HLA-Polymorphismus und Assoziationen mit der Dilatativen Kardiomyopathie, der Inflammatorischen Kardiomyopathie und der Myokarditis

Aus dem medizinischen Zentrum für Innere Medizin

Aus der Klinik für Innere Medizin-SP Kardiologie, Direktor: Prof. Dr. B. Maisch

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum

Giessen und Marburg GmbH, Standort Marburg

HLA-DQB1 Polymorphismus und Assoziationen mit der Dilatativen

Kardiomyopathie, der Inflammatorischen Dilatativen Kardiomyopathie

und der Myokarditis

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin

dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Sabine Ella Margaret Kreilinger aus Chicago

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 25.06.2009

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. med. Matthias Rothmund

Referent: Prof. Dr. med. Bernhard Maisch

Inhaltsverzeichnis ... I

Abkürzungsverzeichnis... VI

Abbildungsverzeichnis ...VIII

Tabellenverzeichnis ... IX

1. Einleitung... 1

1.1. Definition und Klassifikation der Kardiomyopathien ... 1

1.2. Die Dilatative Kardiomyopathie... 5

1.2.1. Defintion und Ätiologie der DCM ... 5

1.2.2. Klinik und Diagnose der DCM ... 8

1.2.3. Klinischer Verlauf und Prognose der DCM... 11

1.2.4. Therapie der DCM... 12

1.3. Die Myokarditis ... 13

1.3.1. Definition und Ätiologie der Myokarditis ... 13

1.3.2. Klinik und Diagnose der Myokarditis ... 14

1.3.3. Verlauf und Prognose der Myokarditis ... 17

1.3.4. Therapie der Myokarditis ... 19

1.4. Die Inflammatorische Dilatative Kardiomyopathie ... 19

1.5. HLA... 20

1.5.1. HLA-Genkomplex – Aufbau und Funktion ... 20

1.5.2. HLA-Klassen ... 21

1.5.3. HLA-Polymorphismus... 22

1.6. DCM – End- oder Folgestadium der Myokarditis ... 24

1.6.1. Auto-Antikörper vermittelte Myokarditis... 24

1.6.2. HLA-Assoziation... 25

1.6.3. Erhöhte Prävalenz anderer Autoimmunerkrankungen.... 26

1.6.4. Tiermodelle ... 26

1.6.4.1. Die Persistierende Virus-Myokarditis ... 27

1.6.4.2. Die Virus-getriggerte Autoimmunmyokarditis ... 28

1.6.4.3. Die nicht-Virus-getriggerte Autoimmunmyokarditis . 28 2. Fragestellung und Ziel der Arbeit... 30

3. Material und Methoden ... 31

3.1. Studiendesign und Patientengruppen... 31

3.2. Definitionen und klinische Verlaufskontrolle ... 31

3.3. Immunohistochemische und molekularbiologische Analyse von Endomyokardbiopsien und Blutproben ... 33

3.4. Material... 34

3.4.1. Chemikalien ... 34

3.4.2. Reagenzgefäße... 34

3.4.3. Material zur DNA-Extraktion... 34

3.4.4. Geräte ... 35

3.4.5. Probenpuffer ... 35

3.4.6. Elektrophoresepuffer ... 36

3.5. Molekularbiologische Methoden ... 36

3.5.1. DNA–Extraktion... 36

3.5.2. DNA-Integrität ... 37

3.5.3. DNA-Quantifizierung ... 37

3.5.4. Agarose-Gel-Elektrophorese... 38

3.5.5. Amplifikation von DNA mittels Polymerasekettenreaktion 39 3.5.6. DQB1*SSP-Typisierung - Testprinzip... 40

3.5.6.1. DQB1* SSP Typisierung (low resolution) ... 40

3.5.6.2. DQB1*03 SSP-Subtypisierung ... 42

3.5.6.3. DQB1* 06 SSP-Subtypisierung ... 43

3.5.7. Software HELMBERG-SCORE (Fa. Genovision)... 50

3.6. Statistische Methoden ... 50

4. Ergebnisse... 51

5. Diskussion ... 61

5.1. Diskussion der Methode ... 61

5.2. Diskussion der Ergebnisse ... 61

5.2.1. Auswahl der Patienten und Kontrollen ... 62

5.2.2. HLA DQB1 Allele und Herzerkrankungen ... 63

5.2.3. HLA-DQB1 Allele und bekannte Assoziationen mit anderen (Autoimmun-) Erkrankungen ... 66

5.2.4. Pathophysiologische Schlussfolgerung ... 67

6. Zusammenfassung ... 69

6.1. Conclusion ... 70

Literaturverzeichnis... 71

Anhang X

Verzeichnis der akademischen Lehrer... XIV

Abkürzungsverzeichnis

ACE Angitoensin Converting Enzyme

AHA American Heart Association

bp Basenpaare Cl Koinfidenzintervall CK Kreatinkinase CK-MB Kreatinkinase (Myokardtyp) CRT Kardiale Resynchronisationstherapie DCM Dilatative Kardiomyopathie

DCMI inflammatorische Dilatative Kardiomyopathie

DNA Desoxyribonukleinsäure

EBV Ebstein Barr Virus

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EF Ejektionsfraktion

EMB Endomyokardiale Biopsie

HIV Humanes Immundefizienz-Virus

HLA Humane Leukozytenantigene

HSV Herpes simplex Virus

ICD Implantierbarer Kardioverter-Defibrillator

kd Kilodalton

KHK Koronare Herzkrankheit

LVEF Linksventrikuläre Ejektionsfraktion

LVEDD Linksventrikulärer Enddiastolischer Durchmesser

OR Odds Ratio p P-Wert pc korrigierter P-Wert pf Phänotyp-Frequenz PCR Polymerasekettenreaktion RNA Ribonukleinsäure SD Standard Deviation

SSP Sequence Specific Primer

Taq Thermophilus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA

WHF World Health Federation

WHO World Health Organization

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Primäre Kardiomyopathien, bei welchen klinisch relevante Krankheitsprozesse primär das Myokard betreffen (nach Maron et al., 2006)... 4

Abb. 2: Zusammenfassung der ESC Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases: Klassifikation der Kardiomyopathien (nach Elliott et al.,2008)... 5

Abb. 3: Echokardiogramm eines normal grossen, gesunden Herzens und eines Herzens mit DCM ... 9

Abb. 4: Thorax-Röntgenaufnahme mit DCM ... 10

Abb. 5: Histopathologisches Bild einer EMB bei Myokarditis (HE-Färbung, 250x) ... 17

Abb. 6: Beispiel eines Ergebnisprotokolls für DQB1* SSP-Typisierung (low resolution) ... 45

Abb. 7: Beispiel eines Ergebnisprotokolls für DQB1*03 SSP-Subtypisierung ... 47

Abb. 8: Beispiel eines Ergebnisprotokolls für DQB1*06 SSP-Subtypisierung) ... 49

Tabellenverzeichnis

Tab.1: Ursachen der spezifischen Kardiomyopathien... 3

Tab.2: Ursachen der DCM (nach Felker et al., 2000) ... 6

Tab.3: Übersicht der chromosomalen Loci und Krankheitsgene bei DCM als dominierenden Phänotyp (aus Schönberger et al., 2004)... 7

Tab.4: Klinische mit Histo-Pathologischer Klassifikation (Dallas Kriterien 1987 (nach Aretz, 1987) / ISFC-Klassifikation 1998) ... 16

Tab.5: Master-Mix für PCR ... 41

Tab.6: PCR-Ansatz DQ Low Resolution ... 41

Tab.7: PCR-Zyklen ... 41

Tab.8: PCR-Ansatz für DQB1 Subtypisierung... 42

Tab.9: Spezifität und Grösse der PCR Produkte der 8 Primer Ansätze für die DQ low resolution SSP Typisierung (Olerup SSP DQ low resolution Protokoll, 2004) ... 44

Tab.10: Olerup SSP DQB1*03 Protokoll, 2005 ... 46

Tab.11: Olerup SSP DQB1*06 Protokoll, 2004 ... 48

Tab.12: Klinische Charakteristika von Patienten und Kontrollen... 55

Tab.13: Phänotyp-Frequenz (pf) von HLA-DQB1 Allelen bei Patienten mit DCM, DCMI und Myokarditis im Vergleich zur Kontrollgruppe (n=44) ... 56

Tab.14: Phänotyp-Frequenz (pf) von HLA-DQB1 Allelen bei Patienten mit DCM, DCMI und Myokarditis im Vergleich zur Populationskontrolle (n=6350) ... 57

Tab.15: HLA-DQB1-Allel Kombinationen bei Patienten und Kontrollen ... 58

Tab.16: Phänotyp-Frequenz (pf) von HLA-DQB1 Allelen bei Patienten ohne (Kontrollen) und mit (DCMI und Myokarditis) Zeichen einer Entzündung in Endomyokardbiopsien... 58

Tab.17: Phänotyp Frequenz (pf) von HLA-DQB1 Allelen bei Patienten mit Nachweis einer Entzündung in Endomyokardbiopsien und normaler (Myokarditis) oder reduzierter (DCMI) Ejektionsfraktion ... 59

Tab.18: Phänotyp Frequenz (pf) von HLA-DQB1 bei Patienten mit reduzierter Ejektionsfraktion und mit (DCMI) oder ohne (DCM) Entzündung in Endomyokardbiopsien ... 59

Tab.19: Klinische Charakteristika der Patienten mit DCM und DCMI und Präsenz oder Abwesenheit von HLA-DQB1*0301 oder HLA-DQB1*0602 ... 60

Tab.20: Assoziation zwischen DQB1 Allel und echokardiographischen Daten bei DCM and DCMI Patienten ... 60

1. Einleitung

1.1.

Definition und Klassifikation der

Kardiomyo-pathien

Die Kardiomyopathien repräsentieren eine Gruppe von Herzmuskeler-krankungen (Abelmann, 1984). Im Jahre 1980 definierte die World Health Organization (WHO) die Kardiomyopathien als „ Herzmuskeler-krankung mit unbekannter Ätiologie “ um die Kardiomyopathie von der kardialen Dysfunktion mit bekannter Ätiologie, wie arterieller Hyperten-sion, koronarer Herzerkrankung oder valvulärer Erkrankungen abzu-grenzen (Report, 1980).

1995 erweiterte die WHO/International Society and Federation of Car-diology ( ISFC ) Task Force die Definition und Klassifikation der Kar– diomyopathien und schloss all diejenigen Krankheiten ein, die eine di-rekte Beteiligung des Herzmuskels, unter Berücksichtigung von Ätio– logie und Pathophysiologie aufweisen (Richardson et al., 1996). In die-ser Klassifikation von 1995 wurden die Kardiomyopathien als „ Herz-muskelerkrankungen mit kardialer Dysfunktion“ definiert. Anhand anatomischer und physiologischer Charakteristika werden fünf Typen unterschieden.

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM), welche durch eine ventrikuläre Dilatation und systolische kontraktile Dysfunktion einer oder beider Ventrikel charakterisiert ist, tritt am häufigsten auf (Dec et al., 1994).

Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) weist eine linksventrikuläre Hypertrophie auf, die häufig auch das interventrikuläre Septum asym-metrisch miteinbezieht und damit zu einer diastolischen Dehnbarkeit– störung des Herzmuskels führt. Die kontraktile Funktion kann bis zum Endstadium der Erkrankung jedoch noch erhalten sein (Braunwald et al., 2002).

Die restriktive Kardiomyopathie (RCM), welche selten in westlichen Ländern auftritt, weist eine inadäquate diastolische Füllung bei normaler

Myokarddicke und in manchen Fällen auch eine endokardiale Narben-bildung des Ventrikels auf (Kushwaha et al., 1997).

Die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVCM) tritt seltener auf und ist durch ventrikuläre Arrhythmien und eine spezifische Pathologie des rechten Ventrikels, nämlich eine lipomatöse Degenera-tion und DilataDegenera-tion, gekennzeichnet (Gemayel et al., 2001; Corrado et al., 2000).

Unter den Nichtklassifizierbaren Kardiomyopathien (NKCM) versteht man eine Sammlung verschiedener Störungen, die nicht in die zuvor erwähnten Kategorien passen (Richardson et al., 1996), wie zum Bei-spiel die endokardiale Fibroelastose und linksventrikuläre ‚Noncompac-tion’.

Von diesen primären Kardiomyopathien sind spezifische Kardiomyo-pathien abzugrenzen, d.h. Herzmuskelerkrankungen, die mit einer spezifischen kardialen oder systemischen Grunderkrankung einherge-hen. Dazu zählen die ischämische, valvuläre, hypertensive, inflammato-rische (akute und chronische Myokarditis), metabolische, toxische und die familiäre Kardiomyopathie.

Infiltrativ

Speicher-krankheiten Toxizität Endomyokardial Inflammatorisch

Amyloidose Hämochroma-tose Drogen Endomyokardiale Fibrose Sarkoidose M. Gaucher M. Fabry Schwer-metalle Löfflersche Endokarditis lymphozytäre / autoreaktive

Endokrin Neuromuskulär Autoimmun Mangelzustände Medikamente Diabetes mellitus Friedreich`s Ataxie Systemischer Lupus Erythematodes Beriberi Anthrazykline: Doxorubicin Hyper– thyreose Duchenne-Becker- Muskuläre Dystrophie Rheumatoide Arthritis Pellagra Cyclophos– phamid

Tab.1: Ursachen der spezifischen Kardiomyopathien

2006 schlug die American Heart Association (AHA) eine neue Definition und Klassifikation der Kardiomyopathien vor (Maron et al., 2006): „ Car-diomyopathies are a heterogeneous group of diseases of the myocar-dium associated with mechanical and/or electrical dysfunction that usually exhibit inappropriate ventricular hypertrophy or dilatation and are due to a variety of causes that frequently are genetic. Cardio– myopathies either are confined to the heart or are a part of generalized systemic disorders, often leading to cardiovascular death or progressive heart failure-related disability.”

Diese Definition erkennt Widersprüche in früheren Klassifikationen und bietet eine neue genetische und molekulare Perspektive. Nun werden z.B. auch Ionen-Kanal Erkrankungen als primäre Kardiomyopathien anerkannt trotz Abwesenheit einer makroskopischen strukturellen Anomalie.

Abb. 1: Primäre Kardiomyopathien, bei welchen klinisch relevante Krankheitsprozesse primär das Myokard betreffen (nach Maron et al., 2006)

Die European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases vertritt im Gegensatz zur American Heart Associa-tion die Ansicht, dass ein klinisch orientiertes KlassifikaAssocia-tionssystem, in der Herzmuskelerkrankungen anhand ihrer ventrikulären Morphologie und Funktion gruppiert werden, zur Diagnose und Behandlung von Pa-tienten und ihren Familien mit Herzmuskelerkrankungen von grösserem klinischen Nutzen ist. Die Kardiomyopathien werden als myokardiale Erkrankungen, in welchen der Herzmuskel strukturell und funktionell abnormal ist und zugleich KHK, Hypertension, valvuläre und kongenita-le Herzerkrankung ausgeschlossen werden können, definiert (Elliott et al., 2008).

Cardiomyopathies

HCM DCM ARVC RCM Unclassified

Familiär / Genetisch Nichtfamiliär / Nichtgenetisch

Unbekannter Erkrankungs- Idiopathisch Erkrankungs-

Gen-Defekt Subtyp Subtyp

Abb. 2: Zusammenfassung der ESC Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases: Klassifikation der Kardiomyopathien (nach Elliott et al.,2008)

Eine einheitliche, allgemein anerkannte Klassifikation steht also bislang nicht zur Verfügung. Die hier vorgestellte Arbeit wurde im Jahr 2005 konzipiert. Die Definitionen beziehen sich auf die WHO-Klassifikation von 1996 und werden durch die neuen Klassifikationen nicht beeinflußt.

1.2.

Die Dilatative Kardiomyopathie

1.2.1. Defintion und Ätiologie der DCM

Der dilatativen Herzmuskelerkankung mit vergrößertem Ventrikel und eingeschränkter Pumpfunktion können eine ganze Anzahl an möglichen Ursachen zugrunde liegen (Tabelle 2).

Besonders interessant ist die Untersuchung von Felker et al. (2000), die bei 1230 Patienten Ursache und Langzeitüberleben einer zunächst nicht erklärbaren dilatativen Herzmuskelerkrankung zum Inhalt hatte. In 50 Prozent der Fälle konnte die wahrscheinliche Ursache aufgedeckt werden, in weiteren 50 Prozent blieb die Ursache jedoch unbekannt (idiopathische DCM).

Tab.2: Ursachen der DCM (nach Felker et al., 2000)

Innerhalb der Gruppe der idiopathischen DCM findet sich in bis zu 50% der Fälle eine familiäre Häufung der Erkrankung (familiäre DCM), die durch grössere epidemiologische Studien belegt werden konnte (Grünig et al., 1998, Mestroni et al., 1999).

Genetische Untersuchungen konnten Genmutationen in verschiedenen Genen identifizieren, weiterführende tierexperimentelle Untersuchungen und Untersuchungen am Zellkulturmodell belegen einen Zusammen-hang mit den in Tabelle 3 beschriebenen Genmutationen und dem Phänotyp DCM. Ursache Anteil Idiopathisch 50 % Myokarditis 9 % Ischämische Herzerkrankung 7 % Infiltrative Erkrankungen 5 % Peripartale Kardiomyopathie 4 % Hypertension 4 % HIV Infektion 4 % Bindegewebserkrankungen 3 % Substanzmissbrauch 3 % Doxorubicin 1 % Andere 10 %

Locus

Vererbungs-muster Zusätzlicher Phänotyp Krankheitsgen

Allelische Erkran-kungen

1q32 AD Nicht vorhanden Kardiales Troponin HCM

1q32 AD Nicht vorhanden ?

2q31 AD Nicht vorhanden Titin TMD, HCM?

5q33-34 AD Nicht vorhanden -Sarcoglycan LGMD2F

6q12-16 AD Nicht vorhanden ?

6q22.1 AD Nicht vorhanden Phospholamban

9q13-22 AD Nicht vorhanden ?

11p15.1 AD Nicht vorhanden Kard. Muskel-LIM-Protein HCM 14q11 AD Nicht vorhanden Kard.schwere -Myosinkette HCM 15q14 AD Nicht vorhanden Kardiales Aktin HCM 15q22.1 AD Nicht vorhanden -Tropomyosin HCM

10q21-23 AD Mitralprolaps ?

10q21-23 AD Nicht vorhanden Metavinculin

1p1-q21 AD Reizleitungsstörung Lamin A/C EDMD, FLPD, MAD, CMT2B1, HGPS 2q14-q22 AD Reizleitungsstörung ?

3q22-25 AD Reizleitungsstörung ? 6q23 AD Reizleitungsstörung und

Skelettmyopathie ?

2q35 AD Skelettmyopathie Desmin Desminmyopathie

6q23-24 AD Sensoneuraler Hörver-_lust Eyes absent-4 Sensoneuraler Hör-_verlust 18q12 AD LVNC und VSD -Dystrobrevin

17q21 AR RV Dyspl. und wollige

Haare und Keratodermie Desmoplakin

Xp21 X Skelettmyopathie Dystrophin ARVD, KPPS, SFWHS

Xq28 X LVNC Tafazzin EFE, Kleinwuchs und

Neutropenie AD-autosomal dominant, AR-autosomal rezessiv, LVNC-linksventrikuläre Noncompaction, HCM-hypertrophische Kardiomyopathie, TMD-tibiale muskuläre Dystrophie, LGMD2F-limb-girdle muscular dystrophy Typ 2F, EDMD-Emery Dreifuss Muskeldystrophie, FLPD-familiäre Lipodystrophie Typ Dunnigan, CMT2B1-Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2B1, MAD-mandibuloakrale Dysplasie, HGPS-Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom, ARVD-arrythmogene rechtsventrikuläre Dysplasie, KPPS-Keratosis palmoplanta-ris striata, SFWHS-skin-fragility wooly hair syndrome, RV-Dyspl.-rechtsventrikuläre Dysplasie, EFE-endokardiale Fibroelastose

Tab.3: Übersicht der chromosomalen Loci und Krankheitsgene bei DCM als dominierenden Phänotyp (aus Schönberger et al., 2004)

Da die Erkrankung in der Regel einen langsam schleichenden Verlauf nimmt, ist der Kliniker oft mit dem narbigen Endstadium der Erkrankung konfrontiert, die eigentliche Ursache also nicht mehr zu eruieren.

1.2.2. Klinik und Diagnose der DCM

Die Inzidenz der idiopathischen DCM liegt relativ hoch bei 5-8 Fällen pro 100000 Einwohner pro Jahr und scheint auch weiterhin anzusteigen und die Prävalenz bei 36 pro 100000 (Dec et al., 1994). Meist sind Männer mittleren Alters, 20-60 Jahre, von der DCM betroffen und die Symptome präsentieren sich normalerweise schleichend (Dec et al, 1994). Einige der Patienten bleiben lange asymptomatisch, obwohl sie schon seit Monaten oder Jahren eine ventrikuläre Dilatation haben. Patienten mit manifester DCM repräsentieren eine heterogene Gruppe mit einer grossen Anzahl verschiedener klinischer Symptome (Abelmann et al., 1989, Dec et al., 1994). Meist sind es Symptome der Herzinsuffizienz, wie zum Beispiel die progrediente Linksherzinsuffi-zienz mit Belastungsdyspnoe, und späterer GlobalinsuffiLinksherzinsuffi-zienz und da-mit verbundener Leistungsminderung. Das Rechtsherzversagen ist ein spätes Zeichen und mit einer schlechteren Prognose assoziiert.

Als Komplikationen hervorzuheben sind arterielle und pulmonale Embo-lien infolge kardialer Thrombenbildung, Arrhythmien und der plötzliche Herztod (Abelmann et al, 1989).

Die Diagnose wird vor allem anhand von klinischen Parametern und unter Ausschluss von bekannten Ursachen gestellt. Bei der körper– lichen Untersuchung ist ein Pulsus alternans nicht ungewöhnlich, vor allem wenn ein Linksherzversagen besteht. Eine Cheyne-Stokes At-mung kann vorhanden sein und ist mit einer schlechten Prognose as-soziiert. Falls auch das rechte Herz betroffen ist, kann eine Stauung der Jugularvenen und der Leber sowie Aszites und periphere Ödeme die Folge sein. Bei der Auskultation ist oft ein Systolikum über der Mitralklappe zu hören, welches durch eine Mitralklappeninsuffizienz bedingt ist.

Nicht invasive Untersuchungen

Das EKG kann atriale und/oder ventrikuläre Arrhythmien, P-Wellen-, ST-Strecken- und T-Wellen Abnormalitäten zeigen. Eine schwache R-Progression sowie intraventrikuläre Überleitungsdefekte, vor allem der Linksschenkelblock, sind häufig.

Bei der Echokardiographie benutzt man zwei-dimensionale- und Dopp-leruntersuchungen, um den Grad der Schädigung der linksventrikulären Funktion abzuschätzen und um eine valvuläre oder perikardiale Erkran-kung auszuschliessen. Man untersucht standardmässig alle vier Herz-klappen, die Ventrikelgrösse und die Dicke des Myokards und kann damit strukturelle oder funktionelle Schädigungen diagnostizieren. Mit-hilfe des Dopplers ist z.B. die Schwere einer Mitralinsuffizienz zu beur-teilen. DCM Patienten zeigen eine Dilatation einer oder beider Ventrikel und Dysfunktion sowie eine abnormale diastolische Mitralklappenbewe-gung aufgrund der abnormalen Compliance. Ausserdem besteht eine Hypokinesie, also eine verminderte Bewegungsamplitude der Ventri-kelwand bei Einschränkung der systolischen Einwärtsbewegung. Die Ejektionsfraktion ist typischerweise vermindert. Selten werden Throm-ben im Ventrikel oder Vorhof nachgewiesen (Pinamonti 2000).

Abb. 3: Echokardiogramm eines normal grossen, gesunden Herzens und eines Herzens mit DCM

Im Thorax-Röntgenbild sind eine Vergrösserung vor allem des linken Herzens und Zeichen der pulmonalen Hypertonie zu erkennen.

Abb. 4: Thorax-Röntgenaufnahme mit DCM

Serologische Untersuchungen umfassen insbesondere Blutbild, Elekto-lyte, Enzyme, Kreatinin und Harnstoff. Auch Schilddrüsenwerte und Ei-sen werden untersucht, sowie gezielt die Serologie kardiotroper Erre-ger, wie HIV (siehe Tabelle. 1).

Invasive Untersuchungen

Bei der Durchführung der Linksherzkatheteruntersuchung mit Koronar-angiographie wird ein flexibler Katheter meist über die Femoralarterie eingeführt und bis in den linken Ventrikel vorgeschoben. Diese Unter-suchung dient dem Ausschluss einer koronaren Herzerkrankung. Zu-sätzlich können mittels Laevokardiographie eine Dysfunktion der Vent-rikel und Klappenvitien diagnostiziert werden. Füllungsdrücke, der linksventrikuläre enddiastolische Druck und der pulmonalkapilläre Wed-ge Druck (PCWP), letzterer per Rechtsherzkatheter, sowie die Ejekti-onsfraktion werden ermittelt und damit das Ausmaß der Einschränkung der Ventrikelfunktion beurteilt ebenso wie die Herzklappenfunktion. Über den transarteriellen oder transvenösen Zugang können rechts- oder/und linksventrikuläre Endomyokardbiopsien zur histopathologi-schen Untersuchung aber auch für den Nachweis von mikrobieller DNA oder RNA entnommen werden.

Histopathologisch finden sich in der Regel strukturelle, aber unspezifi-sche Veränderungen wie z. B. sich weit erstreckende Areale mit intersti-tieller und perivaskulärer Fibrose, die vor allem das linksventrikuläre Subendokard betreffen, eine Herzmuskelhypertophie, nukleäre und mi-tochondriale Abnormitäten (Rose et al., 1985).

1.2.3. Klinischer Verlauf und Prognose der DCM

Der klinische Verlauf der DCM ist beim individuellen Patienten nicht immer vorhersehbar und auch vom zugrunde liegenden pathogeneti-schen Prozess abhängig.

Die Prognose ist von dem Grad der Herzinsuffizienz, der Auswurfsfrak-tion und der diastolischen Füllungscharakteristik des linken Ventrikels abhängig. Fortgeschrittenes Alter, komplexe ventrikuläre Arryhthmien, postdiastolischer Gallop (S3) und eine überschiessende Sympathikus-Stimulation spielen eine wichtige Rolle (Sun et al., 1997).

Auch das Belastungs-EKG vermag prognostische Informationen zu lie-fern. Hohe linksventrikuläre Füllungsdrucke, eine verminderte Ejekti-onsfraktion, das Ausmaß der linksventrikulären Dilatation, eine vermin-derte linksventrikuläre Myokardmasse, eine schwere Mitralklappeninsuffizienz, eine abnormale diastolische und / oder systolische Funktion, aber auch eine Dilatation oder Dysfunktion des rechten Herzens haben eine ungünstige Prognose. Die 10-Jahres-Überlebensrate der DCM beträgt 10-30% und die jährliche Letalität 10%. Somit stellt die DCM eine prognostisch äusserst ungünstige Erkrankung dar. Todesursachen umfassen die progrediente Herzinsuffizienz und der plötzliche Herztod infolge ventrikulärer Herzrhythmusstörungen.

1.2.4. Therapie der DCM

Eine spezifische Therapie der idiopathischen DCM ist nicht möglich, da deren Ursache unbekannt ist. Die Behandlung besteht aus einer Thera-pie der Herzinsuffizienz mit körperlicher Schonung, insbesondere bei akuter Dekompensation, sowie Einschränkung der Flüssigkeitszufuhr. Die medikamentöse Therapie soll den überschiessenden Kompensati-onsmechansimen des Organismus entgegenwirken und besteht aus ACE-Hemmer, AT I-Antagonisten, Beta-Blocker und Diuretika. Die Thromboembolieprophylaxe mittels Antikoagulanzien sollte bei einer Ejektionsfraktion < 30% angestrebt werden. In Betracht gezogen wer-den können auch ein automatischer implantierbarer Cardioverter (AICD) bei lebensbedrohlichen ventrikulären Arrhythmien und ein CRT-System für eine kardiale Resynchronisationstherapie. (Maisch et al., 2002b).

1.3.

Die Myokarditis

1.3.1. Definition und Ätiologie der Myokarditis

Die Myokarditis ist eine entzündliche Herzmuskelerkrankung, die in un-terschiedlichem Umfang die Myozyten, das interstitielle und perivas– kuläre Bindegewebe sowie die Herzgefässe betreffen kann (O`Connell, 1998).

Die Myokarditis teilt man in eine infektiöse und nicht-infektiöse Myo– karditis ein.

Die infektiöse Myokarditis wird in der Regel durch Viren ausgelöst. Die verbreiteste Form in Europa und der USA ist die Virusmyokarditis. Vor allem Parvovirus B 19 sind für diese Form verantwortlich. Ferner kom-men Enteroviren - Coxsackie B1-B5 aber auch Coxsackie A, Herpesvi-ren (Herpes simplex, Cytomegalievirus, Ebstein-Barr-Virus, Humanes Herpesvirus-6), Influenzaviren, Adenoviren, Echoviren und HIV-Viren in Frage. Ausserdem können Bakterien, wie Staphylokokken, betahämo-lysierende Streptokokken der Gruppe A, Borrelia burgdorferi und ande-re eine Myokarditis hervorrufen. Pilze, Protozoen und Parasiten müssen auch in Betracht gezogen werden (Pankuweit et al., 2003, Maisch et al., 2007, Bowles et al, 2003).

Die nicht-infektiöse Myokarditis ist eine myokardiale Entzündung, die autoreaktiver Natur sein kann, aber auch im Rahmen von Autoimmun-erkrankungen, wie systemischem Lupus erythematodes und Wege-ner’scher Granulomatose auftreten kann. Medikamente, wie Clozapin oder Drogen, wie Kokain, Chemikalien oder Bestrahlung des Mediasti-nums können ebenfalls zu dieser Form führen (Maisch et al, 2007, Mo-der et al., 1999, Pfizenmaier et al., 2004).

1.3.2. Klinik und Diagnose der Myokarditis

Das klinische Erscheinungsbild der Myokarditis kann sehr vielgestaltig sein und reicht vom asymptomatischen oder milden Verlauf, welches die Mehrzahl der Fälle betrifft, bis hin zum fulminanten Verlauf mit tödli-chem Ausgang (Maisch et al, 2002; Lieberman et al., 1991).

Populationsbasierte, epidemiologische Untersuchungen, die in der Lage wären, initiale Symptome der Myokarditis zu definieren, existieren nicht, unter anderem weil es keinen sicheren und sensitiven nicht-invasiven Test für die Diagnose Myokarditis gibt.

Symptome einer Myokarditis sind recht unspezifisch und können Abge-schlagenheit, Dyspnoe, Schmerzen über der Brust und Palpitationen umfassen. Die Myokarditis kann Beschwerden eines Myokardinfarktes imitieren. Eine Beteiligung des Herzbeutels führt zu thorakalen Be-schwerden, die typischerweise im Liegen verstärkt sind. Herzrhythmus-störungen werden häufig beklagt. Dazu gehört die Sinustachykardie, aber auch Palpitationen als Folge (supra-) ventrikulärer Extrasystolen (Maisch 2006).

Nicht invasive Untersuchungen

Routine-Laboruntersuchungen sind in der Regel unauffällig oder zeigen nur milde unspezifische Veränderungen. Troponin T/I und seltener CK/CK-MB können erhöht sein und sind Folge von Herzmuskelunter-gang. Auto-Antikörper gegen Myolemm (AMA), Sarkolemm (ASA) Typ IgM, anti-Myosin Typ IgM, mitochondriale und endotheliale Antigene und Komplementfaktor C3 sind möglicherweise nachweisbar.

Das EKG kann normal sein, unspezifische EKG-Veränderungen können aber auftreten, wie zum Beispiel eine Sinustachykardie, Arrhythmien – vor allem Extrasystolen, ST-Senkungen und T-Negativierungen und ventrikuläre oder atriale Überleitungsstörungen.

Das RöntgenThoraxbild zeigt in ausgeprägten Fällen bei Herzinsuffi-zienz eine Vergrösserung des Herzens oder auch Zeichen einer Lun-genstauung, ist aber in der Regel unauffällig.

Die Echokardiographie dient dazu, eine Einschränkung der linksventri-kulären Pumpfunktion mit Dilatation des einzelnen Ventrikels nachzu-weisen neben einer möglichen Beteiligung des Herzbeutels mit Perikar-derguß.

In letzter Zeit wird das MRT (Maisch et al, 2006), das myokardiales Ö-dem und Myozytenschädigung infolge einer Myokarditis zeigen kann, häufiger zur Diagnostik herangezogen:

a. Ödem kann mittels T2 turbo-spin-echo Sequenzen mit Fettsup-pression detektiert werden.

b. T1-gewichtete „steady-state-free-precession“ (SSFP) Sequen-zen vor, während und unmittelbar nach Applikation von 0.1 mmol Gadolinium-Diethylentriaminpentazetat (DTPA) kann Ei-weiß-Verlust über Kapillaren nachweisen.

c. T1gewichtete Sequenzen 1012 Minuten nach Magnevist® -Applikation kann „late enhancement“ aufzeigen: Ist das myo-kardiale Interstitium durch Ödem oder Fibrose vergrößert erfolgt der Abtransport des Gadoliniums später als in gesundem Myo-kard – und resultiert so in „late enhancement“.

Invasive Untersuchungen

Um eine sichere Diagnose der Myokarditis stellen zu können bedarf es einer endomyokardialen Biopsie (Mason, 1978). Sie gilt als Gold-Standard. Durch die fokale Natur der Myokarditis ist die Sensitivität die-ser Methode eingeschränkt und bedarf mehrerer Probenentnahmen. Mittels Immunhistochemie werden die Quantität, Distribution und vor-herrschender Zell-Typ entzündlicher Infiltrate und der Grad der

Schädi-gung von benachbarten Myozyten beurteilt (Aretz, 1987). Zusätzliche Studien wie „Common Leukocyte Antigen Staining“ oder die Identifikati-on vIdentifikati-on hochregulierten MHC Molekülen und vIdentifikati-on Antikörpern gegen die Myozytenmembran können durchgeführt werden (Ansari et al., 1991). MHC-Klasse I Moleküle sind in den meisten kernhaltigen Zellen enthal-ten, MHC-Klasse II Moleküle jedoch nur in immunologischen Zellen.

Diagnose

Konventionelle Histologie

(Dallas Kriterien 1987)

Histologische und Immun- histologische Kriterien (ISFC-Klassifikation 1998) 1. Aktive/akute Myokarditis Infiltrat, Myozytolyse, Ödem 1.bis 3. identisch: Infiltrat, charakterisiert mit monoklonalen Antikörpern, Immunglobulin- und Komple-mentfixation.

Inobligat: De-novo-Expression von HLA-Antigenen der Klasse I und II und Adhäsionsmolekülen 2. Fortbestehende

Myokarditis

Siehe 1., aber in Folgebi-opsie bei Verlaufsbeobach-tung

3. Abheilende Myokarditis

Rückläufiges Infiltrat, fakul-tative Myozytolyse, repara-tive Fibrose

4. Borderline Myokarditis

Eingestreute seltene Lym-phozyten ohne Myozytolyse

Grenzbefund zur Myokarditis bei 1-13 Lymphozyten/mm³ 5. Chronische Myokarditis, dilatative Kardi-omyopathie mit Inflammation

Nicht definiert 14 Lymphozyten ( + Makropha-gen) /mm³, fakultativer immun-histologischer Nachweis von viraler RNA oder DNA

Tab.4: Klinische mit Histo-Pathologischer Klassifikation (Dallas Krite-rien 1987 (nach Aretz, 1987) / ISFC-Klassifikation 1998)

Abb. 5: Histopathologisches Bild einer EMB bei Myokarditis (HE-Färbung, 250x)

1.3.3. Verlauf und Prognose der Myokarditis

Der natürliche Verlauf der Myokarditis in großen Bevölkerungsgruppen ist nicht bekannt, da es keinen nicht-invasiven diagnostischen Test gibt, der die Diagnose bestätigen könnte. Aber es kann doch gesagt werden, dass der natürliche Verlauf der Myokarditis abhängt von Ursache und klinischer Präsentation: so legen sero-epidemiologische Untersuchun-gen nahe, dass z.B. die Coxsackievirus-assoziierte Myokarditis in der Regel subklinisch verlaufen und einen gutartigen Verlauf nehmen. Pati-enten, bei denen EKG-Veränderungen eine entzündliche Herzmuskel-erkrankung im Rahmen eines Virusinfektes vermuten lassen, bleiben in der Regel ebenfalls asymptomatisch und die EKG-Veränderungen nor-malisieren sich. Nur selten entwickeln diese Patienten Zeichen einer Herzinsuffizienz, schwere Herzrhythmusstörungen, AV-Überleitungs-störungen bis hin zum Tod im globalen Herzversagen.

Liebermann et al. (1991) haben anhand des klinischen Verlaufs, der linksventrikulären Funktion und dem Ergebnis der Endomyokardbiospie das klinische Spektrum der Myokarditis versucht zu charakterisieren (Liebermann et al., 1991, Maisch et al., 2006).

Von 348 Patienten, bei denen zur Abklärung einer linksventrikulären Funktionseinschränkung Endomyokardbiopsien entnommen wurden, zeigten anhand der Dallas-Kriterien 60 Patienten eine akute oder Bor-derline-Myokarditis. Von diesen fand sich bei 25 Patienten eine spezifi-sche Ursache, 35 Patienten wurden weiter untersucht und werden im Weiteren vorgestellt.

Die fulminante Myokarditis weist in der Anamnese einen genauen Zeit-punkt des Beginns der Erkrankung auf und präsentiert sich mit einer schweren linksventrikulären Dysfunktion häufig in Verbindung mit einem kardiogenen Schock. Die Biopsien zeigen eine eindeutige multifokale Myokarditis. Diese Patienten erholen sich entweder komplett oder ster-ben innerhalb von zwei Wochen.

Bei der akuten Myokarditis gaben die 26 betroffenen Patienten keinen eindeutigen Beginn der Krankheit an und stellten sich meist mit einer milden Dilatation und mässiger Dysfunktion vor. In den Biopsien fand sich eine akute oder Borderline-Myokarditis, die im Laufe der Zeit nicht mehr nachzuweisen ist. Diese akute Form kann entweder in eine in-komplette Remission oder in eine dilatative Kardiomyopathie überge-hen.

Die chronisch aktive Myokarditis (drei Patienten) ähnelte der subakuten Form hinsichtlich ihres Beginns und der Beeinträchtigung der Myokard-funktion. Die Biopsien zeigten eine akute oder Borderline-Myokarditis. Im Verlauf persistierten die entzündlichen Veränderungen, hinzu kamen fibrotische Umbauprozesse. Echokardiographisch zeigt sich im Verlauf ein leicht dilatierter Ventrikel mit ausgeprägten Zeichen der systolischen Dysfunktion.

Bei der chronisch persistierenden Form (zwei Patienten) berichteten die Patienten unspezifische Herzbeschwerden. Die linksventrikuläre Pump-funktion war nicht pathologisch verändert. Die Biopsie zeigte jedoch eine aktive oder Borderline Myokarditis, die auch im Verlauf

nachzuwei-sen war. Bei beiden Patienten blieb die linksventrikuläre Pumpfunktion trotz Nachweis entzündlicher Infiltrate unverändert normal.

1.3.4. Therapie der Myokarditis

Die Behandlung umfasst symptomatische Maßnahmen wie körperliche Schonung und bei Entwicklung einer Herzinsuffizienz eine Herz– insuffizienz-Therapie mit Diuretika, ACE-Hemmern und Betablockern. Ultima ratio ist die Herztransplantation bei terminaler Herzinsuffizienz.

Im Rahmen von Studien werden immunsuppressive und antivirale Therapieregime erprobt. Eine endgültige Bewertung ist derzeit noch nicht möglich (Heim et al., 1997, Maisch et al., 1995, Maisch et al., 2000, Maisch et al., 2004, und Pauschinger et al.,2004).

1.4.

Die Inflammatorische Dilatative

Kardiomyo-pathie

Die Inflammatorische DCM gehört in die Gruppe der spezifischen Kar-diomyopathien und wurde 1995 von der WHO und der WHF als „ Myo-karditis in Assoziation mit kardialer Dysfunktion“ eingeführt. In der Echokardiographie zeigt sich eine linksventrikuläre Dilatation mit redu-zierter Ejektionsfraktion. In der Myokardbiopsie finden sich histologi-sche Befunde wie bei der fulminanten, subakuten und chronisch aktiven Myokarditis wieder – in der Literatur werden inflammatorische DCM und Myokarditis häufig synonym verwandt (s.a. vorangegangenes Kapitel 1.3.3).

In der hier vorgelegten Arbeit bedeutet Myokarditis entzündliche Herzerkrankung noch ohne wesentliche Einschränkung der linksventri-kulären Pumpfunktion (entsprechend der akuten Virusmyokarditis oder chronisch persisterenden Myokarditis des vorangegangenen Kapitels) und unterscheidet sich damit von der inflammatorischen DCM, bei der

die entzündliche Herzerkrankung mit einer Einschränkung der links-ventrikulären Pumpfunktion einhergeht (entsprechend der chronisch aktiven Myokarditis oder der subakuten Myokarditis des Kapitels 1.3.3) (Maisch et al., 2000 und 2005).

1.5.

HLA

1.5.1. HLA-Genkomplex – Aufbau und Funktion

Humane Leukozytenantigene (Synonyme: MHC-AG, Haupthisto-kompatibilitäts-AG, Transplantations-AG) sind in der Zellmembran ver-ankerte Glykoproteine, die zu den Immunglobulinen gehören. Die MHC-Moleküle nehmen durch ihre Funktion der Antigenpräsentation eine wichtige Rolle in der Erkennung und Unterscheidung zwischen körper-eigenen und körperfremden Strukturen durch das Immunsystem ein (Guillet et al., 1986), sowie bei der Aktivierung spezifischer Abwehrme-chanismen, indem sie auch die Prägung des Immunsytems beeinflus-sen. Zur Auslösung einer antigenspezifischen Immunantwort ist die Ak-tivierung von antigenspezifischen T-Zellen nötig. Diese erkennen Prote-inantigene nur dann, wenn sie durch antigen–präsentierende Zellen prozessiert und als Proteinfragmente gebunden an den MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Dieses Phänomen bezeichnet man als MHC-Restriktion. Die Antigenerkennung wird durch einen Komplex vermittelt, der aus dem MHC-Molekül, dem daran ge-bundenen Antigen und dem Antigen erkennenden T-Lymphozytenrezeptor (TLR) besteht. Verschiedene MHC-Moleküle können eine bestimmte Anzahl von diversen Peptiden binden und damit das Repertoire an Antigenen bestimmen, welches den T-Lymphozyten angeboten wird. Somit findet noch vor der Erkennung durch den TLR eine Determinantenselektion statt (Babbitt et al., 1985 und Buus et al., 1987).

1.5.2. HLA-Klassen

Die Gene für den MHC sind auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert und umfassen den Bereich von etwa 3500 Kilobasenpaaren. In diesem Komplex kommen die HLA-Genloci (HLA-Klasse I und II) und die Genloci einer heterogenen Gruppe, die als HLA-Klasse III bezeich-net wird, vor. Die Gene der HLA-Klasse II liegen zentromerwärts, darauf folgt die Klasse III–Region und telomerwärts die Region der HLA-Klasse I (Waßmuth, 1995).

Die HLA-Klasse I Moleküle sind Heterodimere und bestehen aus einer transmembranär, an der Zellmembran verankerten schweren polymor-phen alpha-Kette, an die auf der extrazellulären Seite eine nicht poly-morphe beta2-Mikroglobulin-Kette angelagert ist. Der Genort für das beta2-Mikroglobulin liegt ausserhalb des MHC auf Chromosom 15. Der extrazelluläre Teil der alpha-Kette besitzt drei Domänen (alpha 1-3). Während die Aminosäuresequenz der Zellmembran nahe gelegenen alpha 3 Domäne recht konstant ist , weisen die alpha 1 und 2 Domäne hypervariable Regionen auf , die für den Polymorphismus der Klasse I Antigene verantwortlich und am Aufbau des Paratops (Bindungsstelle für antigene Peptide) beteiligt sind (Bjorkman et al., 1987a,b und Thorsby, 1987). HLA-Klasse I Moleküle werden in unterschiedlichem Maße auf allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten exprimiert. Zu ihnen gehören die Isotope HLA-A, HLA-B und HLA-C. Sie präsentieren Peptide an suppressorische und zytotoxische CD8 T-Lymphozyten.

HLA Klasse II Moleküle bilden Dimere aus nicht kovalent gebundenen Polypeptidketten, einer alpha und einer beta-Kette, die beide in der Zellmembran verankert sind. Mit einem Molekulargewicht von etwa 30kD besitzen sie jeweils zwei extrazellulär gelegene Domänen. Die N-terminalen Domänen alpha1 und beta1 weisen hypervariable Abschnitte auf, wie bei den MHC Klasse I Molekülen, die für den Poly-morphismus und die Bildung des Paratops (etwas grösser als bei MHC I) verantwortlich sind. Alpha2 und Beta2 Domänen, die der Zellmemb-ran nahe sind haben nur eine geringe Variabilität (Brown et al., 1993,

Thorsby, 1987). Zur MHC Klasse gehören die Isotypen HLA-DP, -DQ,-DR sowie DN und DO. MHC- Klasse II Moleküle finden sich nur auf phagozytierenden Zellen wieder, wie auf Zellen des Monozyten-Makrophagen-Sytems, B-Lymphozyten, dendritischen Zellen, Langer-hanszellen der Haut und aktivierten T-Lymphozyten (Daar et al., 1984, Forsum et al., 1987). Andere antigenpräsentierende Zellen wie Epithel und Endothelzellen können durch externe Stimuli zur Expression von HLA-Klasse II Molekülen angeregt werden (Cabrera et al., 1995, Cresswell, 1987).

MHC-Klasse II Moleküle präsentieren den CD4 T-Helfer-Zellen bzw. Inducer-Lymphozyten Peptide mit einer Länge von 13-25 Aminosäuren. Diese Peptide werden durch den Abbau von phagozytotisch aufge-nommenen Proteinen in Phagolysosomen gebildet und nach der Fusion mit Klasse II Moleküle enthaltenden Vesikeln an die MHC-Moleküle ge-bunden (Janeway et al., 1995).

Zu den MHC-Klasse III Molekülen gehören die Komplementfaktoren C2 und C4 sowie Bf. Im Gegensatz zu den anderen Klassen handelt es sich hierbei um Plasmaproteine, die an der unspezifischen Immunab-wehr beteiligt sind.

1.5.3. HLA-Polymorphismus

Diese grosse Variabilität des MHC wird einerseits durch die individuelle Diploidie und dem Vorhandensein mehrerer auf dem Chromosomen– abschnitt eng zusammen liegender Genloci, eines „Supergenes“, ande-rerseits vor allem durch einen ausgeprägten genetischen Polymorphis-mus (multiple Allele) der jeweiligen Loci bestimmt. Beschränkt ist diese jedoch auf die hypervariablen Regionen. Der Allel-Polymorphismus bleibt während der gesamten Lebenszeit eines Individuums unverän-dert. Die Gesamtheit der Allelausstattung an mehreren oder allen Ge-norten eines Chromosoms wird als HLA- Haplotyp bezeichnet.

Im Bereich der alpha-Kettengene der MHC-Klasse I Merkmale gibt es auf einem Chromosom je nur einen polymorphen Genlocus. Bei den HLA Klasse II Genen, die sich ja in die Regionen HLA-DR, -DQ und – DP mit je alpha und beta-Loci gliedern, gibt es nur innerhalb der HLA-DR Region für die alpha Kette einen nicht polymorphen Genort. Die HLA-DQ-Region enthält 5 Genorte. Es werden aber nur die beiden po-lymorphen Gene DQA1 und DQB1 exprimiert. Die Gene DQA2, DQB2 und DQB3 sind Pseudogene. Eine zusätzliche Besonderheit des HLA-Komplexes stellt die Existenz eines Kopplungsungleichgewichts ( linka-ge disequilibrium ) zwischen den Allelen unterschiedlicher Genorte ei-nes Haplotypes dar. Darunter versteht man das Abweichen der beo-bachteten Häufigkeit des Auftretens gemeinsam vererbter Allelkombina-tionen von einem Erwartungswert, der aus dem Produkt der Allelfre-quenzen berechnet werden kann. Die Differenz zwischen dem Beo-bachtungs- und Erwartungswert wird als Maß für das Kopplung-sungleichgewicht herangezogen und delta genannt. Es herrscht z.B. eine starkes Kopplungsungleichgewicht zwischen den HLA Merkmalen DR und DQ. Mechanismen, die zur Entstehung von diesen Ungleich-gewichten führen sind bisher noch unklar. Vermutet werden aber z.B. durch Pathogene verursachte selektive Mechanismen (Snell, 1968).

1.5.4. HLA-Nomenklatur

Bisher konnten serologisch 21 HLA-DR- und 9 HLA-DQ-Spezifitäten unterschieden werden (Bodmer et al., 1997).

Durch den Einsatz der PCR (Saiki et al., 1988) für molekulargenetische HLA-Typisierungstechniken wurde der Nachweis der einzelnen Allele auf der DNA–Ebene (Olerup et al., 1992) möglich. Die serologisch defi-nierten HLA-Antigene werden durch die Bezeichnung ihres Gen–ortes und die Nummer ihrer Spezifität benannt (z.B. HLA-A9). Die Bezeich-nung eines Allels setzt sich aus dem Namen des Genortes und einer Allelnummer, beides durch ein Sternchen getrennt, zusammen.

Die ersten beiden Ziffern der Allelnummer geben die Hauptgruppe, die nachfolgenden beiden Ziffern die Nebengruppe an (z.B. DQB1* 0301).

1.6.

DCM – End- oder Folgestadium der

Myokardi-tis

Wie bereits eingangs erwähnt, steht der Kliniker vor dem Problem, dass die DCM das narbige Endstadium einer wie auch immer gearteten My-okardschädigung darstellt. Die DCM ist also End- oder Folgestadium einer Erkrankung, welche durch diverse pathophysiologische Mecha-nismen hervorgerufen wird, wozu auch Myokarditis und DCMI gehören können.

Da virales Genom nur in etwa einem Drittel der Fälle im Myokardge– webe von betroffenen Patienten trotz sensitiver molekularbiologischer Verfahren nachgewiesen wird, wird zumindest für eine Subgruppe von DCM-Patienten eine autoimmunologische Genese angenommen.

Diese Autoimmunhypothese wird durch unterschiedliche Beobachtun-gen gestützt. Besonderes Gewicht traBeobachtun-gen hier tierexperimentelle Unter-suchungen, aber auch Beobachtungen bei betroffenen Patienten, wie im Folgenden dargestellt.

1.6.1. Auto-Antikörper vermittelte Myokarditis

Bei Patienten mit Myokarditis und DCM werden potentiell pathogene Autoantikörper, die gegen eine Reihe von zellulären Komponenten ge-richtet sind, nachgewiesen. Kardiales Myosin, der Beta-1 Adreno– rezeptor, der Adenin Nukleotid Translokator, Laminin repräsentieren solche Autoantigene (Maisch et al, 1993, Maisch et al., 2002a, Panku-weit et al., 1997, Portig et al., 1997). Die Pathogenese der anti-kardialen Antikörper beginnt wahrscheinlich mit der direkten virus-induzierten Myozytenschädigung und der damit verbundenen

Freiset-zung von intrazellulären Proteinen. Die freien Antigene werden als fremd erkannt und es folgt eine autoimmune Phase der Erkrankung. B-Zellen differenzieren sich und produzieren Antikörper gegen Myosin und andere kardiale Proteine. CD4-positive T-Zellen rufen eine Myozy-tenschädigung durch Stimulation der B-Zellen, zytotoxischer Zytokine und zytotoxischer CD8-positiver T-Zellen hervor. Die Präsenz von anti-kardialen Autoantikörpern vermag die Entwicklung von DCM oder links-ventrikulärer Dysfunktion in Verwandten von Patienten mit DCM anzu-deuten (Caforio et al., 2007).

1.6.2. HLA-Assoziation

Bei Patienten mit DCM konnten eine Assoziation zwischen HLA-Klasse II Allelen, insbesondere HLA-DR4, und dem Auftreten der Erkrankung aufgezeigt werden; in einem Fall auch für die Myokarditis (McKenna et al., 1997). Andere Studien fanden keine HLA-DR4 Assoziation (Bilinska et al., 2002, Grant et al., 1994, Lozano et al., 1997, McKenna et al., 1997). 1997 berichtete McKenna, dass HLA-DR4 bei DCM Patienten im Vergleich mit gesunden Blutspendern zwar nicht häufiger nachzu– weisen war, jedoch wurde HLA-DR4 öfter bei Patienten mit familiärer DCM gefunden als bei sporadischer DCM.

Assoziationen von DCM mit HLA-DQA1 und HLA-DQB1 wurden erst-mals 1994 genauer unter die Lupe genommen (Limas et al., 1994a). Limas konnte zeigen, dass HLA-DQA1* 0101- DQB1* 0602 gehäuft bei Patienten mit DCM auftritt, in deren Serum Anti-ß-Rezeptor Antikörper nachzuweisen waren (Limas et al., 1994b).

Seither wurden Assoziationen mit HLA-DQB1 Allelen für japanische (DQB1*0503, DQB1*0301, DQB1* 0604)(Nishi et al.,1995), chinesische (DQB1*0303)(Liu et al., 2005), polnische (DQB1*02)(Bilinska et al., 2002), und US-amerikanische (DQB1*05 in Myokarditis, DQB1*0503 und/oder DQB1*0304 in DCM)(Lozano et al., 1997) DCM Patienten be-richtet.

1.6.3. Erhöhte Prävalenz anderer Autoimmunerkrankungen

Limas et al. konnten 2004 nachweisen, dass Autoimmunerkrankungen, wie der Diabetes mellitus Typ I, die Psoriasis, die Zöliakie oder Auto– immunthyreoitiden bei Angehörigen von Patienten mit DCM gehäuft zu beobachten waren.

1.6.4. Tiermodelle

Tiermodelle haben gezeigt, dass z.B. die Coxsackie B Virus-Myokarditis in drei Phasen abläuft. In der ersten Phase, nämlich Tag 0-3, wandern die Viren entweder über den Respirationstrakt oder Gastrointestinaltrakt ein und vermehren sich dort im lymphatischen Gewebe. Anschliessend gelangen sie über den Blutweg in die Zielorgane. Es besteht kurzzeitig eine Virämie. Das Virus dringt mithilfe von Korezeptoren und dem CAR (Coxsackie adenoviral receptor), der als Andockstelle dient, in die Myo-zyten ein. Im MyoMyo-zyten angelangt, fängt das Virus an zu replizieren und wird in den Nukleus weitergeleitet, wo es die Zellfunktionen beeinflus-sen kann und an der Zelloberfläche Myosin-ähnliche Epitope präbeeinflus-sentiert bzw. erneut weitere Zellen befällt. In den Tagen 3-14 geben dendriti-sche Zellen und Makrophagen, die im gesunden Myokard anwesend sind und für die initiale antigen-unabhängige Antwort verantwortlich sind, Cytokine, Interleukine, Proteasen, TNF (Tumor Nekrose Faktor) und Perforin ab. Ausserdem nehmen sie Fremd-Elemente, wie Viren, zur weiteren Aufarbeitung auf. Diese viralen Peptid-Fragmente oder exponierten myokardialen Membran-Antigene werden im Golgi-Apparat prozessiert und zur Zelloberfläche transportiert. Diese Epitope werden den T-Zellen in Zusammenarbeit mit dem Major–Histokompatibilitäts– komplex präsentiert. Die antigen-präsentierenden Zellen können dann zytotoxische Zellen stimulieren, die in der Lage sind, Herzmuskelzellen zu zerstören (Liu et al., 2001, Kawai et al., 1999).

In der Regel heilt die Coxsackie-Myokarditis aus. Selten kommt es ab dem 14. Tag zu einem Fortschreiten der Myokarditis, wie zum Beispiel bei Persistenz des Virus (Klingel et al., 1992), welches mithilfe der PCR nachweisbar ist oder durch Übergang in eine autoimmune Phase, die durch ein diffuses lymphozytäres Infiltrat, Nachweis von Antikörpern, die schwere Myosin-Ketten binden, und ohne Virusnachweis gekenn-zeichnet ist (Bachmaier et al., 1999, Neu et al., 1987 ).

1.6.4.1. Die Persistierende Virus-Myokarditis

Klingel et al. wiesen 1992 nach, dass es zur viralen Persistenz des Coxsackie B Virus in immunkompetenten Mäusen kommt. Mithilfe der PCR wurde enterovirale RNA sowohl im akuten Stadium der Myokardi-tis als auch während der chronischen Phase der DCM gezeigt. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die virale Persistenz mit einer myokar-dialen Dysfunktion einherging. Die Expression der Coxsackie Virus DNA undder Synthese der viralen RNA ohne Replizierbarkeit des infek-tiösen viralen Genoms führte zu typischen morphologischen Merkmalen der DCM beim Menschen (Wessely et al., 1998). Diese Überlegung wird auch durch serologische Untersuchungen, PCR und In-situ-Hybridisierung beim Menschen unterstützt (Keeling et al., 1994). In ei-ner Untersuchung, die 172 Patienten umfasste, wurde Virusgenom mit-hilfe der PCR nachgewiesen (in 32.6% fand sich Enterovirus RNA, in 8.1% Adenovirus DNA, in 36.6% parvovirus B19 DNA und in 10.5% humanes Herpesvirus Typ 6 (HHV6) DNA, in 12.2% der Proben fand sich sowohl Parvovirus B19 als auch HHV6). Bei etwa der Hälfte dieser Patienten kam es nach etwa sechs Monaten zu einer spontanen Elimi-nierung des Virus (virus-spezifische Clearance-Raten waren: 50% für Enterovirus, 35.7% für Adenovirus, 22.2% für Parvovirus B19 und 44.4% für HHV6. Bei den übrigen 50 % war eine persistierende virale Infektion mit begleitendem Abfall der linksventrikulären Ejektionsfraktion

(LVEF) im Vergleich zur vorherigen Gruppe nachweisbar (Kühl et al., 2005).

1.6.4.2. Die Virus-getriggerte Autoimmunmyokarditis

In weiteren Untersuchungen zur Coxsackie B Virus Infektion wurde im Tierexperiment eine persistierende Myokarditis trotz Abwesenheit des Virus in Kulturen und der PCR festgestellt (Rabausch-Starz et al., 1994). Obwohl die PCR eine Viruslast für längere Zeit als die Biopsie-kultur nachweisen kann, korrelierte die Persistenz des Virus nicht mit dem Ausmaß der andauernden Myokarditis und umgekehrt. Rabausch-Starz et al. zeigten, dass die meisten Mäuse mit einer fortdauernden Myokarditis (in der chronischen / Spätphase) kardiale Autoantikörper, v.a. gegen schwere Myosin-Ketten, produzierten (Neu et al., 1987, Ca-forio et al., 1996), was möglicherweise auf das Ergebnis der Gewebs-zerstörung, wie Myozytennekrose und Lymphozyteninfiltrate, zurückzu-führen ist. 1999 bekräftigten Bachmeier et al. diese Theorie, indem sie nachwiesen, wie schwere Myosin-Ketten alleine eine Myokarditis in ein-zelnen Mausstämmen induzieren konnte.

Coxsackie B Virusinfektionen könnten also zu einer lokalen Gewebs-schädigung mit darauffolgender (Auto-)Immunantwort führen (Neu et al., 1987, Penninger et al., 1996, Rose, 1996).

1.6.4.3. Die nicht-Virus-getriggerte Autoimmunmyokarditis

Obwohl kardiotrope Viren als Ursache der Myokarditis angenommen werden, war es in der Mehrzahl der Fälle nicht möglich virales Genom aus dem betroffenen Myokard zu isolieren. Die Ätiologie ist in diesen Fällen nicht bekannt (Feldman et al., 2000). Es wird daher vermutet, dass zumindest in einer Subgruppe von Patienten mit Myokarditis auto-immunologische Prozesse ursächlich beteiligt sind.

Tiermodelle lieferten einen direkten experimentellen Beweis, dass eine spontane Autoimmunmyokarditis in der Abwesenheit einer Infektion auftreten kann (Taylor et al., 2004).In dieser Studie wurde das MHC Klasse II Molekül HLA-DQ8 untersucht. Wie bei zahlreichen anderen Autoimmunerkrankungen ist das Auftreten eines Typ I Diabetes mit be-stimmten HLA-Typen assoziiert, beim Menschen mit Diabetes tritt der Haplotyp DQA1*0301/DQB1*0302 (DQ8) in 80% der Fälle auf. Der Haplotyp HLA-DQA1*0103/DQB1*0601 dagegen schützt vor dem Auf-treten eines Diabetes mellitus. In transgenen Mäusen, die den Haplotyp DQA1*0301/DQB1*0302 tragen, wird im Gegensatz dazu ein auto– immuner Diabetes provoziert. Diese Daten stellen somit den in vivo Beweis für einen diabetogenen Effekt des menschlichen MHC Klasse II Moleküls dar und sind somit ein einzigartiges Tiermodell für die Ent-wicklung eines spontanen Diabetes (Wen et al., 2000). Transgene Mäuse, die diese Haplotypen (DQA1*0301/DQB1*0302) tragen, bilden anders als vermutet nicht nur einen Diabetes sondern auch eine auto-immun–induzierte Myokarditis aus. Diese spontane Myokarditis weist deutliche Merkmale der beim Menschen beobachteten Myokarditis auf, wie lymphozytäre Infiltrate im Myokard, eine Myozytolyse, zirkulierende IgG-Autoantikörper gegen schwere Myosin-Ketten und einen frühzeiti-gen Tod durch Herzversafrühzeiti-gen.

2. Fragestellung und Ziel der Arbeit

Die akute Myokarditis heilt in der Regel aus. Sie kann aber durchaus von einem chronischen Stadium mit Übergang in ein narbiges Endsta-dium, der DCM, gefolgt sein, wie eine Anzahl experimenteller Hinweise belegen. Es ist möglich, durch Auswahl von Patienten mit Myokarditis mit und ohne Einschränkung der linksventrikulären Pumpfunktion bzw. von Patienten mit DCM die Bedeutung von HLA-DQB1 Allelen näher zu untersuchen. Als Kontrollgruppe sollen Patienten dienen, bei denen eine strukturelle Herzerkrankung ausgeschlossen werden kann.

Hierzu werden die HLA-DQB1 Allel-Frequenzen molekularbiologisch bei diesen vier Gruppen ermittelt und auf eine statistisch signifikante Ab-weichung hin miteinander verglichen. Ziel dieser Arbeit ist es, den Nachweis von gehäuft auftretenden Polymorphismen des HLA-DQB1 Gens innerhalb einer der drei Patientengruppen und zwei Kontrollgrup-pen (einer Populationskontrolle und einer Kontrollgruppe, bei der ent-zündliche und koronare Herzerkrankung ausgeschlossen waren) zu erbringen, um damit einen möglichen Erklärungsansatz für die unter-schiedliche Entwicklung der Myokarditis bezüglich der Herzinsuffizienz zu liefern.

3. Material und Methoden

3.1.

Studiendesign und Patientengruppen

In einer prospektiven Untersuchung wurden Patienten, die unsere Klinik zwischen November 2001 und August 2003 aufgrund des Verdachtes auf eine entzündliche Herzerkrankung aufsuchten, nach schriftlichem Einverständnis aufgenommen. Dieser Verdacht beruhte auf dem plötzli-chen Auftreten von kardialen Arrhythmien, undefinierbaren EKG-Veränderungen, reduzierter Belastungstoleranz oder atypischem Brust-schmerz. Unter strengen Einschlusskriterien wurden gemäss den WHO/ISFC-Kriterien (Richardson et al., 1996) 16 Patienten mit Myo-karditis, 19 Patienten mit DCMI und 22 Patienten mit DCM eingeschlos-sen. Als Kontrollgruppe dienen 44 Patienten, bei denen diagnostisch eine inflammatorische Herzerkrankung ausgeschlossen werden konnte und publizierte Daten einer Populationskontrolle mit 6350 gesunden, deutschen Stammzellspendern (Gjertson et al., 1998). Wir analysierten Patientenakten, Koronarangiographien, Lävographien und Endomyo-kardbiopsien dieser Patienten aller Gruppen. Unsere Untersuchung wurde im Einklang mit der Deklaration von Helsinki von der lokalen Ethikkomission gebilligt und stets das schriftliche Einverständnis von den Patienten zur Teilnahme an der Studie eingeholt.

3.2.

Definitionen und klinische Verlaufskontrolle

Für die Diagnose einer Myokarditis ohne Einschränkung der linksventri-kulären Pumpfunktion, einer inflammatorischen DCM oder DCM muss-ten nachfolgende Kriterien erfüllt sein.

Bei der (Inflammatorischen) DCM lag ein dilatierter linker Ventrikel mit einem linksventrikulären enddiastolischen Diameter > 117% des Vor-hersage Wertes (Mestroni et al., 1999), d.h. 2 SD + 5% über der Norm mit einer reduzierten Ejektionsfraktion von < 45% ohne Nachweis einer Herzerkrankung (Richardson et al.,1996) vor. Für eine DCMI war der

histologische Nachweis einer Myokarditis in der Endomyokardbiopsie Voraussetzung. Eine Myokarditis wurde histologisch diagnostiziert, wenn die Dallas Kriterien (Aretz, 1987) erfüllt waren und/oder durch immunhistochemische Untersuchungen, durch die infiltrierende Zellen charakterisiert werden (Klassifikation der World Heart Federation Coun-cil on Cardiomyopathies) (Maron et al., 2006 und Elliott et al., 2008), ergänzt wurden.

Desweiteren wurde in jedem einzelnen Fall das Vorhandensein mikro-biellen Genoms, wie z.B. Enterovirus, Ebstein-Barr-Virus, Zytomegalie-virus, Humanes Herpesvirus Typ 6, Adenoviren und Borrelia burgdorfe-ri, unter Zuhilfenahme von PCR und Southern Blot Untersuchung in Endomyokardbiopsien ausgeschlossen.

Eine Myokarditis ohne Dilatation des linken Ventrikels und ohne Ein-schränkung der linksventrikulären Pumpfunktion wurde bei Patienten mit (a-)typischen Brustschmerz, ST-Strecken-Veränderungen und erhöhtem Troponin I Spiegel, in Abwesenheit einer KHK, Herzklappen-erkrankungen, Kollagenspeicherkrankheiten und bei Nachweis von lympho-monozytischen Infiltraten in Endomyokardbiopsien diagnosti-ziert. Die klinische Verlaufskontrolle ließ eine vollständige Remission ohne Einschränkung der linksventrikulären Funktion im Verlauf von mindestens einem Jahr (11-29 Monate) erwarten.

Sporadische Formen entzündlicher Herzerkrankungen wurden bei allen Patienten durch die Erhebung einer detaillierten Anamnese diagnosti-ziert. In jedem Fall wurde eine Untersuchung von erstgradigen Ver-wandten angeboten und in vier Familien von DCM-Patienten vollzogen mit dem Ergebnis eine familiäre Häufung der Erkrankung ausschliessen zu können (Felker et al, 2000).

Das Vorkommen von Autoimmunerkrankungen, vor allem der Typ I Di-abetes mellitus, die Psoriasis, Schilddrüsenerkrankungen und die Zölia-kie wurde abgefragt, aber von allen Patienten verneint.

Die Kontrollen bestanden aus Patienten, deren echokardiographische und lävographische Untersuchungen eine normale Linksherzfunktion aufwiesen. Endomyokardbiopsien zeigten keine entzündlichen Infiltrate und keine Viruspersistenz. Alle Patienten hatten eine klinische Evalua-tion bei Verdacht auf das Vorliegen einer KHK erhalten, welche durch Koronarangiographie ausgeschlossen werden konnte. Die klinische Evaluation, Elektrokardiographie, das Langzeit-EKG, die Echokardio-graphie, die Koronarangiographie und die Lävokardiographie ergaben die Diagnose einer hypertensiven Herzkrankheit und/oder eines idio-pathischen (intermittierendes oder permanentes) Vorhofflimmerns.

3.3.

Immunohistochemische und molekularbiologische

Analyse von Endomyokardbiopsien und Blutproben

Die im Rahmen der Routinediagnostik gewonnenen formalin-fixierten Endomyokardbiopsien wurden in der Abteilung für Pathologie, Leiter Prof. Dr. Moll, und in der Abteilung für Pathologie des Universitätsklini-kums Aarhus, Leiter Prof. Dr. Bandrup, mittels konventioneller histo-pathologischer Färbung ausgewertet. Schockgefrorene Biopsien wur-den immunohistochemisch gefärbt (Pankuweit et al., 2000). Zusätzlich wurden die Biopsien einer PCR-Analyse und einer Southern Blot Unter-suchung, um mikrobielles Genom von Enterovirus, Ebstein-Barr-Virus, Zytomegalievirus, Humanes Herpesvirus Typ 6, Adenoviren und Borre-lia burgdorferi zu detektieren (Pankuweit et al, 2000). Ausserdem wur-den via „dideoxy fingerprinting“ DCM und DCMI Patienten bezüglich Kandidatengene (kardiales Aktin, Schwerketten, Myosin-Leichtketten, alpha-Tropomyosin , Troponin I und T, Lamin A/C, Delta-sakroglycan und Desmin) analysiert (Ruppert et al.,2004)

3.4.

Material

3.4.1. Chemikalien

Agarose p.a. Sigma-Aldrich Taufkirchen, Deutschland

Borsäure p.a. Pharmacia Uppsala, Schweden

Bromphenolblau p.a. Sigma Aldrich Taufkirchen, Deutschland

EDTA p.a. Roth Karlsruhe, Deutschland

Ethidiumbromid p.a. Sigma-Aldrich Taufkirchen, Deutschland

Saccharose p.a. Roth Karlsruhe, Deutschland

TRIS p.a. Roth Karlsruhe, Deutschland

DNA-Längenstandard VIII (0.019-1.11 kbp)

Roche Mannheim, Deutschland

DNA-Längenstandard XIV (100 bp)

Roche Mannheim, Deutschland

3.4.2. Reagenzgefäße

MicroAmp reaction tubes 0.2ml Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA

3.4.3. Material zur DNA-Extraktion

Qi-Amp DNA Blood Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland

Der Kit bietet eine einfache und schnelle Methode vollständige DNA für eine zuverlässige PCR zu reinigen. Die gereinigte DNA ist frei von Pro-teinen, Nukleasen und anderen Verunreinigungen und bewegt sich in

einer Grösse von bis zu 50kb, vor allem mit Fragmenten mit einer Län-ge von 20-30kb. Eine DNA dieser Grösse denaturiert während der thermischen Phase völlig und kann mit höchster Effizienz amplifiziert werden.

3.4.4. Geräte

Thermocycler Primus 96 MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland

Wärmeschrank Heraeus, Hanau, Deutschland

Stromquelle LKB GPS 200/400 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Elektrophoresekammer GNA 200 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Transilluminator 2011 Macrovue LKB

Minizentrifuge neoLAB, Heidelberg, Deutschland

Gene Quant-RNA/DNA Calculator Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

3.4.5. Probenpuffer

Bromphenolblau 0.25 mg

3.4.6. Elektrophoresepuffer

Tris 121 g

Borsäure 50 g

EDTA 37 mg ad 1l H2O, pH 7.4

3.4.7. Agarose-Gel

Je nach erwünschter Stärke des Gels wurden 3.75g (1.5 %ig) bis 7.5g (3%ig) Agarose in 250 ml Elektrophorese-Puffer unter Erwärmen gelöst. Nach dem Abkühlen wurden 3 µl Ehtidiumbromid zugesetzt. Dann wurde das Gel erneut gemischt und in die mit einem Kamm zur Ta-schenbildung bestückte Gelkammer ausgegossen (20x20 cm).

3.5.

Molekularbiologische Methoden

3.5.1. DNA–Extraktion

Die Amplifikation bestimmter DNA-Abschnitte mittels PCR setzt das Vorhandensein freier DNA-Stränge voraus. Für die DNA-Extraktion standen uns durch Ficoll-Gradient isolierte und gewaschene Lymphozy-ten zur Verfügung. Die LymphozyLymphozy-ten wurden lysiert und denaturiert, um anschließend die DNA zu extrahieren. Hierzu wurde das „Qi-Amp DNA-Blood Mini Kit“ verwendet. Die im Folgenden beschriebenen Schritte sind Empfehlungen der Firma Qiagen und wurden entsprechend durch-geführt:

Zunächst werden 200 µl Lymphozytenkonzentrat mit 20 µl Proteinase K Stamm Lösung sowie 200 µl AL-Puffer in ein Sammelgefäß pipettiert. Nach kurzem Durchmischen mit dem Vortexgerät folgte eine Inkubation für 10 Minuten bei 70° C. Nach Zugabe von 200 µl Ethanol (96%) und erneutem Mischen wurde die Probe in eine Filtersäule überführt, die mit einem Auffanggefäß kombiniert war. Es schloss sich eine 1-minütige

Zentrifugation bei 8000 U/min an und nach Auffangbehälterwechsel und Zugabe von 500 µl AW-1 Puffer wurde erneut 1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert. Der Zugabe von 500 µl AW-2 Puffer folgte eine 3-minütige Zentrifugation bei 13000 U/min. Zur Elution der DNA wurden anschlie-ßend nach Auffanggefäßwechsel 200 µl AE Puffer, die auf 70° C erhitzt worden waren, hinzugefügt und nochmals bei 8000 U/min zentrifugiert. Die DNA befand sich jetzt im Auffanggefäß. Zur Erfolgskontrolle wurden 10 µl Eluat mit 2 µl „loading buffer“ gemischt, auf ein 2%iges Agarose-gel aufgetragen und in der Elektrophoresekammer aufgetrennt.

Für die HLA-DQB1 low- und high resolution Typisierungsreaktion mit der sequenz-spezifischen Primer SSP-PCR Technik (Genovision, Wien, Austria) (Olerup et al., 1992), werden 600ng DNA eingesetzt (DNA-Quantifizierung, s.u.). Bei der DQ Typisierung(smethode) wurden nur die DQB1 Allele amplifiziert, die DQB2 und DQB3 Gene blieben unbeeinflusst.

3.5.2. DNA-Integrität

Es wurde die DNA–Integrität der gewonnenen DNA Proben randomi-siert kontrolliert. Dazu stellte man ein 0.8 prozentiges Agarosegel her: 0.96 g Agarose wurden zu 120 ml 1×TBE Puffer hinzugegeben und in der Mikrowelle gekocht. Nach etwas Abkühlen wurden 20 µl Ethidi-umbromid hinzugegeben. Als Laufpuffer diente 1×TBE Puffer. Jeweils 5 µl der DNA Proben wurden zusammen mit je 4 µl Loading Puffer in die Taschen des Gels pipettiert. Nach der Elektrophorese bei 70 Volt für 30 Minuten war die Auswertung unter dem UV-Licht möglich.

3.5.3. DNA-Quantifizierung

Um die DNA zu quantifizieren, erfolgte eine 1:5 Verdünnung. 20µl DNA wurden zu 80µl DNAse freies Wasser gegeben. Diese 100µl wurden in eine Küvette überführt und im Gerät „Pharmacia-Gene

Quant-RNA/DNA Calculator“ analysiert. Die Extinktion der Proben wurde bei 260nm und 280nm bestimmt. Nun war es möglich, die Konzentration der Proben mithilfe des Lambert-Beer´schen Gesetzes zu berechnen:

E = x c x d

Extinktion = Extinktionskoeffizient x Konzentration der absorbierenden Substanz x Länge des Lichtes im Material

3.5.4. Agarose-Gel-Elektrophorese

Bei einem pH-Wert von 7.5 sind DNA-Moleküle insgesamt negativ ge-laden und bewegen sich bei einer angelegten elektrischen Spannung zur Kathode.

Die Agarosegelelektrophorese gilt als die Standardmethode zur Tren-nung, Identifizierung und Reinigung von DNA-Molekülen. Die Wander-ungsgeschwindigkeit der DNA im Agarosegel ist abhängig von dem Mo-lekulargewicht und der Konformation der DNA, von der Agarosekon-zentration, d.h. der Porengröße des Gels, und von der elektrischen Spannung im Gel. Innerhalb eines gewissen Bereichs ist die Wander-ungsgeschwindigkeit linear doppelsträngiger DNA umgekehrt proporti-onal zum Logarithmus des Molekulargewichts. Das Molekulargewicht eines DNA-Fragments unbekannter Größe kann daher aus seiner Wanderstrecke bestimmt werden, indem neben der unbekannten DNA-Probe ein Längenstandard elektrophoretisch aufgetragen wird. Als Län-genstandard diente ein 100 bp-Marker. Für die Gelelektrophorese wur-den je nach zu erwartender DNA-Fragmentlänge horizontale Gele mit Agarosekonzentrationen von 1.5 bis 3% verwendet. Zur Herstellung des Gels wurde die Agarose durch Aufkochen in 1xTBE-Puffer gelöst. Nach dem Abkühlen und Ausklaren der Lösung auf ca. 60 °C wurde Ethidiumbromid (5 µl/ 100ml Gel) hinzugefügt und mit dem Rührer sus-pendiert. Daraufhin wurde die Lösung in das Gelbett gegossen. Nach Erstarren des Gels wurde es in der Gelkammer in 1x TBE-Puffer