Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Einfluss von aktivem Lebensstil und physischer Aktivität auf die
adulte hippokampale Neurogenese und spatiale Kognition unter
physiologischen und pathologischen Bedingungen im Mausmodell.
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Deetje Margarethe Iggena
aus Jever
3 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ... 5 Abstract (deutsch) ... 8 Abstract (englisch) ... 9 1. Einleitung ... 10
2. Methodik und Material ... 11
2.1. Tiere ... 11 2.2. Studiendesign ... 12 2.2.1. TV-Studie ... 12 2.2.2. Jetlag-Studie ... 12 2.2.3. Sport-Diät-Studie ... 13 2.2.4. Sport-MPTP-Studie ... 14
2.3. Gewebevor- und aufbereitung ... 14
2.3.1. 5´-Bromo-2´-desoxy-Uridin Injektion ... 14
2.3.2. Gewebeextraktion und -zuschnitt ... 16
2.4. Histologie ... 16 2.4.1. Immunhistochemie ... 16 2.4.2. Immunofluoreszenz ... 17 2.5. Molekularbiologie ... 17 2.5.1. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion ... 17 2.5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ... 18 2.5.3. Enzymatisches Immunadsorptionsverfahren ... 18 2.6. Verhaltenstests ... 18 2.6.1. Rotarod ... 18 2.6.2. Morris-Wasserlabyrinth ... 18
2.7. Statistische Analyse und Darstellung ... 19
4 3.1. TV-Studie ... 19 3.2. Jetlag-Studie ... 21 3.3. Sport-Diät-Studie ... 22 3.4. Sport-MPTP-Studie ... 23 4. Diskussion ... 25 4.1. Schlussfolgerung ... 27 5. Referenzen ... 28 Eidesstaatliche Versicherung ... 32
Anteilserklärung an den ausgewählten Publikationen ... 33
Druckexemplare der ausgewählten Publikationen ... 35
Lebenslauf ... 79
Komplette Publikationsliste ... 81
5 Abkürzungsverzeichnis µm Mikrometer µl Mikroliter Abb Abbildung ANOVA Varianzanalyse,
engl.: Analysis of variance,
BDNF Vom Gehirn stammender Wachstumsfaktor,
engl.: Brain-derived neurotrophic factor
BrdU 5´-Bromo-2`desoxy-Uridin
C Celsius
CD Kontrolldiät
CD-R Gruppe mit Kontrolldiät und Laufrad
CD-S Gruppe mit Kontrolldiät ohne Laufrad
cm Zentimeter
CTR Kontrollgruppe
CTR-R Kontrollgruppe mit Laufrad
CTR-S Kontrollgruppe ohne Laufrad
DCX Doublecortin
DG Gyrus Dentatus
DIC Differentialinterferenzkontrast
DNA Desoxyribonukleinsäure
DIR Gruppe, die mit reizreicher Umgebung direkt interagiert
DOPAC 3,4-Dihydroxyphenylessig
engl.: 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid
drD1a Dopaminrezeptor D1a
drD2 Dopaminrezeptor D2
drD5 Dopaminrezeptor D5
ELISA Enzymatisches Immunadsorptionsverfahren,
engl.: Enzyme-linked immunosorbent assay
engl Englisch
ENR Käfige mit einer reizreichen Umgebung,
engl.: environmental enrichment
6
g Gramm
Gapdh Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GFAP Saures Gliafaserprotein,
engl.: glial fibrillary acid protein
GFP Grün fluoreszierendes Protein
h Stunden
H2O2 Wasserstoffperoxid
HCl Chlorwasserstoff
HFD Hochkalorische Ernährung,
engl.: High-fat diet
HFD-R Gruppe mit hochkalorischer Ernährung und Laufrad
HFD-S Gruppe mit hochkalorischer Ernährung ohne Laufrad
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie,
engl.: high performance liquid chromatography
HVA Homovanillinsäure
IND Gruppe, die mit reizreicher Umgebung indirekt interagiert
i.p. intraperitoneale Applikation
IPS Idiopathisches Parkinsonsyndrom
JL Jetlag
JL-CTR Gruppe mit Jetlag
JL-ENR Gruppe mit Jetlag in reizreicher Umgebung
JL-Mel Gruppe mit Jetlag und Melatonin-Gabe
Kcal Kilokalorien
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
LAGeSo Landesamt für Gesundheit und Soziales
LT Langzeit, engl.: Long-term m Meter mg Milligramm mm Millimeter mM Millimolar MPTP 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin
7
MPTP-S Mit MPTP behandelte Gruppe ohne Laufrad
mRNA Boten-Ribonukleinsäure
MWM Morris-Wasserlabyrinth,
engl.: Morris water maze
N Größe der Grundgesamtheit
NaCl Kochsalzlösung
NaN3 Natriumazid
NiCl2 Nickelchlorid
NPCs Neurale proliferierende Zellen
NSCs Neurale pluripotente Stammzellen
p Signifikanzwert
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung,
engl.: phosphat buffered saline
PFA Paraformaldehyd
p.o. per os
qPCR quantitative Polymerase-Kettenreaktion,
engl.: quantitative polymerase chain reaction
s Sekunden
SEM Standardfehler des Mittelwertes
SGZ Subgranuläre Zone
SN Substantia Nigra
ST Kurzzeit,
engl.: short-term
Upm Umdrehungen pro Minute
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Abstract (deutsch)
Einleitung: Neurodegenerative Erkrankungen und das Altern gehen mit neuronalen Verlusten und
kognitiven Defiziten einher. Häufig betroffen sind der Hippokampus und die hippokampus-abhängige spatiale Kognition. Die gezielte Steigerung der im Hippokampus lokalisierten adulten Neurogenese bietet die Perspektive, neurodegenerativen Prozessen durch den Aufbau einer neurogenen Reserve entgegenzuwirken. In dieser Arbeit evaluieren wir in vier Mausmodellen das pro-neurogene und -kognitive Potenzial von Lebensstilinterventionen auf die hippokampale Neurogenese und die spatiale Kognition unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Methodik: Zum einen untersuchten wir ob die alleinige Wahrnehmung einer reizreichen
Umgebung ausreichend ist, um als pro-neurogener und -kognitiver Lebensstil zu wirken. Zum anderen verglichen wir die Wirkung einer reizreichen Umgebung mit dem Therapeutikum Melatonin in einem Modell zirkadianer Dysrhythmie. Den Einfluss physischer Aktivität als einzelne Komponente eines aktiven Lebensstils untersuchten wir zum einen im Mausmodell einer hochkalorischen Ernährung und zum anderen im Dopamindepletionsmodell. Zur Beurteilung der hippokampalen Neurogenese verwendeten wir die BrdU-Inkorporationsmethode und quantifizierten sowie phänotypisierten immunhistologisch die BrdU+-Zellen. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Polymerasekettenreaktion nutzten wir zur Evaluation des Dopaminstoffwechsels und im ELISA bestimmten wir Neurotrophine. Die Motorik der Tiere testeten wir im Rotarod und die spatiale Kognition im Morris-Wasserlabyrinth.
Ergebnisse: Wir stellten fest, dass nur ein aktiver Lebensstil mit direkter Interaktion mit einer reizreichen Umgebung – und nicht die alleinige Wahrnehmung dieser – ausreichend ist, um pro-neurogen und pro-kognitiv zu wirken. Ein aktiver Lebensstil wirkte zwar ebenfalls unter zirkadianer Dysrhythmie pro-neurogen und konnte eine defizitäre neuronale Regeneration ausgleichen, jedoch konnte nur Melatonin zusätzlich die kognitiven Folgen kompensieren. Physische Aktivität, die simultan zu einer hochkalorischen Ernährung begonnen wurde, kann den negativen Folgen der Diät auf die spatiale Kognition durch Förderung der adulten hippokampalen Neurogenese ohne Modulation durch BDNF vorbeugen. Ähnlich positiv wirkte physische Aktivität im Dopamindepletionsmodell, indem die negativen Folgen der Dopamindepletion auf die hippokampale Neurogenese und die spatiale Kognition reduziert wurden und der pathologisch gesteigerte Dopaminumsatz wieder herunterreguliert wurde.
Schlussfolgerung: Diese Arbeit zeigt, dass ein aktiver Lebensstil und physische Aktivität die hippokampale Neurogenese und spatiale Kognition sowohl unter physiologischen, als auch unter pathologischen Bedingungen positiv beeinflussen. Dabei haben sie jedoch nicht immer das Potenzial neuronale und kognitive Defizite vollständig zu kompensieren.
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Abstract (English)
Introduction: Neurodegenerative diseases and aging come along with neuronal loss and cognitive
decline. The hippocampus and the hippocampus-dependent spatial cognition are commonly affected. The specific promotion of adult neurogenesis, localized in the hippocampus, offers the perspective to generate a neurogenic reserve for preventing neurodegenerative processes. In this thesis, we evaluate the pro-neurogenic and -cognitive potential of lifestyle interventions on hippocampal neurogenesis and spatial cognition under physiological und pathological conditions in four different mouse models.
Methods: First, we investigated if the mere perception of an enriched environment is sufficient to
act as a pro-neurogenic and -cognitive lifestyle. Second, we compared the effects of the lifestyle intervention environmental enrichment with the hormone melatonin in a model of circadian dysrhythmia. Furthermore, we investigated the influence of physical activity in a high-fat diet mouse model and in a model of dopamine depletion. We applied the BrdU-incorporation method to immunohistologically quantify and typify hippocampal neurogenesis. We used high-performance liquid chromatography and the polymerase chain reaction to evaluate the dopamine metabolism and determined neurotrophins in the enzyme-linked immunosorbent assay. In the Rotarod, we analysed the motor-abilities of the mice and in the Morris water maze, we tested spatial cognition.
Results: Contrary to direct interaction with environmental enrichment, the mere perception of an
enriched environment was insufficient to induce pro-neurogenic and pro-cognitive potential. Furthermore, interaction with environmental enrichment, resembling an active lifestyle, compensated the detrimental influence of circadian dysrhythmia on neural regeneration, but not on cognition. Meanwhile, melatonin prevented both neural and cognitive deficits. Physical activity simultaneously initiated with a high-fat diet prevented the consequences of the diet on hippocampal neurogenesis and spatial cognition without modulation by BDNF. Similar, physical activity reduced the neural and cognitive deficits in a model of dopamine depletion and downregulated a pathologically increased dopamine turnover.
Conclusion: An active lifestyle and physical activity positively influence hippocampal
neurogenesis and spatial cognition under physiological and pathological conditions. However, lifestyle interventions do not always have the potential to completely compensate neural and cognitive deficits.
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1. Einleitung
Ein Leben lang können sich neue Neurone in der subgranulären Zone (SGZ) des Gyrus Dentatus (DG) in der Hippokampus-Formation bilden1–6. Dort befinden sich pluripotente Stammzellen (NSCs), die kontinuierlich proliferierende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) generieren. Die NPCs migrieren aus der SGZ in die granuläre Zone und differenzieren zu Neuronen7. Initial entwickelt sich aus der Glia-ähnlichen Stammzelle (Typ-1) die rapide proliferierende und transient amplifizierende Vorläuferzelle (Typ-2a). Diese Typ-2a-Zelle exprimiert neuronale Marker wie Doublecortin (DCX), durch die sie zur Typ-2b-Zelle wird. Die wiederum differenziert zum Neuroblasten (Typ-3), der in das post-mitotische Stadium eines unreifen Neurons übergeht, in der granulären Zone maturiert und sich in das lokale Netzwerk integriert7–10 . Vor allem im frühen post-mitotischen Stadium sterben 25 % bis 75 % der neugeborenen Zellen wieder ab10–12. Die überlebenden Neurone beginnen zwei Wochen nach ihrer Geburt auf externe Stimuli wie das spatiale Kognitionstraining im Morris-Wasserlabyrinth (MWM) zu reagieren und werden für Lernvorgänge bevorzugt rekrutiert10,13. Der Hippokampus selbst wird aufgrund seiner Rolle in der Prozession von Gedächtnisinhalten als „Pförtner“ des Gedächtnisses bezeichnet14. Neben synaptischer Plastizität und Langzeitpotenzierung wird die adulte hippokampale Neurogenese als neuer Faktor für die hippokampale Gedächtniskonsolidierung in Betracht gezogen. Mehrfach wurde ein Zusammenhang zwischen intakter hippokampaler Neurogenese und spatialer Kognition dargestellt15–19. Besonders die Verknüpfung von spatialen und temporalen Informationen sowie die Gedächtnisflexibilität für die Anwendung erlernter Informationen auf neue Situationen, scheinen von der intakten hippokampalen Neurogenese abzuhängen18,20,21. Die hippokampale Neurogenese wird sowohl durch internale als auch durch externale Faktoren moduliert3,22–24. In einer alternden Gesellschaft könnte die bewusste Beeinflussung der adulten Neurogenese zum Aufhalten des kognitiven Abbaus und neurodegenerativer Prozesse beitragen. Ziel dieser Arbeit ist es daher, Lebensstilinterventionen als Modulationsfaktoren der hippokampalen Neurogenese unter vier verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Ein pro-neurogener Lebensstilstimulus ist die reizreiche Umgebung, bestehend aus nicht-animierten und sozialen Stimuli25,26. Das Leben in dieser Umgebung führt zu einem verstärkten Überleben von hippokampalen Neuronen und besserer spatialer Kognition3,4,20. In einer Zeit, in der Menschen häufig passiv vor Bildschirmen sitzen, haben wir in der Studie mit einem TV-ähnlichen Set-Up untersucht, inwiefern die reine Wahrnehmung einer reizreichen Umgebung ausreichend ist, um neuronal und kognitiv stimulierend zu wirken.
Auch die „innere Uhr“ beeinflusst die hippokampale Neurogenese. Zirkadiane Dysrhythmie, induziert durch manipulierte Hell-/Dunkelphasen, verringert das Volumen des Temporallappens,
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beeinträchtigt die adulte hippokampale Neurogenese und führt zu dysfunktionaler spatialer Kognition27–29. Informationen wie eine zirkadiane Dysrhythmie, die Differenzierungsstadien der hippokampalen Neurone beeinflusst und sich auf die spatiale Kognition auswirkt, könnten entscheidend sein für die Evaluation passender Therapien. Wir untersuchten daher in der
Jetlag-Studie das therapeutische Potenzial des pro-neurogen und -kognitiv wirkenden Hormons
Melatonin sowie eines aktiven Lebensstils in einer reizreichen Umgebung in einem Modell chronischer zirkadianer Dysrhythmie.
Eine hochkalorische Ernährung (HFD) führt nicht nur zu Übergewicht und steigert das kardiovaskuläre Risiko, sondern induziert auch neuronale und kognitive Defizite30,31. Besonders die auf hippokampale Integrität angewiesenen Gedächtnisfunktionen sind davon betroffen32. Dagegen reduziert physische Aktivität als Lebensstilintervention Übergewicht, steigert Gedächtnisleistungen, erhöht das hippokampale Volumen und kompensiert die Folgen von HFD auf die hippokampalen Neurogenese und spatiale Kognition33,34. Wir untersuchten in unserer
Sport-Diät-Studie, inwiefern die positiven Effekte physischer Aktivität auf die Kognition im HFD-Mausmodell durch die hippokampale Neurogenese moduliert werden.
Neben Lebensstilfaktoren induzieren auch Erkrankungen Neurodegeneration im zentralen Nervensystem. Ein Beispiel dafür ist das idiopathische Parkinsonsyndrom (IPS), das sowohl mit einem Untergang von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra (SN) als auch mit einer Dopamindepletion im Striatum und Hippokampus einhergeht35–38. Das beeinträchtigt wiederum die hippokampale Neurogenese, was ursächlich für die kognitiven Defizite in Dopamin-depletierten Tiere sein und zu den kognitiven Defiziten im humanen IPS beitragen könnte39–42. Ein physisch aktiver Lebensstil verbessert dagegen Kognition, erhöht die Dopaminlevel und steigert die hippokampale Neurogenese im Dopamindepletionsmodell, so dass Lebensstilinterventionen auch bei neurodegenerativen Erkrankungen therapeutisch eingesetzt werden können40,43–45. In der Sport-MPTP-Studie untersuchten wir, inwiefern ein veränderter Dopaminstoffwechsel die Effekte physischer Aktivität im Dopamindepletionsmodell moduliert.
2. Methodik und Material 2.1. Tiere
Die Tierstudien genehmigte die zuständige lokale Behörde, das Landesamt für Gesundheit und Soziales (LAGeSo, Berlin). Alle Mäuse lebten in einer Luftfeuchtigkeit und Temperatur kontrollierten Umgebung mit freiem Zugang zu Trinkwasser und Futter. Die Tiere lebten, außer den Jetlag-Tieren, in einem konstanten 12/12 Stunden (h) Hell-/Dunkelzyklus und wurden stets zufällig einer experimentellen Gruppe zugeteilt. Die C57BL/6N Mäuse bezogen wir vom
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kommerziellen Anbieter Charles River und die transgenen Nestin-GFP Mäuse von der Forschungseinrichtung für Experimentelle Medizin (FEM, Berlin). Die Nestin-GFP Mäuse mit C57Bl/6N-Hintergrund exprimieren unter der Kontrolle des Nestin-Promotors das grün fluoreszierende Protein (GFP). Das Filament Nestin ist ein Marker für neuronale Stammzellen. GFP erleichtert die Anfärbung Nestin+-Zellen und somit die Analyse neuronaler Stammzellen46.
2.2. Studiendesign
2.2.1. TV-Studie: Effekte reiner Wahrnehmung versus direkter Interaktion mit einer reizreichen
Umgebung im gesunden Mausmodell.
In einem TV-ähnlichen-Setup haben wir untersucht, ob direkte Interaktion mit einer reizreichen Umgebung notwendig ist, oder ob die visuelle, auditive und olfaktorische Wahrnehmung einer reizreichen Umgebung sowie der in dieser Umgebung lebenden Tiere ausreicht, um die adulte hippokampale Neurogenese zu stimulieren und die spatiale Kognition zu verbessern. Dazu teilten wir 97 weibliche C57Bl/6N Mäuse auf vier verschiedene Gruppen auf (DIR, IND, ENR, CTR; Abb. 1)26. DIR und ENR lebten in einer reizreichen Umgebung, die aus bunten Kartons, einem Röhrensystem, variierenden Futter- und Trinkstellen bestand, die wir 2 – 3x/Woche neu anordneten. Um zwischen proliferierenden und langfristig überlebenden Zellen unterscheiden zu können, haben wir 26 Nestin-GFP Mäuse 24h nach dreimaliger 5´-Bromo-2`desoxy-Uridin (BrdU) -Injektion am 28. Versuchstag getötet, während wir 71 C57BL/6N-Mäuse vier Wochen nach BrdU-Inkorporation am 56. Versuchstag perfundierten. Zur Untersuchung der spatialen Kognition haben wir 41 C57Bl/6N Mäuse in der letzten Versuchswoche im MWM getestet.
2.2.2. Jetlag-Studie: Effekte von Melatonin und einer reizreichen Umgebung in einem
Mausmodell chronischer zirkadianer Dysrhythmie.
Um die Folgen einer Jetlag-Simulation auf die hippokampale Neurogenese und das spatiale Gedächtnis zu charakterisieren sowie die pro-neurogenen Stimuli Melatonin und die reizreiche Umgebung als therapeutische Ansätze zu untersuchen, teilten wir 150 weibliche C57Bl/6N Mäuse auf vier verschiedene Gruppen auf (Abb. 2)47. Drei Gruppen (JL-CTR/ -Mel/ -ENR) durchliefen
Abb. 1. TV-Käfigbedingungen. Magenta (DIR): Mäuse in reizreicher Umgebung können von Mäusen im inneren Standardkäfig wahrgenommen werden. Rot (IND): Mäuse im Standardkäfig inmitten der reizreichen Umgebung. Blau (ENR): Mäuse in reizreicher Umgebung mit unbewohntem Standardkäfig im Zentrum. Gelb (CTR): Kontrolltiere im Standardkäfig ohne Konfrontation mit anderen Tieren26.
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drei Wochen lang Jetlag, den wir durch eine Verkürzung der Dunkelphase um sechs Stunden an jedem dritten Tag induzierten. Insgesamt durchlebten die Tiere acht Zeitverschiebungen. Die Therapie mit Melatonin (8 mg/kgKG) respektive einer reizreichen Umgebung wurde entweder direkt vor der dritten Zeitverschiebung in 68 C57Bl/6N Mäusen oder vier Tage nach der Zeitverschiebung in 52 C57Bl/6N Mäusen begonnen (Langzeit-Gruppe = LT). Der Zeitpunkt der BrdU-Injektionen, zur Markierung proliferierender Zellen, erfolgte abhängig vom Therapiebeginn entweder vor der dritten Zeitverschiebung oder zwei Tage nach der letzten Zeitverschiebung in der LT-Gruppe. Die Zellproliferation wurde 24h nach BrdU-Inkorporation in 30 Nestin-GFP Mäusen untersucht, während das Überleben von Zellen vier Wochen nach BrdU-Inkorporation in 40 C57Bl/6N Mäusen analysiert wurde. In der letzten Woche des Experiments wurde das spatiale Gedächtnis von 80 Mäusen im MWM getestet.
2.2.3. Sport-Diät-Studie: Effekte physischer Aktivität im HFD-Mausmodell.
Um zu untersuchen, ob die pro-kognitiven Auswirkungen physischer Aktivität im HFD-Modell durch hippokampale Neurogenese moduliert werden, teilten wir 135 weibliche C57Bl/6N Mäuse auf zwei verschiedene Versuchsläufe – präventiv und therapeutisch - auf48. Im präventiven Ansatz erhielten je 36 sechs Wochen alte Mäuse eine Hochkalorische Diät (5.24 kcal/g; 60 % Fett, 20 % Protein, 20 % Kohlenhydrate) oder eine Kontrolldiät (3.85 kcal/g; 10 % Fett, 20 % Protein, 70 % Kohlenhydrate). Simultan zu der Diät erhielt die Hälfte dieser Tiere Zugang zu einem Laufrad (HFD-R/ CD-R), die andere verblieb ohne Laufrad (HFD-S/ CD-S). Im therapeutischen Ansatz erhielten 63 zehn Wochen alte Tiere entweder die hochkalorische (N = 36) oder die Kontrolldiät (N = 27). Von diesen erhielten nach zehn Diätwochen 32 Tiere ein Laufrad (HFD-R/ CD-R), 31 Mäuse verblieben ohne Laufrad (HFD-S/ CD-S). Die Versuchsdauer betrug in beiden Ansätzen zwölf Wochen. Sowohl in der präventiven als auch in der therapeutischen Gruppe wurde die Neurogenese histologisch untersucht oder die Kognition im MWM getestet und der „brain-derived neurotrophic factor“ (BDNF) bestimmt. Wir kontrollierten täglich das konsumierte Futter, das Körpergewicht und kalkulierten die physische Aktivität anhand der Laufraddrehungen.
Abb. 2. JL-Käfigbedingungen.
Grün (CTR): Kontrolltiere mit konstantem Hell/Dunkel-Zyklus. Orange (JL-CTR): Jetlag-Mäuse. Blau (JL-Mel): Jetlag-Mäuse behandelt mit Melatonin. Magenta (JL-ENR): Jetlag-Mäuse in einer reizreichen Umgebung47.
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2.2.4. Sport-MPTP-Studie: Effekte physischer Aktivität im Dopamindepletionsmodell.
Zur Untersuchung der dopaminergen Regulation der adulten hippokampalen Neurogenese, sowie deren Modulation durch physische Aktivität, teilten wir 118 weibliche Nestin-GFP Mäuse zufällig auf zwei Gruppen auf49. Der einen Gruppe injizierten wir dreimal das neurotoxische in 0.9% Kochsalzlösung (NaCl) verdünnte Opioid-derivat 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,4-Tetrahydropyridin (MPTP, 20 mg/kg). Das Toxin zerstört die dopaminergen Neurone der SN und reduziert den Dopamingehalt im Striatum und Hippokampus. Die Kontrollgruppe erhielt dreimal 0.9% NaCl intraperitoneal (i.p.). Beide Gruppen unterteilten wir in Gruppen mit Zugang zu einem Laufrad (MPTP-R/ CTR-R) und in Gruppen ohne Laufrad (MPTP-S/ CTR-S) sowie in zwei verschiedene Zeitverläufe: Eine Kurzzeitgruppe (ST), in der die Tiere zehn Laufradtage hatten, und eine Langzeitgruppe (LT) mit 28 Tagen Laufrad. Die physische Aktivität kalkulierten wir anhand der Laufraddrehungen. In der ST- und in der LT-Gruppe untersuchten wir in insgesamt 55 Mäusen die hippokampale Neurogenese histologisch nach Perfusion an Tag 16/34 und in 63 Mäusen analysierten wir die Motorik im Rotarod sowie die Gedächtnisleistung im MWM und die Genexpression sowie den Katecholamingehalt nach Perfusion an Tag 23/41.
2.3. Gewebevor und -aufbereitung
2.3.1. 5´-Bromo-2´-desoxy-Uridin Injektion
Für die histologische Quantifizierung und Charakterisierung der Neurogenese injizierten wir den Mäusen in 0.9% NaCl verdünntes BrdU i.p. (50 mg/kgKG). BrdU inkorporiert statt Thymidin in die Desoxyribonukleinsäure (DNA) und markiert proliferierende Zellen.
Die in den Experimenten verwendeten Substanzen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1: Liste der verwendeten Substanzen mit Dosis, Eigenschaften und Herstellerangabe.
Substanz Abkürzung Dosis/ Eigenschaften Hersteller
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Hydrochloride
MPTP-HCl 20 mg/kgKG Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
2-Methylbutan C15H12 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
3,3'-Diaminobenzidin DAB 0.025 mg/ml Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5'-Bromo-2'-deosxyuridine BrdU 50 mg/kgKG Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5'-Bromo-2'-desoxyuridine-Antikörper, Ratte Anti-BrdU, rt 1:500 Bio-Rad Inc., Hercules, USA
10-6 M Dopamin-Lösung Bio-Rad Inc., Hercules, USA
10-7 M 3,4 Dihydroxyphenylessig-Lösung DOPAC Bio-Rad Inc., Hercules, USA Alexa 488, Huhn, Kaninchen, Maus 1:1000 LifeTechnologies, Carlsbad, USA
Alexa 647, Maus 1:300 Dianova GmbH, Hamburg,
Deutschland
Alexa 647, Ziege 1:100 LifeTechnologies, Carlsbad, USA
Biotin-Antikörper, Ratte, Ziege Anti-Biotin, rt, gt 1:250 Dianova GmbH, Hamburg, Deutschland
15
Boratpuffer 0.1 M, pH 8.5 Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
Deutschland
Brain-derived neurotrophic factor ELISA kit BDNF ELISA Promega Inc., Fitchburg, USA
Chlorwasserstoff HCl 2 N Merck, Darmstadt, Deutschland
Control diet (D12459) CD 3.85 kcal/g
10 % Fett
Research Diets Inc., New Brunswick, USA
Dopaminrezeptor D1a TaqMan® assay drD1a Applied Biosystems, Foster City, USA
Dopaminrezeptor D2 TaqMan® assay drD2 Applied Biosystems, Foster City, USA
Dopaminrezeptor D5 TaqMan® assay drD5 Applied Biosystems, Foster City, USA
Doublecortin-Antikörper, Ziege Anti-DCX, gt 1:200 Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA
Esel-Serum 10 % Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Extraktionspuffer (100mM Tris-HCl, 400mM NaCl, 0,1% NaN3, Proteaseinhibitoren)
Bio-Rad Inc., Hercules, USA Glial fibrillary acidic protein-Antikörper, Ziege Anti-GFAP, gt 1:200 Santa Cruz Biotechnology,
Dallas, USA Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase TaqMan®
assay
Gapdh Applied Biosystems, Foster City, USA
Green-fluorescent protein-Antikörper, Huhn Anti-GFP, ck 1:250 Novus Biologicals, Littleton, USA
Green-fluorescent protein-Antikörper, Kaninchen Anti-GFP, rb 1:250 Abcam, Cambridge, UK
High-fat diet (D12492) HFD 5.24 kcal/g
60 % Fett
Research Diets Inc., New Brunswick, USA
High Capacity RNA-to-cDNA kit Applied Biosystems, Foster City, USA
Homovanillinsäure-Lösung HVA Bio-Rad Inc., Hercules, USA
Ketamin-hydrochlorid/ Xylazine (Rompun) Ketamin 10 %/ 2 %, 0.1ml/20g Provet AG, Lyssach, Schweiz Neuronal Nuclei-Antikörper, Maus Anti-NeuN, ms 1:100 Merck-Millipore, Billerica, USA
Nickelchlorid NiCl2 0.04 % Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Nucleospin RNA/Protein Isolation Kit Macherey-Nagel, Düren, Deutschland
Melatonin 8 mg/kgKG Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Paraformaldehyd PFA 4 % Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Perchlorsäure HCLO4 0.1 M Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Phosphatpuffer PBS 0.1 M, 7.5 pH Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
ProTaqs®Clear, PARAmount Quartett GmbH, Berlin,
Deutschland
Rhodamin-X-Antikörper, Ratte Anit-RhX, rt 1:250 Dianova, Hamburg, Deutschland
Saccharose C12H22O11 20 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
Deutschland
Triton X-100 Triton 0.1 % Sigma-Aldrich, St.Louis, USA
Vectastain® ABC Elite kit ABC-Reagenz 9 µl/ml Vector Laboratories, Burlingame, USA
Wasserstoffperoxid H2O2 0.6 %, 0.01 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
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2.3.2. Gewebeextraktion und -zuschnitt
Zur Gewinnung von fixiertem Gewebe für die Histologie anästhesierten wir die Mäuse mit einer Überdosis Ketamin und perfundierten diese transkardial mit einer kalten phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS, 0.1 M) und kaltem 4%-Paraformaldehyd (PFA). Die freipräparierten Gehirne fixierten wir in PFA für 24h bei 4 °C und dehydrierten sie in einer 20%-Saccharoselösung. Wir froren die Gehirne bei -80 °C in Methylbutan ein, schnitten die Gehirne im Kryostat in 40 µm dicke koronare Schnitte und bewahrten diese bei 4 °C in einer Anti-Frost-Lösung auf.
Zur Gewebegewinnung für die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR), das enzymatische Immunadsorptionsverfahren (ELISA) und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) anästhesierten wir die Mäuse mit einer Überdosis Isofluran und perfundierten sie transkardial mit kaltem PBS. Die freipräparierten Gehirne froren wir auf Trockeneis ein und lagerten sie bei -40 °C. Für die Analysen präparierten wir das Striatum (Bregma 1.1 mm – 0.1 mm), den anterioren (Bregma -1.7 mm – -2.3 mm) sowie den posterioren Hippokampus (Bregma -2.3 mm – -3.3 mm) einzeln frei. Die in der Arbeit verwendeten Geräte und Software sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2: Liste der verwendeten Geräte und Software mit Funktion und Herstellerangabe.
Gerät Funktion Hersteller
Kryostat CM 1850 Gewebeschnitte Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland Leica DMR Mikroskop Differentialinterferenzkontrast-Mikroskopie Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland Leica TCS SP2, Lasermikroskop Konfokale Mikroskopie Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland Multiskan™ FC
Mikrotiterplatten-Photometer
ELISA, Proteinlevel-Messung ThermoFischer Scientific Inc., Waltham, USA
Reversed-phase HPLC-ECD System, ProntoSIL. C18. SH., ECD 4100, Chromsystems
Katecholaminlevel-Messung Bischoff Analysetechnik und -geräte GmbH, Neu-Anspach, Deutschland
Rotarod Advanced 3375-M5 Rotarod-Test TSE systems, Chesterfield, USA StepOne real-time PCR instrument Polymerasekettenreaktion: Amplifizierung Applied Biosystems, Foster City, USA Zeiss Axio, Lichtmikroskop Lichtmikroskopie Zeiss, Jena, Deutschland
Software Funktion Hersteller
GraphPad Prism 5.1 Grafik GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA Matlab R2014a, R2015b Statistik, Grafik MathWorks, Natick, USA
StepOne PCR-Auswertung, C1-Methode Applied Biosystems, Foster City, USA SPSS, Version 19, 22, 23 Statistik International Business Machine Corporation
(IBM), Armonk, USA
Viewer3 Analyse von Verhaltenstests Biobserve GmbH, Bonn, Deutschland
2.4. Histologie
2.4.1. Immunhistochemie
Zur Bestimmung von BrdU-inkorporierten und DCX+-Zellen färbten wir die koronaren Schnitte immunhistochemisch an. Das Gewebe behandelten wir mit 0.6%-Wasserstoffperoxid (H2O2) für
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30 Minuten vor. Für weitere 30 Minuten denaturierten wir die DNA mit 2 N Chlorwasserstoff (HCl) bei 37 °C und behandelten anschließend das Gewebe mit Boratpuffer (pH 8.5, 0.1M) für 10 Minuten. Zur Antigenblockierung nutzten wir PBS+ (PBS, 0.1% Triton X-100, 10% Esel Serum). Die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht bei 4 °C. Am Folgetag inkubierten wir die Schnitte für zwei Stunden mit dem biotinylierten Sekundärantikörper und behandelten das Gewebe für eine Stunde mit dem ABC Elite Kit. Mit dem Chromogen 3,3’-diaminobenzidine (DAB), 0.01% H2O2 und 0.04% Nickelchlorid (NiCl2) färbten wir die BrdU+-/ DCX+-Zellen an. Zwischen den einzelnen Schritten spülten wir das Gewebe mit PBS. Das Gewebe dehydrierten wir schließlich in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe, transferierten es auf Objektträger und deckelten es mit ProTaqs®Clear ein. In jedem sechsten Schnitt quantifizierten wir die gefärbten Zellen unter dem Lichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Die absolute Zahl der angefärbten Zellen bestimmten wir durch sechsmalige Multiplikation.
2.4.2. Immunfluoreszenz
Zur Phänotypisierung der BrdU+-Zellen untersuchten wir das Gewebe auf Ko-Expression neuronaler Marker. Wir behandelten die Schnitte mit HCl bei 37 °C für 30 Minuten und für 10 Minuten mit 0.1 M Boratpuffer vor und spülten diese mit PBS+ für 30 Minuten zur Antigenblockierung. Die Inkubation mit den Primärantikörpern erfolgte über Nacht bei 4 °C. Am Folgetag inkubierten wir die Schnitte für vier Stunden lichtgeschützt mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper. Zwischen den Schritten spülten wir die Schnitte mit PBS. Schließlich dehydrierten wir die Schnitte in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe, transferierten sie auf Objektträger und deckelten diese mit ProTaqs®Clear ein. In jedem zwölften Gewebeschnitt wählten wir 50 BrdU+-Zellen zufällig im DG aus, die wir auf Ko-Expression bei 40-facher und 63-facher Vergrößerung durch die Bildung von Z-Stapeln (1 µm) in der konfokalen Laser-Mikroskopie untersuchten. Zur Schätzung eines Zelltyps übertrugen wir den prozentualen Anteil auf die Gesamtzahl der BrdU+-Zellen.
2.5. Molekularbiologie
2.5.1. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion
Die Genexpression der anterioren Hippokampi analysierten wir mit der qPCR. Dazu extrahierten wir die Boten-Ribonukleinsäuren (mRNA) mit dem Nucleospin RNA/Protein Isolierungs Kit. Mit dem „High Capacity RNA-to-cDNA Kit“ synthetisierten wir die komplementäre DNA (cDNA) und amplifizierten diese mit dem „TaqMan® Fast Advanced Master Mix“ und den Assays drD1a, drD2, drD5 und Gapdh im StepOne® real-time PCR Instrument. Gapdh diente als interne Kontrolle, um die relative Genexpression mit der komparativen C1-Methode (ΔΔCt) in der Software StepOne® zu normieren und Expressionslevel zu kalkulieren.
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2.5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Mit der HPLC bestimmten wir den Gehalt von Dopamin und dessen Metaboliten 3,4- Dihydroxyphenylessig (DOPAC) und Homovanillinsäure (HVA) im Striatum und im posterioren Hippokampus. Die Proben homogenisierten wir mit Ultraschall in 0.1 M Perchlorsäure. In 60 µl des Homogenats maßen wir die Proteinlevel50. Wir zentrifugierten die Proben (13.000 Upm) und bestimmten die Katecholaminlevel mit dem Umkehrphase-HPLC-ECD System. Standardisierte Dopamin-, DOPAC- und HVA-Lösungen fungierten als Referenzen. Mit dem Chromatogramm und den Proteinproben kalkulierten wir die Katecholamin-Konzentration. Den Dopamin-Umsatz bestimmten wir über das Verhältnis von Dopamin zu seinen Metaboliten.
2.5.3. Enzymatisches Immunadsorptionsverfahren
Die Level des Neurotrophins BDNF bestimmten wir mit ELISA. Wir wogen die unfixierten Hippokampi, homogenisierten sie unter Ultraschall mit einem Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 0,1% NaN3, Proteaseinhibitoren) und zentrifugierten sie für zehn Minuten bei 4 °C (13.000 Upm). Die BDNF-Level bestimmten wir unter Adaption der fluormetrischen Methode51,52 .
2.6. Verhaltenstests 2.6.1. Rotarod
Um auszuschließen, dass die Dopamindepletion die Motorik der MPTP-Tiere beeinflusste und sich auf den MWM auswirkte, testeten wir die Mäuse im Rotarod, bestehend aus einem motorisierten Zylinder mit Boden und Trennwänden53. Nach zweitägiger Habituation testeten wir die Mäuse auf dem rotierenden Zylinder und maßen die Latenz bis zum Herunterfallen für maximal fünf Minuten. Die Startgeschwindigkeit lag bei vier Runden pro Minute, die wir sukzessive auf 40 Runden pro Minute für mindestens 60 Sekunden erhöhten.
2.6.2. Morris-Wasserlabyrinth
Wir testeten das spatiale Gedächtnis und die Gedächtnisflexibilität in einer modifizierten Version des MWM17. Für fünf konsekutive Tage trainierten wir die Mäuse mit Hilfe von visuellen Hinweisen zu einer Plattform zu navigieren, die in einem zirkulären Tank (1.2 m Durchmesser) 1 cm unter der Oberfläche im opaken Wasser (20 ± 1°C) versteckt lag. Die Mäuse setzten wir sechsmal täglich für maximal 120 Sekunden ins Wasser mit mindestens 30 Minuten Pause zwischen den Trials. An Tag 4 positionierten wir die Plattform im gegenüberliegenden Quadranten neu (Abb. 4). Die Latenz bis zum Finden des Ziels, die Strecke, die Geschwindigkeit und das Kreuzen des Plattformbereichs wurden automatisch vom Programm Viewer3 analysiert. Die Strecke wurde automatisch in XY-Koordinaten codiert, die wir in einem Matlab-Algorithmus einer Schwimmstrategie zuordneten. Die Strategien teilten wir in spatiale Hippokampus-abhängige
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Strategien oder Hippokampus-unabhängige Strategien ein. „Gezielte Suche“, „Fokale Suche“ und „Direktes Schwimmen“ galten als spatial, während die verbliebenen als nicht-spatial galten17. Die Lokalpräferenz wurde in Wärmebildern abhängig von der Koordinatenhäufigkeit dargestellt.
2.7. Statistische Analyse und Darstellung
Wir implementierten die Daten in SPSS und testeten den experimentellen Einfluss auf metrische Variablen mit oneway-, twoway- oder repeated-measures-ANOVA. Bei statistischer Signifikanz – die bei p ≤ 0.05 lag – führten wir Gruppenvergleiche mit Post-hoc-Tests durch. Der ausgewählte Test hing von der Varianz und N ab. Nominale Variablen testeten wir mit dem 𝜒2 -Unabhängigkeits-Test auf Abhängigkeiten. Die Grafen erstellten wir mit GraphPad Prism 5.1 oder Matlab. Metrische Daten stellen wir als Mittelwerte ± SEM oder als Tukey-Style Boxplots mit Median und einer Reichweite von der 25. bis zur 75. Perzentile dar.
3. Ergebnisse
3.1. TV-Studie: Direkte Interaktion mit einer reizreichen Umgebung ist notwendig, um die adulte
hippokampale Neurogenese zu erhöhen und spatiale Kognition zu verbessern.
Den Einfluss reiner Wahrnehmung einer reizreichen Umgebung versus (vs) direkter Interaktion mit einer reizreichen Umgebung auf die adulte hippokampale Neurogenese untersuchten wir histologisch mit der BrdU-Inkorporations-Methode. Vier Wochen nach BrdU-Gabe zeigte sich der charakteristische pro-neurogene Effekt einer reizreichen Umgebung auf die Neurogenese in DIR und ENR. Beide Gruppen zeigten eine erhöhte Anzahl von überlebenden reifen BrdU+/NeuN+-Neuronen im DG (F
3,25 = 11.673, p < 0.001; ENR vs CTR, p < 0.001; DIR vs CTR, p = 0.001). Die indirekte Konfrontation von IND mit der reizreichen Umgebung und der in dieser Umgebung lebenden Tiere erhöhte dagegen die BrdU+-/NeuN+-Neuronenzahl nicht (IND vs CTR, p = 0.401). Die hippokampale Zellproliferation bestimmten wir 24h nach BrdU-Injektion in Nestin-GFP Mäusen. Jedoch beeinflussten weder die direkte noch die indirekte Konfrontation mit einer reizreichen Umgebung die neuronale Proliferation (F3,22 = 0.391, p = 0.761). Ebenso blieben die Subpopulationen der NPCs unverändert (Nestin+/GFAP+- Typ-1: F3,17 = 0.730, p = 0.548; Nestin+-Typ-2a: F3,21 = 0.467, p = 0.709; Nestin+/DCX+ -Typ-2b: F3,21 = 0.704, p = 0.560; DCX+-Typ-3: F3,21 = 0.271, p = 0.846).
Die spatiale Kognition der Tiere testeten wir im MWM. Alle Gruppen starteten unter denselben Ausgangsbedingungen und zeigten keine Unterschiede während des ersten Trials (F3,37 = 0.603, p = 0.617). In der Akquisitionsphase lernten alle Tiere die Plattformposition und zeigten keine Häufigkeitsunterschiede beim Kreuzen der vorherigen Plattformposition im ersten Trial an Tag 4 (F3,37 = 0.216, p = 0.885). Die reizreiche Umgebung hatte den erwarteten positiven Effekt
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auf die spatiale Kognition, sodass ENR eine durchschnittlich kürzere Strecke zur Plattform als CTR über die fünf Testtage schwamm (F3,241 = 10.343, p < 0.001; ENR vs CTR, p = 0.030). Dieser Effekt war am Ende der Akquisitionsphase an Tag 3 besonders ausgeprägt (F3,241 = 6.920, p < 0.001; ENR vs CTR, p = 0.031). Überraschend konnte DIR nicht von der reizreichen Umgebung profitieren und zeigte keine bessere Leistung als CTR, weder insgesamt (DIR vs CTR, p = 0.999), noch an einzelnen Tagen (Tag 1: p = 0.135; Tag 2: p = 0.154; Tag 3: p = 0.961; Tag 4: p = 0.971; Tag 5: p = 1.000). An Tag 2 benötigte DIR sogar eine längere Schwimmstrecke als ENR (F3,242 = 6.248, p < 0.001; ENR vs DIR, p = 0.050). Ebenso überraschte, dass IND eine längere Strecke zur Plattform benötigte als CTR (IND vs CTR, p = 0.036). Der Leistungsunterschied zwischen den beiden Gruppen wurde besonders an Tag 2 (IND vs CTR, p = 0.012) und während der Umlernungsphase an Tag 4 und 5 deutlich (F3,242 = 7.549, p < 0.001; IND vs CTR, p = 0.032). In der qualitativen Analyse des MWM zeigte die Bestimmung der Suchstrategien zudem, dass IND weniger effiziente nicht-spatiale Strategien präferierte (χ2 (3) = 34.276, p < 0.001; IND (53.8 %), CTR (43.9 %), DIR (42.1 %), ENR (35.4 %)). ENR dagegen wählte seltener Perseveration – eine Strategie, in der die alte Plattformposition weiter im Fokus steht – als Suchstrategie (χ2 (21) = 44.782, p = 0.002; IND (31.3 %), CTR (28.3 %), DIR (15.3 %), ENR (6.7 %)). Das verdeutlicht das flexiblere Umlernen von ENR im Gruppenvergleich. Darüber hinaus visualisierten wir die Lokalpräferenzen der Gruppen an Tag 4 von Trial 1 bis Trial 6. Abbildung 3 zeigt wie ENR ab Trial 3 eine neue Zielpräferenz entwickelte, während CTR, IND und DIR erst am Ende von Tag 4 eine neue Präferenz ausbildeten.
In Zusammenschau der morphologischen und funktionellen Daten zeigte sich, dass die bekannte positive Wirkung einer reizreichen Umgebung auf die adulte hippokampale Neurogenese und spatiale Kognition nur durch die direkte Interaktion mit der reizreichen Umgebung induziert werden konnte. Die alleinige Wahrnehmung war hingegen unzureichend. Die indirekte Exposition korrelierte sogar mit einer schlechteren Leistung der Gedächtniskonsolidierung und -flexibilität. Folglich ist die direkte Interaktion mit einer reizreichen Umgebung notwendig, um das pro-neurogene und pro-kognitive Potenzial einer reizreichen Umgebung zu induzieren.
Abb. 3. Aufenthaltswahrscheinlichkeit im MWM. Die Wärmebilder stellen die Entwicklung der Lokalpräferenz nach der Neupositionierung der Plattform an Tag 4 dar. Der Farbumschlag von rot (6-fache Wahrscheinlichkeit) nach blau (Zufall) stellt die abnehmende Präsenzwahrscheinlichkeit dar26.
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3.2. Jetlag-Studie: Melatonin beugt den neuronalen und kognitiven Defiziten chronischer
zirkadianer Dysrhythmie vor.
Den Einfluss von zirkadianer Dysrhythmie sowie von Melatonin und einer reizreichen Umgebung auf die adulte hippokampale Neurogenese untersuchten wir histologisch mit der BrdU-Inkorporations-Methode. 24h nach BrdU-Gabe bestimmten wir die Proliferationsrate der NPCs im DG, die durch zirkadiane Dysrhythmie um 36 % reduziert wurde (F3,23 = 4.582, p < 0.01; CTR vs JL-CTR, p = 0.029). Eine verantwortliche Subpopulation der NPCs war jedoch nicht detektierbar (Nestin+/GFAP+-Typ-1: -40 %, F
3,23 = 0.938, p = 0.438; Nestin+-Typ-2a: -37 %, F3,23 = 1.527, p = 0.234; Nestin+/DCX+-Typ-2b: -73 %, F3,23 = 1.584, p = 0.220; DCX+-Typ-3: +4 %, F3,23 = 0.392, p = 0.760). Die verminderte Proliferationsrate konnte sowohl durch Melatonin als auch durch eine reizreiche Umgebung kompensiert werden (F3,23 = 4.582, p = 0.012; CTR vs
JL-Mel, p = 1.000; CTR vs JL-ENR, p = 1.000; JL-CTR vs JL-Mel, p = 0.035; JL-CTR vs JL-ENR, p = 0.047). Im Gegensatz zur Proliferation blieb das Überleben hippokampaler Neurone
von zirkadianer Dysrhythmie vier Wochen nach BrdU-Gabe sowohl wenige Tage als auch mehrere Wochen nach der letzten Zeitverschiebung unbeeinflusst (F3,19 = 32.066, p < 0.001; CTR vs JL-CTR, p = 0.955; F3,16 = 5.426, p = 0.009; LT-CTR vs LT-JL-CTR, p = 0.508).
Um die spatiale Kognition der Mäuse zu untersuchen, testeten wir die Tiere im MWM. Alle Tiere erlernten die Aufgabe und erbrachten eine ähnliche Schwimmleistung über die gesamte Akquisitionsphase (F3,276 = 1.873, p = 0.134) und kreuzten ähnlich häufig die alte Plattformzone im ersten Trial an Tag 4 (F3,44 = 0.872, p = 0.463). Über den gesamten MWM zeigte JL-CTR jedoch eine um 23 % schlechtere Schwimmleistung als CTR (F3,274 = 6.540, p < 0.001; CTR vs JL-CTR, p = 0.018). Diesem Leistungsabfall konnte sowohl durch Melatonin als auch durch eine reizreiche Umgebung vorgebeugt werden (CTR vs JL-Mel, p = 0.986; CTR vs JL-ENR, p = 0.060). Betrachteten wir allein die Phase nach dem Umstellen der Plattform, zeigte sich, dass nicht nur JL-CTR eine längere Strecke als CTR zum Ziel benötigte, sondern auch JL-ENR (F3,281 = 7.893, p < 0.000; CTR vs JL-CTR, p = 0.001; CTR vs JL-ENR, p = 0.009). Im Gegensatz dazu und trotz Jetlag zeigte JL-Mel auch in der Umlernungsphase eine bessere Leistung als JL-CTR und unterschied sich nicht von der Kontrollgruppe (CTR vs JL-Mel, p = 1.000; JL-CTR vs JL-Mel, p = 0.005). In der qualitativen Analyse des MWMs zeigte sich, dass JL-CTR und JL-ENR weniger effiziente Suchstrategien nutzten um zur Plattform zu gelangen. In CTR war der Anteil von Thigmotaxis, einer ineffizienten Suchstrategie, in der sich die Tiere im äußeren Zirkel des Tanks befinden, gerade einmal 2.8 %, in JL-CTR dagegen 10.6 % und in JL-ENR 14.3 % (χ2 = 62.189, p = 0.001). Die „falsche“ Wahl der Suchstrategie trug zur schlechteren Leistung von JL-CTR und JL-ENR im MWM bei. Die Wärmebilder verdeutlichen die Überlegenheit von JL-Mel und CTR
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(Abb. 4). Beiden Gruppen gelang es eine Präferenz für das neue Ziel zu entwickeln, während JL-CTR und JL-ENR bis zum Testende keine klare neue Präferenz ausbildeten.
Im Gegensatz zu den Gruppen, die kurz nach der letzten Zeitverschiebung im MWM getestet wurden, hob sich der Einfluss von Jetlag auf die kognitive Performance vier Wochen nach der letzten Zeitverschiebung fast vollständig wieder auf. Zwischen den LT-Gruppen ließen sich keine Unterschiede bezüglich der Schwimmstrecke weder insgesamt noch in der Umlernungsphase, detektieren (F3,173 = 1.432, p = 0.235; F3,187 = 2.185, p = 0.091), jedoch war die Wahrscheinlichkeit für ineffiziente nicht-spatiale Suchstrategien in LT-JL-CTR weiterhin erhöht (χ2 = 48.536, p = 0.001; LT-CTR (1.3 %), LT-JL-CTR (10.1 %), LT-JL-Mel (8.4 %), LT-JL-ENR (6.8 %)). In Zusammenschau der morphologischen und funktionellen Daten zeigte sich, dass zirkadiane Dysrhythmie vor allem die neuronale Regeneration im DG verminderte und die Gedächtnis-flexibilität einschränkte. Während eine reizreiche Umgebung nur den neuronalen Veränderungen entgegenwirkte, glich Melatonin sowohl die neuronalen als auch die kognitiven Defizite aus.
3.3. Sport-Diät-Studie: Physische Aktivität beugt kognitiven Defiziten im HFD-Modell vor und
moduliert die adulte hippokampale Neurogenese.
Den Einfluss von HFD und Aktivität auf die adulte hippokampale Neurogenese haben wir histologisch zwölf Wochen nach BrdU-Inkorporation durch die Analyse reifer BrdU+/NeuN+ -Neurone und unreifer neuronaler DCX+-Zellen untersucht. HFD bewirkte in der präventiven Gruppe vor allem eine Verringerung unreifer DCX+-Neurone (F
1,30 = 14.034, p < 0.01). Dagegen blieb die Anzahl DCX+-Neurone in der therapeutischen Gruppe unverändert und HFD beeinflusste stattdessen die Anzahl reifer BrdU+/NeuN+-Neurone (F
1,27 = 7.964, p < 0.01). Physische Aktivität erhöhte die Anzahl reifer hippokampaler BrdU+/NeuN+-Neurone sowohl in der präventiven als auch in der therapeutischen Gruppe (F1,30 = 23.725, p < 0.001; F1,27 = 7.734, p < 0.05). Der positive Effekt von physischer Aktivität wirkte sich jedoch nur in der therapeutischen Gruppe auf die Anzahl unreifer DCX+-Neurone unabhängig von der Diät aus (F
1,27 = 79.624, p < 0.001).
Abb. 4. Aufenthaltswahrscheinlichkeit im MWM. Die Wärmebilder stellen die Entwicklung der Lokalpräferenz über den gesamten MWM von Tag 1 bis Tag 5 dar. Der Farbumschlag von rot (6-fache Wahrscheinlichkeit) nach blau (Zufall) stellt die abnehmende Präsenzwahrscheinlichkeit dar 47.
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Ein bekannter Modulationsfaktor der adulten hippokampalen Neurogenese ist das Neurotrophin BDNF. Allerdings veränderten weder eine Diätform noch Aktivität die im ELISA gemessenen BDNF-Level (Präventiv: F3,25 = 0.804, p > 0.05; Therapeutisch: F3,36 = 1.420, p > 0.05), so dass BDNF die beobachteten neuronalen Veränderungen zum Messzeitpunkt nicht modulierte.
Die spatiale Kognition der Mäuse testeten wir im MWM. Alle Gruppen lernten in der Akquisitionsphase zur Plattform zu navigieren, was sich in einer Abnahme der Strecke zum Ziel widerspiegelte (Präventiv: F2,56 = 35.649, p < 0.001; Therapeutisch: F2,56 = 41.040, p < 0.001). Während die Diätform die Leistung in der Akquisitionsphase nicht beeinflusste, verbesserte physische Aktivität das Lernvermögen in der präventiven Gruppe (F2,56 = 3.320, p < 0.05), was sich besonders als kürzere Schwimmpfadlänge an Tag 2 präsentierte (R-Gruppe vs S-Gruppe, p < 0.01). Die Gedächtnisflexibilität wurde durch eine Neupositionierung der Plattform an Tag 4 getestet. Von Tag 4 bis Tag 5 zeigte HFD-S im Vergleich zu den Kontrollen eine längere Schwimmstrecke zur Plattform (F1,28 = 4.458, p < 0.05; HFD-S vs CD-S, p < 0.05). Dieser Effekt wurde besonders an Tag 4 deutlich (HFD-S vs CD-S, p < 0.01). Sowohl über die gesamte Umlernungsphase als auch an Tag 4 konnte der Beeinträchtigung der Gedächtnisflexibilität jedoch durch simultane physische Aktivität vorgebeugt werden (F1,28 = 6.995, p < 0.05; HFD-S vs HFD-R, p < 0.01). Im Gegensatz zur präventiven Gruppe veränderten weder die Diätform noch physische Aktivität die Schwimmstrecke zum Ziel in der therapeutischen Gruppe.
In Zusammenschau der morphologischen und funktionellen Daten zeigte sich, dass HFD sich vor allem kurzfristig auf die unreifen Neurone und die Gedächtnisflexibilität auswirkte. Physische Aktivität konnte diesem negativen Effekt auf die Neurogenese über Modulation der reifen Neurone entgegenwirken und die Defizite in der spatialen Kognition ausgleichen.
3.4. Sport-MPTP-Studie: Physische Aktivität vermindert kurzfristig die neuralen und kognitiven
Folgen von MPTP, aber wirkt sich nur langfristig positiv auf den Dopaminstoffwechsel aus. Den Einfluss von Dopamindepletion und physischer Aktivität auf die adulte hippokampale Neurogenese untersuchten wir mit der BrdU-Inkorporations-Methode und bestimmten die BrdU+ -Zellen im DG. In der ST-Gruppe verringerte die MPTP-Behandlung die Anzahl der BrdU+/Nestin+-Typ-1-NPCs (F
1,20 = 9.411, p < 0.01). Im Gegensatz dazu förderte physische Aktivität die hippokampale Neurogenese und steigerte die Anzahl BrdU+/Nestin+-Typ-1- und BrdU+/DCX+-Typ-3-Zellen (F
1,20 = 12.21, p < 0.01; F1,19 = 25.034, p < 0.001) sowie die Anzahl reifer BrdU+/NeuN+-Neurone (F
1,20 = 30.36, p < 0.001). In der LT-Gruppe zeigte MPTP keinen zellulären Effekt, während Aktivität die Anzahl unreifer BrdU+/DCX+-Typ-3- und reifer BrdU+/NeuN+-Neurone erhöhte (F
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In der HPLC untersuchten wir den Gehalt von Dopamin und seiner Metabolite DOPAC und HVA im Striatum und Hippokampus. In der ST- wie auch in der LT-Gruppe zeigte sich, dass MPTP den striatalen Dopamin- (F1,24 = 38.226, p < 0.001; F1,26 = 105.916, p < 0.001), und DOPAC-Anteil verringerte (F1,24 = 5.743, p < 0.05; F1,26 = 23.537, p < 0.001) und parallel den Dopaminumsatz ((DOPAC + HVA) /Dopamin) unabhängig von der Aktivität der Tiere steigerte (F1,24 = 34.041, p < 0.001; F1,26 = 76.539, p < 0.001). Auch der hippokampale Dopaminstoffwechsel wurde durch MPTP beeinflusst. In der ST-Gruppe erhöhte MPTP sowohl den hippokampalen HVA-Gehalt (F1,25 = 14.213, p < 0.001) als auch den Dopamin-Umsatz (F1,25 = 5.272, p < 0.05), der ebenso durch Aktivität erhöht wurde (F1,25 = 5.722, p < 0.05). In der LT-Gruppe dagegen war das hippokampale Dopamin reduziert (F1,26 = 26.081, p < 0.001) wie auch DOPAC und HVA (F1,26 = 8.781, p < 0.01; F1,26 = 8.238, p <0.01) bei gleichzeitig erhöhtem Dopaminumsatz (F1,26 = 7.916, p < 0.01). Im Gegensatz dazu trat kein erhöhter Dopaminumsatz in der physisch aktiven Gruppe LT-MPTP-R auf. Parallel zum MPTP induzierten hippokampalen Dopamindefizit zeigte sich eine Hochregulation der Dopaminrezeptoren drD1 und drD5 im DG der ST-MPTP-Mäuse. Diese exprimierten vermehrt drD1 (MPTP-S: 2.2 ± 0.4 -fache Erhöhung, MPTP-R: 2.7 ± 0.5 -fache Erhöhung; F1,16 = 9.676, p < 0.01) und drD5 (MPTP-S: 1.5 ± 0.3 -fache Erhöhung, MPTP-R: 1.4 ± 0.3 -fache Erhöhung; F1,16 = 4.854, p < 0.05). Aktivität veränderte dagegen die mRNA-Level nicht und in der LT-Gruppe beeinflussten weder MPTP noch Aktivität die Genexpression. Um festzustellen, ob MPTP die Motorik der Tiere, und damit die Tests beeinflusste, testeten wir die Tiere im Rotarod. Trotz neurotoxischer Wirkung auf die SN schränkte MPTP die Motorik nicht ein und änderte die Latenz bis zum Herunterfallen vom Zylinder nicht (t196 = 0.7514, p > 0.05). Allerdings zeigten die MPTP-Tiere insgesamt weniger physische Aktivität im Laufrad (ST: t102 = 2.566, p < 0.05; LT: t345 = 2.062, p < 0.05).
Die spatiale Kognition testeten wir in einem viertägigen MWM-Paradigma. An den ersten drei Tagen wurde die Lernfähigkeit getestet und an Tag 4 nach Plattformentfernung die Gedächtnisleistung in einem Testtrial mit Messung der Zeit im ehemaligen Zielquadranten untersucht. Alle Gruppen lernten in den ersten drei Tagen zum Ziel zu navigieren, sodass sich eine Abnahme der Schwimmstrecke zeigte (ST: F2,56 = 70.824, p < 0.001; LT: F2,54 = 81.46, p < 0.001). An Tag 1 zeigte sich ein Trend in ST-MPTP-S einen längeren Weg zum Ziel zurückzulegen (F2,56 = 4.9, p < 0.05; MPTP-S vs CTR-S, p = 0.055). An Tag 3 zeigte die Gruppe sogar eine signifikant schlechtere Schwimmleistung (p < 0.05), der jedoch durch Aktivität vorgebeugt werden konnte. Im Gegensatz zur ST-Gruppe waren die LT-MPTP-Gruppen uneingeschränkt lernfähig. Während des Testtrials an Tag 4 zeigte sich in allen ST-Gruppen eine klare Präferenz für den vorherigen Zielquadranten (F3,84 = 5.504, p < 0.01). Die LT-MPTP-Tiere verbrachten
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dagegen im Testtrial weniger Zeit im vorherigen Zielquadranten (F3,81 = 4.498, p < 0.01; MPTP vs CTR, p < 0.05). Physische Aktivität beeinflusste die Leistung der LT-Gruppen im MWM nicht. Zusammenfassend zeigte sich, dass MPTP vor allem kurzfristig die neuronale Regeneration im Hippokampus verminderte, den Dopaminumsatz steigerte und die Lernfähigkeit störte. Langfristig bestand ein striatales und hippokampales Dopamindefizit mit erhöhtem Dopaminumsatz und kognitiv zeigte sich eine gestörte Gedächtnisleistung. Die kurzfristigen neuronalen und kognitiven Folgen konnten durch Aktivität teilweise kompensiert werden. Auf den Dopaminstoffwechsel hatte Aktivität jedoch nur langfristig einen Einfluss mit Reduktion des Dopaminumsatzes.
4. Diskussion
In den vier Studien demonstrierten wir, dass Lebensstilinterventionen die adulte hippokampale Neurogenese und die hippokampus-abhängige spatiale Kognition positiv beeinflussen können. Die konkreten Auswirkungen von Lebensstilinterventionen auf die zelluläre, molekularbiologische und kognitive Ebene fallen bezüglich des neurogenen und kognitiven Potenzials in Abhängigkeit vom zugrundeliegenden neurodegenerativen Prozess jedoch unterschiedlich aus.
Die TV-Studie zeigte, dass das pro-neurogene und -kognitive Potenzial einer reizreichen Umgebung nur durch direkte Interaktion mit dieser – ähnlich einem aktiven Lebensstil – induziert werden kann. Die indirekte Konfrontation mit einer reizreichen Umgebung – ähnlich einem passiven Lebensstil – oder mit Tieren kann sogar zu einer verschlechterten Kognition, wie in IND, führen oder die positiven Effekte einer reizreichen Umgebung, wie in DIR, vermindern. Die Resultate sind vereinbar mit einer Studie von 1975, in der Ratten, die andere Ratten in einer reizreichen Umgebung beobachten konnten, weder ein erhöhtes Gehirngewicht noch verbesserte Exploration zeigten54. 1963 wurde zudem nachgewiesen, dass alleinige passive Bewegung in einer visuell stimulierenden Umgebung die visuell-spatiale-Diskrimination nicht verbessern kann55. Bewegungsarmut und die passive Stimulation über Bildschirme sind Kennzeichen eines passiven Lebensstils, der mit erhöhter Morbidität und Mortalität assoziiert ist56–58. Diesen Lebensstil repräsentierte IND und verdeutlichte, dass Passivität sich nicht pro-neurogen auf die hippokampale Neurogenese auswirkt und die spatiale Kognition sogar nachteilig beeinflussen kann.
Die Jetlag-Studie zeigte, dass zirkadiane Dysrhythmie sich negativ auf die adulte Neurogenese auswirkt. Im Vergleich zu früheren Studien stellten wir fest, dass vor allem die neurale Regeneration in Form einer gestörten Zellproliferation betroffen ist und zusätzlich die spatiale Kognition eingeschränkt wird27,28. Die verminderte Regeneration der hippokampalen Neurone trägt durch die limitierte neurogene Reserve zu den beobachteten kognitiven Defiziten bei59. Melatonin beugt zwar den neurogenen und kognitiven Defiziten vor, dessen vollständiges
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neurogenes Potenzial kann unter zirkadianer Dysrhythmie jedoch nicht induziert werden, wie sich an dem fehlenden bekannten pro-neurogenen Effekt auf reife Neurone zeigte24,60. Im Gegensatz zu Melatonin, wirkt ein aktiver Lebensstil in einer reizreichen Umgebung nur den Konsequenzen von zirkadianer Dysrhythmie auf zellulärer Ebene entgegen. Eine Erklärung könnte sein, dass eine reizreiche Umgebung vor allem das Überleben reifer Neurone positiv beeinflusst, zirkadiane Dysrhythmie jedoch vor allem die Zellregeneration stört. Eine effektive Therapie zirkadianer Dysrhythmie würde nicht nur Vielfliegern und Schichtarbeitern nützen, sondern auch Unfällen und Unglücken, wie der Katastrophe von Tschernobyl, vorbeugen61. Lebensstilinterventionen scheinen sich – im Gegensatz zu Melatonin – dafür jedoch nur limitiert zu eignen.
Das hier verwendete experimentelle Paradigma wird genutzt, um „Jetlag“ durch Manipulation der Hell-/Dunkelphasen in Tieren und Menschen zu simulieren27,28,62,63. Einschränkungen sind, dass die Tiere keiner erhöhten Strahlung wie im Flugzeug ausgesetzt sind und nicht auszuschließen ist, dass andere Schlafstörungen die Ergebnisse beeinflusst haben könnten. Allerdings beugten wir Schlafdeprivation und -fragmentierung durch die alleinige Kürzung der Dunkelphase vor.
In unserer Sport-Diät-Studie repräsentierte die präventive Gruppe eine in der Adoleszenz begonnene HFD, während in der therapeutischen Gruppe erst im Erwachsenenalter die HFD begonnen wurde. Wir zeigten, dass die in der Adoleszenz initiierte HFD die Gedächtnisflexibilität einschränkte. Die limitierte Gedächtnisflexibilität ging dabei mit einem Verlust DCX+-Neuronen einher. Physische Aktivität konnte jedoch sowohl den zellulären als auch den kognitiven Defiziten entgegenwirken. Unsere Ergebnisse sind vergleichbar mit denen einer früheren Studie, die ebenfalls eine verminderte Neurogenese und schlechtere Gedächtnisleistung in Mäusen nachweisen konnte, die in der Adoleszenz eine HFD bekamen, jedoch nicht in Mäusen, die erst im Erwachsenenalter eine HFD erhielten30. Ob Übergewicht in der Adoleszenz auch zu einem erhöhten Risiko für Demenz im Menschen führt, steht weiterhin zur Diskussion64. Unsere Studie unterstützt jedoch die Hinweise darauf, dass die Adoleszenz eine vulnerable Phase ist, in der der Konsum einer HFD zu kognitiven Defiziten im Erwachsenenalter führen kann. Diesen Konsequenzen kann jedoch durch erhöhte physische Aktivität entgegengewirkt werden.
Unsere Sport-MPTP-Studie zeigte, dass Dopamindepletion kurzzeitig zu verminderter neuraler Regeneration und Lernfähigkeit führt und langfristig die spatiale Kognition einschränkt. Damit ergänzten wir Studien, die bereits eine veränderte neurale Zellproliferation in MPTP-behandelten Tieren nachweisen konnten65,66. Die physisch aktiven Mäuse zeigten vermehrt fortgeschrittene neuronale Vorläuferzellen und glichen den kognitiven Leistungsabfall der MPTP-Tiere wieder aus. Diese Resultate indizieren, dass Aktivität die neuronale Reifung und Differenzierung beschleunigte und die schneller heranreifenden Neuronen zu einer besseren
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abhängigen spatialen Kognition beitragen konnten. Sowohl in der Kurzzeit- als auch in der Langzeitgruppe kam es nach MPTP-Behandlung bei reduziertem Dopamingehalt zu einem verstärkten Dopaminumsatz und kompensatorisch in der Kurzzeitgruppe auch zu einer Hochregulation der exzitatorischen Dopaminrezeptoren. Im Gegensatz zu vorherigen Studien hatte physische Aktivität keinen restaurativen Effekt auf die Dopaminkonzentration. Stattdessen beschleunigte physische Aktivität den Dopaminumsatz. Möglicherweise wird dem Verlust neuraler Zellen entgegengewirkt, in dem vermehrt Dopamin in den synaptischen Spalt ausgeschüttet wird und die Anzahl der Dopaminrezeptoren erhöht wird. Insgesamt konnte Aktivität den MPTP-Effekten auf neuronaler, molekularbiologischer und kognitiver Ebene zumindest teilweise entgegenwirken. Menschen erkranken immer öfter an neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson. Ein Ansatz den körperlichen und kognitiven Konsequenzen vorzubeugen sind Lebensstilinterventionen. Dabei verdeutlichte unsere Studie jedoch, dass Lebensstilinterventionen wie physische Aktivität unterstützend wirken können, als alleinige Intervention jedoch nicht alle Folgen ausgleichen können.
Derzeit sind kontrollierte Experimente über adulte Neurogenese nur tierexperimentell realisierbar, dennoch ist Vorsicht geboten Resultate aus Tierexperimenten über Lebensstil auf den Menschen zu übertragen. Lebensstil ist ein komplexes Konstrukt, das aus multiplen aktiven und passiven Faktoren besteht. Genetisch identische Tiere bieten jedoch die Möglichkeit einzelne Aspekte von Lebensstil kontrolliert zu simulieren und deren Einfluss auf Zellen und Kognition zu analysieren. Trotz der Einschränkungen waren die Experimente erste Schritte zum besseren Verständnis vom pro-neurogenen und -kognitiven Potenzial von Lebensstilinterventionen. Für bessere Einblicke sind jedoch komplexere Konstrukte notwendig, um „menschlichere“ Situationen zu simulieren.
4.1. Schlussfolgerung
In einer stetig alternden Gesellschaft, die zunehmend von einem passiven Lebensstil geprägt ist und in der die Prävalenz neurodegenerativer Erkrankungen steigt, wären Lebensstilinterventionen ein weltweit verfügbares und kosteneffizientes Mittel, um Morbidität und Mortalität vorzubeugen. Auch wenn es schwierig ist, Lebensstil-Experimente in Mäusen auf den Menschen zu übertragen, zeigt diese Arbeit, dass ein aktiver Lebensstil für den Aufbau einer neurogenen und kognitiven Reserve bedeutsam ist. Es ist erforderlich, physisch aktiv zu sein und mit seiner Umgebung direkt zu interagieren, um neurodegenerativen Prozessen mit abträglichen Folgen für die adulte hippokampale Neurogenese und das spatiale Gedächtnis entgegenzuwirken. Lebensstilveränderungen sind dabei zwar kein Allheilmittel, jedoch ein Weg um die Passivität unserer Gesellschaft zu überwinden und deren Folgen entgegenzuwirken, sowie eine Möglichkeit, als unterstützende Therapieform bei neurodegenerativen Erkrankungen zu wirken.
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