al., 2005; GERKE et al., 1998). IcaA, C und D sind Membranproteine mit enzymatischer Aktivität. Das Protein IcaA weist vier Transmembrandomänen auf und besitzt in vitro eine geringe N-Acetylglucosaminyl-Tranferaseaktivität mit UDP-N-Acetylglucosamin als Substrat, die in Anwesenheit von IcaD verstärkt wird (GERKE et al., 1998; HEILMANN et al., 1996b). N-Acetylglucosaminoligomere, die durch IcaAD synthetisiert werden, besitzen eine maximale Länge von nur 20 Resten. Bei Koexpression von IcaADC werden längere Oligomerketten synthetisiert, die mit spezifischem PIA-Antiserum reagieren (GÖTZ, 2002).
Das hydrophobe Transmembranprotein IcaC ist für die PIA-Synthese zwingend erforderlich.
IcaB ist ein extrazelluläres Protein, dass für die Modifizierung des für die Biofilmbildung essentiellen Exopolysacharidpolymers verantwortlich ist (VUONG et al., 2004b). Es deacetyliert das Poly-N-Acetylglucosamin-Molekül und gibt ihm einen kationischen Charakter. Bei isogenen icaB Mutanten mit nicht acetylierten Poly-Acetylglucosaminen fehlte die Fähigkeit, sich an Bakterienzelloberflächen anzuheften (VUONG et al., 2004b).
Die Bedeutung von PIA für die Infektion wurde in zwei Tiermodellen unter Verwendung des PIA-exprimierenden Stammes S. epidermidis 1457 und der PIA-negativen Mutante 1457-M10 gezeigt. In einem Mausmodell konnte mit dem Wildtypstamm im Gegensatz zur Mutante häufiger die Entstehung subkutaner Katheter-Abszesse nachgewiesen werden (RUPP et al., 1999b). In einem Rattenmodell konnte die gehäufte Infektion an einem intravenösen Katheter durch den Wildtyp gezeigt werden (RUPP et al., 1999a). Inzwischen konnte ausgeschlossen werden, dass PIA unter den Standard-Biofilm-Testbedingungen während der primären Adhäsion von Bedeutung ist (BARTSCHT, 2001). Neben der Funktion als interzelluläres Adhäsin besitzt PIA jedoch mindestens eine weitere Funktion. Es dient als aktive Substanz bei der Agglutination von Erythrozyten, eine Fähigkeit, die viele S. epidermidis-Isolate besitzen (MACK et al., 1999). Bereits früh wurde gezeigt, dass die Fähigkeit zur Agglutination von Erythrozyten mit der Biofilmbildung korreliert (RUPP und ARCHER,
1992). Das Hämagglutinin besaß auch viele Eigenschaften, die auf ein Polysaccharid als funktionellen Bestandteil schließen ließen (RUPP et al., 1995). Eine Korrelation zwischen der Menge an produziertem PIA und Hämagglutinationstitern konnte beobachtet werden (FEY et al., 1999). Schließlich wurde PIA als Hämagglutinin oder zumindest als ein notwendiges funktionelles Element desselben identifiziert (FEY et al., 1999).
Das ursprünglich als Adhäsionsfaktor an Silikonkathetern isolierte PS/A von RP62A kann von einem rekombinanten, das ica-Operon tragenden S. carnosus Stamm gebildet werden (MCKENNEY et al., 1998). Dieser Stamm besitzt außerdem die Fähigkeit zur Aggregation und für einen anderen PS/A-positiven Stamm und für eine Biofilm-negative Transposonmutante konnte gezeigt werden, dass der Verlust von PS/A zu einem Verlust der interzellulären Aggregation führt (HIGASHI et al., 1998). Möglicherweise handelt es sich bei PIA und PS/A um Derivate desselben Glucosaminpolymers, das stammspezifisch und/oder durch variierende externe Bedingungen unterschiedlich stark N-acetyliert oder N-succinyliert vorliegt. Sowohl für PIA als auch für das sehr ähnliche PS/A konnte in Studien mit klinischen Isolaten eine Korrelation zwischen der Expression des Antigens und der Fähigkeit zur Biofilmbildung festgestellt werden (MACK et al., 1996b; MULLER et al., 1993b).
Ein weiteres Polysaccharid war wie PS/A aus S. epidermidis RP62A isoliert worden und wurde als SAA (slime associated antigen) bezeichnet (CHRISTENSEN et al., 1990).
Während erste chemische Analysen durch einen geringen Galaktosegehalt zu einer Abgrenzung von PS/A führten, wurde in einer jüngeren Studie dargelegt, dass gereinigtes SAA zu mehr als 70 % des Trockengewichtes aus N-Acetylglucosamin besteht (BALDASSARRI et al., 1996). Zudem waren alle getesteten Biofilm-positiven Isolate SAA-positiv. Dies lässt vermuten, dass es sich bei diesem Polysaccharid um PIA, oder um eine PIA-Variante handeln könnte (GÖTZ, 2000).
Auch Infektionen durch PIA-negative Stämme konnten beobachtet werden, was die Existenz PIA-unabhängiger Mechanismen der Biofilmakkumulation nahelegt. Neben den Polysacchariden PIA, PS/A und SAA, scheinen Proteinstrukturen eine Rolle zu spielen.
Mittels chemischer Mutagenese mit Mytomicin C wurde eine Mutante M7 von S. epidermidis RP62A erzeugt. Diese Mutante war Biofilm-negativ, während ihre initiale Adhäsion an Glas oder Polystyrol aber nicht betroffen war (SCHUMACHER-PERDREAU et al., 1994). Die
Mutante M7 war nicht mehr in der Lage ein 140 kDa großes extrazelluläres Protein Aap (accumulation associated protein) zu exprimieren. Aap vermittelt Polysacharid-unabhängig die interzelluläre Adhäsion und führt zur Biofilmakkumulation von S. epidermidis (HEILMANN et al., 1997; SCHUMACHER-PERDREAU et al., 1994; ROHDE et al., 2005).
Allerdings führt die Expression des aap-Gens in voller Länge, im Gegensatz zur prozessierten 140 kDa Aap Isoform, nicht zu einem Biofilm-positiven Phänotyp. Um adhäsive Funktion zu erlangen, wird das Wildtypprotein durch Staphyloproteasen proteolysiert, wobei auch exogen zugeführte Granulozytenprotease Aap aktivieren kann (ROHDE et al., 2004). Diese Ergebnisse zeigten, dass eine direkte Aktivierung der Protein-abhängigen Zellaggregation und Biofilmbildung von S. epidermidis durch Effektormechanismen des wirtseigenen Immunsystems möglich ist (ROHDE et al., 2004). In humanen S. epidermidis-Isolaten konnte wie zuvor beschrieben ein zum bap-Gen von S. aureus homologes Gen bhp identifiziert werden, für das eine Beteiligung an der primären Adhäsion und der akkumulativen Phase der Biofilmbildung postuliert wird (CUCARELLA et al, 2001).
2.2.3.4 Regulative Faktoren der Biofilmbildung
Eine phänotypische Variabilität der Biofilmexpression von S. epidermidis wird sowohl in vivo als auch in vitro beobachtet (BADDOUR et al., 1984; BADDOUR et al., 1990;
CHRISTENSEN et al., 1987; CHRISTENSEN et al., 1990; DEIGHTON et al., 1992;
ZIEBUHR et al., 1997; ZIEBUHR et al., 1999). Die Adhäsion, icaADBC-Transkription, PIA-Synthese und Biofilmbildung durch Staphylokokken erfolgt in Abhängigkeit unterschiedlicher Umweltfaktoren wie Zuckerkonzentration (RACHID et al., 2000b), Osmolarität im Medium (FITZPATRICK et al., 2002; KNOBLOCH et al., 2001; RACHID et al., 2000b; RACHID et al., 2000a), Temperatur (KONIG et al., 1998; RACHID et al., 2000a;
VAN WAMEL et al., 1998), O2-Spannung (CRAMTON et al., 2001) sowie unter Einfluß subinhibitorischer Konzentrationen von Antibiotika (FITZPATRICK et al., 2002; RACHID et al., 2000b) und Desinfektionsmitteln (FITZPATRICK et al., 2002; KNOBLOCH et al., 2002).
Mittels Transposonmutagenese mit Hilfe des temperatursensitiven Plasmids pTV1ts, welches das aus Enterococcus faecalis stammende Transposon Tn917 (SHAW und CLEWELL, 1985;
YOUNGMAN et al., 1983) enthält, konnten Mutanten mit einem Biofilm-negativen Phänotyp beziehungsweise mit verminderter Biofilmbildung generiert werden (MACK et al., 2000b).
Diese Mutanten wurden nach ihrem phänotypischen Verhalten in die Klassen I bis IV eingeteilt. Es konnte gezeigt werden, dass der Biofilm-negative Phänotyp der Klasse I Mutanten auf einer Inaktivierung des icaADBC-Operons beruht (MACK et al., 2000b). Die Klasse II Mutanten wiesen neben einem Biofilm-negativen Phänotyp eine Veränderung der Koloniemorphologie mit grauen bis durchscheinenden Kolonien auf, die sich von den weißen Kolonien des Wildtyps deutlich abgrenzen ließen (MACK et al., 2000b). Die Klasse III Mutanten M15 und M19 zeichneten sich ebenfalls durch eine stark verminderte Biofilmbildung und eine graue Koloniemorphologie aus. Die in ihrer Koloniemorphologie im Vergleich zum Wildtyp unveränderte Klasse IV Mutante M17 zeigte charakteristischerweise in Medien unterschiedlicher Hersteller eine differentielle Expression der Biofilmbildung (MACK et al., 2000b). Durch Expression des icaADBC-Operons in trans in den Mutanten der Klasse II bis IV und der daraus resultierenden Rekonstitution der PIA- und Biofilmbildung konnte gezeigt werden, dass es sich bei den inaktivierten Genorten um regulative Elemente der Biofilmbildung handelt (MACK et al., 2000b). Weiterhin konnte für die inaktivierten Genorte der Mutanten der Klasse II bis IV ein Einfluß auf die Expression der Oxacillinresistenz in S. epidermidis 1057 nachgewiesen werden (MACK et al., 2002).
Für die Klasse III Mutante M15 konnte nachgewiesen werden, dass Tn917 19 Basen unterhalb des Translationsstarts eines offenen Leserahmens mit hoher Homologie zu dem ersten Gen rsbU des σB-Operons in S. aureus (KNOBLOCH et al., 2001; KNOBLOCH et al., 2003; KULLIK und GIACHINO, 1997; WU et al., 1996), sowie den entsprechenden Homologen in Bacillus subtilis (KALMAN et al., 1990; WISE und PRICE, 1995) und Listeria monocytogenes (BECKER et al., 1998) lokalisiert ist. Das σB-Operon kodiert für den alternativen Sigmafaktor σB, welcher 1979 erstmalig von Haldenwang und Losick in B. subtilis beschrieben wurde (HALDENWANG und LOSICK, 1979; HALDENWANG und LOSICK, 1980). Sigmafaktoren vermitteln durch Bindung an die RNA-Polymerase die Erkennung spezifischer Promotorsequenzen und erlauben somit eine gezielte Transkription einzelner Gene. Die Charakterisierung der flankierenden chromosomalen Bereiche ergab, dass in S. epidermidis unterhalb des Homolog von rsbU drei weitere offene Leserahmen mit identischer Abfolge und hoher Homologie zu rsbV, rsbW und σB von S. aureus, B. subtilis und L. monocytogenes lokalisiert sind (KNOBLOCH et al., 2001). Wie in S. aureus wurden für S. epidermidis keine Homologe der Gene rsbR, rsbS, rsbT und rsbX des σB-Operons von
B. subtilis nachgewiesen (KNOBLOCH et al., 2001), so dass aufgrund der hohen Homologie zu den Genen in S. aureus die entsprechenden Gene in S. epidermidis als rsbU, rsbV, rsbW und σB bezeichnet wurden (KNOBLOCH et al., 2001; KNOBLOCH et al., 2004). In B. subtilis und S. aureus konnte demonstriert werden, dass die σB-Aktivität auf posttranskriptioneller Ebene durch die im σB-Operon kodierten Regulatorproteine (RsbU, RsbV, RsbW) kontrolliert wird. RsbW fungiert als negativer Regulator (Anti-Sigmafaktor), da es ist in der Lage ist, σB zu binden und somit die Bindung des alternativen Sigmafaktors an die RNA-Polymerase zu verhindern (BENSON und HALDENWANG, 1992; BENSON und HALDENWANG, 1993a; BENSON und HALDENWANG, 1993b; DUFOUR und HALDENWANG, 1994; MIYAZAKI et al., 1999). Gleichzeitig besitzt RsbW eine spezifische Kinase-Aktivität für den Anti-Anti-Sigma-Faktor RsbV (ALPER et al., 1996;
DUFOUR und HALDENWANG, 1994; YANG et al., 1996). Lediglich die nicht-phosphorillierte Form von RsbV ist in der Lage, RsbW zu binden und somit den Anti-Sigmafaktor zu inaktivieren. Der Phosphorilierungsgrad von RsbV wird durch den Energiezustand der Zelle sowie die RsbV-spezifische Phosphatase RsbU reguliert (BANDOW et al., 2002; BRODY et al., 2001; EYMANN und HECKER, 2001; GIACHINO et al., 2001;
PALMA und CHEUNG, 2001; VIJAY et al., 2000; VOELKER et al., 1995; VOELKER et al., 1996). Die Inaktivierung des rsbU-Gens führt zu einer stark verminderten icaADBC-Transkription, PIA-Synthese und Biofilmbildung (KNOBLOCH et al., 2001;
MACK et al., 2000b). Die rsbU-abhängige Regulation der Biofilmbildung wird über den alternativen Sigmafaktor σB durch Unterdrückung des negativen Regulatorgens icaR vermittelt (KNOBLOCH et al., 2004). Weiterhin scheint die Aktivierung der PIA-Expression unter verschiedenen Stresssituationen unterschiedlichen regulativen Mechanismen zu unterliegen. Die Induktion der PIA-Synthese durch NaCl ist von einem funktionellen rsbU-Gen abhängig (KNOBLOCH et al., 2001; KNOBLOCH et al., 2004), wohingegen Ethanol RsbU-unabhängig zur Induktion der PIA-Synthese und Biofilmbildung führt. NaCl besitzt durch einen noch unbekannten Mechanismus einen positiven Einfluß auf σB und führt zu einer vermehrten Biofilmbildung und PIA-Synthese (KNOBLOCH et al., 2001;
KNOBLOCH et al., 2004). Die Tansposonmutagenese von rsbU führt neben einem Biofilm-negativen Phänotyp bei S. epidermidis 1457 zu einer verminderten Methicillinresistenz (KNOBLOCH et al., 2001; MACK et al., 2002).
Neben den bereits aufgeführten Genorten konnte für S. epidermidis gezeigt werden, dass dem icaADBC-Operon in entgegengesetzter Orientierung vorgeschaltete Gen icaR für einen negativen Regulator der icaADBC-Transkription kodiert und somit auch der PIA Expression (CONLON et al., 2002a; CONLON et al., 2002b; GÖTZ, 2002). Das negative Regulatorgen icaR wurde als Mitglied der tetR Transkriptionsregulatoren-Familie beschrieben, dessen eigene Transkription durch hohe Konzentrationen an Ethanol supprimiert wird. Hierbei erfolgt eine ica-Induktion durch Ethanol auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene über eine verminderte icaR-Transkription (CONLON et al., 2002a; CONLON et al., 2002b), während die Induktion durch NaCl icaR-unabhängig erfolgt (CONLON et al., 2002b). Auch die Induktion der ica-Transkription durch stammabhängige subinhibitorische Tetracyclinkonzentrationen war mit einer Repression der icaR-Transkription assoziiert (CONLON et al., 2002b).
Mit Hilfe eines arbitrary PCR-Verfahrens wurde für die Klasse-II-Mutante S. epidermidis M12 gezeigt, dass die Tn917 Insertion in einem offenen Leserahmen mit hoher Homologie zu den purR-Genen von B. subtilis und S. aureus lokalisiert ist (KNOBLOCH et al., 2003). Die Insertion führte unter anderem zu der Inaktivierung eines circa 1 kb großen Transkriptes, welches zwei offene Leserahmen mit Homologie zu den Bacillus subtilis Genen yabJ und spoVG umfasst. Mittels Komplementierungsversuchen wurde gezeigt, dass die yabJ und spoVG Homologen gemeinsam für die Rekonstitution der Biofilmbildung notwendig sind, während purR nicht essentiell ist (BARTSCHT, 2001). Da für die auch in S. aureus zu findenden homologen Gene in Staphylokokken bisher keine Funktion bekannt ist, wurden die Gene entsprechend ihrer nachgewiesenen Funktion in S. epidermidis als biofilm accumulation regulator A und B (barAB) bezeichnet (KNOBLOCH et al., 2005).
Ein weiteres mit SarA (staphylococcal accessory gene regulator A) von S. aureus einen hohen Verwandschaftsgrad aufzeigendes Protein, wurde auch bei S. epidermidis beschrieben (FLUCKIGER et al., 1998). SarA Mutanten zeigten aufgrund einer transkriptionellen Herabregulation des icaADBC-Operons und der PIA-Synthese durch einen icaR-unabhängigen Mechanismus einen schwerwiegenden Defekt in der Biofilmexpression (TORMO et al., 2005b). Die Regulation der icaADBC-Transkription durch das globale Regulatorprotein SarA erfolgte durch eine Bindung an den icaA Promotor. Die Studie von TORMO et al. (2005b) konnte zeigen, dass das SarA Protein ein positiver Regulator der
icaADBC-Operon Transkription ist und in seiner Abwesenheit die PIA-Synthese und Biofilmbildung in klinischen Isolaten stark herabgesetzt ist.
S. epidermidis besitzt zwei quorum-sensing Systeme agr (accessory gene regulator) und luxS (S-Ribosylhomocysteinlyase). Die quorum sensing Systeme von Bakterien regulieren die Genexpression als Reaktion auf eine Veränderung der Zelldichte. Hierbei sind hormonähnliche Moleküle (Autoinducer), die während des Wachstums der Zellpopulation in der externen Umwelt akkumulieren für das quorum sensing erforderlich. Die zwei quorum sensing Systeme agr und luxS von S. epidermidis führen zu einer verminderten Biofilmbildung während Biofilm-assoziierter Infektionen, während die Synthese einer Vielzahl an Virulenzfaktoren positiv reguliert wird (KONG et al., 2006; YAO et al., 2006).
Während des Übergangs von der exponentiellen in die stationäre Phase wird das agr-System durch autoregulatorische Mechanismen aktiviert, an denen modifizierte Peptide beteiligt zu sein scheinen (LI et al., 2004). Das agr-System besteht aus einem Zwei-Komponentensystem der Signaltransduktion (AgrC und AgrA) und einem System für die Produktion von Pheromonen mit dem Propheromonpeptid AgrD und dem Enzym AgrB, für das eine Funktion der Maturation und des Exports des Pheromons postuliert wird (VUONG et al., 2003). Die Transmembrankomponente AgrC bindet das extrazelluläre AIP (autoinducing peptide) und moduliert hierdurch die Aktivität des response regulator AgrA. Agr Pheromone verschiedener Spezies oder Subgruppen innerhalb einer Spezies zeigen eine Kreuzinhibition, wobei eigene Pheromone den response regulator agr induzieren und fremde Pheromone diese hemmen (VUONG, 2003). Das agr System enthält auch Gene für eine regulatorische RNA (RNAIII), die Zielgene des agr Systems auf eine bisher noch unbekannte Weise hemmt (VUONG, 2003). Zusätzlich zu ihrer regulatorischen Funktion kodiert RNAIII ein zytolysierendes Exotoxin, das δ-Toxin, im hld-Gen (VUONG, 2003). S. epidermidis-Stämme besitzen drei agr-Gruppen mit unterschiedlicher Pathogenität, wobei die hypervariablen Regionen insbesondere in agrD, agrB und agrC auftreten (DUFOUR et al., 2002; LI et al., 2004). Die PIA-abhhängige Biofilmexpression wird durch agr ohne Beeinflussung der icaADBC-Expression und PIA-Synthese reguliert. Hierbei kommt es zu einer Beeinflussung der Biofilmbildung aufgrund einer Herabregulation der Expression von Autolysin (atlE), das an der primären adhäsiven Phase der Biofilmbildung an Polymeroberflächen beteiligt ist (HEILMANN et al., 1997; VUONG et al., 2003). Im Kontrast zu AtlE, das an der primären
