Institut für Pathologie
Universität Hamburg
Prof. Dr. med. G. Sauter
EXPRESSION DES ÖSTROGENREZEPTORS
α
UND
AMPLIFIKATION DES ESR1-GENS BEI
MESENCHYMALEN NEOPLASIEN
DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von
Sylvia Giese
geboren in Potsdam
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am: 27. Januar 2012 Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. Guido Sauter Prüfungsausschuss: 2. Gutachter/in: Prof. Dr. Fritz Jänicke Prüfungsausschuss: 3. Gutachter/in: PD Dr. Ronald Simon
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 4
1.1 Mesenchymale Neoplasien 4
1.1.1 Epidemiologie 4
1.1.2 Ätiologie 5
1.1.3 Staging und Grading 7
1.1.4 Therapie 8 1.1.5 Leiomyom 9 1.1.6 Leiomyosarkom 9 1.1.7 Gastrointestinaler Stromatumor 11 1.1.8 Liposarkom 12 1.2 Der Östrogenrezeptor 14
1.3 Genetische Veränderungen und Kanzerogenese 16 1.4 Bedeutung des Östrogenrezeptors in der Kanzerogenese 17 1.5 Östrogenrezeptor und mesenchymale Neoplasien 18
1.6 Ziele der Arbeit 19
2 MATERIAL UND METHODEN 20
2.1 Zusammensetzung des Arrays: Patienten-/ Tumorkollektiv 20
2.2 Befunde/ Histologie-Review 22
2.3 Herstellung des Tissue-Micro-Arrays 22
2.4 Immunhistochemie (IHC) 26 2.5 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 27 2.6 Auswertung 29 2.6.1 Immunhistochemie 29 2.6.2 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 30 2.7 Statistik 31 3 ERGEBNISSE 32 3.1 Allgemein 32
3.2 Technische Probleme und Auswertbarkeit 35
3.3 Primärtumoren 35 3.3.1 Immunhistochemie 35 3.3.2 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 38 3.3.3 Tumorverhalten 40 3.3.4 Differenzierungsgrad 41 3.3.5 Geschlecht 42 3.3.6 Lokalisation 44 3.3.7 Tumorgröße 45 3.4 Rezidive 46 3.5 Leiomyom 47 3.6 Leiomyosarkom 49
3.6.1 Amplifikationen bei Leiomyosarkomen 51 3.7 Gastrointestinaler Stromatumor 52
3.8 Liposarkom 55
3.8.1 Amplifikationen bei Liposarkomen 57 3.9 Immunhistochemie und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 58
4 DISKUSSION 59
4.1 Proteinebene 59
4.1.1 Östrogenrezeptorexpression und histogenetischer Ursprung 59 4.1.2 Östrogenrezeptorexpression bei Leiomyomen 60 4.1.3 Östrogenrezeptorexpression bei Leiomyosarkomen 61 4.1.4 Östrogenrezeptorexpression bei Gastrointestinalen
Stromatumoren 62
4.1.5 Östrogenrezeptorexpression bei Liposarkomen 62 4.1.6 Östrogenrezeptorexpression und Geschlecht 63 4.1.7 Mesenchymale Neoplasien und Östrogeneinfluss 64 4.1.8 Mesenchymale Neoplasien in Zusammenhang mit
Hormontherapien
65 4.1.9 Östrogenrezeptorexpression und Prognose 65
4.2 Genebene 66
4.3 Therapieansätze 71
4.3.1 Tamoxifen 71
4.3.2 Therapieversuche bei mesenchymalen Neoplasien 73
4.4 Methode 74 5 ZUSAMMENFASSUNG 77 6 LITERATURVERZEICHNIS 79 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 89 8 TABELLENVERZEICHNIS 90 9 DANKSAGUNG 91 10 CURRICULUM VITAE 92 11 ERKLÄRUNG 93
1 EINLEITUNG
1.1 MESENCHYMALE NEOPLASIEN
Weichgewebstumoren (Soft Tissue Tumours) sind im Allgemeinen Neoplasien verbindender Gewebe 1. Sie bilden eine Gruppe heterogener Tumoren, die
benigne, maligne und intermediär maligne (Borderline-Tumoren) Neoplasien beinhaltet 1, 2.
Benigne Tumoren zeigen eine große Ähnlichkeit mit gesundem Gewebe, wohingegen maligne mesenchymale Neoplasien (Sarkome) je nach Differenzierung unterschiedlich stark normalen Zellen gleichen 1.
Es gibt verschiedene Klassifizierungssysteme; die gebräuchlichsten, nach World Health Organization sowie Enzinger & Weiss, erfolgen nach dem histologischen Zelltyp, dem der Weichgewebstumor ähnelt in: adipozytäre Tumoren, fibroblastische/ myofibroblastische Tumoren, so genannte fibrohistiozytäre Tumoren, Tumoren der glatten und Skelettmuskulatur, perivaskuläre Tumoren, vaskuläre Tumoren, chondro-ossäre Tumoren, Tumoren der peripheren Nervenscheiden, periphere neuroektodermale Tumoren sowie solche unklarer Differenzierung 1-3.
1.1.1 EPIDEMIOLOGIE
Der größte Anteil von Weichgewebstumoren ist benigne 3. Dessen Inzidenz
lässt sich nicht genau feststellen, da gutartige Tumoren oftmals keiner chirurgischen Exzision unterliegen und in Krebsregistern nicht eingeschlossen sind 1, 2. Vermutlich liegt das Verhältnis benigner zu maligner
Weichgewebstumoren bei 100 : 1 1-3.
Maligne Weichgewebstumoren sind relativ selten im Vergleich zu anderen bösartigen Neoplasien wie beispielsweise Karzinomen und machen weniger als 1% dieser aus 2, 3. Die jährliche Inzidenz maligner mesenchymaler Neoplasien
liegt bei ungefähr 3-4/ 100000 Einwohner (Europa, USA) 1, 3.
Einige Entitäten sind gehäuft bei Männern (wie zum Beispiel synoviales Sarkom, nasopharyngeales Angiofibrom), andere wiederum bevorzugt bei
Frauen (beispielsweise Leiomyosarkome, Haemangioperizytom) nachweisbar 1, 2.
Mesenchymale Tumoren betreffen alle Altersgruppen, jedoch ist die Mehrzahl der Sarkome bei Erwachsen zu finden, das mittlere Alter beträgt 65 Jahre 1-3.
Spezielle Tumoren treten allerdings vorherrschend im Kindesalter (Neuroblastom, embryonales Rhabdomyosarkom u. a.) oder bei Jugendlichen (synoviales Sarkom, alveolares Rhabdomyosarkom u. a.) auf 1.
Benigne Weichgewebstumoren liegen meist oberflächlich - dermal oder subkutan - (99%) und sind häufig kleiner als 5 cm (95%) 3. Die häufigsten
Subentitäten sind Lipome (33%), fibrohistiozytäre und fibröse Tumoren (33%), dann folgen vaskuläre (10%) und Nervenscheidentumoren (5%) 3.
Sarkome sind zu 75% in den Extremitäten lokalisiert und zu jeweils 10% am Rumpf oder retroperitoneal 3. Sie liegen zu zwei Drittel im tiefen Gewebe, der
mittlere Durchmesser beträgt hier 9 cm 3. Nur zu einem Drittel sind sie
oberflächlich mit einem mittleren Durchmesser von 5 cm zu finden 3. Drei Viertel
aller Sarkome sind Liposarkome, Leiomyosarkome, undifferenzierte pleomorphe Sarkome (ehemals maligne fibröse Histiozytome 4, 5), synoviale
Sarkome und maligne periphere Nervenscheidentumoren. Drei Viertel sind hochmaligne (G2-3) 3.
1.1.2 ÄTIOLOGIE
Die Ätiologie von malignen Weichgewebstumoren ist relativ wenig verstanden im Vergleich zu anderen malignen Erkrankungen (wie beispielsweise Lungenkarzinomen) 1, 2.
Zu möglichen ursächlichen Faktoren der Kanzerogenese bei Sarkomen zählen unter anderem ionisierende Strahlung (Fibrosarkom, Angiosarkom, peripherer Nervenscheidentumor u. a.), bestimmte onkogenetische Viren (humanes Herpesvirus 8: Kaposi Sarkom, Epstein-Barr Virus: Leiomyosarkom) sowie Chemikalien 1, 2. Immundefizienz oder therapeutische Immunsuppression
werden in Zusammenhang mit dem Auftreten von Sarkomen gebracht 2.
genetischer Erkrankungen wie zum Beispiel der Neurofibromatose Typ1 (Neurofibrom, maligner peripherer Nervenscheidentumor) oder der familiären adenomatösen Polypose (desmoide Fibromatose) 1-3.
Es wird davon ausgegangen, dass sich maligne Formen von Weichgewebstumoren allgemein nicht aus deren benignen Varianten entwickeln, sondern de novo entstehen 2, 3.
Sarkome sind in aller Regel genetisch instabile Tumoren. Bei etwa einem Drittel aller Sarkome sind spezifische genetische Alterationen zu finden 6.
Translokationen sind ein häufiges Phänomen wie beispielsweise bei synovialen Sarkomen (t(X;18)(p11;q11)), bei primitiven neuroektodermalen Tumoren (t(11;22)(q24;q12) und t(21;22)(q22q12)) oder auch beim kongenitalen Fibrosarkom (t(12;15)(p13;q25)) 1, 6, 7. Die durch Translokation entstehenden
Fusionsgene involvieren oft Transkriptionsfaktoren 1, 6. Des Weiteren kann es
zur spezifischen Mutation von Onkogenen kommen wie zum Beispiel c-kit bei gastrointestinalen Stromatumoren 6. Diese charakteristischen Merkmale einer
Entität erlauben eine bessere Differentialdiagnose und Klassifikation der Weichgewebstumoren sowie zum Teil prognostische Aussagen 6.
Bei zirka zwei Drittel aller Sarkome konnten bislang keine spezifischen wiederkehrenden genetischen Alterationen nachgewiesen werden 6. Sarkome
weisen häufig vielzählige nummerische Chromosomenaberrationen (darunter Genkopienzahlverluste und -gewinne) auf 6. Die meisten adulten Spindelzell-
und pleomorphen Sarkome zählen zu dieser Gruppe 6. Keine konstante
Korrelation dieser Genveränderungen mit klinisch - pathologischen Parametern konnte aufgezeigt werden 6. Verschiedene Amplifikationen wurden beschrieben
wie beispielsweise die der Gene MYC oder der 12q13-15 Region (welche die Gene GLI, MDM2, CHOP, CDK4, SAS und HMGIC beinhaltet) sowie anderer genetischer Regionen, dessen Zielgene bislang unbekannt sind 1, 2.
1.1.3 STAGING UND GRADING
Staging und Grading von malignen Weichgewebstumoren sind essentiell für die Wahl einer geeigneten Therapie sowie deren Prognose und darüber hinaus für wissenschaftliche Untersuchungen.
Das Staging von Sarkomen basiert sowohl auf histologischen als auch klinischen Informationen. Gemäß American Joint Committee on Cancer (AJCC) und Union Internationale Contre le Cancer (UICC) beinhaltet die TNM - Klassifizierung den histologischen Malignitätsgrad, Tumorgröße und -tiefe, regionalen Lymphknotenstatus sowie Fernmetastasen 1-3.
Das Grading betrachtet histologische Parameter und ermöglicht Aussagen über den Malignitätsgrad des Tumors 2, 3. Insbesondere die zelluläre Differenzierung,
Anzahl der Mitosen und Tumornekrosen spielen hier eine Rolle (Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer - FNCLCC) 1-3.
Es erfolgt eine Unterteilung der malignen Weichgewebstumoren nach dem histologischen Malignitätsgrad in „gut differenziert“ (low grade Sarkome) und „schlecht differenziert“ (high grade Sarkome), um das Risiko von Rezidiven und Metastasen abzuschätzen 2.
Low grade Sarkome sind lokal aggressiv, neigen zu Lokalrezidiven, haben jedoch ein eher niedriges Metastasierungsrisiko und daher eine eher gute Prognose 1. Die Therapie ist in erster Linie chirurgisch, sofern möglich 1. High
grade Sarkome hingegen tendieren sowohl zur lokalen Rekurrenz als auch zu Metastasen, so dass die Therapie chirurgisch und/oder durch Bestrahlung sowie zytostatischer Behandlung erfolgt 1.
Prognostische Parameter mit statistischer Relevanz sind bei Sarkomen Größe, histologischer Malignitätsgrad sowie Staging des Tumors und tumorfreie Resektionsränder 8, 9. Weitere prognostische Faktoren sind Lokalisation des
Tumors sowie Alter, Geschlecht, Rasse des Patienten, die voneinander unabhängig mit der Überlebenszeit assoziieren 8.
1.1.4 THERAPIE
Die Ansprechraten von Zytostatika sind insgesamt gering (Anthrazykline, Ifosfamid 16 - 36%, andere 10 - 20%) und zahlreiche Studien zeigen keinen gesicherten Zusammenhang zwischen zytostatischer Behandlung oder Radiotherapie und Überleben 7, 8, 10. Lediglich Rhabdomyosarkome und primitive
neuroektodermale Tumoren des Weichgewebes reagieren gut auf eine zytostatische Behandlung (Vincristin, Etoposid, Actinomycin D), bei denen diese als Standardtherapie gilt 9, 10.
Die Wahl der Therapie ist abhängig vom histologischen Subtyp sowie der anatomischen Lokalisation 7, 8. Die Behandlungsoptionen insbesondere für
metastasierte Sarkome sind schlecht.
Die Therapie der Wahl von Sarkomen mit statistisch signifikantem Vorteil hinsichtlich Überlebenszeit besteht in erster Linie in der chirurgischen Exzision mit tumorfreien Resektionsrändern (R0 - Resektion) 7, 8, 10.
Die klinische Bedeutung neuerer Therapieformen ist bislang größtenteils noch unklar.
In Bezug auf neuere, spezifische Therapieansätze ist es hilfreich, Zielgene und -proteine in Schlüsselpositionen zu identifizieren 7, 11. Denn je spezifischer der
Angriffspunkt, seine Prävalenz, seine unabdingbare Rolle für das Zellüberleben und seine Aktivität in den Tumorzellen erforscht ist, desto wahrscheinlicher ist es, eine geeignete Behandlung zu finden und eine Aussage über deren Effektivität zu treffen 7.
So konnte für gastrointestinale Stromatumoren (GIST) solch ein Angriffspunkt gefunden werden. Hierbei handelt es sich um die mutierte Tyrosin-Kinase c-kit, deren pathologische Aktivität mittels Imantinibmesylat (STI571/ Glivec) inhibiert
1, 7, 10 und dadurch das autonome Tumorwachstum gehemmt wird. Erste
Resultate zeigen Ansprechraten von 60 - 70% und dass die Therapie zu einem verlängerten rezidivfreien Intervall sowie ebenfalls bei metastatischem Stadium zu einer besseren Prognose durch ein verlängertes krankheitsfreies Intervall führt 7, 12-14. Die Ein-Jahres-Überlebensrate bei fortgeschrittenem Krankheitsbild
lag vor Imatinib bei etwa 35% und konnte jetzt bis auf 90% angehoben werden dank auf ursächliche molekulare Anomalien zielender Therapie 13. Somit konnte
bei GISTs im c-kit und dessen Sensibilität für Imatinib ein therapeutisches Schlüsselelement gefunden werden.
Molekulare Analysen können Informationen liefern, die sowohl für das Verständnis der Pathogenese bedeutend sind als auch diagnostische und prognostische Relevanz haben.
Im Folgenden werden die in der durchgeführten Untersuchung am häufigsten repräsentierten Entitäten kurz vorgestellt.
1.1.5 LEIOMYOME
Leiomyome haben große Ähnlichkeit mit ihrem Ursprungsgewebe, der glatten Muskulatur. Sie sind der häufigste gynäkologische Tumor der Frau im reproduktiven Alter 15.
Die häufigste Lokalisation dieser gutartigen Tumore ist der weibliche Genitaltrakt, insbesondere der Uterus 1, 2. Weitere mögliche Entstehungsorte
sind retroperitoneal, peritoneal, im tiefen Weichgewebe, gastrointestinal, vaskulär und dermal 1, 2.
Es ist bekannt, dass auch bei Leiomyomen chromosomale Veränderungen auftreten können 16.
Die Therapie besteht in der chirurgischen Resektion, sofern anatomisch bedingt durchführbar 3. Lokale Rezidive nach Entfernung sind möglich 3.
1.1.6 LEIOMYOSARKOME
Das maligne Pendant der Leiomyome sind Leiomyosarkome. Sie sind histologisch recht ähnlich in Bezug auf ihr Ursprungsgewebe, unterscheiden sich jedoch klinisch - pathologisch erheblich von Leiomyomen 1.
Vom diagnostischen und therapeutischen Standpunkt aus haben Leiomyosarkome trotz ihrer relativen Seltenheit eine große klinische Bedeutung
aufgrund ihrer unvorhersehbaren Rekurrenz sowie ihrer Möglichkeiten zur Metastasierung.
Sie stellen 5 - 10% der Sarkome dar 2, sind jedoch die häufigsten malignen
uterinen Tumoren nicht-epithelialen Ursprungs 15, die dominierenden malignen
mesenchymalen Tumoren der Blutgefäße 3 und häufige retroperitoneale
Sarkome 3. Insbesondere die Differentialdiagnose gegenüber Leiomyomen ist
wichtig hinsichtlich therapeutischer Konsequenzen.
Leiomyosarkome treten in Abhängigkeit von der Lokalisation häufiger bei Frauen auf (insbesondere uterin, retroperitoneal, vaskulär) 2, 3, Wachstum und
Proliferation stehen in Zusammenhang mit hormonellem Einfluss (Schwangerschaft, Östrogenstimulation) 2, 3. Das Prädilektionsalter ist das 50.
bis 60. Lebensjahr 2.
Sie werden nach Lokalisation eingeteilt, da sie sich hinsichtlich Klinik und Biologie unterscheiden 1, 2. Häufig treten sie uterin, retroperitoneal oder
intraabdominell auf, andere mögliche Lokalisationen sind Weichgewebe, Extremitäten und Rumpf 2.
Leiomyosarkome sind genetisch instabile Tumoren und weisen oft komplexe Karyotypen mit unbeständigen chromosomalen Aberrationen auf 3.
Histologisch können Leiomyosarkome in epithelioid, myxoid, inflammatorisch und Granularzellleiomyosarkom unterschieden werden 2.
Relevante prognostische Parameter sind Tumorgröße, Lokalisation, histologischer Malignitätsgrad und Invasion in Knochen und Blutgefäße 3.
Besonders günstig sind kutane Leiomyosarkome aufgrund ihrer oberflächlichen Lokalisation 2, 17. Ungünstig hingegen sind retroperitoneale Leiomyosarkome, da
sie oft wegen ihrer Größe und tiefen Lokalisation nicht im Gesunden reseziert werden können 2. Neben dem Rezidivrisiko besteht darüber hinaus die Gefahr
der Metastasierung, bevorzugt in Lunge und Leber 2, 3.
Die Therapie von Leiomyosarkomen ist in erster Linie chirurgisch 8. Bestrahlung
Benefit 7, 8.
Leiomyosarkome sind zwar relativ selten, jedoch aggressiv und ihre Prognose ist insgesamt im Vergleich mit anderen malignen Weichgewebstumoren eher schlecht (mittlere Überlebenszeit 21 Monate) 8.
1.1.7 GASTROINTESTINALER STROMATUMOR
Gastrointestinaler Stromatumor (GIST) ist die Bezeichnung für eine Gruppe spezifischer mesenchymaler Tumoren des Gastrointestinaltrakts 1. GISTs
unterscheiden sich von anderen Tumoren der glatten Muskulatur durch klinische, histologische und molekulare Merkmale, speziell durch die Expression von c-kit (CD117) 1.
Es gibt benigne und maligne Varianten 1, 18. Sie sind bevorzugt im
Erwachsenenalter (vorrangig über 50 Jahren) vorzufinden 1, 18.
GISTs sind die häufigsten mesenchymalen Tumoren des Gastrointestinaltrakts (80%) und können dort überall vorkommen 1, 13, 18. Ihre Hauptlokalisation ist der
Magen 1, 18 (50 - 70%), dann folgt Dünndarm und Duodenum (20 - 30%), Kolon
und Rektum (10%) sowie Ösophagus (1%), mesenterial (5%) und appendikulär (<1%) 13. In der Regel treten sie unifokal auf 13.
Charakterisiert sind GISTs, vor allem maligne Formen, durch Mutationen auf dem c-kit-Gen, lokalisiert auf Chromosom 4q11-q12 1. Das c-kit-Gen gehört zu
Familie der Tyrosin-Kinasen (Typ 3), deren Rezeptor normalerweise Dimere bildet, dessen Tyrosin-Kinase durch Liganden aktiviert (phosphoryliert) wird und es schließlich nukleär zum Proliferationssignal kommt 1. Durch die Mutation wird
c-kit ligandenunabhängig, was so zur Autophosphorylierung und damit zum autonomen Wachstum führt 1, 18.
Eine starke Expression des c-kit-Gens (CD117) liegt in 85 - 95% vor 2.
Des Weiteren sind andere Genkopienzahlvermehrungen sowie -Verluste bei GISTs zu finden, welche verschiedene Chromosomen betreffen 16, 18.
Prognostisch relevante Parameter sind Tumorgröße, Tumornekrose, Expression von Ki67 und Aneuploidie 1, 18. Darüber hinaus spielt die Lokalisation des
Primärtumors eine diagnostische Rolle, wobei proximale GISTs (Ösophagus, Magen) günstiger sind als distale (Dünndarm, Kolon) 13.
Nach wie vor ist die chirurgische Exzision mit tumorfreiem Resektionsrand (R0 - Resektion) die Therapie der Wahl 1, trotzdem besteht die Wahrscheinlichkeit
von Rezidiven 18. Darüber hinaus bildet die mutierte Tyrosin-Kinase c-kit einen
Angriffspunkt, deren pathologische Aktivität durch Imantinibmesylat (STI571/ Glivec) inhibiert wird 1, 7. Dies führt auch bei inoperablem Primärtumor oder
fortgeschrittenem Stadium zu einem deutlich verlängertem krankheitsfreien Intervall 12, 13. GISTs gelten als resistent gegenüber zytostatischen Therapien
(<10% Ansprechraten auf Mono- oder Polychemotherapien mit Anthrazyklinen) und zeigen auch keine günstige Entwicklung unter Radiotherapie 13.
Bei malignen Formen besteht die Gefahr, diffus intraabdominell oder peritoneal zu rezidivieren oder in die Leber, Lunge sowie Knochen zu streuen – die hauptsächlichen Lokalisationen von Metastasen 1, 13, 18. Insbesondere bei
Rezidiven oder Metastasen ist die Prognose schlecht 13.
1.1.8 LIPOSARKOME
Liposarkome sind eine histologisch und genetisch heterogene Gruppe maligner mesenchymaler Neoplasien mit Fettgewebsdifferenzierung 1, 2.
Insgesamt zählen sie mit mehr als 20% zu den häufigsten malignen Weichgewebstumoren im Erwachsenenalter 1, 19.
Häufige Lokalisationen von Liposarkomen, die vorrangig im mittleren und späten Erwachsenenalter auftreten, sind Extremitäten und Retroperitoneum, bevorzugte Metastasierungsorte Weichgewebe, Knochen sowie Lunge. 1-3.
Klinische Parameter sind stark abhängig vom Subtyp des Liposarkoms und können daher sehr zwischen den einzelnen Tumorgruppen variieren.
Folgende Subentitäten werden unterschieden: die histologische Untergliederung erfolgt nach Enzinger und Weiss in hochdifferenziert/dedifferenziert, myxoid/rundzellig und pleomorph 2. Darüber
und in dieser Arbeit nicht vertreten sind.
Dedifferenzierte Liposarkome stellen die fortgeschrittene Form hochdifferenzierter Liposarkome dar, rundzellige die von myxoiden Liposarkomen 1. Die Subentitäten hochdifferenziert/dedifferenziert sowie
myxoid/rundzellig sind auch genetisch verschieden. Die erstere Gruppe charakterisiert ein Rearrangement des Genabschnittes 12q 1-3, wohingegen für
myxoid/rundzellige Liposarkome die Translokation t(12;16)(q13;p11) typisch ist
1-3. Genetische Aspekte pleomorpher Liposarkome sind bislang wenig
verstanden 1.
Hochdifferenzierte Liposarkome in subkutaner Lokalisation werden im Rahmen dieser Arbeit als atypische Lipome bezeichnet, da sie nie metastasieren und keine Progression hin zu dedifferenzierten Liposarkomen zeigen 1-3, 19, 20. Des
Weiteren sind sie aufgrund ihrer anatomischen Lage chirurgisch kurativ therapierbar 1-3, 19. Dadurch unterscheiden sie sich prognostisch von
hochdifferenzierten Liposarkomen anderer Lokalisation, beispielsweise retroperitoneal oder mediastinal, die häufig rezidivieren und deren Risiko einer Progression im Sinne einer Dedifferenzierung deutlich höher ist, so dass diese der Gruppe hochdifferenziert/dedifferenziert zugeordnet werden 1-3, 5.
Die Prognose hängt stark vom histologischen Subtyp ab 19.
Tabelle 1: Prognose in Abhängigkeit des histologischen Subtyps bei Liposarkomen
Daten entnommen aus Miettinen „Diagnostic soft tissue pathology“ Churchill Livingstone 2003 1
und Böcker, Denk, Heitz „Pathologie“ Urban & Fischer 2004 19
SUBENTITÄT HÄUFIGKEIT 5-JAHRES-ÜBERLEBENSRATE
hochdifferenziert >50% 90%
dedifferenziert 5% 60-70%
myxoid/rundzellig 30-40% 40-50%
pleomorph 5% 20%
Wie bereits oben erwähnt spielt bei Liposarkomen die Lokalisation eine entscheidende prognostische Rolle 3. Des Weiteren beeinflussen histologischer
Malignitätsgrad, Nekrosen, TP53-Überexpression bei myxoid/rundzelligen sowie Tumorgröße und -Tiefe, Anzahl der Mitosen, Nekrosen bei pleomorphen Liposarkomen die Prognose 3.
Therapie der Wahl mit statistisch signifikantem Benefit ist eine ausgedehnte chirurgische Exzision mit tumorfreiem Resektionsrand (R0 - Resektion), die in
Abhängigkeit von der Lokalisation nicht immer ausreichend durchzuführen ist 1, 3, 8. So gelten retroperitoneale hochdifferenzierte Liposarkome, die
zweithäufigste Lokalisation dieser Subentität 1-3, als schlecht therapierbar durch
häufige unkontrollierbare lokale Rekurrenz sowie der Fähigkeit zur Dedifferenzierung 1, 2, 5. Weitere therapeutische Möglichkeiten sind
Radiotherapie sowie Zytostatika 1, 8, wobei hier kein gesicherter Benefit
hinsichtlich der Überlebenszeit besteht 7, 8, 11. Die zytostatischen eingesetzten
Substanzen Doxorubicin/Epirubicin und Ifosfamid zeigen bei Monotherapie Ansprechraten von 10 - 30%, jedoch ohne Erwirkung einer längeren Überlebenszeit 8, 11. Insbesondere bei Rezidiven oder fortgeschrittener
Erkrankung lässt die Effektivität einer zytostatischen Therapie zu wünschen übrig 11.
1.2 DER ÖSTROGENREZEPTOR
Ein besseres Verständnis von Mechanismen, die maßgeblich an der Pathogenese von Weichgewebstumoren beteiligt sind, ist notwendig, um neue und bessere therapeutische Optionen zu finden. Der Östrogenrezeptor wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit Ziel dieser Suche.
Der Östrogenrezeptor gehört zur Familie der Steroidhormonrezeptoren. Diese nukleären Rezeptoren können extrazelluläre Signale in eine Transkription eines Genabschnittes überführen.
Das Steroidhormon Östrogen entwickelt seine Wirkung über den Östrogenrezeptor, der bis zum Kontakt mit dem Hormon zellulär im inaktivierten Zustand vorliegt, gebunden an zytoplasmatische Proteinkomplexe – den Hitzeschockproteinen 21. Bei der Aktivierung der Rezeptoren lösen diese sich
von den Hitzeschockproteinen und bilden Dimere, die dann über zwei Mechanismen ihre Wirkung entfalten können 21. Der Östrogenrezeptor kann
einerseits direkt als regulativer Transkriptionsfaktor agieren, indem er als Dimer an Zielsequenzen der Zelle bindet 21. Die Transkription kann dann sowohl
aktiviert als auch reprimiert werden 21. Andererseits kann der Östrogenrezeptor
Transkriptionsfaktoren forcieren, beispielsweise durch Bindung an AP-1 über Fos und Jun, die dann ihrerseits an die DNA binden 21.
Abbildung 1: Funktion des Östrogenrezeptors
Grafik entnommen aus Ganten, Ruckpaul „Grundlagen der Molekularen Medizin“ Springer-Verlag 2003 21
Der Östrogenrezeptor als regulativer Transkriptionsfaktor und hormonabhängiger indirekter Transkriptionsfaktor 21 steht daher im
Zusammenhang mit einer Expression von Zielgenen, die den Zellzyklus beeinflussen.
Östrogenrezeptorabhängig werden stimulierende Wachstumsfaktoren wie
TGF-α, IGF-II und PDGF sowie der inhibierende Faktor TGF-β exprimiert 22. Auch
die Produktion zellulärer Proteine wie Progesteronrezeptor und Proteasen wird durch den Östrogenrezeptor als Transkriptionsfaktor beeinflusst 22.
Das ESR1-Gen (6q25.1 23) ist eine komplexe genomische Einheit mit
zahlreichen Möglichkeiten alternativen Spleißens sowie mit Nutzung sechs verschiedener Promotoren 24. Über die Anzahl der aktiven Promotoren in einer
Zelle kann die Menge des synthetisierten Östrogenrezeptors reguliert werden 24.
Der Östrogenrezeptor wird in hormonsensitiven Geweben der Frau exprimiert wie im Epithel der Brust und des Endometriums, in Stromazellen des Endometriums und im Myometrium des Uterus 1.
Die Verteilung der Subtypen α und β des Östrogenrezeptors ist unterschiedlich in verschiedenen Geweben, ebenso ihre Spezifität bezüglich der Bindung von Liganden 25, 26.
1.3 GENETISCHE VERÄNDERUNGEN UND KANZEROGENESE
Es ist heute bekannt, dass genetische Veränderungen wie beispielsweise numerische Chromosomenaberationen, Translokationen, Verlust oder Zugewinn von Genabschnitten Kontrollmechanismen des zellulären Wachstums destabilisieren, eine unkontrollierte Proliferation fördern, die dann schließlich in der Entwicklung benigner und maligner Neoplasien resultieren kann 1.
Amplifikation sowie auch Deletion von genetischem Material sind bei malignen Tumoren ein häufiger Mechanismus, die Expression bestimmter Zielgene zu steigern und sich so einen Wachstums- und Überlebensvorteil zu sichern 19, 24, 27-29.
Es kommt im Rahmen einer Amplifikation zu einer Vermehrung von normalerweise zwei vorhandenen Kopien eines Gens auf bis zu mehrere tausend 24. Die Amplifikation stellt sich zytogenetisch als homogene Struktur
dar, die sich in anderen Chromosomen integrieren (intrachromosomal) oder als paarige, extrachromosomale Genpakete vorliegen kann 1, 24.
Das Produkt, also das Protein, liegt bei einer Genamplifikation unverändert, aber bei entsprechender Expression in erhöhter Konzentration vor 28. Durch die
unphysiologisch erhöhten Spiegel dieses Genproduktes, beispielsweise die vermehrte Bildung unveränderter Wachstumsfaktoren, kann ein Verlust der kontrollierten Zellproliferation erfolgen 28.
Die Identifikation von genetischen Veränderungen trägt zum besseren Verständnis der Kanzerogenese bei, kann diagnostisch genutzt werden und führt zur Entwicklung selektiver Therapien 1. Möglicherweise ergeben sich
prognostische Assoziationen der Genveränderung 1.
1.4 BEDEUTUNG DES ÖSTROGENREZEPTORS IN DER KANZEROGENESE
Der Einfluss von Östrogen sowie Östrogenrezeptorblockern (trans-hydroxytamoxifen) auf die Wachstumsrate von Zellen ist in vitro nachgewiesen
30. Zelllinien von ER-positiven Mammakarzinomen reagieren auf das Fehlen von
Östrogen unmittelbar mit einer verringerten Wachstumsrate 30. Diese kann nach
kurzfristigem Entzug von Östrogenen durch Gabe von Östradiol gesteigert werden 30. Östrogenrezeptorblocker wirken dosisabhängig als vollständiger
Antagonist bei einer durch Östradiol stimulierten Proliferation und führen zu einem verminderten Zellwachstum 30.
Es konnte ein Zusammenhang zwischen Anwesenheit von Östrogen und Expression des Östrogenrezeptors in Form einer Up-/Down-Regulation nachgewiesen werden 30. Zellen unter östrogenfreien Bedingungen zeigen
höhere Östrogenrezeptorspiegel 30.
Im Tiermodell wurde gezeigt, dass Östrogen und sein Rezeptor auch bei primär östrogenunabhängigem Wachstum über andere Mechanismen proliferationsfördernd wirken 31.
Des Weiteren wurde an Tiermodellen dargestellt, dass es unter Östrogeneinfluss zu einer erhöhten Inzidenz von Neoplasien (u. a. Liposarkom) sowie zu einem hormonstimulierten Tumorwachstum kommt 32, 33.
Das Vorliegen einer Östrogenrezeptorexpression bei Mammakarzinomen gilt als prognostischer Faktor und ist Ziel einer Antiöstrogenrezeptor-Therapie mit Tamoxifen 34, 35. Hierdurch kann eine statistisch signifikante Verlängerung des
krankheitsfreien sowie des rezidivfreien Intervalls erreicht werden, was sich insgesamt in einer verlängerten Überlebenszeit widerspiegelt 34-36.
Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass ESR1-Amplifikationen in 20% und eine geringe Vermehrung der Genkopienzahl in weiteren 15% bei Mammakarzinomen vorliegen. In fast allen Fällen sind die ESR1-Amplifikationen mit einer Östrogenrezeptorexpression assoziiert 27. Außerdem
scheinen Patientinnen mit ESR1-Amplifikation und Östrogenrezeptorexpression mehr von einer Therapie mit Tamoxifen zu profitierten als Patientinnen ohne Amplifikation 27.
1.5 ÖSTROGENREZEPTOR UND MESENCHYMALE NEOPLASIEN
Östrogenrezeptors α beschrieben. Dies gilt insbesondere für uterine und retroperitoneale Leiomyome weiblicher Patienten 1, uterine Leiomyosarkome 1,
Angiomyofibroblastome, aggressivem Angiomyxome sowie genitale Stromatumore der Frau (wie Stromasarkome des Endometriums) 1.
Trotz der früher durchgeführten Untersuchungen geben die publizierten Studien in ihrer Gesamtheit nur ungenügende Aufschlüsse über die tatsächliche Häufigkeit von Östrogenrezeptorexpressionen bei Weichgewebstumoren. Auffällig sind große Diskrepanzen zwischen den Resultaten der einzelnen Studien. So variieren die angegebenen Häufigkeiten beispielsweise bei Leiomyosarkomen zwischen 0% und 100%, bei Liposarkomen zwischen 0% und 60%. Die Beurteilung ist durch diese doch recht unterschiedlichen Aussagen stark erschwert.
Einige Entitäten wie zum Beispiel atypische Lipome oder Rhabdomyome wurden bislang keiner Analyse unterzogen, sodass das Wissen über Östrogenrezeptorexpressionen bei Weichgewebstumoren zudem unvollständig ist.
Interessant ist die Tatsache, dass in einigen Studien und Fallberichten die Entstehung von Sarkomen (u. a. Liposarkom, Leiomyosarkom, Stromazell-Sarkom) unter Tamoxifen-Therapie geschildert wurde 37-39.
Mechanismen die für eine Östrogenrezeptorexpression ursächlich sind, wurden bislang an mesenchymalen Tumoren nicht entdeckt. Eine mögliche Ursache wäre eine Genkopienzahlvermehrung des ESR1-Gens, welches den Östrogenrezeptor α ü kodiert, wie dies bei Mammakarzinomen kürzlich beschrieben wurde 27.
1.6 ZIELE DER ARBEIT
Da bislang noch keine gezielte Untersuchung an Weichgewebstumoren hinsichtlich Östrogenrezeptoren sowohl auf Protein- als auch auf Genebene an einer größeren Tumorpopulation, die zahlreiche Subentitäten repräsentiert, durchgeführt wurde, ist dies Ziel der vorliegenden Arbeit. Eine standardisierte Analyse unter Verwendung der gleichen Methode, des gleichen Protokolls sowie identischer Materialien soll eine bessere Vergleichbarkeit der Daten realisieren. Dies wird hier mittels Tissue-Microarray-Technik erreicht.
Im Fokus stehen die Entitäten Leiomyome, Leiomyosarkome und Liposarkome, bei denen Expressionen des Östrogenrezeptors sowie teils auch Genkopienzahlveränderungen des ESR1-Gen gezeigt wurden, jedoch keine einheitlichen Angaben in der Literatur zu finden sind.
Insbesondere Zusammenhänge zwischen Genveränderung und Proteinexpression wurden bei mesenchymalen Tumoren nur unzureichend untersucht.
Die Rolle einer ESR1-Amplifikation für die Expression des Östrogenrezeptors wurde bei 743 Proben mesenchymaler Neoplasien von 632 Patienten analysiert. Es erfolgte die Konstruktion eines Tissue Microarrays (TMA), der verschiedene mesenchymale Neoplasien enthielt sowie eines TMAs, der unterschiedliche Fettgewebstumoren beinhaltete. Diese wurden hinsichtlich der Expression des Östrogenrezeptors immunhistochemisch und bezüglich der ESR1-Amplifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung analysiert.
Die durchgeführten Untersuchungen sollen dazu beitragen, die Pathogenese von Weichgewebstumoren besser zu verstehen. Bekannte Proteinexpressionen oder Genveränderungen könnten bei der Differentialdiagnose der Subentitäten hilfreich sein. Letztlich könnte die Expression des Östrogenrezeptors einen neuen gezielten Therapieansatz ermöglichen.
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 ZUSAMMENSETZUNG DER ARRAYS: PATIENTEN-/ TUMORKOLLEKTIV
Für die Untersuchung standen zwei verschiedene Weichgewebstumor-TMAs zur Verfügung. Freundlicherweise konnte auf einen durch E. von Friderici und M. Hochreiter im Rahmen ihrer Doktorarbeit hier im Institut gefertigten Array zurückgegriffen werden. Ein weiterer TMA mit Fettgewebstumoren wurde eigens für diese Arbeit zusammengestellt.
Die Multitumorarrays beinhalten verschiedene Entitäten von Weichgewebstumoren sowie standardisiertes Kontrollgewebe. Insgesamt sind 20 Tumortypen vertreten.
Tabelle 2: Übersicht Entitäten
1. 012 Angiosarkome
2. 010 Chondrosarkome (extraskelettal)
3. 008 Dermatofibrosarkoma protuberans
4. 022 desmoide Fibromatose
5. 012 primitive neuroektodermale Tumoren des Weichgewebes (PNET)
6. 003 Fibrosarkome
7. 072 gastrointestinale Stromatumoren (GIST)
8. 021 Granularzelltumoren 9. 014 Haemangioperizytome 10. 077 Leiomyome 11. 001 Rhabdomyom 12. 072 Leiomyosarkome 13. 120 Liposarkome 14. 012 atypische Lipome
15. 035 maligner peripherer Nervenscheidentumor (malignes Schwannom)
16. 074 Non Specified Sarkome (NOS)
17. 007 Osteosarkome (extraskelettal)
18. 007 Rhabdomyosarkome
19. 003 Synovialsarkome
20. 050 Lipome
21. 000 Standardkontrollgewebe
Das Standardkontrollegewebe setzte sich aus Gewebe von Herz, Niere, Lunge, Kolon, Endometrium, Prostata, Lymphknoten, quergestreifter Muskulatur, Haut, Fett, Mamma-, Lungen-, Kolon- und Prostatakarzinomen zusammen.
Abbildung 2: Schema des TMA Angiosarkom Chondrosarkom Dermatofibrosarkoma protuberans Desmoide Fibromatosis PNET Fibrosarkom GIST Granularzelltumor Haemangioperizytom Leiomyom Rhabdomyom Leiomyosarkom Liposarkom Atypisches Lipom Malignes Schwannom Standardkontrollgewebe NOS Osteosarkom PNET Rhabdomyosarkom Synovialsarkom Standardkontrollgewebe Lipom Atypisches Lipom Liposarkom Standardkontrollgewebe
2.2 BEFUNDE/ HISTOLOGIE-REVIEW
Aus den Berichten des Instituts für Pathologie Hamburg Eppendorf wurden Angaben zur Diagnose und Lokalisation der Tumoren entnommen, bezüglich der Sarkome ebenfalls Größe (pT-Stadium), Differenzierungsgrad (Grading), Lymphknotenstatus (pN-Stadium) und Metastasierungsgrad (pM-Stadium). Allgemeine Daten wie Operationsdatum, Alter und Geschlecht der Patienten sowie Angaben über rezidivierendes Auftreten des Tumors gehörten ebenso dazu.
Des Weiteren wurden alle histologischen Präparate des Fettgewebstumorarrays noch einmal hinsichtlich der Entität sowie eventuell genaue Charakterisierung von Untergruppen nach aktuellen Kriterien der World Health Organization 3
befundet.
2.3 HERSTELLUNG DES TISSUE MICROARRAYS
Das Tissue-Micro-Array-Verfahren ermöglicht die Untersuchung eines großen Gewebekollektivs auf Proteinebene (Immunhistochemie) sowie mittels molekularer Methoden (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung).
Zunächst erfolgt die Rekrutierung potentiell verwendbarer Fälle aus der Datenbank des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf. Entsprechende histologische Schnitte werden aus den Archiven herausgesucht und von einem erfahrenen Pathologen beurteilt. Auf dem hematoxylin-eosin-gefärbten Objektträger werden repräsentative Anteile des Gewebes markiert. Anschließend werden die korrespondierenden Gewebeparaffinblöcke aus den Archiven zu den Objektträgern sortiert. Ein Datenfile wird erstellt, der folgende patientenbezogene Informationen aus den pathologischen Befunden beinhaltet: Geburtsdatum, Geschlecht, jeweiliges Datum der Probenentnahme, Lokalisation sowie Angaben zum Staging und Grading. Nach Erstellung eines Datenfiles (Punch-File) beginnt das Stanzen des Arrays: aus dem repräsentativen Areal eines Gewebeparaffinblocks (Donor-Block) werden Gewebezylinder (Durchmesser 0,6 mm, Höhe 3 - 4 mm 40, 41)
mittels einer Hohlnadel entnommen. Die Gewebezylinder werden in vorgefertigte Löcher im Empfängerparaffinblock eingebracht.
Abbildung 3: Herstellung des TMA
entnommen aus „Human Molecular Genetics“ 2001, Vol.10, 658 42
Abbildung 4: Stanzgerät und dessen Funktion
entnommen aus „Nature reviews drug discovery“ 2003, Vol. 2, 964 43
Abbildung 5: Übersichtsaufnahme des Stanzgerätes
Abbildung 6: Detailaufnahme des Bohrers
Mittels eines selbst hergestellten X-Y-Achsen-Präzisionsinstruments werden die einzelnen Gewebezylinder im Empfängerblock (45 x 20mm) eingebettet; der Abstand zwischen den einzelnen Spots beträgt 0,8 mm. Auf diese Art können bis zu 1000 Gewebestanzen hochpräzise in einen einzigen Empfängerblock angeordnet werden 41, 42.
Abbildung 8: Beispiel eines Tissue Microarrays
Der Array wird mit einem Mikrotom in histologische Schnitte mit einer variablen Dicke von 4 - 8 µm geschnitten und mit Hilfe eines adhesive-coated tape sectioning system (Instrumedics, Hackensack, NJ/USA) auf einen Objektträger aufgebracht 40, 44.
2.4 IMMUNHISTOCHEMIE (IHC)
Für die immunhistologische Färbung wurde das standardisierte indirekte Immunoperoxidase-Verfahren (ABC-Elite, Vector Laboratories, Berlingame, CA, USA) angewandt.
MATERIALIEN45
ER pharmDx-Kit von DAKO (Glostrup, Dänemark): Mix aus Antikörper-Klone 1D5 und ER-2-123
Waschpuffer (code S3006)
Dual Endogenous Enzyme Block (code S2003) Target Retrieval Solution (code S1699)
kalibrierter Dampfkocher
EnVision+ Mouse, HRP (code K4000) DAB+ (Diaminobenzidin, code K3468) Haemalaun
• entparaffinieren und rehydrieren der Probe
• eintauchen in Target Retrieval Solution
• kalibrierter Dampfkocher:
5 min bei 125°C inkubieren
30 min abkühlen lassen (keine Zugluft) Druck ablassen und Objektträger entnehmen abgießen der Target Retrieval Solution und
spülen mit Waschpuffer
5 min einweichen der Objektträger in frischem Waschpuffer
• Färbung im DAKO-Färbeautomat (DAKO-Autostainer)
• Gegenfärbung mit Haemalaun 15 s
• trocknen, reinigen und eindeckeln der Objektträger
Für die Negativkontrolle wurde der primäre Antikörper weggelassen. Die Positivkontrolle wurde durch Färbung von Standardkontrollgewebe auf dem Array mit bekannter Östrogenrezeptor-Expression (Mammakarzinome) erzielt.
2.5 FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG (FISH)
TAG I
MATERIALIEN
Pretreatment Solution (Vysis VP 2000 Pretreatment Reagent #30-801250, Abbott Molecular Inc., IL/USA): NaSCN, pH 5,4, 50 ml, auf 80°C erwärmt
Protease Solution (1 L Vysis VP 2000 Protease Buffer #30-801255 (0,01 N HCl, pH 2,0) + Vysis Protease I #32-801260 (Pepsin 250 mg), Abbott Molecular Inc., IL/USA): auf 37°C erwärmt
Sonden-Hybridisierungsmix für 20 µl: 14,0 µl Basismix
2,0 µl COT-DNA (1 µg/µl)
3,5 µl ESR1-Sonde DNA (0,03µg/µl) (BAC RP11-450E24, RZPD)
0,5 µl CEP6-Sonde Spektrum Orange (Abbott Molecular Inc., IL/USA)
• Paraffinschnitt des Gewebearrays auf Superfrost plusTM über Nacht bei 40°C
backen, anschließend mit einem Diamantschreiber das Areal markieren
• 3 x 10 min Xylol, 2 x 5 min in 96% Ethanol entparaffinieren
• 3 min Lufttrocknung auf Heizplatte, Alkohol entfernen
• 15 min Pretreatment bei 80°C
• 2 min in demineralisiertem Wasser waschen
• 150 min in Proteaselösung bei 37°C andauen
• 2 min Wasserspülung (demineralisiertes Wasser)
• 3 min 70% Ethanol in Küvette gießen
• 3 min 80% Ethanol in Küvette gießen
• 3 min 96% Ethanol in Küvette gießen
• 3 min Lufttrocknung auf Heizplatte (48°C)
• 10 µl Sonden-Hybridisierungsmix auf den Gewebearray pipettieren und mit
Deckgläschen eindeckeln, mit Rubbercement versiegeln
denaturieren
• über Nacht Schnitt im HYBrite bei 37°C inkubieren
TAG II
MATERIALIEN
Waschpuffer-Küvette: 2 x SSC (Saline-Trinatriumcitrat: 0,14M NaCl, 0,015M Trinatriumcitrat; 4 x 66 g auf 1 L = 20 x SSC, dann 1:10 verdünnen) (Abbott Molecular Inc., IL/USA), 0,3% NP40 (Octylphenoxypolyethoxyethanol; Abbott Molecular Inc., IL/USA), pH 7,25 (pH 7-7,5), auf 72°C erwärmen
Fluorescent Antibody Enhancer Set (Roche, Basel/Schweiz)
Waschpuffer: 1 x PBS (Phopshate-Buffered saline), 0,2% Tween20, auf 37°C aufwärmen
1 x Blocking-Lösung 500 µl + 3 x 50 µl/Objektträger (10 x Blocking aus Kit-Flasche #4 auftauen und mit PBS 1:10 verdünnen)
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) - Antifade 1000 mg/ml (Abbott Molecular Inc., IL/USA)
Antikörperaliquots vor Verdünnung mit Blocking-Lösung 5 min bei circa 10000 rpm zentrifugieren
• Kleber und Deckgläschen vorsichtig entfernen
• Objektträger in den Waschpuffer bei Raumtemperatur stellen bis Wasserbad aufgeheizt, 2 min bei 72°C Objektträger in den Waschpuffer ins Wasserbad stellen
• Objektträger nach der Post-Hybridisierung kurz in 1 x PBS (100 ml in Objektträger-Küvette) waschen
• Objektträger mit 500 µl Blocking-Solution eindecken, 30 min bei Raumtemperatur inkubieren
• Blocking-Solution abkippen
• 50 µl Maus-Anti-DIG-Antikörper-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus Kit-Tube #1 in 48 µl 1 x Blocking) auf Objektträger-Küvette pipettieren, mit Parafilm abdecken, 1 h bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren
• 3 x mit 100 ml Waschpuffer (1x PBS, 0,2% Tween20) bei 37°C jeweils etwa 1 min kurz nacheinander waschen (3 Küvetten), zwischendurch etwas
schütteln
• 50 µl Anti-Maus-Antikörper-DIG-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus Kit-Tube #2 in 48 µl 1 x Blocking) auf Objektträger pipettieren, mit Parafilm abdecken, 1 h bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren
• 3 x mit 100 ml Waschpuffer (1x PBS, 0,2% Tween20) bei 37°C jeweils etwa 1 min kurz nacheinander waschen (3 Küvetten), zwischendurch etwas schütteln
• 50 µl Anti-DIG-Fluorescein-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus Kit-Tube #3 in 48 µl 1 x Blocking) auf Objektträger pipettieren, mit Parafilm abdecken, 1 h bei 37°C in feuchter, dunkler Kammer inkubieren
• 3 x 5 min mit 100 ml Waschpuffer (1 x PBS, 0,2% Tween20) waschen, Küvetten dunkel halten
• lufttrocknen der Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur
• eindecken der luftgetrockneten Objektträger mit 50 µl DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) - Antifade, mit Deckgläschen (24x32 mm) abdecken, möglichst dunkel halten
2.6 AUSWERTUNG
2.6.1 IMMUNHISTOCHEMIE
Die Auswertung erfolgt nach dem Allred-Score 35. Der Anteil der positiven
Tumorzellen wird zunächst geschätzt und ein Proportionsscore ermittelt 35.
Anschließend wird ein Intensitätsscore vergeben, der sich an der durchschnittlichen Färbeintensität positiver Zellen orientiert 35.
Tabelle 3: Definition des Allred-Scores 35
SCORE PROPORTIONSSCORE INTENSITÄTSSCORE
0 negativ negativ 1 < 1% schwach positiv 2 1-10% mittelstark positiv 3 10-33% stark positiv 4 33-66% 5 > 66%
Proportions- und Intensitätsscore werden addiert, so dass ein Gesamtscore von 0 bis 8 erreicht werden kann 35.
Tabelle 4: Interpretation des Allred-Scores 35
0 – 2 ER-negativ
3 – 8 ER-positiv
Bei allen immunhistochemisch positiven Tumoren wird die Untersuchung an Schnitten der Großfläche des Tumors wiederholt.
2.6.2 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
Die Auswertung erfolgt manuell.
Die Zellkerne werden mit DAPI blau gefärbt. Als Vergleich wird eine Zentromer-Sonde (Cep6) verwendet, so dass eine ESR1-Amplifikation vorliegt, wenn das Verhältnis von grünen (ESR1) zu roten (Cep6) Signalen >2 ist. Im Falle intrachromosomaler ESR1-Amplifikationen stellen sich diese als grüne Cluster dar. Bei einer Ratio zwischen 1 und 2 handelt es sich um eine Polysomie. Entspricht die Anzahl der ESR1-Gen-Signale denen der Centromersonde, so liegt keine spezifische Veränderung des ESR1-Gens vor. Ist die Ratio kleiner 1 kann von einer Deletion des ESR1-Gens ausgegangen werden. Die Evaluierung basiert auf dem etablierten Scoring-System für HER2-Amplifikationen beim Test-Kit PathVysion (akzeptiert durch US Food and Drug Administration (FDA)) 46.
Amplifikationen und Polysomien werden im Rahmen dieser Arbeit als FISH-positiv bezeichnet. Deletionen wie auch normale Genkopienanzahlen des ESR1-Gens werden hier als FISH-negativ eingeordnet.
Tabelle 5: Definition und Interpretation der FISH-Ergebnisse
RATIO AUSSAGE BEZEICHNUNG
> 2 Amplifikation FISH-positiv
1 – 2 Polysomie FISH-positiv
1 normal FISH-negativ
< 1 Deletion FISH-negativ
Bei allen FISH-positiven Neoplasien wird ebenfalls an weiteren Schnitten der Großfläche nochmals eine FISH-Analyse sowie mehrfach Immunhistochemie durchgeführt.
2.7 STATISTIK
Mittels Kontigenztabellen-Analyse und Chi-Quadrat-Test werden Zusammenhänge zwischen klinisch - pathologischen Daten und Östrogenrezeptorexpression sowie ESR1-Amplifikation dargestellt.
Lediglich der erste Spot eines Patienten wird bei Vorhandensein mehrerer Gewebeproben (Primarius/Rezidiv/Metastase) für die statische Analyse genutzt.
3. ERGEBNISSE
3.1 ALLGEMEIN
Es wurden 743 Tumoren von 632 Patienten untersucht.
Davon sind 313 Patienten männlich (49,50%) und 319 weiblich (50,50%).
Das durchschnittliche Alter liegt bei 55,32 Jahren, der Median bei 57,25 Jahren; der jüngste Patient war 1 Jahr, der älteste 98 Jahre alt.
Es ergibt sich folgende zu untersuchende Gesamttumorpopulation:
Tabelle 6: Übersicht der Gesamttumorpopulation ENTITÄT ANZAHL
PATIENTEN ANZAHL PRIMÄR-TUMOREN
ANZAHL
REZIDIVE ANZAHL METAST-ASEN ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom 50 50 - -Atypisches Lipom 12 11 1 -Liposarkom 120 112 25 7 FIBROBLASTISCH/MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide Fibromatose 22 20 5 -Haemangioperizytom 14 9 3 4 Fibrosarkom 3 1 1 2 FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkoma protuberans 8 6 5 1 GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom 77 77 1 -Leiomyosarkom 72 48 12 26 GIST 72 64 1 14 SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 1 1 - -Rhabdomyosarkom 7 4 2 1 VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 12 9 4 2 CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 10 6 3 4 Osteosarkom 7 4 2 3 PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 21 21 1 -malignes Schwannom 35 20 11 12
PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN
PNET 12 8 3 3
TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG
Synovialsarkom 3 1 - 2
NOS 74 54 18 12
TOTAL 632 526 98 93
in Frage gestellt, so dass diese Tumoren im Rahmen dieser Arbeit als pleomorphe undifferenzierte high grade Sarkome bezeichnet werden und der Gruppe „Non-other-specified-Tumoren (NOS)“ zugeordnet sind 4, 5.
Von 38 Patienten konnten sowohl Primarius als auch Rezidiv untersucht werden, bei weiteren 3 Patienten war es möglich Primarius, Rezidiv und Metastase zu analysieren.
Tabelle 7: Übersicht Entität, Primarius, Rezidiv und Metastase ENTITÄT PRIMARIUS UND
REZIDIV PRIMARIUS, REZIDIV UND METATASE PRIMARIUS UND METASTASE Liposarkom 16 1 4 Desmoide Fibromatose 3 - -Dermatofibrosarcoma protuberans 3 - -Leiomyom 2 - -Leiomyosarkom 2 1 5 GIST - - 7 Angiosarkom 2 - 1 Chondrosarkom 1 - 1 Osteosarkom - - 1 Granularzelltumor 1 - -malignes Schwannom 2 1 3 PNET 1 - -NOS 6 - 3 TOTAL 38 3 25
Nach Enzinger und Weiss 2 erfolgt eine Einteilung der Tumoren in benigne,
intermediär (so genannte Borderline-Tumoren) und maligne:
• benigne: Lipom, Leiomyom, Rhabdomyom, Granularzelltumor
• intermediär: atypisches Lipom, desmoide Fibromatose, Dermatofibrosarcoma protuberans
• maligne: Liposarkom, Haemangioperizytom, Fibrosarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Angiosarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, malignes Schwannom, PNET, Synovialsarkom, NOS.
GISTs werden entsprechend ihrer pathologischen Parameter wie Tumorgröße, Nekrosen, Mitosenanzahl etc. eingeordnet.
Insgesamt konnten 174 Tumoren als benigne, 61 als intermediär und 397 als maligne eingeordnet werden.
Bei 297 malignen Primärtumoren konnte die Tumorgröße ermittelt werden: 98 (33,00%) Weichgewebstumoren waren kleiner als fünf Zentimeter (entspricht
pT1) und 199 (67,00%) größer (entspricht pT2).
Die Lokalisationstiefe konnte bei 290 malignen Primarii bestimmt werden: wobei 45 (15,52%) Weichgewebstumoren suprafaszial (entspricht pTa) und 245 (84,48%) tief (d.h. unterhalb der Muskelfaszie, entspricht pTb) auftraten.
Die einzelnen Neoplasien waren wie folgt lokalisiert:
Tabelle 8: Übersicht Lokalisation
LOKALISATION PRIMARII REZIDIVE METASTASEN
Kopf/Hals 43 12 2 Rumpfwand 68 17 12 Lunge 7 3 28 Mediastinum 2 - 2 Gastrointestinaltrakt 115 2 3 intraperitoneal 38 12 30 retroperitoneal 42 12 4 obere Extremität 26 2 1 untere Extremität 88 14 -Genitaltrakt 38 2 1 Skelettsystem 2 - -andere Lokalisation 1 - 3 ohne Angabe 56 22 7
Bei 351 malignen Tumoren konnte anhand der eingesandten Präparate ein Lymphknotenstatus erhoben werden; bei 22 (6,27%) malignen Weichgewebstumoren wurden Lymphknotenmetastasen nachgewiesen (pN1).
Das Grading konnte bei 304 der malignen Tumoren aus den Unterlagen entnommen werden, wobei 46 Primarii G1, 87 G2 und 171 G3 klassifiziert wurden.
Bei Liposarkomen konnten folgende Subentitäten untersucht werden:
Tabelle 9: Übersicht Subentität bei Liposarkomen
SUBENTITÄT ANZAHL DER FÄLLE
hochdifferenziert/ dedifferenziert 62
myxoid/ rundzellig 40
pleomorph 15
3.2 TECHNISCHE PROBLEME UND AUSWERTBARKEIT
Immunhistochemisch konnten insgesamt 665 von 743 (89,50%) untersuchten Gewebeproben ausgewertet werden. Fehlende Resultate sind dem Mangel an Gewebe im Spot oder dem Fehlen des Spots geschuldet (78 = 10,50%).
Die FISH-Analyse war in 532 von 743 (71,60%) untersuchten Gewebeproben erfolgreich. Fehlende Resultate sind dem Mangel an Gewebe im Spot oder dem Fehlen des Spots geschuldet (211 = 28,40%).
3.3 PRIMÄRTUMOREN
3.3.1 IMMUNHISTOCHEMIE
466 von 526 Primarii (88,59%) waren im immunhistochemischen Verfahren interpretierbar. Es wiesen 62 Primärtumoren (13,30%) ein positives immunhistochemisches Ergebnis auf. Davon waren 38 (8,16%) schwach und 24 (5,15%) stark positiv anfärbbar (Allred – Score s. S. 29).
Die Ergebnisse sind tabellarisch auf der folgenden Seite dargestellt.
Insbesondere bei glattmuskulären Tumoren (Leiomyom, Leiomyosarkom und GIST trat häufig eine Expression des Östrogenrezeptors auf). Bei der überwiegenden Zahl von östrogenpositiven Tumoren handelt es sich um Leiomyome und Leiomyosarkome, größtenteils aus dem Uterus stammend. Daneben war bei Haemangioperizytomen, malignen peripheren Nervenscheidentumoren häufig sowie Liposarkomen und NOS - Tumoren gelegentlich ein Vorhandensein des Östrogenrezeptors darstellbar.
Tabelle 10: Übersicht der IHC-Ergebnisse bei Primärtumoren
ENTITÄT ANZAHL IHC NEGATIV IHC SCHWACH POSITIV IHC STARK POSITIV ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom 50 50 100% - -Atypisches Lipom 11 11 100% - -Liposarkom 108 102 94% 6%6
-FIBROBLASTISCH/ MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide Fibromatose 13 13 100% - -Haemangioperizytom 7 5 71% 14%1 14%1 FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkom protuberans 4 100%4 - -GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom 59 31 52% 14%8 20 34% Leiomyosarkom 47 39 83% 5 11% 3 6% GIST 56 45 80% 20%11 -SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 1 1 100% - -Rhabdomyosarkom 3 3 100% - -VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 7 7 100% - -CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 4 4 100% - -Osteosarkom 4 4 100% - -PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 17 17 100% - -malignes Schwannom 19 15 79% 4 21% -PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN
PNET 5 5
100% -
-TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG
Synovialsarkom 1 1 100% - -NOS 50 47 94% 6%3 -TOTAL 466 404 87% 38 8% 24 5%
Abbildung 10: IHC mit schwach positiver Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom
Abbildung 11: IHC mit schwach positiver Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom
Mittels FISH-Analyse waren 375 von 526 (71,29%) der Primarii interpretierbar. 32 (8,53%) Primärtumoren wiesen eine Genkopienveränderung auf. Davon waren 25 (6,67%) Polysomien, 6 (1,60%) Amplifikationen sowie 1 Deletion (0,27%) nachweisbar.
Die Ergebnisse sind tabellarisch auf der folgenden Seite dargestellt.
Genkopienzahlveränderungen waren am häufigsten bei NOS-Tumoren nachweisbar. Darüber hinaus stellen sich diese bei Liposarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Granularzelltumoren sowie malignen periphereren Nervenscheidentumoren dar.
Die Amplifikationen betrafen 2 Liposarkome, ein Primärtumor eines Leiomyosarkoms sowie ein Rezidiv und 3 NOS-Tumoren. Detaillierte Informationen und Fallbeschreibungen sind weiter unten aufgeführt.
Abbildung 12: FISH ESR1-Amplifikation bei einem Liposarkom
Bla u: Nuklei, grün: ESR1, rot: Centromer 6. Die ESR1-Amplifikation ist als Cluster grüner Signale zu sehen bzw. wenn das Verhältnis von grünen zu roten Signalen >2 ist.
Tabelle 11: Übersicht der FISH-Ergebnisse bei Primärtumoren
ENTITÄT ANZAHL FISH NEGATIV POLYSOMIE AMPLIFIKATION ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom 44 44 100% - -Atypisches Lipom 9 9 100% - -Liposarkom 93 81 87% 11%10 2%2 FIBROBLASTISCH/ MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN
Desmoide Fibromatose 12 100%12 - -Haemangioperizytom 5 5 100% - -FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkom protuberans 4 100%4 - -GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom 37 37 100% - -Leiomyosarkom 39 36 92% 5%2 3%1 GIST 50 50 100% - -SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 1 1 100% - -Rhabdomyosarkom 2 1 50% 50%1 -VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 7 7 100% - -CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 3 3 100% - -Osteosarkom 1 1 100% - -PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 11 10 91% 9%1 -malignes Schwannom 17 94%16 6%1
-PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN
PNET 4 4
100%
-
-TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG
Synovialsarkom 1 1 100% - -NOS 35 22 63% 29%10 9%3 TOTAL 375 344 92% 25 7% 2%6
3.3.3 TUMORVERHALTEN
Benigne Tumoren exprimierten den Östrogenrezeptor in unserem Kollektiv generell häufiger und stärker als intermediäre oder maligne Weichgewebsneoplasien. Dies ist statistisch hochsignifikant (p < 0,001) und gilt auch bei alleiniger Betrachtung glattmuskulärer Tumoren. Eine ER-Positivität war hier signifikant häufiger bei Leiomyomen (28 von 59 positiv, 47,46%) als bei Leiomyosarkomen (8 von 47 positiv, 17,02%) (p = 0,001). Eine definitive Aussage zu uterinen Tumoren ist nicht möglich aufgrund der geringen Anzahl maligner Neoplasien in dieser Region.
Tumorverhalten TOTAL
benigne intermediär maligne PRIMÄRTUMOR
IHC negativ 79,86%115 95,24%40 88,89%248 403 PRIMÄRTUMOR
IHC schwach positiv 6,25%9 4,76%2 9,68%27 38 PRIMÄRTUMOR
IHC stark positiv 13,89%20 - 1,43%4 24
TOTAL 144 42 279 465
Abbildung 13: IHC Primärtumoren und Tumorverhalten
Genkopienzahlveränderungen traten vor allem bei malignen Tumoren, selten oder gar nicht bei benignen oder intermediären Neoplasien auf. Dieser Zusammenhang ist statistisch hoch signifikant (p < 0,001).
Tumorverhalten TOTAL benigne intermediär maligne
PRIMÄRTUMOR
FISH negativ 99,06%106 100%41 86,28%195 342 PRIMÄRTUMOR
FISH positiv 0,94%1 - 13,72%31 32
Abbildung 14: FISH Primärtumoren und Tumorverhalten
3.3.4 DIFFERENZIERUNGSGRAD
Die ER-Expression der malignen Weichgewebsneoplasien zeigt geringe Assoziationen zum Differenzierungsgrad (statistisch nicht signifikant, p = 0,494).
Grading TOTAL G1 G2 G3 PRIMÄRTUMOR IHC negativ 29 82,86% 53 86,89% 98 89,09% 180 PRIMÄRTUMOR
IHC schwach positiv 11,43%4 11,48%7 11,00%11 22 PRIMÄRTUMOR
IHC stark positiv 5,71%2 1,64%1 0,91%1 4
TOTAL 35 61 110 206
Jedoch zeigten insbesondere niedrig differenzierte Neoplasien Genkopienzahlveränderungen des ESR1-Gens. Der Zusammenhang zwischen Differenzierungsgrad des Tumors und Genveränderung ist statistisch signifikant (p = 0,030). Grading TOTAL G1 G2 G3 PRIMÄRTUMOR FISH negativ 96,67%29 84,31%43 79,31%69 141 PRIMÄRTUMOR FISH positiv 1 3,33% 8 15,69% 18 20,69% 27 TOTAL 30 51 87 181
Abbildung 16: FISH Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad
3.3.5 GESCHLECHT
Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Geschlecht und Expression des Östrogenrezeptors ist darstellbar (p < 0,001). Neoplasien weiblicher Patienten exprimieren den ER-Rezeptor deutlich häufiger als bei männlichen Patienten. GESCHLECHT TOTAL weiblich männlich PRIMÄRTUMOR IHC negativ 81,86%194 91,70%210 404 PRIMÄRTUMOR
IHC schwach positiv 8,44%20 7,86%18 38
PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv
23 9,71% 1 0,44% 24 TOTAL 237 229 466
Abbildung 17: IHC Primärtumoren und Geschlecht
Es besteht ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Geschlecht sowie Genkopienzahlveränderung (p = 0,008). Diese treten deutlich häufiger bei Männern als bei Frauen auf. Eine Hypothese zu diesem unerwarteten Ergebnis findet sich im Diskussionsteil.
GESCHLECHT TOTAL weiblich männlich PRIMÄRTUMOR FISH negativ 95,70%178 87,83%166 344 PRIMÄRTUMOR FISH positiv 4,30%8 12,17%23 31 TOTAL 186 189 375
Abbildung 18: FISH Primärtumoren und Geschlecht
Der anhand des Alters angenommene Menopausenstatus weiblicher Patienten (jünger als 45 Jahre = prämenopausal, 45 - 55 Jahre = menopausal, älter als 55 Jahre = postmenopausal 47, 48) weist weder einen statistisch signifikanten
3.3.6 LOKALISATION
In einigen Geweben kommt es häufiger und stärker zu einer Östrogenrezeptorexpression. Dies gilt insbesondere für den Genitaltrakt.
Tabelle 12: IHC ER-Expression und Tumorlokalisation
LOKALISATION ANZAHL IHC NEGATIV IHC SCHWACH POSITIV IHC STARK POSITIV Kopf/ Hals 38 38 100% 0- 0 -Rumpfwand 61 57 93% 04 7% 0 -Lunge 07 07 100% 0- 0 -Mediastinum 02 02 100% 0- 0 -Gastrointestinaltrakt 92 79 86% 13 14% 0 -intraperitoneal 32 25 78% 04 13% 03 9% retroperitoneal 36 28 78% 06 17% 02 6% obere Extremität 24 23 96% 01 4% 0 -untere Extremität 86 84 98% 01 1% 01 1% Genitaltrakt 35 12 34% 06 17% 17 49% Skelettsystem 02 02 100% 0- 0 -ohne Angabe 51
Zwischen FISH-Ergebnis und Lokalisation des Tumors lässt sich eine deutliche Assoziation herstellen.
Tabelle 13: FISH Genkopienzahlveränderung und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL FISH
NEGATIV FISH POSITIV
Poly-somie Amplifi-kation Deletion
Kopf/ Hals 31 30 97% 1 3% 1 - -Rumpfwand 47 44 3 6% 2 1 -Lunge 6 5 83% 1 17% 1 - -Mediastinum 2 2 100% - - - -Gastrointestinaltrakt 76 75 99% 1 1% - 1 -intraperitoneal 22 20 91% 2 9% 1 1 -retroperitoneal 33 28 85% 5 15% 4 1 1 obere Extremität 21 17 81% 4 19% 3 1 -untere Extremität 64 55 86% 9 14% 8 1 -Genitaltrakt 26 26 100% - - - -Skelettsystem 1 1 100% - - - -ohne Angabe 46
3.3.7 TUMORGRÖßE
Häufiger exprimierten maligne Tumoren den Östrogenrezeptor, die größer als 5 Zentimeter waren (entspricht pT2). Dies ist allerdings ohne statistische Signifikanz (p = 0,538). T-STADIUM TOTAL pT1 pT2 PRIMÄRTUMOR IHC negativ 81 91,01% 155 87,57% 236 PRIMÄRTUMOR IHC positiv 8,99%8 12,43%22 30 TOTAL 89 177 266
Abbildung 19: IHC Primärtumoren und Tumorgröße
Auf Genebene jedoch, stellt die Tumorgröße eine statistisch signifikante Einflussgröße dar (p = 0,130). Eine Genkopienzahlveränderung ist insbesondere bei malignen Tumoren größer als 5 Zentimeter zu finden.
T-STADIUM TOTAL pT1 pT2 PRIMÄRTUMOR FISH negativ 92,75%64 85,16%132 196 PRIMÄRTUMOR FISH positiv 5 7,25% 23 14,84% 28 TOTAL 69 155 224
Abbildung 20: FISH Primärtumoren und Tumorgröße
3.4 REZIDIVE
In 38 Fällen wurden Primärtumoren und zugehörige Rezidive untersucht, diese waren hinsichtlich des Östrogenrezeptors in 36 Fällen identisch (p = 0,013).
REZIDIV TOTAL
IHC negativ IHC positiv PRIMÄRTUMOR
IHC negativ 97,14%34 33,33%1 35
PRIMÄRTUMOR
IHC positiv 2,86%1 66,67%2 3
TOTAL 35 3 38
In 28 Fällen konnten Primärtumor und zugehöriges Rezidiv mittels FISH analysiert werden. Dabei fanden sich Unterschiede bezüglich Amplifikation- oder Polysomiestatus im zeitlichen Verlauf.
REZIDIV TOTAL
FISH negativ FISH positiv PRIMÄRTUMOR
FISH negativ 90,00%18 87,50%7 25
PRIMÄRTUMOR
FISH positiv 10,00%2 12,50%1 3
TOTAL 20 8 28
Im Folgenden werden die im Fokus stehenden Entitäten Leiomyom, Leimoysarkom sowie Liposarkom näher dargestellt. Ein Kapitel zu Gastrointestinalen Stromatumoren bietet sich ebenfalls an aufgrund der überraschenden Ergebnisse in der Immunhistochemie.
3.5. LEIOMYOM
59 Primärtumoren konnten immunhistochemisch analysiert werden, von denen 28 (47,46%) positiv waren. Eine stark positive Färbung war bei 20 (34,90%) Leiomyomen zu finden.
11 Leiomyome stammten von männlichen Patienten, die keine Expression des Östrogenrezeptors (0%) zeigten; 28 von 48 (58,33%) Leiomyomen weiblicher Patienten waren ER-positiv. Die Assoziation von ER-Expression und Geschlecht ist bei Leiomyomen hoch signifikant (p = 0,002).
GESCHLECHT TOTAL
weiblich männlich PRIMÄRTUMOR
IHC negativ 41,67%20 100%11 31
PRIMÄRTUMOR
IHC schwach positiv 16,67%8 - 8
PRIMÄRTUMOR
IHC starkpositiv 41,67%20 - 20
TOTAL 48 11 59
Die Lokalisation des Leiomyoms ist ein statistisch hoch signifikanter Faktor in Bezug auf das Vorhandensein des Östrogenrezeptors (p < 0,001). Leiomyome exprimieren diesen bevorzugt im weiblichen Genitaltrakt.
Tabelle 14: IHC Leiomyom und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC SCHWACH
POSITIV IHC STARK POSITIV IHC NEGATIV Kopf/ Hals 01 0- 0- 01 100% Lunge 01 0- 0- 01 100% Mediastinum 01 0- 0- 01 100% Gastrointestinaltrakt 20 01 5% 0- 19 95% intraperitoneal 05 0- 03 60% 02 40% retroperitoneal 03 01 33% 01 33% 01 33% untere Extremität 03 0- 0- 03 100% Genitaltrakt davon Uterus 25 021 0 6 24% 0 5 24% 016 64% 0 13 62% 03 12% 0 3 14% Abbildung 22: IHC Leiomyom Primärtumoren und Lokalisation
3.6 LEIOMYOSARKOM
Es waren 47 Primärtumoren immunhistochemisch auswertbar, von denen 8 (17,02%) positiv, davon 3 (6,38%) stark positiv, anfärbbar waren.
Bei 3 von 39 (7,69%) interpretierbaren Primärtumoren traten Genkopienzahlveränderungen auf; dabei handelt es sich um 2 Polysomien (5,13%) und um 1 Amplifikation (2,56%).
Das Geschlecht war in unserem relativ kleinen Kollektiv nicht signifikant mit der Östrogenrezeptorexpression assoziiert (p = 0,269). GESCHLECHT TOTAL weiblich männlich PRIMÄRTUMOR IHC negativ 76,92%20 90,48%19 39 PRIMÄRTUMOR IHC positiv 23,08%6 9,52%2 8 TOTAL 26 21 47
Abbildung 23: IHC Leiomyosarkom Primärtumoren und Geschlecht
Ebenso sind keine Assoziationen zwischen einer Genkopienzahlveränderung und Geschlecht bei Leiomyosarkomen darstellbar (p = 1,000).
Die Lokalisation ist keine statistisch signifikante Einflussgröße in Bezug zur ER-Expression (p = 0,313).
Tabelle 15: IHC Leimyosarkom und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC SCHWACH
POSITIV IHC STARK POSITIV IHC NEGATIV Kopf/ Hals 03 0- 0- 03 100% Rumpfwand 01 01 100% 0- 0 -Lunge 02 0- 0- 02 100% Gastrointestinaltrakt 07 0- 0- 07 100% intraperitoneal 06 01 17% 0- 05 83% retroperitoneal 9 02 22% 0- 07 78% obere Extremität 02 0- 0- 02 100% untere Extremität 08 0- 01 12% 07 88% Genitaltrakt 03 0- 01 33% 02 67% Skelettsystem 01 0- 0- 01 100% ohne Angabe 05
Die Polysomien waren bei Primarii der Lunge und der unteren Extremität, die Amplifikation intraperitoneal zu finden. Es besteht keine statistische Signifikanz zwischen Genkopienzahlveränderung und Lokalisation des Tumors (p = 0,385).
Der Differenzierungsgrad von Leiomyosarkomen zeigte eine Tendenz zur quantitativen ESR1-Veränderungen ohne statistische Signifikanz.
Grading TOTAL G1 G2 G3 PRIMÄRTUMOR FISH negativ 100%7 94,12%16 86,67%13 36 PRIMÄRTUMOR FISH positiv - 5,88%1 13,33%2 3 TOTAL 7 17 15 39
