(12) INTERNATIONAL APPLlJ^ION PUBLISHED UNDER THE PATEWTCOOPERATION TREATY (PCT)
WIPO PCT (19) World Intellectual Property Organization
International Bureau (43) International publication date
22 February 2001 (22.02.2001)
(10) International publication number WO 01/13123 A2 (51) International patent classification7:
33/58, 33/543
G01N 33/86,
(21) International application number: PCT/DEOO/02748 (22) International filing date: 11 August 2000 (11.08.2000) (25) Language of filing: German (26) Language of publication: German (30) Data relating to the priority:
199 37 654.9 14 August 1999 (14.08.1999) DE 199 41 447.5 31 August 1999 (31.08.1999) DE (71) Applicant (for all designated States except US):
NOVEMBER AKTIENGESELLSCHAFT
GESELLSCHAFT FUR MOLEKULARE MEDIZIN [DE/DE]; Ulrich-Schalk-Str. 3a, D-91056 Erlangen (DE).
(72) Inventors; and
(75) Inventors/Applicants (US only): BERTLING, Wolf [DE/DE]; Meisenweg 22, D-91056 Erlangen (DE).
(81) Designated states (national): AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW.
(84) Designated states (regional): ARIPO-Patent (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), Eurasian Patent (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), European Patent (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OAPI- Patent (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Published
Without the International Search Report and to be republished once the report has been received.
For an explanation of the two-letter codes and the other abbreviations, reference is made to the explanations ( "Guidance Notes on Codes and Abbreviations") at the beginning of each regular edition of the PCT Gazette
(74) Attorney: GASSNER, Wolfgang; Nagelsbachstrasse (75) 49 A, D-91052 Erlangen (DE).
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O
As printed
(54) Title: METHOD FOR INDIRECTLY DETERMINING THE BLOOD-CLOTTING STVOUS
(54) Bczckhnung: VERFAHREN ZURINDREKTEN BESTIMMUNC DES BLUTGERINNUNGSSTATUS
(57) Abstract: The invention relates to a method for indirectly determining the blood-dotting status. The inventive mrenod <
prises the following steps: a) collecting body fluids which cjwitain a protein that can be modified by a vitamin K-dependent •/-car- boxylase, b) determining at least two concentrations selected from a group consisting of a first concentration CI of carboxylatcd protein, a second concentration C2 of decarboxylated protean and an entire concentration C3 of carboxylated and decarboxylated protein, whereby the first concentration CI is determined using a first antibody Al, the second concentration using a second anti- body A2 and the chin) concentration C3 using a third antibopy A3, c) generating a first quotient Ql from the first CI and second concentration C2 or generating a second quotient Q2 from the third C3 and first concentration CI or generating a third quotient Q3 from the third C3 and second concentration. C2. whereby a concentration CI. C2. C3 which has not been determined in step b) and which is required for generating the first Ql, the second Q2 oithe third quotient Q3 is calculated according to the following relation;
C3 C2a CI and d) the first, second or third quotient Ql, QV Q3 are correlated with the blood-clotting status,
(57) Zusammcnfassung: Die Erfindung beoifit eio Verfahren zur indirekten Bestimrrrung des Blutgerinnungastattg mil folgenden Schriuen: aj Eatnahme von Ko^perflussigcrit, die ein durch cine Vjtamin-K abhfingige ^Carboxylase mcjcUffcierbares Protein em- halt; b) Erminlung von mindestena zweri Koiufinrrationen ausgjswahlt aus einer Gruppc bestehend aus einer ersten Konzemrati on (CI) an carboxylicrten Protein, einer zweiten Konzentraiion (C2) jan dccarpoxyliencm Protein und einer GesamtkoMentration (C3) an carboxyliertem und c^arboxyliertcm Protein, wobei die crstelKnnxeniration (CI) nnter \ferwendung ersten Antikfirpers (AIX die zweite Konzentration nnter Verwcndung eines Aweiten Antikdrpers (A3) und die drine Konzennatiap (C3) unter Vbrwendung ei- nes driuen Antikorpers (A3) enninelt wird; c) Bildung eines ersten Quotientcn (Ql) aus erster (Cl) und zweiter Konzentration (C2).
Oder Bildung eines zweiten Qooticnten (Q2) aus dritier (C3) tmd erster Konzentration (Cl), oder Bildung eines drinen Quotientcn (Q3) ans ddner (C3) nod zweiter Konzentration (C2), wobei eine zur Bildung des ersten (Ql), zweiten (Q2) oder drinen Quodenteo (Q3) erforderliche und beJ Schritt lit. (b) nicht errjiiaelte Konzentration (Cl. C2, C3) gemfiB founder Beziehung: C3 - C2 = Cl e^chnez wird; und d) Korrelation des ersten, zweiten oder drjtten Quotienten (Ql. Q2. Q3) mit dem Bliugeriiuiimgsstatus.
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BUNDEJREPUBLIK DE
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Prioritatsbescheinigung iiber die Einreichung \ 4- einer Patentanmeldung
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
199 37 654.9
14. August 1999
Anmelder/lnhaber: november AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fur Molekulare Medizin, Erlangen/DE
Bezeichnung: Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerin- nungsstatus
IPC: G 01 N, C 12 Q
Die angehefteten Stucke sind eine richtige und genaue Wiedergabe der ur- sprunglichen Unterlagen dieser Patentanmeldung.
Mi^hen.^den 20. September 200CL D^utsches p|tent- und Marke^m t
President Auftrag
A9-B61 06/00-
{61 UOA£ 9i!8S)09609U.et600/22*e9XVd-SAN UOA 881*91 :JN eOXVd 66 80 Pi UinjeQ
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Verfafcren zur indirekten Bestiranung des Blutgerinnungsstatus Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur indirekten Bestim- mung des Blutgerinnungsstatus.
Ermittlung der Prothrombinkonzentration in menschlichen KSr- perfliissigkeiten erfolgen. Bei Prothrombin handelt es sich urn ein Protein, welches vorwiegend im Plasma des menschlichen Bluts vorkommt. Prothrombin ist mitverantwortlich fur die Blutgerinnung. Es wandelt ISsliches Fibrinogen in unlosliches Fibrin urn.
Die durch Prothrombin induzierte Umwandlung des Fibrinogens erfolgt nur dann, wenn Prothrombin in natiirlicher carboxy- lierter Form vorliegt. Die Carboxylierung erfolgt in der Le- ber durch eine Carboxylase unter Bindung des Co-Faktors Vit- amin K. Die Aktivitat der Carboxylase ist von der Konzentra- tion an Vitamin K abhangig. Wenn die Vitamin-K-3indungsstelle der Carboxylase blockiert wird, ist sie nicht aktiv. Es en- steht dann eine abnormale nicht carboxylierte Form des Pro- thrombins/ welche nicht gerinnungsaktiv ist. Die Wirkung oral verabreichter Anticoagulantien beruht auf der Wirkung der Blockierung der Vitamin K Bindungsstellen der Carboxylase, Beim gesunden Menschen liegt das Prothrombin in naturlicher, d.h. carboxylierter, Form vor. Die Carboxylierung wird durch Vitamin-X als Co-Faktor bewirkt. Bei kranken Menschen, insbe- sondere bei Menschen mit Leberschaden, oder bei Zugabe von Antikoagulantien, kommt Prothrombin auch in der abnormalen Form vor.
20]OA.nor
€00-£ 9T9C# 996091 UTS 6661. SAY"^
(61 UOA p Q\\QS) 09609Uei600/2? eOXVd:SAN U°A 8eit>9L MN €9XVd 91 '91 66WH Lunjea
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Das carboxylierte Prothrombin bewirkt eine Gerinnung nur dann, wenn zuvor Ca2+ -Ionen gebunden werden. Nur darm ist das carboxylierte Prothrombin in der Lage, an die Membranen der Blutplattchen zu binden und eine Gerinnung zu bewirken. Nur die carboxylierte Form des Prothrombins kann Calcium binden.
Somit laSt^der fl^halt an carboxyliertem Prothrombin auf den Blutgerinnungsstatus schlieEen.
Aus der US 4,769,320 ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Ermittlung des Gehalts an carboxyliertem Prothrombin unter Verwendung spezifischer Antikorper fur Prothrombin mittels Immunoassay erfolgt.
Aus der US 5,352,712 ist ein monoklonaler Antik6rper bekannt, der spezifisch fiir nicht-carboxyliertes Prothrombin ist. Un- ter Verwendung dieses Antikorpers la&t sich mittels Immunoas- say die Konzentration an nicht-carboxyliertem Prothrombin er- mitteln. Auch darnit ist eine Aussage iiber den Blutgerinnungs-
status m6glich.
Nach dem Stand der Technik tritt das Problem auf, da£ das zu analysierende Probenmaterial nicht imrher unmittelbar nach der Entnahme der Probe analysiert wird. Durch die Versendung des Probenmaterials vergehen mitunter 1 bis 2 Tage. Die meisten der an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren sind hoch emp- findlich und schnell inaktiv. 2s wird wahrend dieser 2eit wird u.a. sowohl carboxyliertes als auch nicht-carboxyliertes Prothrombin in der Probe abgebaut. Einer Verfalschung der Er- gebnisse des Blutgerinnungsstatus ist die Folge.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem. Stand der Technik zu beseitigen. Es soli insbesondere die Genauig-
201 OA.nrx:
!«00'<2 STQC#
(61 UOA s BVQS) 09609Uei600/22 £9XVd:SAN UOA 881^91 :JN £OXVd 9L SU 66 80 n ujn;ec
keit der Ermittlung des Blutgerinnungsstatus mittels der Be- stimmung des Prothrombingehalts erhoht werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprtiche 1 und 2 5 gelSst, Zweckmafiige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben
sich aus den Merkmalen der Anspruche 3 bis 15.
Nach Ma£gabe der Erfindung isfc ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungsstatus mit folgenden Schritten 10 vorgesehen:
a) Entnahme von KSrperflussigkeit, die ein durch eine Vit- amin-K abhSngige y-Carboxylase modifizierbares Protein enthalt,
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bl) Ermittlung einer ersten Konzentration an carboxyliertem Prothrombin unter Verwendung eines ersten Antikdrpers und Ermittlung einer zweiten Konzentration an decarboxy- liertem Prothrombin unter Verwendung eines zweiten Anti- 2 0 kfcrpers,
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c) Bildurag eines ersten Quotienten aus erster und zweiter Konzentration und
25 d) Korrelation des Quotienten mit dem Blutgerinnungsstatus.
Nach einer weiteren Variante ist ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungsstatus mit folgenden Schritten vorgesehen:
a) Entnahme von Korperf liissigkeit, die ein durch eine Vit- amin-K abhangige y-Carboxylase modifizierbares Protein enthait,
20I0A.DOC
SOO'c 9I9C# C»0 £ flQ T TCTi c
(61 uoA9ai!as)09609U8L600/22'eOXyd^SAN UOA 861WI :JN 99XVd 91 $1 66*80 'M ujnjBQ
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b2) Ermittlung einer Gesamtkonzentration an carboxyliertem und decarboxyliertem Prothrombin unter Verwendung eines dritten Antikorpers und Ermittlung einer zweiten Konzen- tration an decarboxyliertern Prothrombin unter Verwendung eines zweiten Antilcorpexsr;
cl) Errechnung einer ersten Konzentration an carboxyliertem Prothrombin gemaS folgender Beziehung:
C3 - C2 = Cl
und 3ildung eines ersten Quotienten aus erster und zwei- ter Konzentration
oder
c2) Bildung eines zweiten Quotienten aus dritter und erster Konzentration und
d) Korrelation des ersten bzw. zweiten Quotienten mit dem Blutgerinnungsstatus.
Unter einem durch eine Vitamin-K abhangige 7-Carboxylase mo- difizierbaren Protein wird ein Protein verstanden, das in Ab- hangigkeit des Blutgerinnungsstatus anteilig sowohl caboxy- lierter als auch in decarboxylierter Form vorliegen kanti.
Mit den erfindungsgemaSen Verfahren ist es moglich, auf der Basis des Gehalts an modifizierbarem Protein den Blutgerin- nungsstatus genau zu ermitteln. Die Betrachtung sowohl des Gehalts an carboxyliertem Protein als auch des Gehalts an de- carboxyliertem Prothrombin und das Inbeziehungsetzen der bei-
2OIOA.DOC
9G0'5 9T90# YSKSSVO'Jft'ONI-m"£Q 996091 T€T6 6* + + €T:9T 666T.£>nV'?"
(6L UOA i anas) 09609U€l600/23*e9XVd-SAN UOA 8€lt^9l :JN SOXVd 91-91 66'80'n wrnea
den vorgenannten Proteingehalte werden Fehler bei der Bestim- mung des Blutgerinnungsstatus minimiert.
Bei der Korperflussigkeit kann es sich zweckm&Sigerweise urn 5 Plasma, Blut, Speichel, Urin oder dgl. handeln. Geeignet sind grun^a~^frcn^r
Protein in einem Gehalt en thai ten ist, der eine Messung er- moglicht.
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Nach einem Ausgestaltungsmerkmal der Erfindung erfolgt die Bestimmung der ersten, zweiten und/oder dritten Konzentration mittels eines enzym- oder fluoreszenz-immunologischen verfah- rens . Dabei kann als enzym-irtimunologisches Verfahren ELISA Oder Strip-Assay verwendet werden.
Es ist aber auch moglich, daS die erste, zweite und/oder dritte Konzentration und/oder der erste bzw. zweite Quotient mittels einer Farbreaktion oder Fluoreszenzdetektion ermit- telt wird. Damit ist eine besonders schnelle und einfache Er- mittlung des Blutgerinnungsstatus mttglich.
Bei dem ein durch eine Vitamin-K abhangige ^Carboxylase mo- difizierbaren Protein handelt es sich vorzugsweise um Pro- thrombin, Nephrocalcin oder Osteocalcin. Es ist auch denkbar zur Bestimmung des Blutgerinnungsstatus andere Proteine be- nutzen, die von einer Vitamin-K abhangigen Carboxylase car- boxyliert werden und ebenfalls mittels oral verabreichbarer Anticoagulantien beeinflufibar sind. Nephrocalcin ist z.B. im Urin nachweisbar. Es mufi bei Benutzung dieses Proteins kein Blut entnommen werden- Das bedeutet fur Patienten, deren Blutgerinnungsstatus laufend uberwacht werden rnu£, eine er- hebliche Erleichterung.
2010fc.DOC
LOO'd 9TSC# ?36C?T HIS + + CT5ST 6661.Snv?T
(61 UOA 8 ai^S) 09609U€l600/Z2XOXVd:SAN UOA :JN 99XVd 66 80 n lurnea
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Es ist femer ein Kit zur Durchfuhrung des erfindungsgem&£en Verfahrens vorgesehen, wobei zur enzym-inununologischen Be- stimmung einer ersten Konzentration an carboxyliertem Pro- thrombin ein erster Antikorper enthaiten ist.
Zweekm&frirgerW:^
tration an decarboxyliertem Prothrombin ein zweiter Antik6r- per enthalten sein.
Es kann sich beim ersten vmd zweiten AntikSrper um nach dem Stand der Technik bekannte AntikSrper handeln. Solche Anti- korper sind z.3. aus der US 5,252,712 und US 4,769,320 be- kannt, deren Inhalt hiermit in die Beschreibung einbezogen wird.
Der Kit kann zweckm&fiigerweise zur Bestimmung einer Gesamt- konzentration an carboxyliertem und decarboxyliertem Pro- thrombin einen dritten AntikSrper enthalten. Axich dabei kann es sich um einen nach dem Stand der Technik bekannten Anti- k6rper handeln.
Der erste und der zweite AntikSrper konnen jeweils auf einem separaten Feld eines Teststreifens aufgenommen sein. Das er- moglicht eine besonders einfache Ermittlung des jeweiligen Gehalts z.B. mittels Farbreaktion,
Der dritte Antikorper kann auf einem Feld eines weiteren Teststreifens aufgenommen sein.
Zur Vervollstandigung des Kits kann jeweils ein zum ersten und zweiten Antikorper korrespondierendes Anti-Prothrombin- Enzym-Konjugat oder ein Anti-Prothrombin-Fluoreszenz- Farbstoff-Konjugat enthalten sein. Vorteilhafterweise kann
2010A-on<:
QOO'd 5T90# 996091 T€I6 6* + + M:9T 666IiSnY'?T
(61 uOA6 91|aS)09609Uf:i600/22 e9XVd:SAN UOA Q£iV9l :JN SOXVd 91-91 66'80'n wmea
auch ein zum dritten AntikSrper korrespondierendes Anti- Prothrombin-Enzym-Konjugat oder ein Anti - Prothrombin- Farbstoff-Konjugat enthalten sein.
5 Nachfolgend wird das erfindungsgemaSe Verfahren anhand der Z"ei"chrmng—erl-aatrertr;—Es—xeigen
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Fig. 1 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus rnit cPT/dcPT,
Fig. 2 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit cd?T/cPT und
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Fig. 3 die Xorrelation des Blutgerinnungsstatus mit dcPT.
In Fig. 1 ist der Quotient aus der Konzentration von carboxy- liertem und decarboxyliertem Prothrombin uber dem Blutgerin- nungsstatus INR aufgetragen. Die Konzentration ist hier als OD-Wert gemessen. Bei einem ermittelten Quotienten von 0,5 ergibt sich ein Blutgerinnungsstatus INK von 3,8.
In Fig. 2 ist der Quotient aus decarboxyliertem mit carboxy- liertem Prothrombin uber dem Blutgerinnungsstatus aufgetra- gen. Es ist ersichtlich, da£ der Quotienten hier besonders gut mit dem Blutgerinnungsstatus INR korreliert.
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Fig, 3 zeigt die nach dem Stand der Technik bekannte Korrela- tion von dcPT mit dem Blutgerinnungsstatus INR. Diese veran- dert sich mit zunehmendem Alter der Proben.
Beispiel:
Fur Seri ©nines sungen besonders geeignet ist der sogenannten Sandwi ch- ELISA.
201 0A .DCX:
600*a 5I90# v2tl£SYO'ONI - "EG 926C9T Tet6 6f + + ^T:9T 6661.SHY'*!
(61. UOA OL 9«3S) 09609Ltei.600/32 e9XVd:SAN u°A 8£l-fr9l :JN COXVd SL:SL 6680U ujniBQ
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a) Probenvorbereitung:
Zu deren Durchfuhmng werden die Kavitaten von Mikrotiter- platten (z.B. Maxisorb, NUNC) iiber Nacht bei 4°C mit je 50M1
5 Capture-AntikSrper (10fig/tnl in Carbonatpuf f er) beschichtet.
p.i.e^p^a^e^ 2ur Abs&ttigunc
unspezifischer Bindungsstellen werden die Platten lh bei zim- mertemperatur mit 50^1 1% BSA in PBS pro Kavitat geblockt.
Die Platten werden dann 3mal mit PBS/0, 05%Tween 20 gewaschen.
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Anschliefcend werden die Antigene wie folgt aufgetragen (50/il/Kavitat) :
Xalibrierplasmen, 1:50 verdunnt in PBS/0,1% BSA 15 Normalplasxna, 1:50 verdunnt in PBS/0,1% BSA
Patientenplasma, 1:50 verdunnt in PBS/0,1% BSA Prothrombindefizientes Plasma (negative Kontrolle)
Die Platten werden lh bei Zimmer temper a tur inkubiert und an- 20 schlie£end 3mal mit PBS/0,05%Tween 20 gewaschen. Es werden 5Oul/Kavitat Kaninchen anti Gesamt-Prothrombin (ID^g/tta) zu- fugt. Dann werden die Flatten lh bei zimmer tempera tur inku- biert und anschlie&end 3xnal mit PBS/0, 05%Tween 20 gewaschen.
Es werden 50/^1 /Kavitat Ziege anti Kaninchen Antikorper, Bio- 25 tin-konjugiert, (Dianova, 1:20000 in PBS/0,1% BSA) zufugt.
Die Platten werden lh bei Zimmertemperatur inkubiert und dann 3mal mit PBS/0,05%Tween 20 gewaschen.
Es werden 50/il/Kavi tat Streptavidin-Peroxydase-Konjugat (Ho- 30 che Diagnostics, 1:1000 in Konjugatpuf fer) zufiigt. Die Plat- ten werden lh bei Zimmertemberatur inkubiert und anschlieEend 3mal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.
2C10A.DOC
oicra 9iso# ^ZKS SYO 'A"ONI- *£G 926091 TCT5 6*- + 91 : ST 6S6T,onVH
(61 UOA 11 eyes) 09609U€L600/32*8DXVd:SAN UOA 8€lfr9l €9XVd Ql Sl 66*80 n wmeQ
Dann werden SO/il/Kavitat A3TS-L5sung (Roche Diagnostics, lmg/ml) zufugt, und die Platten werden VSh - lh bei zimmertem- pera tur inkubiert. Schliefelich werden die Platten im ELISA- Reader gemessen.
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Ausw^-^tTjp.g-:- Es werden
aa) die Absorbtionswerte (OD) des Gesamtprothrombins (Kavi- taten mit anti Gesamt-Prothrombin mAK beschichtet),
10 bb) der OD von Descarboxy-Prothrombin (Kavitaten mit anti- Descarboxy-Prothrombin mAK) und
cc) der OD von carboxylierten Prothrombin (OD Gesamt-PT - OD Descarboxy-PT)
bestimmt.
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Dann werden Eichkurven aus den gemessenen OD-Werten (siehe Fig. 1-3: Punkte A,B,C und D) der Kalibrierplasmen erstellt und der INR der Patientenplasmen berechnet.
2010A.ntx:
TTO'd 9T50# IK S S Y O • ' O NI - * * Q T€T6 + + 91 = 91 666T.QXW"»T
(61 UOA Zl e\\*S) 09609U€L600/22 eOXVd:SAN UOA Q£lP9i :JN SOXVd 91-91 66*80*n ujn)BQ
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10 Patentanspruche
1. verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungs- status mit folgenden Schritten:
a) Entnahme von Korperflussigkeit, die ein durch eine Vitamin-K abhangige y-Carboxylase rnodifizierbares Protein enthalt,
10 bl) Ermittlung einer ersten Xonzentration (CD an car- boxyliertem Prothrombin unter Verwendung eines ersten An- tikorpers (Al) und Ermittlung einer zweiten Kor.zentration
<C2) an decarboxyliertem Prothrombin unter Verwendung ei- nes zweiten Antikfcrpers (A2),
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c) Bildung eines ersten Quotienten (Ql) aus erster (CI) und zweiter Konzentration (C2) und
d) Korrelation des Quotienten (Q) mit dem Blutgerin- 20 nungsstatus.
2. Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungs- status mit folgenden Schritten:
2 5 a) Entnahme von Korperflussigkeit, die ein durch eine Vitamin-K abhangige y-Carboxylase modifizierbares Protein
enthalt,
b2) Ermittlung einer Gesamtkonzentration (C3) an car- 3 0 boxyliertem und decarboxyliertem Prothrombin unter Ver- wendung eines dritten Antik6rpers (A3) und Ermittlung ei- ner zweiten Konzentration (C2) an decarboxyliertem Pro- thrombin unter Verwendung eines zweiten Antikorpers <A2),
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ZIO'd 9I3C# 996C2T T€T6 6*^ + 51:91 666!.SHY"?!
(61 UOA £i eiias) 09609U€L600/22"89XVd:SAN UOA 8ei^9l '^H eDXVd Sl'Sl 66 80 PI LunjBQ
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cl) Srrechnung einer ersten Konzentration (CI) an car- boxyliertem Prothrombin gemaS folgender Be2iehung:
C3 - C2 = Cl
und Bildung eines ersten Quotienten (Ql) aus erster (Cl) und 2weiter Konzentraticn (C2)
oder
c2) Bildung eines zweiten Quotienten (Q2) aus dritter (C3) und erster Konzentration {CD und
d) Korrelation des ersten bzw. zweiten Quotienten (Ql, 15 Q2) mat dem Blutgerinnungsstatus.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Korperflus- sigkeit Plasma, Blut, Speichel, Urin Oder dgl. ist.
2 0 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprttche, wobei die Bestimmung der ersten (Cl) , zweiten <C2) und/oder dritten Kon2entration (C3) mittels eines enzym- oder fluoreszenz-immunologischen Verfahrens erfolgt.
25 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprtiche, wobei als enzym-imirxunologisches Verfahren 2LISA oder Strip- Assay verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, wobei 30 die erste (Cl), zweite (C2) und/oder dritte Konzentration (C3) und/oder der erste bzw. zweite Quotient (Ql, Q2) mittels einer Farbreaktion oder Fluoreszenzdetektion er- mittelt wird.
3 5 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, wobei durch eine Vitamin-K abh&ngige Y~Carbo:*ylase ntodifizier- 20i
€T0"d ST9C# >£SKSrtfO-A-£)NI-">£C 996091 iei5 5$^ + 91 = 51 666T.SnV*T
(61 UOA n ^!®S) 09609ue1600/32 eSOCVzTSAN UOA Q£iP9l :JN £S>XVd QL'SL 66'80'n tunjea
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bare Protein Prothrombin, Nephrocalcin Oder Osteocalcin ist.
8. Kit zur Durchftihrung des Verfahrens nach einem der vor- 5 hergehenden Anspriiche, wobei zur enzym-immunologischen Bestirnmung einer ersten Konzentration (CI) der carboxy- lierten Form des Proteins ein erster Antikorper (Al) ent- halten ist.
9. Kit nach Anspruch 7, wobei zur Bestimmung einer zweiten Konzentration (C2) der decarboxylierten Form des Protei- nes ein zweiter Antik6rper (A2) enthalten ist.
10. Kit nach einem der Anspruche 7 oder 8, wobei zur Bestim- 15 mung einer Gesamtkonzentration (C3) an carboxyliertem und decarboxyliertem Protein ein dritter AntikSrper (A3) ent- halten ist.
11. Kit nach einem der Anspriiche 7 bis 9, wobei der erste 2 0 (11) und der zweite Antikorper (12) jeweils auf einem se-
paraten Feld eines Teststreifen aufgenommen sind.
12. Kit nach einem der Anspruche 7 bis 10, wobei der dritte AntikSrper (A3) auf einem Feld eines weiteren Teststrei- 2 5 fens aufgenommen ist.
13. Kit nach einem der Anspruche 7 bis 11, wobei jeweils ein zum ersten (Al) und zweiten AntikSrper (A2) korrespondie- rendes Anti-Protein-Enzym-Konjugat oder ein Anti-Protein- 30 Fluoreszenz-Farbstoff-Konjugat enthalten ist-
14. Kit nach einem der Anspruche 7 bis 12, wobei ein zuin dritten Antikorper (A3) korrespondierendes Anti-Protein- Enzym-Konjugat oder ein Anti-Protein-Fluoreszenz- 35 Farbstoff-Konjugat enthalten ist.
2010A.DOC
{61 UOA gi B\\BS) 09609Uei600/2^ eOXVd-SAN UOA Q£iPQi :JN €9XVd 91-91 66'80'n UJnjBQ
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15. Kit nach einern der Anspruche 8 bis 14, wobei das Protein Prothrombin, Nephrocalcin Oder Osteocalcin ist.
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2010A.tX»C
STO'c STSC* SVO"A'ONI- ■ HQ 226091 ICT6 6t + + Ll-ST 666T.snV"*T
(61 U0A9L 9^S)09609Liei600/22'?9Xyd:SAN UOA 8€l^9t :JN SOXVd 9l'9l 66WK tunjeQ
14 Zusaircmenfassung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur indirekten Bestim- mung des physiologischen Blutparameters xnit folgenden Schrit- 5 ten;
a) Bntnahme von Prothrombin en thai tender Korperf Ittssigkei t, bl) Ermittlung einer ersten Konzentration an carboxyliertem 10 Protein unter verwendung eines ersten AntikSrpers und Ermittlung einer zweiten Konzentration an decarboxylier- tem Protein unter Verwendung eines sweiten Antikdrpers, c) Bildung eines ersten Quotienten aus erster und zweiter 15 Konzentration und
d) Korrelation des Quotienten mit dem physiologischen Blut- parameter.
20I0A.DOC 9T0"c 9T90#
(6L UOA n anas) 096091-tet600/23'eOXyd:SAN UOA 8eLfr9t :-"N £9XVd SL:9l 66'80>l uinjea
Korrelation INR mit Ratio cPT/dcPT 3 i — 2.5 -
INR
Fig. 1
LXO'd STS0# 99609T TtT6 5* + + 61 = 91 666t.snVM
(61 UOA 81 9«aS) 09609L L£l600/Z3'€9XVd:SAN UOA 8etfr9l :JN £9XVd 91-91 66*80>l aimed __ _
(Correlation INR mit Ratio dcPT/cPT 5.5 i
Fig. 2
8T0'<a 9TSC# fZMSSVO ONI- 'h'G 936091 TCT6 6* + + 81 : 9T 666!iSnY"H
.* (6L UOA 6U eji.es) 09609Uf:L600/22 e9XV=|:SAN UOA 8Sl.fr9L :JN eSXVd 9l.:SL 66'80>L tuniea A 5
Korrelatlon INR mlt dcPT 0,55 -i
Fig. 3
610'd 9T5C# HZtf£SYD'>;'ONI-*>£G I€T6 S!^ + S!:ST 666I*^nV?T
