SYNTHESE VON
N-CARBORANOYLAMIDO-DERIVATEN DER SIALINSÄURE UND DER
GLUCOSE
Vom Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen genehmigte
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften –Dr.rer.nat.-
vorgelegt von Björn Lechtenberg
aus Bremen
Tag des öffentlichen Kolloquiums: 13. April 2007
1. Gutachter: Prof. Dr. Detlef Gabel 2. Gutachter: Prof. Dr. Sørge Kelm Prüfer: Prof. Dr. Dieter Wöhrle
DANKSAGUNGEN
Ich danke Herrn Prof. Dr. Detlef Gabel für die Überlassung des interessanten und vielseitigen Themas, für seine gute Betreuung und seine Geduld.
Für die Erstellung des Zweitgutachtens und den fachlichen Rat auf dem Gebiet der molekularen Zellerkennung danke ich Herrn Prof. Dr. Sørge Kelm.
Für die Durchführung der Inhibitionstests danke ich Frau Dr. Antje Kelm.
Für die Aufnahme der Massenspektren danke ich Frau Dorit Kemken und Herrn Dr. Thomas Dülcks, dem ich darüber hinaus für die Übernahme des Prüferamtes danke. Für die Bereitschaft meine Dissertation zu prüfen danke ich ebenso Herrn Prof. Dr. Dieter Wöhrle.
Bei den Mitgliedern der Arbeitsgruppe möchte ich mich ganz besonders herzlich für die nette Arbeitsatmosphäre, die vielen anregenden und angeregten Diskussionen und die guten Ratschläge bedanken. Für letzteres danke ich insbesondere Dr. Eugen Justus, Dr. Inga Justus und Renate Alberts.
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INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung... 41.1 Die N-Acetylneuraminsäure und ihre Derivate ... 4
1.1.1. Vorkommen und Biosynthese... 4
1.1.2. Chemische Synthese... 7
1.1.3. Molekulare Zellerkennung durch Sialinsäuren... 8
1.1.4. Bindung von Sialinsäureanaloga an myelin-assoziertes Glycoprotein (MAG)... 13
1.2. Ortho-Carboran als Pharmacophor ... 21
1.2.1. Struktur und Synthese von closo-Carboran (C2B10H12) ... 21
1.2.2. Abbau zum nido-Carboran (C2B9H12-) ... 24
1.2.3. Verwendung als Pharmacophor ... 27
2. Ziel der Arbeit ... 30
2.1. Synthese von o-carboranhaltigen 9-N-Amino (5-N-Acetyl) Neuraminsäureglycosiden... 30
3. Resultate und Diskussion ... 32
3.1. Synthese von 9-N-Amino-(5-N-acetyl-)neuraminsäure glycosiden ... 32
3.1.1. Synthese der Neu5Ac-Alkylglycoside ... 32
3.1.2. Derivatisierung der Gycerinseitenkette des Neu5Ac-Glycosides... 37
3.2. Synthese von N-(1-o-carboranoylamido)neuraminsäureglycosiden... 39
3.2.1. Syntheseweg... 39
3.2.2. Synthese des closo-o-Carboranylcarbonsäurechlorides ... 41
3.2.3. Synthese der Modellverbindung 2-Carboranoylamido-glucose ... 45
3.2.4. Synthese der closo-o-Carboranoylamido-neuraminsäureglycoside und ihr Abbau zum nido-Produkt...48
3.2.5. Inhibitionstest mit 9-nido-Carboranoylamido-Neu5Ac2αBn ... 53
3.3. Ausblick... 54 4. Zusammenfassung ... 56 5. Experimenteller Teil... 57 5.1. Analytische Verfahren ... 57 5.1.1. 1H-NMR-Spektroskopie ... 57 5.1.2. Massenspektrometrie ... 57
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5.1.3. Infrarotspektroskopie ... 57 5.2. Synthese von o-carboranhaltigen 9-N-Amino-(5-N-Acetyl)- Neuraminsäureglycosiden... 58
5.2.1. Darstellung von Methyl 5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonat... 58 5.2.2. Darstellung von Methyl 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-chloro-2,3,5-dideoxy-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosonat ... 59 5.2.3. Darstellung von Methyl 5-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-2,3,5-dideoxy-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosonat ... 60 5.2.4. Darstellung von Methyl (benzyl 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat... 61 5.2.5. Darstellung von Methyl (benzyl 5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat ... 62 5.2.6. Darstellung von Methyl (benzyl 5-acetamido-3,5-dideoxy-9-O-p-toluolsulfonyl-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat ... 63 5.2.7. Darstellung von Methyl (benzyl 5-acetamido-9-azido-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat ... 64 5.2.8. Darstellung von Benzyl 5acetamido9azido3,5,9trideoxyDglycero -D-galacto-2-nonulopyranosidonsäure ... 65 5.2.9. Darstellung von Benzyl 5-acetamido-9-amino-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonsäure ... 66 5.2.10. Darstellung von Benzyl 5-acetamido-9-(1-o-nido-carboranoylamido)-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2- nonulopyranosidonsäure... 67 5.2.11. Darstellung von Dinatrium [benzyl 5-acetamido-9-(1-o-nido-carboranoylamido)-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat
... 69 5.2.12. Darstellung von Methyl (methyl 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat... 71 5.2.13. Darstellung von Methyl (methyl 5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α- D-galacto-2-nonulopyranosid)onat ... 72 5.2.14. Darstellung von Methyl (methyl 5-acetamido-3,5-dideoxy-9-O-p-toluolsulfonyl-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat ... 73
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5.2.15. Darstellung von Methyl (methyl 5-acetamido-9-azido-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat ... 74 5.2.16. Darstellung von Methyl 5-acetamido-9-azido-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonsäure ... 75 5.2.17. Darstellung von Methyl 5-acetamido-9-amino-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonsäure ... 76 5.2.18. Darstellung von Bistriethylammonium [methyl 5-acetamido-9-(1-o-nido-carboranoylamido)-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat ... 77 5.3. Synthese der 2-Carboranoylamido-glucose ... 78 5.3.1. Darstellung von 2-Amino-1,3,4,6-tetra-O-trimethylsilyl-2-deoxy-D-glucopyranosid ... 78 5.3.2. Darstellung von 2-N-Trimethylsilylamino-1,3,4,6-tetra-O-trimethylsilyl-2-deoxy-D-glucopyranosid... 79 5.3.3. Darstellung von 2-(1-o-closo-carboranoylamido)-1,3,4,6-tetra-O-trimethylsilyl-2-deoxy-D-glucopyranosid ... 81 5.3.4. Darstellung von 2-(1-o-Carboranoylamido)-2-deoxy-D-glucose ... 83 5.3.5. Versuch der Darstellung von Benzyl 5-acetamido-9-amino-4,7,8-tri-O-trimethylsilyl-3,5,9-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonsäure 85 5.4. Synthese des closo-o-Carboranylcarbonsäurechlorids ... 86 5.4.1. Darstellung von 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-carbonsäure ... 86 5.4.2. Darstellung von 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-carbonsäurechlorid. 88 6. Literaturverzeichnis ... 89 7. Anhang (Strukturen der Sialinsäuren und ihrer Derivate) ... 98
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1. Einleitung
1.1 Die N-Acetylneuraminsäure und ihre Derivate
1.1.1. Vorkommen und Biosynthese
Die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) gehört zu der Familie der Sialinsäuren (kurz: Sia), in der Natur vorkommenden 2-Keto-3-deoxy-nonulonsäuren (Abb. 1). Sie ist das acetylierte C-5-Aminoderivat der Ketodeoxynonulonsäure (KDN). Der Zuckerring in Neu5Ac hat eine 2C5–Konformation in der die voluminöse Seitenkette und die
C-5-Acetamidoeinheit äquatorial zum Ring stehen.
3 4 5 6 O 2 OH H N 7 1 OH 8 9 OH HO OH O OH O Abb. 1 N-Acetylneuraminsäure
Neu5Ac kommt hauptsächlich in Wirbeltieren und einigen höheren Wirbellosen vor, jedoch gibt es Ausnahmen, wie das Vorkommen des Zuckers in den Embryos der Fruchtfliege Drosophila und in den Kapselpolysacchariden einiger Bakterienstämme zeigt (Boons und Demchenko 2003b); (Varki 1997). Wie die meisten Sialinsäuren wird auch Neu5Ac an den äußeren Enden von N-Glykanen, O-Glykanen und Glycosphingolipiden gefunden (Abb. 2). In der Natur werden Glycoside ausschließlich mit den α-Anomeren der Neu5Ac gebildet, welche eine äquatoriale Bindung zur nächsten Zuckereinheit aufweisen (Boons und Demchenko 2003b). Die Glykane der Wirbeltiere spielen eine wichtige Rolle in der molekularen Zellerkennung. Sowohl körpereigene Lektine als auch körperfremde Pathogene wie Viren, Bakterien und Toxine nutzen diese Strukturen zur Bindung an die Zelloberfläche. Die ständige Bedrohung durch kurzlebige, schnell mutierende pathogene Lebensformen zwingt die langlebigen Wirbeltiere zum Schutz ihrer Zellen durch die Entwicklung immer komplexerer Glykane mit modifizierten Sialinsäuren.
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Die Vielfalt an Oligosaccharid-Ketten sorgt beim einzelnen Organismus zur Begrenzung der Infektion und kann das Überleben der Art sichern, indem einige Individuen Immunität durch atypische Glycanstrukturen während einer Epidemie entwickeln (Kelm 2001), (Gagneux und Varki 1999).
O OH AcHN O COOMe OH HO OH O OH OH OH O O OH OH O O OH OH O O AcHN COOMe OH HO OH O OH AcHN O OH OH O NH HO (CH2)12CH3 (CH2)14CH3 O Neu5Ac Gal GalNAc Gal Glc Ceramid Neu5Ac HO
Abb. 2 Das Gangliosid GD1a besteht aus dem glycosidisch gebundenen Ceramid und dem N-Acetylneuraminsäure-haltigen Oligosaccharid:
Neu5Ac-(α2,3)Gal-(β1,3)GalNAc-(β1,4)[Neu5Ac-(α2,3)]Gal-(β1,4)Glc-βCer
Die Biosynthese der Neu5Ac erfolgt durch eine Aldolreaktion zwischen N-Acetyl-D-mannosamin-6-Phosphat (1) und Phosphoenolpyruvat (PEP), welche bei Säugetieren fast ausschließlich durch die N-Acetyl-neuraminat-9-phosphat-Synthase (E.C. 2.5.1.57) katalysiert wird. Das Gleichgewicht der Reaktion wird durch die Dephosphorylierung des Zwischenproduktes N-Acetylneuraminat-9-Phosphat (3, Neu5Ac-9-P) mittels NeuAc-9-phosphatase zur Neu5Ac verschoben (Lehmann 1996). Ein potentieller Reaktionsmechanismus der Synthase könnte, wie in Schema 1 dargestellt, die Bildung eines Oxocarbenium-Iones 2 und einer sp3-hybridisierten Struktur 3 als Zwischenprodukte beinhalten. Er würde dann einem der beiden zurzeit diskutierten Mechanismen der prokaryontischen Biosynthese entsprechen (Tanner 2005). Bei Bakterien wie Escherichia coli wird die Biosynthese der Sialinsäure durch N-Acetylneuraminat-Synthase (E.C. 2.5.1.56) katalysiert.
Dabei dient N-Acetylmannosamin (ManNAc) als Enzymsubstrat, welches in Neu5Ac umgewandelt wird.
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Beim Menschen erschien dieser Weg auch möglich nach der Entdeckung des humanen sialic acid synthase (SAS) – Gens, in vitro wurde jedoch N-Acetyl-D-mannosamin-6-Phosphat 70-fach als Substrat bevorzugt (Lawrence et al. 2000).
O OH AcHN COO -OH OH HO OH O HO HO AcHN O 1 OH O -O 2C O H OH AcHN HO OH O P P P O H OH AcHN HO OH O P O OH AcHN HO OH OH P O+ -O 2C P O OH AcHN HO OH OH P O -O 2C P HO O OH AcHN HO OH OH P O -O 2C O OH AcHN COO -OH OH O OH HO -- Pi P -Pi 2 3 4
Schema 1 Biosynthese von Neu5Ac in Eukaryonten(Lehmann 1996) mit einem potentiellen Mechanismus der Neu5Ac-9-P-Synthase
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1.1.2. Chemische Synthese
ManNAc 5 stellt ebenfalls den Startpunkt für eine chemische Synthese der Neu5Ac (4) dar (Schema 2). Durch die Indium- katalysierte Kopplung von ManNAc mit α-(Bromomethyl)acrylsäure (6) entstehen das threo und erythro Diastereomere des gewünschten Enolates als Gemisch im Verhältnis (threo: erythro) 3:1. Die Ozonolyse und oxidative Aufarbeitung des Gemisches ergibt Neu5Ac und das 4-Epimer (9) im Verhältnis 3:1 (Chan und Lee 1995).
O OH AcHN COO -OH OH HO OH 4 O HO HO AcHN OH 5 OH Br CO2H HO OH NHAc CO2H OH HO H OH NHAc OH HO O HO OH HO OH NHAc CO2H OH HO OH 6 7 8 + O3 O HO AcHN COO -OH OH HO OH O3 Indium 9
Schema 2 Chemische Synthese von Neu5Ac ausgehend von ManNAc
Eine de novo Synthese von Neu5Ac wurde von Danishefsky et al.1988 beschrieben. Der Ringschluss erfolgt dabei durch eine hetero Diels-Alder-Reaktion zwischen einem Dien und einem Aldehyd.
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1.1.3. Molekulare Zellerkennung durch Sialinsäuren
Inhibitoren der Influenza –Neuraminidase
Die Influenza Viren A und B verursachen beim Menschen die Krankheit Grippe bzw. Influenza. Die Membran von Influenzaviren enthält zwei Glycoproteine: Haemagglutinin und Neuraminidase. Haemagglutinin stellt den ersten Kontakt zur Wirtszelle her, indem es endständige Siagruppen von zellulären Glycoconjugaten erkennt. Es fungiert dann als „biologischer Klebstoff“ und steuert die Fusion der Zellmembran mit der Virushülle (Thomson und von Itzstein 2003).
Beim Influenza A-Virus treten 16 Haemagglutininmoleküle auf (H1 – H16). Für denselben Virentyp sind insgesamt 9 Neuraminidasemoleküle bekannt (N1 – N9). Neuraminidase ist eine exo-Glycohydrolase (E.C. 3.2.1.18), welche in der Lage ist α-ketosidisch gebundene Sialinsäuren von zellulären Glycoproteinen abzutrennen. Dadurch ermöglicht dieses Enzym dem Virus sich im oberen Respirationstrakt zu bewegen. Entscheidend ist jedoch seine Rolle als „molekulare Schere“ bei der Freisetzung der neuen Virengeneration von der Membran der Wirtszelle (Thomson und von Itzstein 2003).
Die Influenza-Neuraminidase ist ein Tetramer von identischen Untereinheiten. Im aktiven Zentrum befinden sich an für die Bindung relevanten Stellen Aminosäuresequenzen, welche nur konservativ austauschbar sind. Neu5Ac wird durch ionische Wechselwirkungen zwischen der Carboxylat-Gruppe und drei positiv geladenen Arginingruppen, durch diverse Wasserstoffbrückenbindungen (siehe Abb. 3) mit Beteiligung der Aminosäuren Arginin und Glutamat sowie durch unpolare Interaktionen zwischen der Methylkomponente der C-5 Acetamidogruppe und den unpolaren Aminosäuren Tryptophan und Isoleucin im aktiven Zentrum gehalten (Taylor und von Itzstein 1994).
9 O OH O O -N H O H OH HO O HN C NH2 H2N+ Arg 371 HO O -O Asp 151 O -O 276 Glu O -O Glu 119 NH C H2N NH2+ 152 Arg H N C H2N NH2+ Arg 292 H N C H2N H2N+ Arg 118 OH2 H2O
Abb. 3 Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Aminosäureeinheiten der Influenza Sialidase und N-Acetylneuraminsäure (Taylor und von Itzstein 1994)
Die Entdeckung eines invarianten Aminosäureabschnittes, welcher sowohl bei Influenza A und B Viren gleich ist, machte die Neuraminidase zu einem interessanten Ziel für Anti-Influenza-Wirkstoffe, welche auf Enzyminhibition beruhen (Thomson und von Itzstein 2003; Varghese et al. 1983; Colman et al. 1983; von Itzstein et al. 1993; Taylor und von Itzstein 1994).
Das Enzym wird durch das Produkt Neu5Ac inhibiert (Ki ~ 10-3 M)(Thomson und von
Itzstein 2003). Der erste potente Inhibitor war jedoch 2-Deoxy-2,3-didehydro-N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac2en; Ki ~ 10-6 M ) 10, welches dem Zwischenprodukt 11 während der Neuraminidasereaktion entspricht (Abb. 4)(Holzer et al. 1993). In
vivo ist das Neu5Ac Derivat jedoch wirkungslos gegen Influenza (Thomson und von Itzstein 2003).
10 O OH AcHN OH HO OH COOH O OH AcHN OH HO OH COOH 10 11
Abb. 4 Der erste potente Inhibitor Neu5Ac2en 10 und die Zwischenstufe 11 der Neuraminidasereaktion
1983 gelang einer Arbeitsgruppe um P.M.Colman die Struktur der Neuraminidase N2 komplexiert mit Neu5Ac2en mittels Röntgenstrukturanalyse aufzuklären (Varghese et al. 1983;Colman et al. 1983). Am Computer konnten Inhibitorstrukturen entwickelt werden, die sich bei Interaktion mit dem aktiven Zentrum der Sialidase als energetisch günstig erwiesen. Die Bindung zwischen Inhibitor und Enzym konnte durch die Substitution einer Hydroxy- durch eine Aminogruppe an der Position C-4 verstärkt werden, da die Aminofunktion im physiologischen pH-Bereich eine Salzbrücke zum nur konservativ austauschbaren Glutamat 119 bildet (von Itzstein et al. 1993;Holzer et al. 1993)(Abb. 5). Da die Tasche, die das Protein an dieser Stelle bildet, auch Platz für einen größeren Substituenten bietet, wurde die größere und stärker basische Guanidino-Gruppe als Substituent eingesetzt. Durch ionische Wechselwirkungen mit den Glutamateinheiten Glu 119 und Glu 227 konnte die Bindung weiter verstärkt werden (Abb. 6).
O NH3+ AcHN OH HO OH COO -C H2 H2 C C O O Glu119 12
Abb. 5 Die Substitution der C-4 Hydroxygruppe durch eine Aminogruppe verstärkt die Inhibitorwirkung durch Ausbildung einer Salzbrücke
11 O NH AcHN OH HO OH COOH NH3 HN H2C H2C C O O H2C CH2 C O O Glu119 Glu227 13
Abb. 6 Die größere Guanidinogruppe bildet zwei Salzbrücken
Sowohl das Amino(12)- als auch das Guanidinoderivat(13) (Ki 12 = 4*10-8 M; Ki 13 =
4*10-9 - 2*10-10 M) sind sehr potente Inhibitoren der Influenzavirus-Sialidase (Holzer et al. 1993) (von Itzstein et al. 1993). Das Guanidinoderivat wurde unter dem Namen „Zanamivir“ als Influenza-Therapeutikum zugelassen. Als Nachteil erwies sich die hohe Hydrophilie des Zuckerderivates, da es nicht oral eingenommen werden kann, sondern als Aerosol verabreicht werden muß. Durch die Substitution des Glycerinrestes durch einen zyklischen Ether konnte ein Zanamivir-ähnlicher Inhibitor (14) mit größerer Lipophilie synthetisiert werden, der als oral verwendbarer Wirkstoff einsetzbar wäre (Abb. 7) (Masuda et al. 2003).
Nach der Entwicklung des Wirkstoffes Zanamivir wurden auch Inhibitoren entwickelt, welche nicht mehr das Grundgerüst der Kohlenhydrate aufweisen, die jedoch mit dem aktiven Zentrum der Neuraminidase stark interagieren und damit potente Inhibitoren sind (siehe Abb. 7). Das Cyclohexenderivat GS 4071 (15) (IC50 = 3* 10-10
– 3.3*10-8 M)(Mishin et al. 2005) ist in Form seiner Prodrug GS 4104 (16) unter dem Namen Oseltamivir als Wirkstoff zugelassen. Im Unterschied zum Zanamivir kann Oseltamivir oral eingenommen werden. Mit einem Cyclopentanring als Gerüst wurde BCX-1812 (17) entwickelt (IC50 = 3*10-10 – 1.3*10-9 M)(Mishin et al. 2005), welches
unter dem Namen Peramivir zugelassen werden sollte. Jedoch fiel der Wirkstoff, oral eingenommen, während des klinischen Phase-III-Testes nach Herstellerangaben
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(Biocryst Pharmaceuticals) aufgrund zu niedriger biologischer Verfügbarkeit im Körper durch. Auf einem Pyrrolidon-Gerüst basierend wurde der Inhibitor A-315675 (18) entwickelt (Ki= 2*10-11 - 3*10-10 M) (Kati et al. 2002).
NH2 AcHNO COOR 15 16 R = H GS 4071 R = Et GS 4104 (Oseltamivir) H N COOH H AcHN O 18 A-315675 COOH HN AcHN OH HN NH2 17 BCX-1812 (Peramivir) O NH R OH HO COOH NH2 HN 14 O R = NHAc
Abb. 7 Inhibitoren der Influenza-Neuraminidase
Problematik der Resistenzentwicklung
Um Resistenzbildungen vorzubeugen, wurde mit dem aktiven Zentrum der Influenza-Neuraminidase eine Zielstruktur („Target“) gewählt, deren Aminosäuresequenzen invariant sind oder nur konservativ veränderbar durch den Austausch gleichartiger Aminosäuren. Dennoch treten bei der Behandlung der derzeit dominierenden Influenza-A Virusvariante H3N2, aber auch bei der neuen Virusvariante H5N1
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insbesondere mit Oseltamivir Resistenzen auf (Kiso et al.2004; Mishin et al. 2005). Durch Mutationen einzelner Aminosäuren kommt es zu einer Konformations-änderung des Proteins, welche zur Folge hat, dass die Energiebarriere zur Bindung von Inhibitoren mit dem hydrophoben Rest statt der Glycerinseitenkette zu hoch wird (Varghese et al. 1998). Rusell et al untersuchten unter anderen die Struktur der Neuraminidase der H5N1-Variante und regte die Entwicklung von noch spezifischeren, auf die jeweilige Neuraminidase-Struktur ausgelegten Inhibitoren an (Russell et al. 2006).
1.1.4. Bindung von Sialinsäureanaloga an myelin-assoziertes Glycoprotein (MAG)
Regulation des Nervenwachstums bei adulten Vertebraten
Im Nervensystem sind die Neuronen (Nervenzellen) für die Aufnahme und Verarbeitung von Signalen zuständig. Die wesentlichen Abschnitte eines Neurons sind der Zellkörper, der Dendrit und das Axon. Der Zellkörper enthält den Zellkern und die für die Proteinsynthese notwendigen Ribosomen. Die meisten Neuronen verfügen nur über ein Axon, welches auf die Fortleitung elektrischer Impulse, sogenannter Aktionspotenziale spezialisiert ist, die vom Zellkörper auswärts geleitet werden. Die stark verzweigten Dendriten empfangen von Sinneszellen oder anderen Neuronen chemische Signale, welche in elektrische Impulse umgewandelt und zum Zellkörper geleitet werden.
Da ein Axon meterlang sein kann, ist es bei Vertebraten meistens mit einer Myelinscheide umwickelt, um die Leitungsgeschwindigkeit zu erhöhen. Myelin besteht aus zahlreichen Plasmamembranschichten, welche von Gliazellen gebildet werden. Im peripheren Nervensystem (PNS) werden diese Zellen Schwann’sche Zellen genannt, während sie im zentralen Nervensystem (ZNS) als Oligodendrocyten bezeichnet werden. Die Plasmamembran des Axons steht nur an den Ranvierschen Schnürringen, welche die Myelinscheide unterbrechen, im direkten Kontakt mit der extrazellulären Flüssigkeit (Lehninger et al. 1998).
Kurz nach der Geburt verliert das ZNS bei Säugern die Fähigkeit axonale Leitungsbahnen und bereits bestehende Synapsenverbindungen nach einer
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Verletzung zu regenerieren. Im PNS finden das Auswachsen des durchtrennten Axons und das Kontaktieren der Zielzelle statt, jedoch ist die Wiederherstellung häufig unvollständig und fehlerhaft (Sandvig et al. 2004).
Im ZNS wird das Auswachsen durch einen Mangel an neurotrophen Faktoren wie das growth-associated-protein GAP43 behindert, welches Neuronenwachstum anregt (Kapfhammer 1997). Neben der Vernarbung der Verletzungsstelle wird die Regeneration durch Wachstumsinhibitoren gehemmt, welche in der Myelinscheide enthalten sind beziehungsweise durch die Oligodendrocyten gebildet werden. Zu diesen Faktoren gehören das Nogo-Protein, das Myelin-assozierte Glycoprotein MAG, das Oligodendrocyten-Myelin-Glycoprotein OMgp, und der myelinassozierte Chondroitinsulfat-Proteoglycan CSPG (Sandvig et al. 2004).
An der Spitze, dem Leitsaum, des auswachsenden Axons befindet sich ein Wachstumskegel, eine äußerst bewegliche Struktur mit Zelloberflächenrezeptoren für extrazelluläre Signalmoleküle (Venkatesh et al. 2005). Mit Ausnahme von CSPG führt die Bindung der oben genannten Inhibitoren an den Nogo-Rezeptor Ngr über eine Signalkaskade zum Kollaps des Wachstumskegels und damit zum Stop des Axonwachstums (siehe Abb. 8). Gesteuert durch den Guanin exchange factor GEF wird das Rho A Protein mittels Guanosintriphosphat GTP aktiviert. Über die Rho assozierte Proteinkinase ROCK wird die Signalübertragung zum Actin-Cytoskelett gestartet (Sandvig et al. 2004).
Die Bedeutung von Gangliosiden mit endständigen Siaeinheiten für die Inhibition des Nervenwachstums ist Gegenstand wissenschaftlicher Diskussion.
Die Ganglioside GD1a (siehe Abb. 2), GT1b und GQ1bα binden als künstliche Membran in Mikrowellplatten MAG-exprimierende Zellen. Für die Adhäsion ist eine α-Neu5Ac notwendig, welche 2,3-verknüpft mit den ungeladenen Zuckern des Gangliosides sein muss. Die Bindung wird durch eine weitere Sialinsäure, ebenfalls 2,3-verknüpft, signifikant erhöht und durch Sialidase aufgehoben (Yang et al. 1996). Um den Einsatz von MAG in Assays zu vereinfachen, wird ein Fusionsprodukt aus dem Fc-Teil des humanen Immunglobulin G und den extrazellulären Domänen des MAG verwendet. Die Arbeitsgruppe um M.T.Filbin konnte mit der Aminosäure Arginin R118 eine Sialinsäurebindungsstelle des Glycoproteins entdecken, wies jedoch
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nach, dass Bindung zu Gangliosiden allein keine Inhibition des Neuronenwachstums zur Folge hat (Tang et al. 1997).
Die Inhibition des Axonwachstums durch Myelin-assoziertes Glycoprotein lässt sich durch die Behandlung der Neuronenoberfläche mit Neuraminidase, durch die Blockade der Biosynthese von Gangliosiden, durch genetisch veränderte terminale Stukturen dieser Glycane und durch Antikörper gegen GD1a und GT1b aufheben (Vyas et al. 2002). Diese Daten lassen Ganglioside als essentielle Liganden von MAG zur Inhibition des Nervenwachstums erscheinen. Im selben Jahr publizierte Studien betonten jedoch die Bedeutung des Nogo-Rezeptors Ngr für die Bindung von MAG an die Zelloberfläche. Domeniconi et al. wiesen eine Bindung an den Nogo-Rezeptor unabhängig von Sialinsäuren nach und folgerten, dass MAG und Nogoprotein um den gleichen Rezeptor konkurrieren (Domeniconi et al. 2002). Liu et al kamen dagegen zum Ergebnis das MAG und Nogo unabhängig voneinander an den Nogo-Rezeptor binden (Liu et al. 2002).
Die Bedeutung von Glycanen in der Steuerung des Nervenwachstums wurde durch die Untersuchung von „lipid-raft“-Strukturen auf der Zelloberfläche von Neuronen verstärkt. Dabei handelt handelt es sich um Mikrodomänen der Zellmembran, welche reich an Cholesterin und Sphingolipiden, speziell auch Gangliosiden, sind.
Diese „lipid raft“ Mikrodomänen enthalten GT1b, das Transmembranpolypeptid p75NTR, das Rho A Protein und den Nogo-Rezeptor. MAG konnte auf „lipid-raft“ Mikrodomänen auf der Zelloberfläche von Oligodendrocyten lokalisiert werden. Diese speziellen Bereiche des Plasmalemmas weisen eine erhöhte Dichte sowohl an Liganden als auch an Rezeptoren zur Regulation des Neuronenwachstums auf (Vinson et al. 2003b). Die Arbeitsgruppe von T. Yamashita konnte zeigen, dass GT1b und GD1a essentielle Bindungspartner von MAG und notwendig zur Aktivierung des Rho A Proteins sind. Die Bindung von MAG mit den Gangliosiden führt zum Zusammenwirken von GD1a, GT1b, p75NTR und Nogo-Rezeptor. Ob der Nogo-Rezeptor zum Auslösen der Signalkaskade notwendig ist, bleibt unklar (Fujitani et al. 2005),(Sandvig et al. 2004).
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Abb. 8 Regulation des Neuronenwachstums durch den Kollaps des Wachstumskegels eines Axons induziert durch MAG und Nogo-Protein (Sandvig et al. 2004)
Abbildung von A.Sandvig et al. aus Glia, Vol. 46, Ausgabe 3, Seite 234
Myelin-assoziertes Glycoprotein als Zielmolekül von Sialinsäurederivaten
Siglecs, früher auch Sialoadhesine genannt (Kelm et al. 1994), sind Sialinsäure-bindende I-Typ Lectine aus der Immunoglobin Superfamilie (IgSF) (Kelm et al. 1998). Myelin-assoziertes Glycoprotein (MAG, Siglec 4a) und Schwannsche Zellen Myelinprotein (SMP, Siglec 4b) werden im ZNS beziehungsweise im PNS gebildet,
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während die anderen 11 bekannten humanen Siglecs Teil des hämatopoetischen Systems sind. Zu ihnen zählen Sialoadhäsin (Sn, Siglec-1), CD22 (Siglec-2) und CD 33 (Siglec-3). Siglecs, welche mit CD33 verwandt sind, werden CD33-artige genannt: OB-BP2 (Siglec-5), OB-BP1 (Siglec-6), p75/AIRM1 (Siglec-7), Siglec-8 bis Siglec-12 und Siglec-14 (Kelm 2001), (Angata et al. 2006).
Ein Siglec besitzt als Typ 1 Transmembranprotein einen N-terminalen extrazellulären und einen C-terminalen ins Cytoplasma ragenden Teil, verbunden durch eine kurze (bei MAG aus 20 Aminosäuren bestehende) Transmembrandomäne. Die intrazellulären Domänen besitzen eine potenzielle Phosphorylierungsstelle (mit Ausnahme von Siglec-1), welche der Signalübertragung dienen könnte. Der immunoglobin-ähnliche, extrazelluläre Teil besteht aus einer V-set-Domäne, der 1 (CD33) bis 16 (Sn), bei MAG vier C2-set-Domänen folgen (Arquint et al. 1987) (Kelm et al. 1998), (Kelm 2001).
Die Sialinsäure-Bindungsstelle konnte, wie schon oben beschrieben, auf der immunoglobinartigen, N-terminalen V-set Domäne entdeckt werden. So spielt beim MAG die Aminosäure Arginin 118 auf dem GFCC`-β-Faltblatt eine entscheidende Rolle, da eine nicht konservativ ausgetauschte Aminosäure an dieser Stelle zu einem Verlust an Bindung zur Sialinsäure führt (Kelm 2001), (Tang et al. 1997).
Mit Hilfe synthetischer Sialinsäureanaloga wurde die Bedeutung der einzelnen funktionellen Gruppen der Neuraminsäuren für die Bindung an verschiedene Siglecs (Siglecs 1, 2 und 4) untersucht (siehe Abb. 9) (Kelm et al. 1998).
Die C-1 Carboxylgruppe ist essentiell für die Interaktion mit den untersuchten Siglecs. Die Glycoside der Sialinsäure müssen Neu5Ac-(α2,3)Gal verknüpft sein, um von den überprüften Lektinen mit Ausnahme von Siglec 2 (CD22) gebunden zu werden. Eliminierungsexperimente zeigten die Notwendigkeit der unmodifizierten Glyceringruppe an C-6.
Durch Modifikation der funktionellen Gruppen an C-5 und C-9 können die Wechselwirkungen entscheidend beeinflusst und Unterschiede im Bindungsverhalten der Siglecs aufgezeigt werden. Siglec 1 (Sn) und Siglec 4a (MAG) binden Neu5Ac, nicht jedoch das Glykolylderivat (Neu5Gc) der Aminogruppe an C-5. Siglec 2 (CD22) der Maus bindet dagegen ausschließlich Neu5Gc, humanes Siglec 2 bindet beide gleich gut.
Halogenierte N-Acetylgruppen führen zu einer bis zu 17-fach besseren Bindung zum Siglec 4a (MAG) im Vergleich zu den Glycanen, welche unmodifizierte Neu5Ac als
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terminale Gruppe besitzen. Siglec 1 (Sn) und Siglec 2 (CD22) der Maus binden deutlich schwächer an halogenierte N-Acetylderivate, bei humanen Siglec 2 (CD22) ist keine Änderung festzustellen. Die erhöhte Elektonegativität der halogenierten N-Acetylgruppe verstärkt bestehende oder schafft neue Wechselwirkungen mit den Siglecs.
Die Hydroxygruppe an C-9 kann durch eine Aminogruppe, nicht jedoch durch eine Thiolfunktion ersetzt werden. Dies deutet auf eine Wasserstoffbrückenbindung zu den Siglecs hin. Dabei darf das Heteroatom wahrscheinlich aus sterischen Gründen nicht eine Größe erreichen, wie sie das Schwefelatom aufweist.
3 4 5 6 O 2 OH H N 7 OR 1COOH 8 9 OH HO OH Ac Carboxylgruppe Hydroxygruppe an C-9 Acetylgruppe
Abb. 9 Wichtige funktionelle Gruppen der Neu5Ac für die Siglec-Bindung (Kelm et al. 1998b)
Anhand von Röntgenkristallstrukturen von Sialoadhäsin (Siglec 1, Sn) im Komplex mit 3’ Sialyllactose (May et al. 1998) und weiteren Sialylsäurederivaten (Zaccai et al. 2003b) konnte die Bindungstasche der Siglecs auf atomarer Ebene analysiert werden. Dabei wurden insbesondere solche Sialinsäureanaloga untersucht, welche durch Ausprägung starker Bindungen als Inhibitoren von Siglecs wirken können.
19 O OH O O O -N H H O OH HO O O OH O O H HO O OH OH H O OH HN C NH2 H N H2O H2O H2O H2O OH2 H2O OH2 H2O Ser 103* NH Trp 2 HO Tyr 44 Arg 97 Arg 105* NH 106 Trp O H N Leu 107* O O
Abb. 10 Komplex von Sialoadhesin (Siglec 1) mit 3´Sialyllactose. Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen erfolgt durch gestrichelte Linien. Aminosäuren mit * interagieren mit ihrer Peptidbindung ; modifiziert nach A.P.
May et al. (May et al. 1998)
Die Röntgenkristallstrukturanalyse von Sialoadhesin (Siglec 1) mit 3’ Sialyllactose (siehe Abb. 10) zeigt eine Sandwichstruktur von zwei β-Faltblättern, welche aus vier beziehungsweise fünf einzelnen Strängen bestehen. Die Kohlenhydratbindungsstelle liegt auf der Mitte des N-terminalen Proteinstranges G. Das Siaderivat befindet sich neben diesem Strang und interagiert mit den Seitenketten des G- und zweier weiterer Stränge sowie mit den Atomen der Peptidbindungen des G-Stranges. Die besondere Bedeutung der funktionellen Gruppen an C-2, C-5 und C-9 für die Bindung an Siglecs konnte durch die Strukturaufklärung bestätigt werden. Die Guanidinogruppe von Arginin-97 bildet eine Salzbrücke zur C-2 Carboxylatgruppe. Zwischen dem Indolring von Trp-2 und der Methylgruppe der Acetamidofunktion an C-5 können van der Waals-Kräfte wirken. Der Amidstickstoff der N-Acetylgruppe
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bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Carbonylgruppe der Aminosäure Arg-105. Die Glycerinseitengruppe an C-6 wird durch Wasserstoffbrückenbindungen der Hydroxygruppen C-8 und C-9 mit den beiden Peptidbindungen der Aminosäure Leu-107 stabilisiert. Zusätzlich bildet sich ein van der Waals-Kontakt zwischen dem terminalen Kohlenstoff C-9 und der aromatischen Seitenkette von Trp-106. Die Carbonylfunktion von Ser-103 bildet eine polare Bindung zu der C-4 Hydroxygruppe. Zur Entwicklung neuer Inhibitoren wurde das 9-Amino-N-Acetylneuraminsäuremethylglycosid (9-NH2-Neu5Ac2αMe) als Ausgangsstruktur
verwendet, welche bei Inhibitionstests eine stärkere Bindung als das unsubstituierte Neu5Ac-Glycosid (Neu5Ac2αMe) zeigt. Mit Hilfe der Röntgenkristallstrukturdaten und des interaktiven Grafikprogramms „O“ konnten aliphatische und aromatische Substituenten zur Derivatisierung der 9-Amino-Gruppe ausgewählt werden. Mit Inhibitionsassays wurden neben einer Naphtylverbindung (NAP) ein Benzoyl- (BENZ, Abb. 11, Struktur 19) und ein Biphenylamid (BIP, Abb. 11, Struktur 20) als besonders potente Inhibitoren entdeckt (Zaccai et al. 2003b). Das Inhibitionspotential gegenüber dem Siglec 4a (MAG) ist von BENZ 790-fach, von BIP 250-fach höher als jenes von Neu5Ac2αMe.
Die Röntgenkristallstrukturen der drei Inhibitoren jeweils im Komplex mit Sialoadhesin (Siglec 1) lassen auf die gleichen Wechselwirkungen wie beim 3’Sialyllactosekomplex schließen. Der Phenylring von BENZ wird durch drei unpolare Aminosäuren (Tyr 44, Leu 107 und Val 109) stabilisiert. Dabei werden vier Wassermoleküle verdrängt.
Da die Kristallisation von Siglec 4a (MAG) bislang nicht gelang, können Wechselwirkungen zwischen dem Glycoprotein und den verschiedenen Sialinsäurederivaten nur durch den Vergleich von Aminosäuresequenzen prognostiziert werden. Die Aminosäuren Trp-2, Arg-97 und Tyr-44 des Sialoadhesin finden sich auf den entsprechenden Positionen von MAG invariant wieder. Trp-106 und Leu-107 sind dagegen bei MAG konservativ ausgetauscht, Val-109 als einzige bindende Aminosäure durch Serin nicht konservativ ausgetauscht (Kelm 2001), (Zaccai et al. 2003b).
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Daraus kann auf eine ähnliche Struktur der Bindungstasche von MAG geschlossen werden. Die starke Zunahme des Inhibitionspotentials von BENZ kann durch einen besseren van der Waals-Kontakt von Tyr-44 zum Benzolring aufgrund räumlicher Nähe erklärt werden.
O OH AcHN OCH3 COO -OH H N OH O O OH AcHN OCH3 COO -OH H N OH O 19 20
Abb. 11 Siglec-Inhibitoren basierend auf 9-NH2-Neu5Ac2αMe (Zaccai et al.
2003b)
1.2. Ortho-Carboran als Pharmacophor
1.2.1. Struktur und Synthese von closo-Carboran (C2B10H12)
Carborane sind kohlenstoffhaltige Borane. Die closo-Verbindungen weisen eine geschlossene Käfigstruktur aus Bor- und Kohlenstoffatomen auf, die nido-Cluster verfügen über eine offene Neststruktur, während die arachno-Carborane eine noch offenere netzartige Struktur besitzen.
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Der Käfig des Dicarba-closo-dodecaborans besteht aus zwei Kohlenstoffatomen (C-1 und C-2) und zehn Boratomen (B-3 bis B-12). An der Außenseite des Käfigs befinden sich 12 exo-Wasserstoffatome, deren Bindungen mit den Käfigatomen auf das Clusterzentrum zeigen (siehe Abb. 12).
12 9 5 10 11 2 7 8 4 1 3 6 2 = BH = CH
Abb. 12 Struktur des ortho-Dicarba-closo-dodecaborans (o-B10C2H12)
Das closo-Carboran B10C2H12 ist ein elektrisch neutrales Molekül. Daraus folgt eine
thermische sowie chemische Stabilität insbesondere gegenüber Hydrolyse und Oxidationsmitteln. Die Hydrophobie des Clusters ist sehr groß und entspricht etwa jener von Adamantan. C2B10-Käfig und Phenylring sind ähnlich groß, jedoch hat das
Carboran im Gegensatz zum Aromaten eine dreidimensonale Struktur und eine 2,5-mal höhere Lipophilie (Soloway et al. 1998), (Gabel und Endo 2004)(Fauchère et al. 1980). Entsprechend der Anordnung der Kohlenstoffatome im Käfig wird zwischen dem 1,2- (ortho); 1,7-(meta) und 1,12-(para) Isomer unterschieden (siehe Abb. 13). Zur Synthese von ortho-Carboran (Schema 3) wird nido-Decaboran (B10H14) 21 mit
einer Lewis-Base wie Acetonitril oder Dimethylsulfid zum Lewisbasenaddukt 22 umgesetzt. In einer Reaktion mit Acetylen entsteht dann ortho-Carboran. Durch Erhitzen können die thermodynamisch stabilen meta- und para- Isomere aus unsubstituierten ortho-Cluster erhalten werden (Fein et al. 1963), (Heying et al. 1963), (Soloway et al. 1998), (Gabel und Endo 2004).
23 21 L = Lewis-Base CH3CN oder (CH3)2S H H H H H H L L 2 2 L HC CH + - 2L - H2 - H2 o-B10C2H12 22 400° 700° m-B10C2H12 p-B10C2H12
Schema 3 Darstellung von o-, m- und p-closo-Dicarba-dodecaboran (Soloway et al. 1998)
Die Kohlenstoffatome des Clusters verfügen über relativ acide Protonen, welche mit Lithiumorganylen reagieren(Gabel und Endo 2004). Das Lithiumcarboran ermöglicht Reaktionen mit Elektrophilen wie Halogenalkanen, welche C-Alkylderivate ergeben. Die Reaktion mit Kohlendioxid wird im Kapitel „Syntheseplanung“ näher behandelt. Aryl-, Alkenyl- und Alkynyl-Derivate des ortho-Carborans können über C-Kupfer (I)-Derivate des Clusters erhalten werden (Endo et al. 2001). Durch Friedel-Crafts-Halogenierung können die elektronegativsten Boratome der closo-Carborane unter Verwendung von Aluminiumtrichlorid als Katalysator iodiert werden. Die Halogenierung findet beim ortho-Isomer an Position 9 und 12, beim meta-Isomer an Position 9 und 10 und beim para-Isomer an Position 3 statt (Gabel und Endo 2004).
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1.2.2. Abbau zum nido-Carboran (C2B9H12-)
Die Struktur der nido-Carborane (nido-Dicarba-undecaboran) unterscheidet sich von dem Icosaeder der closo-Carborane durch eine fehlende Ecke, hervorgerufen durch den Verlust eines Boratomes. Aus dem 1,2- (ortho); 1,7- (meta) und 1,12- (para) C2B10-Käfig der closo-Isomere entstehen durch Reaktion mit unterschiedlich starken
Nucleophilen die entsprechenden nido-Isomere 7,8-; 7,9- und 2,9-C2B9H12 (siehe
Abb. 13) (Fox et al. 2002). Im Unterschied zu den hydrophoben, elektrisch neutralen C2B10-Borkäfigen sind die einfach negativ geladenen C2B9-Cluster leicht
wasserlöslich (Gabel und Endo 2004).
5 6 2 1 4 8 9 10 11 7 3 H 7,8-C2B9H12 -5 6 2 1 4 8 9 10 11 7 3 H 7,9-C2B9H12 -5 6 2 1 4 8 9 10 11 7 3 H 2,9-C2B9H12
-Abb. 13 Isomere des nido-Dicarba-undecaboran-Anions (Fox; Goeta; Howard; Hughes; Johnson; Keen; Wade, und Wilson 2001), (Fox et al. 2002)
Der Abbau des Borkäfigs gelingt im Falle der ortho-Verbindung bereits bei niedrigen Temperaturen (≈ 25 -40°C) mit Hilfe von Alkoxiden, aliphatischen Aminen und Fluorid-Anionen (Wiesboeck und Hawthorne 1964), (Gabel und Endo 2004).
Zur vollständigen Umsetzung der meta-closo-Carborane ist dagegen refluxierendes Piperidin ein geeignetes Reagenz, um die 7,9-nido-Komponente zu erlangen. Die Deborierung der para-closo-Carborane findet bei Raumtemperatur nicht statt. Erst bei 120°C mit Kaliumhydroxid in Tetraglym und Toluol gelingt die Synthese des 2,9-nido-Clusters (Fox et al. 2002).
Elektronenziehende Substituenten in α-Position zum ortho-C2B10-Käfig können zu
einem schnellen Abbau zum nido-Carboran führen (siehe Schema 4) (Schaeck und Kahl 1999). Ein Tropfen Deuteriumoxid oder Methanol als Nucleophil im aprotischen polaren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid reagiert mit dem Ester 23 zur nido-Verbindung. Die Reaktion erfolgt weder in reinem Dimethylsulfat noch in absolutem
25
Methanol. Wird die elektronenziehende Gruppe wie im Ester 24 separiert vom Cluster, findet kein Abbau unter diesen Reaktionsbedingungen statt. Zumindest bei Raumtemperatur ist der Abbau in Lösungsmittelgemischen auf ortho-Carboranverbindungen beschränkt. So findet keine Reaktion mit dem meta-C2B10
-Käfig (Ester 25) statt.
2 23 O OCH3 2 O OCH3 H DMSO-d6 + D2O 2 24 OCH3 O DMSO-d6 + D2O 2 C H OCH3 O 25 O OCH3 O OCH3 H DMSO-d6 + D2O = BH = CH oder CR
Schema 4 Abbau von Alkyloxycarbonylderivaten des Dicarba-dodecaborans durch Wasser in polaren Lösungsmitteln (Schaeck und Kahl 1999)
26 Reaktionsmechanismus 12 9 5 10 11 2 7 8 4 1 3 6 N H H R H 12 9 5 10 11 2 7 8 4 1 3 6 N H H H R 12 9 5 10 11 2 7 8 4 1 3 6 N H H H R N H H R N H H R closo-1,2-C2B10H12 = B = BH = CH 2 1 H H N H H R 5 6 2 1 4 2 9 10 11 1 3 H
+
- HB(NHR)2 N+ H H R H nido-7,8-C2B9H12 -B H H N HN R R+
3CH3OH B OCH3 H3CO OCH3+
H2+
2RNH2 26 27Schema 5 Reaktionsmechanismus für den Abbau von ortho-closo-Dicarba-dodecaboran zum nido-Dicarba-undecaboran (Zakharkin und Kirillova 1975)
Der nucleophile Angriff erfolgt an einem der beiden elektronenärmsten Boratomen des C2B10-Käfigs, den Boratomen an der Position 3 und 6 (Gabel und Endo 2004).
27
nach Art des Nucleophils bildet sich im nächsten Schritt der negativ geladene nido-C2B9-Käfig mit der offenen Neststruktur und einem verbrückenden
endo-Wasserstoffatom. Dies wird am Beispiel von einem aliphatischen Amin als angreifendes Nucleophil in Schema 5 gezeigt. Das abgespaltene Borwasserstoffderivat 26 reagiert in Anwesenheit von Wasser oder Alkohol zu Borsäure beziehungsweise ihrem Ester 27 unter Freisetzung von Wasserstoffgas (Zakharkin und Kirillova 1975).
1.2.3. Verwendung als Pharmacophor
closo-Dicarba-dodecaboran ist lange Zeit wegen seines hohen Borgehaltes vorwiegend zur Entwicklung neuer Borkomponenten für die Bor-Neutronen-Einfangstherapie (BNCT) verwendet worden. Aufgrund seines stark hydrophoben Charakters wird es jedoch auch in biologisch aktiven Molekülen verwendet, welche hydrophob über van der Waals-Kräfte mit Rezeptoren interagieren. Carborane lassen sich demnach als hydrophobe Pharmacophore in Molekülen dieser Art verwenden (Endo et al.1999a). Ein Pharmacophor wird von Peter Gund 1977 definiert als „ein Satz von Struktureigenschaften in einem Molekül, welcher von einem Rezeptor erkannt wird und verantwortlich ist für die biologische Aktivität dieses Moleküls“ (Gund 1977).
Während Wasserstoffbrückenbindungen äußerst wichtig für die Bindung des biologisch aktiven Moleküls an einen Rezeptor sein können, führen hydrophobe Wechselwirkungen unter anderem zu einer Stabilisierung des Ligand-Rezeptor-Komplexes. Eine geeignete hydrophobe Gruppe kann zu einer Steigerung der Affinität eines Liganden gegenüber einem Rezeptor um mehr als den Faktor 1000 führen im Vergleich zu einem Liganden, dem dieses Strukturmerkmal fehlt (Gabel und Endo 2004).
Carborane wurden als hydrophobe Pharmacophore zur Synthese neuartiger Agonisten und Antagonisten von Retinoiden und Steroidhormonen eingesetzt. Diese Hormone sind wasserunlöslich und werden deshalb mit einem Trägerprotein des Blutserums in das Zielgewebe transportiert. Das Hormon passiert die Plasmamembran durch einfache Diffusion und bindet im Zellkern an ein
28
hormonspezifisches Rezeptorprotein. Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung des Rezeptorproteins, welches daraufhin mit einem weiteren Rezeptorhormonkomplex dimerisiert. Durch Anlagerung des Dimers an hochspezifische DNA-Sequenzen, den Hormonantwortelementen (HRE), wird die Transkription der benachbarten Gene erleichtert. Die hormonregulierten Genprodukte werden vermehrt synthetisiert (Lehninger et al. 1998).
Retinsäure und ihre Derivate, die Retinoide, können Zelldifferenzierung von verschiedenen Zelltypen auslösen unter anderem von Zellen der promyeloischen Leukämie. Für die Bindung von all-trans Retinsäure 28, dem natürlichen Liganden, an den Retinsäurerezeptor (RAR) mit hoher Affinität ist eine Carboxygruppe und eine voluminöse lipophile Gruppe erforderlich (siehe Abb. 14) (Gabel und Endo 2004). Als hydrophobes Pharmacophor wurde ortho-closo-Carboran im synthetischen Retinoid
29 (BR403) eingesetzt (Endo et al. 2001). Die Wirkung dieses Agonists als Auslöser von Zelldifferenzierung in vitro entspricht jener von all-trans Retinsäure 28 (Gabel und Endo 2004).
Bereits bekannte pharmazeutische Wirkstoffe dienten als Ausgangspunkt in der Entwicklung neuer Antagonisten des Steroidhormons Estrogen (siehe Abb. 15). Im Estrogen-Antagonisten 31 (BE360) ersetzt das Pharmacophor ortho-closo-Carboran einen der drei Phenylreste des klinisch-genutzten Wirkstoffes Tamoxifen 30 (Endo et al. 1999). BE360 (Struktur 31) bindet wie sein (CH3)2NCH2CH2O-Phenylderivat
BE362 und Tamoxifen 30 an den Estrogenrezeptor ER α. Im Gegensatz zu den beiden anderen Antagonisten verhindert BE362 den estrogenbedingten Knochenabbau, ohne jedoch als Hormonantagonist auf den Uterus zu wirken (Gabel und Endo 2004). Damit könnte spezifisch der Osteoporosis vorgebeugt werden.
29 HN OH O 29 O OH 28 = BH
= C (ex o-H ersetzt durch organischen Substituenten)
Abb. 14 Retinsäure und Agonist (Endo et al. 2001)
31
HO
HO OCH2CH2N(CH3)2
30
30
2. Ziel der Arbeit
2.1. Synthese von o-carboranhaltigen 9-N-Amino (5-N-Acetyl)
Neuraminsäureglycosiden
Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von Sialinsäurederivaten, welche mit hoher Affinität an Siglecs binden und dadurch als Inhibitor der molekularen Zellerkennung von Glycanstrukturen mit terminalen Siaeinheiten wirken. Ausgangspunkt zur Entwicklung der Zielstuktur ist die Struktur von 9-NH2-Neu5Ac2αMe, welches eine
stärkere Bindung in Inhibitionstests mit Siglec 4a (MAG) als unsubstituiertes Neu5Ac2αMe zeigte (Kelm et al. 1998a). In der Literatur gilt das Benzoylamid BENZ
19 (siehe Abb. 16) als Sialinsäurederivat mit dem größten Inhibitionspotential gegenüber MAG (vergleiche S.21, Zaccai et al. 2003a). Die Stabilisierung der Glycerin-Seitenkette von BENZ im Komplex mit Sialoadhesin (Siglec 1) erfolgt einerseits durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zur C-8 Hydroxy und C-9 Amidgruppe, andererseits durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Phenylring und unpolarer Aminosäuren. Durch die Verwendung von closo-Carboran anstelle des Phenylringes als vergleichbar großes, aber deutlich lipophileres Pharmacophor sollen die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Sialinsäureglycosid und MAG verstärkt werden, die Stabilität des Inhibitor-Siglec-Komplexes erhöht und damit die Inhibitorwirkung verstärkt werden.
Sowohl für das Methyl- als auch das stärker inhibierende Benzylglycosid (Kelm et al. 1998) existieren Vergleichsmöglichkeiten mit unterschiedlich an C-5 und / oder C-9 substituierten Neu5Ac-Derivaten, welche die Methyl- beziehungsweise die Benzylgruppe als Aglycon aufweisen. Damit ergibt sich o-closo-carboranhaltigen 9-N-Amino(5-N-Acetyl)Neuraminsäureglycosid 32 (Abb. 16) als Zielstruktur dieser Arbeit.
31 O OH AcHN OR COO -OH H N O OH O OH AcHN OCH3 COO -OH H N O OH 1 19 32 = BH = CH oder C R = Aglycon a: Methyl-b: Benzyl-Abb. 16
Während die Synthese des 9-NH2-Neu5Ac2αMe in der Literatur bekannt ist (Isecke
und Brossmer 1994), ist eine Beschreibung der Synthese des Benzylglycosides nicht vorhanden. Sie ist in dieser Arbeit enthalten.
Als Modellverbindung für die Verknüpfung eines Aminozuckers mit einem ortho-closo-Dicarba-dodecaboranderivat wird 2-(1-o-Carboranoylamido)-2-deoxy-D-glucose 33 gewählt (siehe Abb. 17). Anhand der Reaktion von Glucosamin mit closo-Dicarba-dodecaborancarbonsäurechlorid sollen Synthesestrategien entwickelt werden, welche den Abbau des o-closo-C2B10-Käfigs zur nido-Komponente durch
das primäre Amin vermeiden und die gewünschte Amid 33 ergeben.
O OH N H HO OH OH O 33 2 1 Abb. 17 2-(1-o-Carboranoylamido)-2-deoxy-D-glucose
32
3. Resultate und Diskussion
3.1. Synthese von 9-N-Amino-(5-N-acetyl-)neuraminsäure
glycosiden
3.1.1. Synthese der Neu5Ac-Alkylglycoside
Die Darstellung von Neu5Ac-Glycosiden mit einer Aminogruppe an Position C-9 beginnt mit der Generierung eines Glycosyl-Donors 38 mit einer geeigneten Abgangsgruppe an C-2, welcher dann auf den entsprechenden, als Glycosyl-Akzeptor fungierenden Alkohol übertragen wird. Danach erfolgt die selektive Substitution der Hydroxygruppe an C-9 zu einer Azidgruppe, welche anschließend zur 9-Aminoglycosid 44 reduziert wird. Während der Synthese wird die Carboxylgruppe an C-1 als Methylester geschützt (siehe Schema 6). Zusätzlich werden die freien Hydroxygruppen des Donors während der Glycosylierung durch geeignete Schutzgruppen maskiert.
O OH AcHN COOH OH OH HO OH O OAc AcHN COOMe Cl OAc AcO OAc O OH AcHN OR COO -OH H3+N OH 38 44 Neu5Ac R = Aglycon a: Methyl-b: Benzyl-Schema 6
Die stereoselektive Darstellung des Glycosyl-Donors 38 ist erschwert, da der dirigierende Einfluss eines Substituenten an C-3 fehlt. Der fehlende Substituent erleichtert darüber hinaus zusammen mit der elektronenziehenden Carboxylgruppe an C-1 die Eliminierung der Abgangsgruppe am anomeren Kohlenstoff und damit die Bildung eines Glykals (Boons und Demchenko 2003). Die Verwendung von 2-Chloroderivaten von Neu5Ac ist weitgehend auf die Darstellung der Glycoside einfacher Alkohole beschränkt, da die benötigte Reaktionszeit für sterisch anspruchvollere Alkohole stark zunimmt bei gleichzeitigem Rückgang der Ausbeute (Kononov und Magnusson 1998).
33 CF3COOH MeOH O OH AcHN COOH OH OH HO OH O OH AcHN COOMe OH OH HO OH 34 O OAc AcHN COOMe Cl OAc AcO OAc 38 O OAc AcHN COOMe OAc OAc AcO OAc O OAc AcHN COOH OAc OAc AcO OAc Pyridin / Ac2O HCl Gas CH2Cl2 AcCl /AcOH Pyridin/ Ac2O kat. DMAP HCl Gas Et2O kat. AcCl O OAc AcHN COOH Cl OAc AcO OAc 35 37 36 Schema 7
Die Synthese von 2-Alkyl-Neu5Ac-Derivaten, deren Konfiguration bestimmt wurde durch die enzymatische Spaltung mit der Vibrio-cholerae-Neuraminidase, erfolgt mit acetylierter 2-Chloro-Neu5Ac 37, erstmals beschrieben von Meindl und Tuppy 1965(Meindl und Tuppy 1965), oder mit ihrem Methylester 38, 1966 beschrieben von Kuhn et al. (siehe Schema 7) (Kuhn et al. 1966). In dieser Arbeit wurde der Methylester von Neu5Ac verwendet, um die Reduktion im letzten Schritt zum 9-Aminoderivat durchführen zu können. Die Veresterung von Neu5Ac in Methanol zum Methylester 34 mit Trifluoressigsäure als Katalysator verläuft mit 96% Ausbeute nahezu quantitativ gemäß Literatur (Sparks et al. 1993). Das Singulett der Methylgruppe im 1H-NMR-Spektrum (200 MHz, CD3OD) erscheint erwartungsgemäß
bei δ = 3.82 ppm.
Der von Kuhn et al.1966 beschriebene Syntheseweg führt über den 2,4,7,8,9-Penta-O-acetyl-Methylester 35 zum 2-Chloro-Methylester 38. Die Acetylierung mit Essigsäureanhydrid und Pyridin als Base zum 2,4,7,8,9-Penta-O-acetyl-methylester
35 sowie die anschließende Chlorierung mit Chlorwasserstoff zum 2-Chloro-Methylester 38 konnten modifiziert nach Sparks et al.(Sparks et al. 1993) erfolgreich in dieser Arbeit durchgeführt werden, die Ausbeuten (71% d.Th. für die Acetylierung; 62% d.Th. für die Chlorierung) erschienen für die Stufen 2 und 3 einer zehnstufigen Synthese jedoch als zu gering. Während der Halogenierung droht bei einer Verlängerung der Reaktionszeit zur Ausbeutesteigerung eine Zunahme des
34
Eliminierungsproduktes, welches durch Abspaltung der neugebildeten Halogenabgangsgruppe entsteht. Eine Reinigung des Reaktionsproduktes durch Chromatographie ist aufgrund der Instabilität des Halogenierungsproduktes nicht möglich. Hohe Anteile an Eliminierungsprodukt und unreagiertem Edukt reduzieren daher die Ausbeute der nachfolgenden Glycosylierung.
Für die Darstellung des 2-Chloro-Methylesters 38 wurde daraufhin ausschließlich die direkte Synthese aus dem Methylester 34, entwickelt von Roy und Laferrière (Roy und Laferrière 1990), durchgeführt. Bei der Umsetzung des Methylesters 34 mit Acetylchlorid und Eisessig entsteht der peracetylierte Methylester als Intermediat, welcher mit dem in situ entstehenden Chlorwasserstoff zum 2-Chloromethylester 38 reagiert (Roy und Laferriere 1990). Diese Synthese zeichnete sich durch eine hohe Ausbeute mit 98% d. Th. aus. Mit 1H-NMR wurden die Signale ausschließlich eines Anomers detektiert, Signallage und Kopplungskonstanten von H-3ax und H-3eq
entsprechen den Literaturangaben (Kononov und Magnusson 1998) für das β-Produkt.
Im nächsten Schritt erfolgt die Übertragung des Glycosyl-Donors auf den Alkohol in einer modifizierten Koenigs-Knorr-Reaktion (siehe Schema 8). Kononov und Magnusson konnten zeigen, dass die Reaktion des 2-Chloro-Methylesters 38 mit einem Überschuss an Methanol auch in Abwesenheit eines Metallsalzes äußerst stereoselektiv verläuft und zu einem 30fachen Überschuss des α-Anomers führt (Kononov und Magnusson 1998). Dieser hohe Überschuss lässt auf einen SN
2-Reaktionsverlauf mit Walden-Inversion der Konfiguration schließen. Die stereospezifische Darstellung von acetyliertem 2-α−Alkyl-Neu5Ac1Me 39 erfordert den Einsatz von Silbersalzen als Promotoren. Eschenfelder und Brossmer konnten durch die Verwendung von polymeren Silbersalzen wie Silbermethacrylat und – polymaleat, unlöslich im Reaktionsgemisch, die Ausbeute des α-Glycosides von 30 auf 60% steigern (Eschenfelder und Brossmer 1980). Eine weitere Ausbeutesteigerung ergab der Gebrauch von Silbersalicylat durch van der Vleugel et al. (van der Vleugel et al. 1982).
35 Ag salicylat ROH O OAc AcHN OR COOMe OAc AcO OAc 39 O OAc AcHN COOMe Cl OAc AcO OAc 38 1.) Base / MeOH 2.) Ionen-austauscher O OH AcHN OR COOMe OH HO OH 40 R = Aglycon a: Methyl-b: Benzyl-Schema 8
Wulff und Röhle entwickelten zuvor einen Reaktionsmechanismus für Glycosylierungen mit 1-Halogenzuckern in Gegenwart unlöslicher Silberverbindungen (Wulff und Röhle 1974). Dieser lässt sich auf 2-Halogen-Sialinsäurederivate übertragen (siehe Schema 9). An der unlöslichen Silberverbindung wie Silbersalicylat adsorbiertes 2-Halogen-Sialinsäurederivat reagiert mit dem Alkohol in einem konzertierten Mechanismus, in dem neben dem Glycosyl-Donor auch die Hydroxygruppe des Akzeptors fixiert sind.
Komplexe Hydroxyverbindungen wie tert. Butanol oder viele Saccharide verhindern zusammen mit der voluminösen Carboxymethylestergruppe an C-1 die Bildung des SN2-typischen Übergangszustandes, so dass keine Reaktion stattfindet (van der
Vleugel et al. 1982). Cl COOMe O O H R1 Ag O O R2 -AgX -R2COOH COOMe OR1 O Schema 9
In dieser Arbeit wurde das acetylierte Methylglycosid 39a nach van der Vleugel et al.(van der Vleugel et al. 1982) und das acetylierte Benzylglycosid 39b nach Ikeda et al.(Ikeda et al. 1991) erfolgreich synthetisiert. Die 1H-NMR-Spektren für beide
36
Glycoside im Bereich δ = 2 bis 3 jeweils nur ein Duplett von Dupletts, dessen Lage, Intensität und Kopplungskonstante, sofern beschrieben, der Literatur entspricht. Methylglycosid 39a: H-3eq: δ = 2.54 ppm, 1H, J1= 12.7 Hz; J2= 4.4 Hz (Lit.(van der
Vleugel et al. 1982): δ = 2.57 ppm, 1H)
Benzylglycosid 39b: H-3eq: δ = 2.67 ppm, 1H, J1= 12.7 Hz; J2= 4.4 Hz (Lit.(Ikeda et al.
1991): δ = 2.66 ppm, 1H, J1= 12.8 Hz; J2= 4.6 Hz)
Bei der Synthese des Benzylglycosides erwies sich die Verwendung eines inerten Lösungsmittel als essentiell, da die Entfernung eines zu großen Überschusses an Benzylalkohol durch Destillation i.Vak. zum Auftreten des Eliminierungsproduktes führte.
Zur Deacetylierung des geschützten Methylglycosids 39a wurde eine katalytische Menge metallisches Natrium in eine Lösung des Glycosides in Methanol gegeben. Nach 12 h wurde das Reaktionsprodukt mit einem protonenbeladenen Ionenaustauscher angesäuert (Sparks et al. 1993). Das 1H-NMR-Signal von H-3eq
entspricht der Literatur (H-3eq δ = 2.53 ppm; Lit. δ = 2.68)(van der Vleugel et al.
1982). Das für α-glycosidische Bindungen ebenso charakteristische H-4 Signal befindet sich in einem Multiplett mit den Signalen von H-5, H-6, H-8 und H-9.
Nach der Reaktion blieb noch viel unreagiertes Edukt zurück, da das eingesetzte Natrium eine zu geringe Menge des Natriummethanolat in situ bildet, welches die Umesterung der Acetylgruppen zum Essigsäuremethylester katalysiert. Aufgrund dieses Resultates wurde für die Deacetylierung des geschützten Benzylglycosides
39b ein anderes Verfahren verwendet (Roy und Laferrière 1990), indem direkt der Katalysator Natriummethanolatlösung bis zum pH-Wert 9 hinzugetropft wurde. Das Benzylglycosid ist bislang nicht in der Literatur beschrieben worden, jedoch liegen die 1H-NMR-Signale von H-3eq und H-4 in dem für α-glycosidische Signale
charakteristischen Bereich (δ = 2.6 – 2.8 für H-3eq und δ = 3.6 – 3.8 für H-4, van der
37
3.1.2. Derivatisierung der Gycerinseitenkette des Neu5Ac-Glycosides
Die Synthese des 9-N-Amino-(5-N-acetyl-)neuraminsäure-methyl-glycosides (9-NH2
-Neu5Ac2αMe) ausgehend vom Neu5Ac2αMe ist 1994 von Isecke und Brossmer veröffentlicht worden (Isecke und Brossmer 1994). Anhand der Literaturvorschrift konnte erfolgreich das 9-Aminoderivat des Methylglycosides dargestellt werden. Noch nicht publiziert ist dagegen die Synthese des 9-N-Amino-(5-N-acetyl-) neuraminsäure-benzyl-glycosides, welche Teil dieser Arbeit ist. Das entschützte Benzylglycosid 40b wurde mit Toluolsulfonsäurechlorid in Pyridin versetzt und reagierte zum 9-O-Tosyl-Derivat 41b (siehe Schema 10). Eine Reaktionskontrolle mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) war nicht möglich, da das in der mobilen Phase gelöste Tosylierungsprodukt sich teilweise wieder zum Edukt zersetzte. Dadurch konnte die benötigte Reaktionszeit nicht exakt bestimmt werden, so dass nicht tosyliertes Glycosid bei der Aufarbeitung in der wässrigen Phase verblieb und sich dadurch die Ausbeute reduzierte.
Die Tosylgruppe stellt eine gute Abgangsgruppe dar und wurde in der nachfolgenen Reaktion in wässrigem Aceton erfolgreich substituiert durch das Azid-Anion. Durch
1H-NMR-Spektroskopie konnte der endständige C-9-Kohlenstoff der
Glycerinseitenkette als Bindungspartner bestätigt werden. Die chemische Verschiebung der beiden magnetisch nicht äquivalenten H-9 Protonen, die Spin-Spin-Kopplung der Kerne untereinander und zum H-8 Proton sind hierfür charakteristisch. Der stereospezifische Angriff des sterisch gehinderten Toluolsulfonsäurechlorides auf den primären Alkohol an C-9 in der vorherigen Reaktion konnte damit nachgewiesen werden.
Für die vom Benzylgykosid ausgehende Synthese musste insbesondere das Laufmittelgemisch für die TLC und Säulenchromatographie neu entwickelt werden, dabei erwies sich die Trennung aller im Solute enthaltenen Komponenten als problematisch, so dass ein großer Teil des gewünschten 9-Azidglycosids 42b als Mischfraktion mit dem Edukt und weiteren Reaktionsprodukten vorlag. Dieser Umstand reduzierte die Ausbeute an Reinstoff.
38
Das 9-Azidoglycosid 43b mit freier Carboxylgruppe wurde erhalten durch die Verseifung des Methylesters mit verdünnter Natronlauge und anschließender Behandlung mit protonenbeladenen Ionenaustauscher. Unter diesen milden Bedingungen blieb die Amidbindung an C-5 erhalten. In der IR-Spektroskopie konnten die Valenzschwingungen der Amidbindung und der freien Carbonsäure, nicht mehr jedoch der Esterbindung, nachgewiesen werden.
Das 9-Amino-(5-N-acetyl-)neuraminsäurebenzylglycosid (9-NH2-Neu5Ac2αBn) 44b
wurde erfolgreich durch die katalytische Hydrierung der 9-Azidogruppe der Vorstufe
43b dargestellt. Als Hydrierkatalysator wurde Palladium-(II)-oxid verwendet.
Während eine Elementaranalyse des 9-NH2-Neu5Ac2αBn 44b nicht durchgeführt
wurde, wiesen Isecke und Brossmer zwei Moleküle Kristallwasser im 9-NH2
-Neu5Ac2αMe nach.(Isecke und Brossmer 1994) Aufgrund der bis auf das Aglycon gleichen Struktur ist auch im Benzylglycosid die gleiche Menge Kristallwasser zu vermuten. Pyridin O OH AcHN OBn COOMe OH TsO OH 41b Aceton / Wasser O OH AcHN OBn COOMe OH N3 OH 42b PdO; Wasser H2 O OH AcHN OBn COO -OH H3+N OH 44b TsCl NaN3 O OH AcHN OBn COOMe OH HO OH 40b MeOH 1.) 0.1N NaOH 2.) Dowex 50W-X8 O OH AcHN OBn COOH OH N3 OH 43b Schema 10
39
3.2. Synthese von
N-(1-o-carboranoylamido)neuraminsäureglycosiden
3.2.1. Syntheseweg
Der C2B10-Käfig des closo-Carborans wurde bislang vorwiegend für die Synthese von
Reagenzien verwendet, welche in der Bor-Neutronen-Einfangstheraphie (BNCT) eingesetzt werden sollten. Zur Darstellung closo-carboranhaltiger Ester und Amide werden 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-carbonsäuren und ihre Säurechloride verwendet. Die Carboxylgruppe kann dabei direkt oder über einen Alkylrest, welcher als Spacer dient, mit dem C2B10-Käfig verbunden sein. Wie in der Theorie zum
nido-Abbau bereits in der Einleitung beschrieben, neigt 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-carbonsäure aufgrund des stark elektronenziehenden Substituenten zur Bildung der nido-Verbindung in wasserhaltigen polaren Lösungsmitteln. Die Veresterung von Hydroxyverbindungen mit dem Säurechlorid 45 erfolgt daher in wasserfreien unpolaren Lösungsmitteln. Ein Beispiel für die Veresterung mit dem Säurechlorid 45 ist die von Kahl und Koo entwickelte Synthese des wasserlöslichen Porphyrins BOPP (Abb. 18) (Kahl und Koo 1990). Die Veresterung erfolgt in Dichlormethan in Anwesenheit von 4-Dimethylaminopyridin als Base. Anschließend erfolgt die selektive saure Hydrolyse von Methylestergruppen zur Erhöhung der Hydrophilie.
N NH N HN H4C2 COO -C2H4 -OOC O O O O B10H10 H10B10 O O O O H10B10 B10H10
Abb. 18 BOPP – ein wasserlösliches Porphyrin mit vier closo-Carboranylcarbonsäureestern (Kahl und Koo 1990)
40
Die Darstellung des vom nido-Produkt freien carboranhaltigen Lactoseglycosids (Abb. 19) gelang dagegen der Arbeitsgruppe von L.O.Kononov nicht. Während die Veresterung des durch Benzylierung geschützten Aminoethyl-Lactoseglycosides mit 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-essigsäurechlorid das gewünschte closo-Produkt ergab, führte die in neutraler Lösung vorgenommene Debenzylierung zu einem Reaktionsprodukt, welches ca.9 % nido-Produkt enthielt (Kononov et al. 2005). Anders als von Schaeck und Kahl beschrieben (Schaeck und Kahl 1999), konnte damit der Abbau des C2B10-Käfigs auch bei Carboranen mit β-Carbonylsubstituenten
nachgewiesen werden. O OH HO O OH HO O OH OH HO O N H O B10H10
Abb. 19 Zum Abbau zum nido-Derivat in neutraler wässriger Lösung neigendes carboranhaltiges Lactoseglycosid (12)(Kononov et al. 2005)
Für die Synthese eines N-(1-o-carboranoylamido)neuraminsäureglycosides ergab sich daher folgende Problemstellung: Für die Reaktion mit 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-carbonsäurechlorid 45 in unpolaren Lösungsmitteln ist die Hydrophilie von 9-NH2-Neu5Ac2αBn (bzw. 9-NH2-Neu5Ac2αMe) zu hoch, d.h. die
Löslichkeit der Glycoside ist zu gering.
Durch die Wahl geeigneter Schutzgruppen wie Acetyl-, Benzyl- und Silyl-gruppen kann die Lipophilie erhöht werden. Jedoch kann das Entfernen der Schutzgruppen im Basischen zum Abbau des Clusters und im sauren Bereich zur Zersetzung des Neu5Ac-Grundkörpers führen. Ein anderer Weg ist der Einsatz einer sterisch gehinderten Base, um die Bildung der Amidbindung in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel wie in Schema 11 dargestellt durchführen zu können.
Beide Wege zur Knüpfung der Amidbindung wurden anhand der Modellreaktion von Glucosamin mit 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-carbonsäurechlorid 45 untersucht. Die Ergebnisse sollten dann für die Wahl der Reaktionsbedingungen in der Reaktion von 9-NH2-Neu5Ac2αBn mit dem Carbonsäurechlorid 45verwendet werden.
41 O OH AcHN OR CO O -O H H3+N OH 44 B10H10 Cl O O OH AcHN OR COO -OH H N O B10H10 OH 46 + Base + HBaseCl 45 R = Aglycon a: Methyl-b: Benzyl-Schema 11
3.2.2. Synthese des closo-o-Carboranylcarbonsäurechlorides
Die Darstellung des 1,2-Dicarba-closo-dodecaboran-1-carbonsäurechlorides (Closo-o-Carboranylcarbonsäurechlorides) erfolgte nach Literatur (siehe Schema 12) (Kasar; Knudsen, und Kahl 1999).
47 2 1 1 2 OH O 2 1 48 45 1. n-BuLi 2. CO2(s) Et2O Toluol PCl5 Cl O = BH = C(H) Schema 12
Um eine denkbare mehrfache Substitution am Carboran nachweisen zu können, wurde die Carbonsäure 48 unter anderem massenspektrometrisch untersucht. Es wurden sowohl die Elektronenstoß- als auch die Elektrosprayionisation als Ionisierungsmethoden gewählt. Das ESI-Spektrum ergab im positiven Bereich keine Signale mit der charakteristischen Isotopenverteilung des Bors, im negativen Bereich wurde das Molekülion (nido-M)- der nido-Carboranylcarbonsäure mit mehr als
42
vierfacher Intensität gegenüber dem Signal der closo-Carboranylcarbonsäure (closo-M+OH)- nachgewiesen (siehe Abb. 20).
180.2 205.2 352.3 431.0 573.4 All, 0.0-1.0min (#1-#65) 0 200 400 600 800 1000 1200 Intens. 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z
Abb. 20 ESI-Spektrum (negativ) von closo-Carboranylcarbonsäure
Im EI-Spektrum wurden die Signale des closo-Molekülions und dem decarboxylierten closo-Carborans, nicht jedoch das Signal des nido-Produktes, detektiert (siehe Abb. 21).
Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie konnte die Struktur der synthetisierten Carboranylcarbonsäure trotz der widersprüchlichen MS-Daten aufgeklärt werden. Im 1H-NMR-Spektrum ermöglicht die Signallage des kohlenstoffgebundenen Protons im Carboran den Aufbau des Clusters zu bestimmen. Das Singulett mit der chemischen Verschiebung δ = 4.05 ppm ist laut Literatur charakteristisch für das closo-Produkt (Kasar et al. 1999). In der 11-B-NMR-Spekroskopie bewirken Kern-Quadrupolmomente eine starke Signalverbreiterung. Dennoch können die zehn Boratome des closo-Carborans den drei Signalen im 11-B-NMR-Spekrum zugeordnet
werden (siehe Abb. 22). Winzige Erhebungen in der Basislinie zwischen δ = -30 ppm und δ = -40 ppm weisen auf Spuren von nido-Carboran hin (nido-B-10 und nido-B-1).
nido-Molekülion
closo-Molekülion + OH-
43
Mit Ausnahme der ESI-Massenspektrometrie bestätigte die Analyse der synthetisierten Carbonsäure die closo-Struktur des enthaltenen ortho-Dicarba-dodcaborans. Für die Aufnahme des ESI-Spektrums wurde die Probe in möglicherweise nicht wasserfreiem Acetonitril gelöst. Dagegen wurde für die Aufnahme der NMR-Spektren unpolares deuteriertes Chloroform verwendet. Im polaren Lösungsmittel konnte der Abbau zum nido-Produkt beginnen. Jedoch stellten Schaeck und Kahl für wässriges Acetonitril nur niedrige Abbauraten, welche im Bereich von Tagen liegen, fest (Schaeck und Kahl 1999). Für einen 75%igen Abbau wäre die Zeit zwischen Probenvorbereitung und Einbringen der Lösung in die MS-Apparatur zu kurz.
SCAN GRAPH.
Scan 87#3:30.44. Base M/z=143.2. 100% Int.=4574,08. Aux =94.4.
Low Resolution m/z 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 In te ns ity ( % age) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 44 60 90 101 113 129 143 158 183 187
Abb. 21 EI-Spektrum von Carboranylcarbonsäure
closo- Molekülion
closo-
44
Abb. 22 11B-NMR (1H entkoppelt) von closo-Carboranylcarbonsäure
Zur Erzeugung geladener Teilchen wird bei der Elektrosprayionisation die Probelösung durch eine Kapillare in eine Kammer gesprüht. Zwischen der Kapillare und dem Kammermantel wird ein Potential von 2 bis 5 kV angelegt. Die dabei entstehenden geladenen Tröpfchen bewegen sich, getrieben durch das elektrische Feld, durch eine Glaskapillare in den Analysenvorraum. Infolge des abnehmenden Druckes verdampft das Lösungsmittel auf den Weg in das Massenspektrometer und es bleiben zum Teil mehrfach geladene Ionen zurück (Hesse et al.1995). Werden Tröpfchen der closo-carboranhaltigen Probenlösung negativ aufgeladen, so ist eine Beschleunigung des Abbaus durch eine elektrochemische Reaktion denkbar. Eine Zunahme der Hydroxidionen aufgrund einer elektrochemischen Reaktion mit im Lösungsmittel enthaltenen Wasser würde den nukleophilen Angriff auf den Borcluster stark erleichtern. Um bei weiteren Messungen die Degradation des Borkäfigs zumindest zu verringern, wurde den Probelösungen für die ESI-Massenspektrometrie 0,5%ige Ameisensäure beigemengt.
2.0000 2.1003 6.0102 Integral --3.514 -9.499 -12.403 (ppm) -65 -60 -55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 B-9, B-12 B-8, B-10 B-3 bis B-7, B-11
