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@ Veröffentlichungsnummer: 0 0 1 2 1 8 4 A 1
© EUROPÄISCHE PATENTANMELDUNG
© Anmeldenummer: 79104098.3 ® Int.CI.3: C 12 Q 1/54, G 01 N 3 3 / 6 6
® Anmeldetag: 23.10.79
(30) Priorität: 22.11.78 DE 2850603 ® Anmelder: Merck Patent Gesellschaft mit beschränkter Haftung, Frankfurter Strasse 250, D-6100 Darmstadt (DE)
© Veröffentlichungstag der Anmeldung: 25.06.80 Patentblatt 80/13
@ Benannte Vertragsstaaten : AT BE CH DE FR GB IT NL SE
@ Erfinder: Vormbrock, Rolf, Dr., Grundstrasse 17, D-6100 Darmstadt (DE)
Erfinder: Helger, Roland, Dr., Ludwigshöhstrasse 85, D-6100 Darmstadt (DE)
@ Hämolysierlösung, Verwendung einer solchen für die Bestimmung von Glucose im Blut, und Hämolyseverfahren.
@ Eine wässerige Hämolysierlösung, die nach Vermischen mit Blut dessen Glucosegehalt zu bestimmen erlaubt, ent- hält als gelöste Bestandteile im wesentlichen einen Puffer (z. B. Phosphatpuffer pH 7,6), Natriumchlorid, mindestens einen Chelatbildner (z. B. EDTA) und mindestens ein Ten- sid (z.B. Polyoxyäthylen-10-alkylphenoläther) sowie zweckmäßig noch ein Alkaliazid (z. B. Natriumazid). Eine derartige Hämolysierlösung ist praktisch unbegrenzt halt- bar; die Glucosekonzentration im mit ihr hydrolysiertem
^™ Blut ist nach zwölf Tagen noch unverändert.
00 Gl O o III
ACTORUM AG Eine wässerige Hämolysierlösung, die nach Vermischen mit Blut dessen Glucosegehalt zu bestimmen erlaubt, ent- hält als gelöste Bestandteile im wesentlichen einen Puffer (z. B. Phosphatpuffer pH 7,6), Natriumchlorid, mindestens einen Chelatbildner (z. B. EDTA) und mindestens ein Ten- sid (z. B. Polyoxyäthylen-10-alkylphenoläther) sowie zweckmäßig noch ein Alkaliazid (z. B. Natriumazid). Eine derartige Hämolysierlösung ist praktisch unbegrenzt halt- bar; die Glucosekonzentration im mit ihr hydrolysiertem Blut ist nach zwölf Tagen noch unverändert.
Die v o r l i e g e n d e E r f i n d u n g b e t r i f f t e i n e H ä m o l y s i e r - l ö s u n g s o w i e e i n V e r f a h r e n z u r H ä m o l y s e von B l u t u n d z u r S t a b i l i s i e r u n g d e r G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n in h ä m o - l y s i e r t e m B l u t .
Die B e s t i m m u n g d e r G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n im V o l l b l u t w i r d wegen des g e r i n g e n A r b e i t s a u f w a n d e s e i n e r B e - s t i m m u n g in P l a s m a o d e r Serum v o r g e z o g e n . Ein w e i t e r e r V o r t e i l b e i d e r V e r w e n d u n g von V o l l b l u t b e s t e h t d a r i n , daß b e r e i t s e i n e s e h r g e r i n g e Menge B l u t ( z . B . 20 N1) f ü r e i n e B e s t i m m u n g a u s r e i c h t . In d e r e n t n o m m e n e n B l u t - p r o b e b e w i r k e n j e d o c h d i e in den E r y t h r o z y t e n e n t -
h a l t e n e n Enzyme e i n e n g l y k o l y t i s c h e n Abbau der v o r - h a n d e n e n G l u c o s e . Aus d i e s e m G r u n d muß d i e G l u c o s e - b e s t i m m u n g e n t w e d e r u n v e r z ü g l i c h n a c h d e r B l u t e n t n a h m e d u r c h g e f ü h r t w e r d e n o d e r d i e G l y k o l y s e muß d u r c h g e - e i g n e t e M e t h o d e n i n h i b i e r t w e r d e n . Die I n h i b i e r u n g k a n n s o w o h l i n . i s o t o n i s c h e r L ö s u n g ohne H ä m o l y s e e r -
f o l g e n a l s a u c h n a c h d e r H ä m o l y s e d e r P r o b e , d i e z . B . d u r c h o s m o t i s c h e n S c h o c k o d e r m i t t e l s D i g i t o n i n h e r v o r - g e r u f e n w e r d e n k a n n .
In d e r L i t e r a t u r s i n d b e r e i t s e i n e R e i h e von I n h i b i t o r e n d e r G l y k o l y s e b e s c h r i e b e n w o r d e n , z . B . F l u o r i d e , H a l o g e n - a c e t a t e , N - A l k y l m a l e i n i m i d e , E s s i g s ä u r e usw. Der H a u p t -
n a c h t e i l d e r b e k a n n t e n , d i e s e I n h i b i t o r e n e n t h a l t e n d e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g e n f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g . i n V o l l b l u t b e s t e h t d a r i n , daß d i e s e L ö s u n g e n e n t w e d e r nur e i n e b e - g r e n z t e Z e i t s t a b i l s i n d o d e r d i e G l y k o l y s e n i c h t v o l l - s t ä n d i g i n h i b i e r e n . So b e t r ä g t z . B . d i e H a l t b a r k e i t d e r H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h d e r DE-AS 18 13 848 n u r e t w a 3 - 4 Wochen, d . h . , d i e s e L ö s u n g e n m ü s s e n in g e r i n g e n Z e i t a b -
s t ä n d e n f r i s c h a n g e s e t z t w e r d e n , um s i c h e r zu s e i n , d a ß s i e n o c h v o l l f u n k t i o n s f ä h i g s i n d .
D e r E r f i n d u n g l i e g t d i e A u f g a b e z u g r u n d e , e i n e H ä m o l y - s i e r l ö s u n g f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g im V o l l b l u t z u r V e r - f ü g u n g zu s t e l l e n , d i e g u t h ä m o l y s i e r t . , d i e G l y k o l y s e hemmt und p r a k t i s c h u n b e g r e n z t h a l t b a r i s t .
E r f i n d u n g s g e m ä ß w u r d e d i e s e A u f g a b e d u r c h e i n e H ä m o l y - s i e r l ö s u n g g e l ö s t , d i e n e b e n e i n e m P u f f e r und N a t r i u m - c h l o r i d e i n e n C h e l a t b i l d n e r und e i n T e n s i d e n t h ä l t .
G e g e n s t a n d d e r E r f i n d u n g i s t d e m n a c h e i n e H ä m o l y s i e r l ö s u n g f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g im B l u t , d i e im w e s e n t l i c h e n e i n e n P u f f e r und N a t r i u m c h l o r i d e n t h ä l t und d i e g e k e n n - z e i c h n e t i s t d u r c h e i n e n G e h a l t an m i n d e s t e n s e i n e m C h e l a t b i l d n e r und m i n d e s t e n s e i n e m T e n s i d .
F e r n e r u m f a ß t d e r G e g e n s t a n d d e r E r f i n d u n g e i n V e r f a h r e n z u r H ä m o l y s e von B l u t und z u r S t a b i l i s i e r u n g d e r e n t h a l - t e n e n G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n , das d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t i s t , daß man V o l l b l u t m i t e i n e r w ä ß r i g e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g b e - h a n d e l t , d i e im w e s e n t l i c h e n P u f f e r , N a t r i u m c h l o r i d , C h e l a t b i l d n e r und T e n s i d e n t h ä l t .
E i n w e i t e r e r G e g e n s t a n d der E r f i n d u n g b e s t e h t in der V e r - w e n d u n g e i n e r K o m b i n a t i o n aus m i n d e s t e n s e i n e m C h e l a t b i l d - n e r und m i n d e s t e n s e i n e m T e n s i d in H ä m o l y s i e r l ö s u n g e n
f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g i m B l u t .
Ü b e r r a s c h e n d e r w e i s e h a t s i c h g e z e i g t , daß die K o m b i n a - t i o n aus C h e l a t b i l d n e r und T e n s i d e i n e v o l l s t ä n d i g e I n - h i b i e r u n g d e r G l y k o l y s e im H ä m o l y s a t b e w i r k t und a u ß e r - dem e i n e s t a b i l e H ä m o l y s i e r l ö s u n g e r h a l t e n w i r d . C h e l a t - b i l d n e r wie Ä t h y l e n d i a m i n t e t r a a c e t a t , d i e d u r c h K o m p l e x i e -
r u n g z w e i w e r t i g e r M e t a l l k a t i o n e n e i n e R e i h e von E n z y m e n d e r G l y k o l y s e zu i n h i b i e r e n v e r m ö g e n , s i n d b i s h e r n i c h t a l s s t a b i l i s a t o r e n in H ä m o l y s i e r l ö s u n g e n v e r w e n d e t w o r - d e n , w e i l C h e l a t b i l d n e r a l l e i n k e i n e e f f e k t i v e Hemmung d e r G l y k o l y s e im B l u t b e w i r k e n ; b e i e i n e r Ä t h y l e n d i a m i n - t e t r a a c e t a t k o n z e n t r a t i o n von z . B . 1 g/1 w i r d die im B l u t e n t h a l t e n e G l u c o s e v i e l m e h r a b g e b a u t . Die G l u c o s e k o n z e n - t r a t i o n im m i t d e r e r f i n d u n g s g e m ä ß e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g h e r g e s t e l l t e n H ä m o l y s a t i s t d a g e g e n n a c h 12 T a g e n i m m e r n o c h u n v e r ä n d e r t . Ein z u s ä t z l i c h e r V o r t e i l d e r e r f i n - d u n g s g e m ä ß e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g b e s t e h t d a r i n , daß i m H ä m o l y s a t k e i n e T r ü b u n g a u f t r i t t .
Als T e n s i d e e i g n e n s i c h i o n i s c h e T e n s i d e , wie N a t r i u m d o - d e c y l s u l f a t , C e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d , L a u r y l s a r k o s i n o d e r T a u r o g l y c o c h o l a t , v o r a l l e m n i c h t i o n i s c h e T e n s i d e , v o r z u g s w e i s e A l k y l p h e n o l p o l y g l y k o l ä t h e r .
G e e i g n e t e C h e l a t b i l d n e r s i n d z . B . Ä t h y l e n d i a m i n t e t r a - a c e t a t , N i t r i l o t r i a c e t a t , C y c l o h e x y l e n - ( 1 , 2 ) - d i n i t r i - l o t e t r a a c e t a t , D i ä t h y l e n t r i a m i n p e n t a a c e t a t , B i s -
( a m i n o ä t h y l ) - g l y k o l ä t h e r - N , N , N ' , N ' - t e t r a a c e t a t , v o r - z u g s w e i s e Ä t h y l e n d i a m i n t e t r a a c e t a t .
In d e r H ä m o l y s i e r l ö s u n g k ö n n e n j e w e i l s a u c h K o m b i n a t i o n e n d e r C h e l a t b i l d n e r und T e n s i d e e i n g e s e t z t w e r d e n .
Die e r f i n d u n g s g e m ä ß e H ä m o l y s i e r l ö s u n g e n t h ä l t d i e T e n s i d e in e i n e r K o n z e n t r a t i o n von 1 - 4 g / l , v o r - z u g s w e i s e 2 g / l ; d i e C h e l a t b i l d n e r s i n d in e i n e r K o n z e n t r a t i o n von 0,5 b i s 2 g / l , v o r z u g s w e i s e 1 g / 1 e n t h a l t e n .
Die H ä m o l y s i e r l ö s u n g e n t h ä l t d a r ü b e r h i n a u s noch m i n - d e s t e n s e i n e n P u f f e r und N a t r i u m c h l o r i d . Der P u f f e r d i e n t d a z u , den p H - W e r t der H ä m o l y s i e r l ö s u n g in e i n e m f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g g e e i g n e t e n B e r e i c h von e t w a 6 - 8 e i n z u s t e l l e n . Als g e e i g n e t e P u f f e r h a b e n s i c h z . B . P h o s p h a t - , T r i s - , T r i ä t h a n o l a m i n - o d e r I m i d a z o l - p u f f e r in e i n e r K o n z e n t r a t i o n von 5 0 - 500 mmol/1 e r - w i e s e n , b e v o r z u g t w i r d e i n P h o s p h a t p u f f e r vom p H - W e r t 7,6 in e i n e r K o n z e n t r a t i o n von 120 mmol/1 v e r w e n d e t . Die N a t r i u m c h l o r i d k o n z e n t r a t i o n s o l l t e g r ö ß e r a l s 0 , 8 m o l / 1 s e i n , v o r z u g s w e i s e e t w a 1 m o l / 1 .
Zur V e r m e i d u n g m i k r o b i e l l e r K o n t a m i n a t i o n k ö n n e n n o c h 5 - 120 mmol/1 e i n e s . A l k a l i a z i d s z u g e s e t z t w e r d e n , v o r - z u g s w e i s e 14 m m o l / 1 N a t r i u m a z i d .
Die H ä m o l y s e von V o l l b l u t u n t e r g l e i c h z e i t i g e r s t a b i l i - s i e r u n g d e r e n t h a l t e n e n G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n e r f o l g t in d e r W e i s e , daß man das zu u n t e r s u c h e n d e V o l l b l u t m i t d e r e r f i n d u n g s g e m ä ß e n w ä ß r i g e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g a u f - nimmt und a n s c h l i e ß e n d o d e r a b e r e r s t n a c h e i n i g e n T a g e n m i t d i e s e r L ö s u n g d i e e n z y m a t i s c h e G l u c o s e b e s t i m m u n g n a c h den ü b l i c h e n M e t h o d e n v o r n i m m t .
Die E r f i n d u n g w i r d d u r c h d i e f o l g e n d e n B e i s p i e l e n ä h e r e r l ä u t e r t .
B e i s p i e l 1
20 µl B l u t w e r d e n u n m i t t e l b a r n a c h der B l u t a b -
nahme in 2 ml e i n e r H ä m o l y s i e r l ö s u n g a u f g e n o m m e n , d i e f o l g e n d e Z u s a m m e n s e t z u n g h a t :
120 mmol/1 P h o s p h a t p u f f e r , pH 7 , 6 1 m o l / 1 N a t r i u m c h l o r i d
14 mmol/1 N a t r i u m a z i d
1 g/1 Ä t h y l e n d i a m i n t e t r a a c e t a t u n d
2 g/1 P o l y o x y ä t h y l e n - 1 0 - a l k y l p h e n o l ä t h e r ( L u t e n s o l ( R ) AP 1 0 ) .
1 ml d i e s e r L ö s u n g w i r d in e i n e K ü v e t t e p i p e t t i e r t und m i t 2 ml P u f f e r l ö s u n g f o l g e n d e r Z u s a m m e n s e t z u n g v e r s e t z t :
120 mmol/1 P h o s p h a t p u f f e r , pH 7 , 6 150 mmol/1 N a t r i u m c h l o r i d
14 mmol/1 N a t r i u m a z i d
2,8 m m o l / 1 Ä t h y l e n d i a m i n t e t r a a c e t a t
3 , 6 m m o l / 1 N i c o t i n a m i d a d e n i n d i n u c l e o t i d u n d 150 U/1 M u t a r o t a s e .
Die E x t i n k t i o n d e r L ö s u n g w i r d b e i e i n e r W e l l e n l ä n g e v o n 340 nm o d e r m i t F i l t e r Hg 334 o d e r Hg 365 g e m e s s e n , d a n n w i r d d u r c h Zugabe von 20 µl E n z y m l ö s u n g , die 500 kU/1 G l u -
c o s e d e h y d r o g e n a s e e n t h ä l t , d i e R e a k t i o n g e s t a r t e t . N a c h e t w a 5 M i n u t e n i s t d i e R e a k t i o n b e e n d e t und d i e E x t i n k t i o n w i r d a b g e l e s e n . Aus d e r E x t i n k t i o n s d i f f e r e n z Δ E e r r e c h n e t s i c h d i e G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n d e r u n t e r s u c h t e n P r o b e n a c h d e r G l e i c h u n g :
G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n c = A E334 x 889,2 m g / d l .
Die G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n b l e i b t ü b e r Wochen k o n s t a n t , d i e H ä m o l y s i e r l ö s u n g i s t u n b e g r e n z t s t a b i l .
B e i s p i e l 2
A n a l o g B e i s p i e l 1 w u r d e d i e G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n in e i - n e r h ä m o l y s i e r t e n B l u t p r o b e b e s t i m m t , w o b e i das H ä m o l y s a t in 6 T e i l e g e t e i l t w u r d e , die j e w e i l s im A b s t a n d von e i - n i g e n T a g e n g e m e s s e n und a u s g e w e r t e t w u r d e n . Zum V e r g l e i c h w u r d e n B l u t p r o b e n g e m e s s e n , die mit e i n e r H ä m o l y s i e r l ö s u n g b e h a n d e l t w a r e n , die N a t r i u m f l u o r i d an S t e l l e der K o m b i n a - t i o n aus C h e l a t b i l d n e r und T e n s i d e n t h i e l t .
Die n a c h s t e h e n d e T a b e l l e g i b t d i e G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n d e r v e r s c h i e d e n e n H ä m o l y s a t e in % des A n f a n g s w e r t e s w i e - d e r . Die W e r t e w u r d e n m i t P r o b e n e r h a l t e n , d i e 70 m g / d l G l u c o s e e n t h i e l t e n .
Aus d e r T a b e l l e g e h t h e r v o r , daß d i e G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n in den m i t d e r e r f i n d u n g s g e m ä ß e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g h e r g e - s t e l l t e n H ä m o l y s a t e n im V e r s u c h s z e i t r a u m k o n s t a n t b l e i b t , w ä h r e n d in den N a t r i u m f l u o r i d e n t h a l t e n d e n H ä m o l y s a t e n d i e G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n s t ä n d i g a b n i m m t .
1. H ä m o l y s i e r l ö s u n g f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g i m B l u t , im w e s e n t l i c h e n e n t h a l t e n d e i n e n P u f f e r und N a t r i u m c h l o r i d , g e k e n n z e i c h n e t d u r c h e i n e n G e h a l t a n m i n d e s t e n s e i n e m C h e l a t b i l d n e r u n d m i n d e s t e n s e i n e m T e n s i d .
2. H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h A n s p r u c h 1, d a d u r c h g e k e n n - z e i c h n e t , daß a l s T e n s i d e n i c h t i o n i s c h e T e n s i d e e n t h a l t e n s i n d .
3. H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h den A n s p r ü c h e n 1 und 2, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß a l s T e n s i d e A l k y l p h e n o l - p o l y g l y k o l ä t h e r e n t h a l t e n s i n d .
4. H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h den A n s p r ü c h e n 1 b i s 3, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß a l s C h e l a t b i l d n e r Ä t h y l e n - d i a m i n t e t r a a c e t a t , N i t r i l o t r i a c e t a t , C y c l o h e x y l e n -
( 1 , 2 ) - d i n i t r i l o t e t r a a c e t a t , D i ä t h y l e n t r i a m i n p e n t a - a c e t a t u n d / o d e r B i s - ( a m i n o ä t h y l ) - g l y k o l ä t h e r - N , N , N ' , N ' - t e t r a a c e t a t e n t h a l t e n s i n d .
5. H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h den A n s p r ü c h e n 1 b i s 4, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß d i e T e n s i d e in e i n e r K o n z e n t r a t i o n von 1 b i s 4 g/1 e n t h a l t e n s i n d .
6. H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h den A n s p r ü c h e n 1 b i s 5, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß d i e C h e l a t b i l d n e r i n e i n e r K o n z e n t r a t i o n von 0,5 b i s 2 g/1 e n t h a l t e n s i n d .
7. H ä m o l y s i e r l ö s u n g n a c h den A n s p r ü c h e n 1 b i s 6, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß z u s ä t z l i c h N a t r i u m a z i d e n t h a l t e n i s t .
8. V e r f a h r e n z u r H ä m o l y s e von B l u t und z u r S t a b i l i - s i e r u n g d e r e n t h a l t e n e n G l u c o s e k o n z e n t r a t i o n , d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man V o l l b l u t m i t e i n e r w ä ß r i g e n H ä m o l y s i e r l ö s u n g b e h a n d e l t , d i e im w e s e n t - l i c h e n P u f f e r , N a t r i u m c h l o r i d , C h e l a t b i l d n e r u n d T e n s i d e n t h ä l t . .
9. V e r w e n d u n g e i n e r K o m b i n a t i o n aus m i n d e s t e n s e i n e m C h e l a t b i l d n e r und m i n d e s t e n s e i n e m T e n s i d i n
H ä m o l y s i e r l ö s u n g e n f ü r d i e G l u c o s e b e s t i m m u n g i m B l u t .
