Aus der
Abteilung für Klinische Immunpathologie und perinatale Immunologie
Universitätskinderklinik
Hamburg Eppendorf
(Komm. Direktor Prof. Dr. Ullrich)
Der Neuraminidase Inhibitor des Menschen
-ein Immunglobulin G
der Subklasse 1
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von
Frauke Lütt
aus Hamburg
Hamburg, 1999
Inhalt
Seiten
1. Einleitung 06 - 10
2. Problemstellung 11 - 12
3. Methoden und Materialien 13 - 27
3.1. Nachweis eines Neuraminidase Inhibitors 13 - 21
3.1.1. Isolierung des Immunglobulin G 13 - 15
3.1.1.1. Herstellung einer Protein G Sepharose 4 Fast Flow Säule 14 3.1.1.2. Vorbereitung der Probe 14 3.1.1.3. Versuchsaufbau 14 3.1.1.4. Lauf der Protein G Sepharose 4 Fast Flow Säule 15 3.1.1.5. Rekonzentrierung der gewonnenen Auftrennungen 15
3.1.2. Isolierung der Immunglobulin G Subklassen 15 - 17
3.1.2.1. Herstellung einer Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule 16 3.1.2.2. Vorbereitung der Probe 16 3.1.2.3. Versuchsaufbau 16 3.1.2.4. Lauf der Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule 17 3.1.2.5. Rekonzentrierung der gewonnenen Auftrennungen 17
3.1.3. Radiale Immunodiffusion zur Quantifizierung der
Immunglobulin G Subklassen 17 - 19
3.1.3.1. Vorbehandlung der Proben 18 3.1.3.2. Versuchsdurchführung 18
3.1.3.3. Auswertung 18 - 19
3.1.4. Hämagglutinationstest zum Nachweis einer Neuraminsäureab-spaltung aus Erythrozytenmembranen 19
3.1.5. Indirekte Bestimmung des Neuraminidase Inhibitors
im Serum 19 - 21
3.1.5.1. Testprinzip 19 - 20
3.1.5.2. Herstellung von Testerythrozyten 20 Seiten 3.1.5.3. Neuraminidase - Behandlung von Erythrozyten 20
3.1.5.4. Standardisierung der Neuraminidaseaktivität 20 3.1.5.5. Neuraminidase Inhibition 21 3.1.5.5.1. Serumansatz 21 3.1.5.5.2. Erythrozytenansatz 21 3.1.5.5.3. Hämagglutinationstest 21 3.1.5.5.4. Auswertung 21 3.1.5.5.5. Kontrollen 21
3.2. Bestimmung des Pneumokokkenneuraminidase
Inhibitors bei Früh- und Neugeborenen 22 - 23
3.2.1. Serumprobe eines adulten Blutspenders 22
3.2.2. Serumproben von 116 Früh- und Neugeborenen 22
3.2.3. Testansatz 22
3.2.4. Neuraminidase 22
3.2.5. Patientenkollektiv 23
3.3. Material und Reagenzien 23 - 27
3.3.1. Material für die Säulenchromatographien 24
3.3.1.1. Chromatographiesäule (Protein G) 24 3.3.1.2. Chromatographiesäule (Protein A) 24 3.3.1.3. Photometer 24 3.3.1.4. Peristaltikpumpe 24 3.3.1.5. Kühlzentrifuge 24 3.3.1.6. Titrierpumpe/Gradientenmischer 24
3.3.2. Puffer für die Säulenchromatographie 24 - 25
3.3.2.1. Puffer A /Equilibrierungspuffer (für Protein G) 24
3.3.2.2. Puffer B /Elutionspuffer (für Protein G) 24
3.3.2.3. Vorlagepuffer (für Protein G) 25
3.3.2.4. Puffer A /Startpuffer (für Protein A) 25
3.3.2.5. Puffer E (für Protein A) 25
3.3.2.6. PBS Puffer 25
Seiten
3.3.3. Säulengele 25
3.3.3.2. Protein A Sepharose 4 Fast Flow 25
3.3.4. Proben für die Säulenläufe 26
3.3.5. Material und Reagenzien für die radiale Immunodiffusion 26
3.3.6. Neuraminidasen verschiedener Bakterien 26
3.3.7. Lectin aus Arachis hypogeae (Anti T Ah) 26
4. Ergebnisse 27 - 40
4.1. Neuraminidasen verschiedener Bakterien 27 - 29
4.1.1. In - vitro Wirksamkeit der Neuraminidasen verschiedener
Bakterien auf die Erythrozytenmembran 27 - 28 4.1.2. Spezifität des Neuraminidase Inhibitors im menschlichen
Serum 28 - 29
4.2. Isolierung des Immunglobulin G aus menschlichem
Serum 29 - 31
4.2.1. Isolierung der Immunglobuline G mit Hilfe einer Protein G
Sepharose 4 Fast Flow Säule 29 - 30
4.2.2. Charakterisierung des Neuraminidase Inhibitors als ein
Immunglobulin G 30 - 31
4.3. Isolierung der Immunglobulin G Subklassen aus menschlichem Serum und Bestimmung der Subklasse, die den Neuraminidase Inhibitor enthält 32 - 36
4.3.1. Isolierung der Immunglobulin G Subklassen mit Hilfe einer
Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule 32 - 33
4.3.2. Bestimmung des IgG - Subklassengehalts der isolierten
Peaks durch radiale Immunodiffusion 33 - 34
Seiten
4.3.3. Bestimmung des Neuraminidase Inhibitors in den
4.4. Der Neuraminidase Inhibitor bei Früh- und Neugeborenen 36 - 40 5. Disskussion 41 - 47 6. Zusammenfassung 48 7. Literaturverzeichnis 49 - 53 8. Danksagung 54 9. Lebenslauf 55 10. Erklärung 56
1.
Einleitung
Die pädiatrische Intensivmedizin hat durch grundlegende Fortschritte die Prognose schwerer Erkrankungen im Kindesalter dramatisch verbessern können. Systemisch generalisierende Infektionen begründen jedoch weiterhin ein erhebliches
Mortali-tätsrisiko im frühen Kindesalter, da sie nicht selten durch eine in -vivo Wirkung mi-krobieller Toxine kompliziert werden.
Auch bei rascher und wirksamer antimikrobieller Therapie des Erregers erleiden die erkrankten Kinder häufig Schädigungen, die durch die im Körperkreislauf zirkulie-renden Toxine verursacht werden. Das Ausmaß der kreisenden Toxine beeinflußt somit im wesentlichen den Schweregrad und die Prognose der Erkrankung.
Zu diesen Toxinen zählt man die Neuraminidase, deren lebensbedrohliche Aktivität erstmals 1951 von Holländer beschrieben wurde (15). Sie wurde seitdem von zahl-reichen Autoren als Auslöser schwerer hämolytischer Anämien (19,20,26,29,32) und gelegentlich sogar letal verlaufender Hämolytisch - urämischer - Syndrome be-stätigt. (2,4,10,16,18,23,33).
Unter den Neuraminidase - bildenden Bakterien befinden sich eine Vielzahl von Er-regern, die als wichtige und häufige Erreger von Infektionen im Kindesalter be-zeichnet werden können.
Bakterien Gruppe Erreger Literatur
Pseudomonaceae Pseudomonas
(fluorescens,stuzeri,ae-ruginosa)
(8)
Lactobacillaceae Diplococcus pneumoniae
Streptococci
Lactobacillus bifidus
(6) (8) (22)
Bacillaceae Clostridium (perfringens,
tretium,septicum, sordelli) (8)
Spirillaceae Vibrio cholerae (8)
Enterobacteriaceae Klebsiella aeruginosa (8)
Abb. 1.1. Neuraminidase - bildende Bakterien (36)
Dabei erlangen altersabhängig unterschiedliche Erreger Bedeutung.
Im Bereich der Neonatologie kommt eine besondere Bedeutung Klebsiella aeru-ginosa und dem Clostridium perfringens zu. Sie sind häufige Auslöser einer nekroti-sierenden Enterocolitis bei Früh- und Neugborenen.
Im Säuglings und Kleinkindesalter ist insbesondere Streptococcus pneumoniae als Erreger der frühkindlichen Meningitis und Pneumonie hervorzuheben.
Die genannten Erkrankungen bergen im Falle der kindlichen Sepsis ein erhöhtes Risiko einer sytemischen in - vivo Wirkung mikrobieller Neuraminidase.
Der klinische Verlauf einer schweren septischen Infektion mit Neuraminidase - bil-denden Bakterien nimmt meist einen typischen Verlauf.
Nach einer kurzen Latenzphase der Besserung der Symptome unter antibiotischer Therapie, kommt es bei Abkapselung des Erregers in Abzesse oder Empyeme am 3. - 5. Krankheitstag zur systemischen Enzymwirkung.
Die ungehemmt frei zirkulierende Neuraminidase führt zur Schädigung von Erythro-zytenmembranen und Thrombozyten, wodurch eine Hämolyse und eine Thrombo-zytopenie mit Blutungsneigung entsteht.
Gleichzeitig werden Endothelzellen kleiner Arteriolen und Kapillaren zerstört mit konsekutiver Ausbildung von peripheren Mikrothromben und daraus resultierenden Durchblutungsstörungen. Es folgen Ödeme und Nekrosen, die vor allem den rena-len Cortex betreffen und somit eine Niereninsuffizienz auslösen können.
Die Patienten können im Bild des Hämolytisch urämischen Syndroms am Herz -Kreislaufversagen versterben (10,16,26,27).
Als frühzeitiger Marker der systemischen in - vivo Wirkung mikrobieller Neuramini-dase wurde die Polyagglutinabilität von Erythrozyten beschrieben.
Die pathophysiologische Klärung der Symptome des durch Neuraminidasewirkung entstandenen Hämolytisch - urämischen - Syndroms zeigt mehrere Mechanismen. Als Ursache der akuten Hämolyse wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen eine Neuraminsäure Abspaltung aus Sialogycoproteinen der Erythrozytenmembranen festgestellt, in deren Folge ein Kryptantigen T freigelegt wird, das je nach dem Ausmaß der Abspaltung zur gesteigerten Phagozytose bis zur vollständigen intra-vasalen Lyse der Zellen führt (1,2).
Auch für Thrombozyten wurde eine verkürzte Lebenszeit festgestellt (7,13). In der Niere verquellen im Tierversuch Endothelzellen der Glomerulum Kapillaren fibrinös und exponieren unter Neuraminidase - Einwirkung ebenfalls ein
T-Kryptantigen (28). Nekrosen dieser Endothelien und eine Aktivierung der Thrombozytenaggregation durch enzymatische Sialinabspaltung aus dem von Willebrand -Faktor (-Faktor 8) führen zur Ausbildung von Mikrothromben (30).
Es werden Herz - Myozyten angegriffen, wo Neuraminsäure - Abspaltungen aus Glycokonjugaten des Sarkolemms eine pathologische Steigerung des Calcium -Influx bewirken mit Kontraktionssteigerung bis zum Stillstand bei kompletter Arrhyt-mie (sog. stoned heart) (38).
Fallbeispiel 1
(36)Ein nur 1100 g schweres, bei progredienter Placentainsuffizienz in der 34. Schwan-gerschaftswoche per Sectio caesarea geborenes, dystrophes, männliches Frühge-borenes fiel am 7. Lebenstag durch eine dramatische Veränderung seines Allge-meinzustandes auf.
Mit den Zeichen einer Nabelvereiterung, massivem galligem Erbrechen und frisch-blutigen Stühlen kündigte sich eine schwere nekrotisierende Enterokolitis an. Trotz sofortiger antibiotischer Therapie entwickelten sich innerhalb der nächsten 12 Stunden schwerste systemische Infektzeichen. Mit Hb - Abfall und Steigerung des Bilirubin im Serum, rasch progredienter Thrombozytopenie, sowie einer durch Hämaturie und Proteinurie eingeleiteten Anurie, zeigten sich die Leitsyptome eines Hämolytisch - urämischen - Syndroms, wie es bei Früh-und Neugeborenen im Zu-sammenhang mit Infektionen durch Neuraminidase - bildende Bakterien beschrie-ben wird. Auf den Erythrozyten wurde eine Exposition des T-Kryptantigen als Zei-chen der in - vivo Wirkung mikrobieller Neuraminidase nachgewiesen.
Die Therapie bestand neben der Fortsetzung der antibiotischen Therapie und voll-ständiger enteraler Nahrungskarenz in Blutaustauschtransfusionen zur Toxinelimi-nation.
Trotz intensivmedizinischer Therapie verschlechterte sich der Zustand des Kindes weiterhin. Bei zunehmend gespanntem Abdomen wurde röntgenologisch eine Darmperforation nachgewiesen, die eine sofortige explorative Laparatomie notwen-dig machte.
Im Peritonealabstrich ließen sich, in Übereinstimmung mit den in Nabelabstrichen gefundenen Erregern, Neuraminidase - bildende Klebsiellen nachweisen.
Nach zwischenzeitlicher Stabilisierung im Gefolge der Blutaustauschtransfusion, entwickelte sich postoperativ am 10. Lebenstag ein Rezidiv des Hämolytisch - urä-mischen - Syndroms, so daß eine erneute Revision und ausgiebige Spülung der Bauchhöhle zur Beseitigung des Toxinreservoirs des Erregers notwendig wurde. Im Gefolge dieser Maßnahme gestaltete sich die weitere Behandlung des Frühge-borenen nach Überwindung aller Infektions - Symptome unproblematisch.
Der Junge konnte bei einem Konzeptionsalter von fast 40 Wochen und einem Ge-wicht von 2360 g nach Hause entlassen werden.
Fallbeispiel 2
(34,36)Ein 1,2 Jahre alter, bis dahin vollkommen gesunder Junge erkrankte, während einer Extensionsbehandlung einer Hüftluxation 3. Grades, an einer röntgenologisch
do-kumentierten Oberlappenpneumonie. Diese wurde antibiotisch behandelt und der Junge entfieberte zunächst.
In der Nacht zum 4. Krankheitstag verschlechterte sich der Allgemeinzustand des Jungen dramatisch. Unter erneutem Fieberanstieg entwickelte er eine
Tachy-/Dyspnoe bei Pleuraempyem, Fußrückenödeme und eine arterielle Durch-blutungsstörung mit peripherem Pulsverlust.
Das blasse Hautkolorit mit Sklerenikterus ließ eine hämolytische Anämie vermuten. Als Ausdruck einer Thrombozytopenie entstanden Petechien im Halsbereich, die Oligo-/Anurie zeigte ein beginnendes Nierenversagen an.
Der Junge bot das Bild eines Hämolytisch - urämischen - Syndroms.
Die Laborparameter bestätigten die Diagnose. Es fanden sich Zeichen einer schwe-ren bakteriellen Infektion, der Hb war auf 7 g/dl abgefallen, das Bilirubin und die LDH angestiegen. Die Thrombozyten betrugen nur noch 19/nl. Das Kreatinin war auf 2,1 g/dl der Harnstoff auf 67 mg/dl angestiegen und dokumentierten damit das beginnende Nierenversagen.
Die Therapie bestand in Austauschtransfusionen, Spüldrainagen des Empyems, antibiotischer Behandlung und low dose Heparinisierung.
Es folgten insgeamt 18 Hämodialysen mit weiteren Transfusionen und Thrombo-zyten Substitutionen bis zur endgültigen Entlassung des Jungen nach Hause am 46. Tag nach Krankheitsbeginn.
Neben der symptomatischen Behandlung der Erkrankung und der raschen und wirksamen Erradikation des Erregers stützte sich die bisherige Therapie im wesent-lichen auf die Blutaustauschtransfusionen zur Toxinelimination und eine frühzeitige Hämodialyse bei größeren Kindern.
Die Einführung der Blutaustauschtransfusionen in das Therapiekonzept hatte in den Jahren 1980-1985 eine Senkung der Mortalität der Erkrankung von nahezu 100% auf 20% erbracht (35). Die rechtzeitige Einleitung dieser sehr invasiven Maßnahme bei schwerstem Krankheitsverlauf bestimmte daher bisher im wesentlichen die Überlebensprognose.
Die Wirksamkeit dieser Blutaustauschtransfusionen führte man auf die Substitution zellulärer Blutbestandteile, wie Erythrozyten und Thrombozyten sowie plasmatischer Proteine und dieToxinbeseitigung zurück.
In therapiebegleitenden wissenschaflichen Untersuchungen der Abteilung für klini-sche Immunpathologie der Universitätskinderklinik Hamburg konnte jedoch gezeigt werden, daß mit den Blutaustauschtransfusionen nicht nur eine Toxinbeseitigung
erreicht wurde sondern auch ein Neuraminidase Inhibitor, der im humanem Serum Erwachsener nachweisbar war, offensichtlich substituiert wurde (35,31).
2.
Problemstellung
Frühere Untersuchungen ließen vermuten, daß es sich bei dem Neuraminidase In-hibitor im menschlichen Serum um ein Protein handelt, das spezifisch an Neurami-nidase bindet und diese in ihrer Aktivität hemmt.
Dieser Inhibitor ließ sich in Erwachsenenseren aller Blutgruppen und in Immunglo-bulinpräparaten nachweisen.
Weiterführende Untersuchungen hatten gezeigt, das Mütter und Neugeborene ähn-liche Neuraminidase Inhibitorspiegel aufwiesen, so daß angenommen wurde, daß
es sich um ein Immunglobulin handeln könnte, das diaplazentar übertragbar war (31).
Den erkrankten Kindern fehlte der Inhibitor oder er war nur noch in Spuren nach-weisbar. Dabei blieb zunächst ungeklärt, ob das Fehlen des Inhibitors die Neurami-nidase Ausbreitung begünstigte oder die systemische Toxinausbreitung diesen ver-brauchte. Eine Klärung seiner pathophysiologischen Bedeutung könnte jedoch eventuell therapeutische Konsequenzen erwachsen lassen.
Die Problemstellung der vorliegenden Arbeit war daher eine nähere Charakterisie-rung des Neuraminidase - Inhibitors unter besonderer Berücksichtigung folgender Fragen:
• Handelt es sich bei diesem Inhibitor tatsächlich um ein Immunglobulin und wenn ja kann man ihn einer speziellen Immunglobulin Klasse bzw. Subklasse zuord-nen?
• Richtet sich dieser Neuraminidase Inhibitor spezifisch gegen ausgewählte bakte-rielle Neuraminidasen oder handelt es sich um einen übergreifenden Inhibitor?
• Können aus der Charakterisierung des Inhibitors Rückschlüsse auf seinen diaplazentaren Transport und somit seine Bedeutung bei Früh- und Neugebore-nen gezogen werden?
In der Analyse dieser Ergebnisse wäre zu diskutieren, ob Kinder mit erworbener oder angeborener Inhibitor Defizienz, oder vor Beendigung des diaplazentaren Anti-körper Transports geborene Frühgeborene, besonders durch Neuraminidase - bil-dende Bakterien gefährdet sind und somit zumindest in diesen Fällen eine Substitu-tion des Inhibitors möglich und sinnvoll wäre.
Als Testmodell zur Untersuchung der biologischen Wirksamkeit mikrobieller Neu-raminidase wurde die Expression des Kryptantigen T nach enzymatisch - toxischer Desialisierung menschlicher Erythrozyten gewählt.
3.
Methoden und Materialien
3.1.
Nachweis eines Neuraminidase Inhibitors
3.1.1.
Isolierung des Immunglobulin G
Für die Isolierung des Immunglobulin G aus menschlichem Serum wurde die Me-thode der Säulenchromatographie mit Protein G 4 Fast Flow von R. Kühlke, B. Wilske, G. Schierz, beschrieben bei Pharmacia LKB aktuell Heft 3, Jahrgang 3, 1988 verwendet.
Protein G besitzt die Eigenschaft, die Fc Regionen der Subklassen der Immunglo-buline G vieler Säugetierarten an sich zu binden und dabei die Antigen - bindende Fab - Region unbeeinflußt zu lassen. Somit eignet sich Protein G gut zur Isolierung und Aufreinigung von Subklassen und Fragmenten von Immunglobulinen G aus jeder Art von biologischer Flüssigkeit oder Zell - Kultur - Medium. Es bindet dabei zu gleichen Teilen die IgG Subklassen: IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Das in E coli her-gestellte Protein G, MW 17000 Dalton, besitzt dabei zwei IgG bindende Regionen, wobei die Albumin bindende Region, die im nativen Protein G vorhanden ist, gene-tisch entfernt wurde, so daß es nicht mehr zu störenden Kreuzreaktionen kommen kann.
Die Bindungskapazität des Protein G hängt von vielen Faktoren ab wie zum Beispiel dem Ursprung des Immunglobulin G. So bindet es Immunglobulin G von Kühen, Schafen oder Hasen deutlich besser als das von Menschen. Andererseits spielen Versuchsdurchführung, IgG Gehalt der Probe, Durchflußrate oder der eingesetzte Bindungspuffer eine entscheidende Rolle. So haben wir uns um optimale und kon-stante Versuchsbedingungen bemüht.
Immunglobulin G wird im neutralen pH Bereich an die aus Protein G bestehende Säule gebunden. Andere Serumbestandteile sowie die Immunglobuline A, E und M durchlaufen die Säule und zeigen sich auf der photometrische Abbildung als erster ungebundener Peak. Im zweiten Schritt wird das Immunglobulin G im sauren pH Bereich aus der Säule gelöst, in einer Base aufgefangen und abgepuffert, um Schädigungen zu vermeiden. Dies zeigt sich photometrisch als zweiter, kleinerer Peak. Um eine optimale Auftrennung und eine größtmögliche Reinheit der Proben zu erreichen wurde die Probe des ersten Peaks ein zweites Mal auf die Säule auf-getragen um noch vorhandenes IgG aus der Probe zu entfernen.
Im Versuch trennten wir insgesamt 800 µl humanes 0 - Serum aus einem Spender-pool auf.
3.1.1.1. Herstellung einer Protein G Sepharose 4 Fast Flow Säule
Protein G Sepharose 4 Fast Flow wird fertig vorgequollen und in 20%igen Alkohol aufgeschwemmt geliefert.
Vor dem Packen des Gels muß der Alkohol entfernt werden. Dazu wurde das Gel mehrmals mit PBS Puffer aufgefüllt, in einer Kühlzentrifuge bei 2000 Umdrehungen zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Anschließend wurde das Gel mit dem Startpuffer (Puffer A) resuspendiert.
Die Säule wurde bei einer Höhe von 12.5 cm und einem Durchmesser von 1 cm mit entsprechendem Gelvolumen gepackt und mit mindestens doppeltem Gelvolumen Puffer A equilibriert.
3.1.1.2. Vorbereitung der Probe
Als Probe wurde ein humanes 0 Serum verwendet, das aus einem Spenderpool gesunder Probanden (4 - 10 Spender) gewonnen wurde. Das Serum wurde frisch entnommen und direkt verwendet.
Um eine optimale Anbindung des im Serum enthaltenen Immunglobulin G an die Säule zu garantieren, sollten Probe und Startpuffer den gleichen pH Wert (7.0) be-sitzen. Aus diesem Grunde wurde das Serum zentrifugiert und gegen den Start-puffer mit Hilfe eines Dialysierschlauches, Porengröße 5mm über 12 h in einem Kühlraum dialysiert.
3.1.1.3. Versuchsaufbau
Der Einlauf der Protein G Sepharose 4 Fast Flow Säule wurde mit einer Peristaltik-pumpe verbunden, die kontinuierlich einen vorgegebenen Puffer durch die Säule pumpte. Der Auslauf der Säule wurde an ein Photometer angeschlossen, das auf eine Welllenlänge von 206 nm eingestellt war. Mit diesem verbunden war ein Auf-zeichnungsgerät, das die Extinktion während der Auftrennung der Serumprobe auf Milimeterpapier kontinuierlich festhielt. Die Papiergeschwindigkeit betrug dabei 2 mm/min. Dem Photometer nachgeschaltet befand sich ein Multirac Fractionierer, der jeweils 50 Tropfen der durchgelaufene Probe in Reagenzgläsern auffing, die bei der Elution der Säule jeweils 1 ml Tris/HCl Lösung enthielten.
3.1.1.4. Lauf der Protein G Sepharose 4 Fast Flow Säule
Nach Eichung des Photometers wurden 400 µl Serum mit einer Pipette auf die Säule aufgetragen, und der Einlauf der Säule mit der Peristaltikpumpe verbunden, die nun kontinuierlich Puffer A durch die Säule pumpte.
Die Anbindung des Immunglobulin G erfolgte bei einer Durchflußrate des Puffer A von 0.56 ml/min, dies entsprach 14 Tropfen pro Minute, die mit Hilfe der Peristaltik-pumpe eingestellt wurden.
Die Elution des gebundenen Immunglobulin G erfolgte, bei gleicher Durchflußrate, in einem niedrigen pH Bereich mit einem Glycin / HCL Puffer pH 2.7 (Puffer B). Da Immunglobulin G auf sehr niedrige pH Werte mit einem Aktivitätsverlust reagieren kann, wurde die eluierte Probe in einer basischen Tris / HCL Lösung pH 9.0
aufge-fangen (Vorlagepuffer). Es wurden 2 ml Eluat pro 1 ml Tris / HCL Lösung aufgefan-gen. Mit Hilfe des Photometers wurden die Auftrennungen sichtbar gemacht und in einem Multirac Fraktionierer aufgefangen. Alle Messungen fanden bei 7° C in einem Kühlraum statt.
3.1.1.5. Rekonzentrierung der gewonnenen Auftrennungen
Die so entstandenen Auftrennungen der Serumprobe wurden gesammelt und mit Hilfe einer Amicon Ultrazentrifugationsmembran GF 50 in einer Kühlzentrifuge bei 2000 Umdrehungen auf ihre Ausgangsmenge rekonzentriert und gegen PBS Puffer dialysiert.
3.1.2.
Isolierung der Immunglobulin G Subklassen
Für die Isolierung der Immunglobulin G Subklassen richteten wir uns nach einer Methode, die im Journal of Immunological Methods, 31, 211-217, (1979)von R. Du-hamel, P. Schur, K. Brendel und E. Meezan beschrieben wurde (9).
Es wurde eine Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule hergestellt.
Das in Staphylococcus aureus hergestellte Protein A ist ein Protein mit einem MW von 42000 Dalton.Es besitzt 5 Bindungsstellen, die eine besondere Affinität zur Fc - Region des IgG besitzen, dabei jedoch die Antigen - bindende Region unbe-einflußt lassen.
Bei neutralem pH 7.0 bindet Protein A die IgG Subklassen IgG1, IgG2 und IgG4. IgG3 wird bis auf einen sehr geringen Teil nicht gebunden und erscheint in der pass - through fraction des Säulenlaufs.
Die humanen IgG - Subklassen IgG1 und IgG2 können durch einen linearen pH Gradienten getrennt werden. IgG2 wird bei einem pH von 5.0 - 4.6, IgG1 bei einem pH von 4.3 - 3.9 aus der Säule gelöst. Die einzelnen pH Werte der Elution können aufgrund der Geschwindigkeit des Abfalls des linearen Gradienten, der Probe oder der Durchflußrate schwanken. Das pH Intervall von 0.4 innerhalb dieser Fraktionen bleibt jedoch immer erhalten.
IgG4 läßt sich durch keinen spezifischen pH Wert aus der Säule lösen. Vielmehr erscheint es während des gesamten Säulenlaufs unabhängig vom pH Wert.
3.1.2.1. Herstellung einer Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule
Protein A Sepharose 4 Fast Flow wird als Trockenpulver geliefert. Vor dem Packen der Säule wird das Trockenpulver über 12 h in einem Gefäß mit PBS Puffer in ei-nem Kühlraum vorgequollen.
Die Säule wurde bei einer Höhe von 22.5 cm und einem Durchmesser von 1 cm mit entsprechendem Gelvolumen gepackt und über 2 Stunden mit dem Startpuffer A equilibriert.
3.1.2.2. Vorbereitung der Probe
Es wurde ein humanes 0 Serum als Probe verwendet, das einem Spenderpool (4 -10 Spender) gesunder Probanden entstammte. Das Serum wurde frisch entnom-men, zentrifugiert und gegen PBS Puffer über 12 h in einem Kühlraum mit Hife ei-nes Dialysierschlauches (Porengröße 5 mm) dialysiert.
3.1.2.3. Versuchsaufbau
Die Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule wurde mit einer Peristaltikpumpe ver-bunden, die kontinuierlich einen vorgegebenen Puffer bzw. ein Puffergemisch durch die Säule pumpte. Dieser Pumpe vorgeschaltet befand sich ein Gradientenmischer, der in zwei Vorratsgefäßen Puffer A und Puffer E in einem Verhältnis von 1:2 ent-hielt.
Der Auslauf der Säule war mit einem Photometer verbunden, das bei einer Wellen-lange von 206 nm die Extinktion während der Auftrennung bestimmte und mit Hilfe eines Aufzeichnungsgerätes auf Millimeterpapier festhielt. Die Papiergeschwindig-keit betrug dabei 2 mm/min.
Dem Photometer nachgeschaltet befand sich ein Multirac Fractionierer, der jeweils 50 Tropfen der durchgelaufenen Serumprobe in Reagenzgläser auffing.
3.1.2.4. Lauf der Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule
Nach Eichung des Photometers wurde 2 ml vorbehandeltes humanes 0 Serum auf-getragen und solange gewartet, bis das Serum vollständig in die Säule eingelaufen war. Dann wurde die Säule mit Puffer A gestartet. Mit Hilfe der Peristaltikpumpe wurde eine Durchflußrate von 0.8 ml/min eingestellt, dies entsprach 20 Tropfen pro Minute. Nachdem sich das Immunglobulin G an die Säule gebunden hatte und sich im photometrischen Bild der erste Peak (von der Säule nicht gebundene Serumbe-standteile) zeigte, wurde ein Gradientenmischer, in dem sich Puffer A und Puffer E in zwei Vorratsgefäßen im Verhältnis 1:2 befanden, zugeschaltet. Dieser Gradien-tenmischer erzeugte ein linear absteigenden pH - Fluß durch den eine Auftrennung der einzelnen IgG Subklassen erfolgte. Die Durchflußrate betrug dabei weiterhin 0.8 ml/min.
Die Auftrennungen wurden mit dem Photometer aufgezeichnet und in einem Multi-rac Fraktionierer aufgefangen. Alle photometrischen Messungen fanden bei 7° C in einem Kühlraum statt.
3.1.2.5. Rekonzentrierung der gewonnenen Auftrennungen
Jeder entstandene Peak der Auftrennung wurde, um gleiche Konzentrationsverhält-nisse zu erhalten, auf seine Ausgangsmenge von 2 ml mit Hilfe einer Amicon Ultra-zentrifugationsmembran GF 50 in einer Kühlzentrifuge bei 2000 Umdrehungen re-konzentriert. Um eine Zerstörungen der Immunglobuline zu vermeiden, wurden sie gegen PBS Puffer dialysiert. Anschließend wurden die Proben tiefgefroren.
3.1.3.
Radiale Immunodiffusion zur Quantifizierung der
Immun-globulin G Subklassen
Das Prinzip der radialen Immunodiffusion beruht darauf, daß eine direkte Korre-lation zwischen Antigenkonzentration und dem Quadrat des Ringdurchmessers während der Diffusion in Antikörperhaltigem Gel besteht. Bei vollständiger Diffusion ist diese linear.
Lösliche Proteine werden in kreisförmige Vertiefungen eines aus korrespondieren-den Antikörpern bestehenkorrespondieren-den Agarosegels aufgetragen. Das Antigen beginnt radial zu diffundieren und bildet am Äquivalenzpunkt mit dem Antikörper ein Immunoprä-zipitat. Das Ende der Diffusion ist erreicht, wenn das gesamte Antigen mit den Anti-körpern unter Bildung eines Präzipitatringes reagiert hat.
Da das Quadrat des Ringdurchmessers proportional zur Antigenkonzentration ist kann eine Standardkurve anhand von Kalibratoren mit bekannten Konzentrationen hergestellt werden und die unbekannte Konzentration der Probe anhand der Stan-dardkurve abgelesen werden.
Der Meßbereich für die Immunglobulinsubklassen beträgt dabei : IgG1: 1.4 - 14.0 g/l Serumprobe
IgG2: 0.8 - 8.0 g/l Serumprobe IgG3: 0.12 - 1.2 g/l Serumprobe IgG4: 0.05 - 0.5 g/l Serumprobe
3.1.3.1. Vorbehandlung der Proben
Es sollten immer frische oder tiefgefrorene Proben verwendet werden um ein best-mögliches Ergebnis zu erzielen.
In unserem Falle testeten wir tiefgefrorenes Serum und tiefgefrorene Proben aus einem Protein A Säulenlauf mit unbekannter Proteinkonzentration.
Bei den Proben unbekannter Proteinkonzentration war es notwendig, Versuchsan-sätze mit verschiedenen Konzentrationen der Proben anzusetzen, um die richtige Antigen/ Antikörper Relation zu erreichen, um somit ein genaues Ergebnis zu er-zielen.
3.1.3.2. Versuchsdurchführung
Für jede Subklasse wird eine eigene Immunodiffusionsplatte verwendet. In die Ver-tiefungen der Platte werden jeweils 5 µl aufgetaute Probe bzw. Kalibrator pipetiert. Die Platten werden gut verschlossen, gegen Austrocknung geschützt und flach lie-gend bei Raumtemperatur 72 h inkubiert.
Für die IgG1 und IgG2 Bestimmung wird eine Vorverdünnung der Serumproben von 1:10 vorgenommen. Für die Bestimmung von IgG3 und IgG4 kann das Serum un-verdünnt eingesetzt werden. Alle Verdünnungen werden mit 7 % bovinem Serumal-bumin angesetzt. Nach 72 Stunden Inkubation kann das Ergebnis abgelesen wer-den.
3.1.3.3. Auswertung
Bei dem Kalibrator handelt es sich um ein Kontrollserum, das eine vorgegebene Konzentration der jeweiligen IgG Subklasse enthält. Sie dient als Qualitätskontrolle des abgelaufenen Versuchs und der Erstellung einer Standardkurve.
Um eine Standardkurve erstellen zu können, werden für jede Subklasse unver-dünnter Kalibrator und Vorverdünnungen von 60 % und 10 % auf die Immunodiffu-sionsplatte aufgetragen. Von den jeweiligen Kalibratoren und ihren Vorverdünnun-gen werden die Ringdurchmesser nach 72 h; wenn die vollständige Diffusion er-reicht ist; abgelesen. Sie werden quadriert und gegen ihre bekannte Proteinkon-zentration (KonProteinkon-zentration des unverdünnten Kalibrators ist angegeben) auf Milime-terpapier aufgetragen. Durch die 3 Kalibratorpunkte wird die bestmögliche Stan-dardkurve gelegt.
Nun kann der Ringdurchmesser der Probe mit Hilfe eines Mikroskopes und eines Lineals abgelesen,ebenfalls quadriert und anhand der Standardkurve der Protein-gehalt bestimmt werden.
3.1.4.
Hämagglutinationstest zum Nachweis einer
Neuraminsäu-reabspaltung aus Erythrozytenmembranen
Es wird von Erythrozyten, aus deren Membran enzymatisch Neuraminsäure abge-spalten wurde, eine 5% ige Suspension hergestellt und jeweils ein Tropfen der Suspension gegen einen Tropfen einer geometrischen Verdünnungsreihe des Anti T Lectins aus dem Extrakt der Erdnuß(Arachis hypoguea = T-Ah) auf ein Bioplate aufgetragen. Nach 30 Minuten Inkubation wird das Ergebnis über einem Lichtkasten abgelesen. Liegt eine Schädigung der Erythrozytenmembran vor und eine T Kryp-tantigenstruktur frei, reagiert diese mit dem Anti T Lectin und es kommt zur Aggluti-nation der Erythrozyten. Diese AgglutiAggluti-nation wird als T - Polyagglutinabilität be-zeichnet. Das Ausmaß der Agglutinabilität kann als Hämagglutinationstiter angege-ben werden.
Der angegebene Titer ist die maximale geometrische Verdünnungstufe des Anti T - Ah ( = Arachis hypogaea), die gerade noch eine Agglutinationreaktion nachweist
3.1.5.
Indirekte Bestimmung des Neuraminidase Inhibitors
im Serum
3.1.5.1. Testprinzip
Es wird eine Neuraminidase mit standardisierter Aktivität mit einer geometrischen Verdünnungsreihe des zu untersuchenden Serums inkubiert. Diesem Neuraminida-se/ Serumansatz werden Testerythrozyten hinzugefügt und wiederum inkubiert. Zum Abschluß werden die so behandelten Testerythrozyten mit Anti T Lectin zur Agglutination gebracht.
Lag im Serum ein Neuraminidase Inhibitor vor, so hemmt dieser die ungebundene Neuraminidase, eine Abspaltung von Neuraminsäure und somit Freilegung des Kryptantigen T aus der Erythrozytenmembran der Testerythrozyten kann nicht statt-finden und somit auch nicht mittels Anti T Lectin nachgewisen werden. Lag im Se-rum kein oder nur eine geringe Menge an Neuraminidase Inhibitor vor, so kann die freie Neuraminidase ungehemmt an der Erythrozytenmembran der Testerythrozyten wirken, Neuraminsäure abspalten und das T Kryptantigen freilegen, das in der Ag-glutinationstechnik mittels Anti T Lectin nachgewiesen wird.
3.1.5.2. Herstellung von Testerythrozyten
Herstellung eines Erythrozytensediments, der Blutgruppe 0 Rh neg. cc dd ee Kell neg.,aus frischem EDTA-blut, nicht älter als 3 Tage, bei 4° C gelagert.
Dreimaliges Aufschwemmen der Erythrozyten mit PBS Puffer, zentrifugieren und dekantieren des Überstandes.
Nach der letzten Zentrifugation Aufschwemmen der Erythrozyten mit PBS Puffer als 5% ige Suspension.
3.1.5.3. Neuraminidase - Behandlung von Erythrozyten
Es wird eine geometrische Verdünnungsreihe einer Neuraminidase mit PBS Puffer hergestellt.
Jeweils 3 Tropfen jeder Verdünnungsstufe werden mit 5 Tropfen Erythrozytensedi-ment, 25 Tropfen PBS Puffer und 1 Tropfen CaCl 0,01M gemischt.
Nach 30 Minuten Inkubation bei 37° C im Wasserbad werden die Ansätze mit PBS Puffer aufgeschwemmt, zentrifugiert und dekantiert. Dieses wird zweimal wieder-holt.
Anschließend werden von allen so behandelten Ansätzen 5%ige Suspensionen hergestellt.
3.1.5.4. Standardisierung der Neuraminidaseaktivität
Die Suspensionen Neuraminidase behandelter Erythrozyten werden gegen eine geometrische Verdünnungsreihe von Anti T Ah im Verhältnis 1:1 auf ein Bioplate aufgetragen. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird der Agglutinati-onstiter über einem Lichtkasten abgelesen.
Die Neuraminidase sollte in standardisierter enzymatischer Aktivität die Erythro-zytenmembran der Testerythrozyten so desialisieren, daß sie mit dem Anti T Lectin bis zur geometrischen Verdünnungsstufe 1:8 reagieren und somit ein Anti T Ah (Arachis hypogaea) Titer von 8 nachgewiesen werden kann.
3.1.5.5. Neuraminidase Inhibition
3.1.5.4.1. Serumansatz
Es wird eine geometrische Verdünnungsreihe mit 400 µl des Probandenserums in CaPBS hergestellt. Zu jeder Verdünnungsstufe wird die gleiche Menge standardi-sierte Neuraminidase gegeben. Die Inkubation erfolgt bei 37 °C im Wasserbad über 30 Minuten.
3.1.5.5.2. Erythrozytenansatz
Zum Neuraminidase/Serumansatz werden 400 µl einer 5 % igen Testerythrozyten-suspension pipettiert. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C im Waserbad werden die Ansätze mit PBS aufgeschwemmt, zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Abschließend werden die so behandelten Testerthrozyten gewaschen und mit PBS Puffer auf 5 % aufgeschwemmt.
3.1.5.5.3. Hämagglutinationstest
Die so enstandenen Erythrozytensuspensionen werden jeweils im Verhältnis 1:1 gegen eine geometrische Verdünnungsreihe von Anti T Lectin auf ein Bioplate auf-getragen. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden die Hämagglu-tinationstiter über einem Lichtkasten abgelesen.
3.1.5.5.4. Auswertung
Eine Verminderung des Hämagglutinationstiters des Anti T Lectins gegenüber dem Kontrollansatz ist bei standardisierter Neuraminidaseaktivität und standardisierter Lectin - Bindungskapazität ein direktes Maß für die Aktivität des Neuraminidase In-hibitors im Patientenserum. Es wurde für unsere Studie definiert, daß die maximale Verdünnungsstufe des Probandenserums, die noch eine vollständige Hemmung der Neuraminidase bewirkt, die anzugebende Aktivität des Neuraminidase Inhibitors ist.
3.1.5.5.5. Kontrollen
Als Kontrollen in diesem Test diente ein Leeransatz mit PBS Puffer statt Proban-denserum als Kontrolle der Neuraminidase Aktivität und des Hämagglutination-testes mit Anti T Lectin, sowie ein Ansatz mit adulter Normalkonzentration des Neu-raminidase Inhibitors als positive Kontrolle des Inhibitionstestes.
3.2.
Bestimmung des Pneumokokkenneuraminidase
Inhibitors bei Früh- und Neugeborenen
3.2.1.
Serumprobe eines adulten Blutspenders
Als Positivkontrolle der indirekten Bestimmung des Neuraminidase Inhibitors im Se-rum, diente addultes Kontrollserum eines freiwilligen Blutspenders der Blutgruppe 0 Rh neg mit einer Normalkonzentration des Neuraminidase Inhibitors.
3.2.2.
Serumproben von 116 Früh- und Neugeborenen
Für die Untersuchung der Früh- und Neugeborenen auf einen Neuraminidase Inhi-bitor wurde frisch gewonnenes Nabelvenenserum oder eine zunächst tiefgefrorene Probe von Restserum aus Infektionsdiagnostik oder Blutgruppenbestimmung am 1. Lebenstag verwendet.
3.2.3.
Testansatz
Je nach vorhandener Menge wurde das Serum, in einem Makro oder einem Mikro-ansatz getestet. Für einen MakroMikro-ansatz wurde 400µl Serum für einen MikroMikro-ansatz nur 200µl Serum benötigt.
3.2.4.
Neuraminidase
Als Neuraminidase wurde eine Pneumokokkenneuraminidase aus dem Pleuraexsu-dat eines Patienten verwendet, deren Aktivität, durch Verdünnung den methodi-schen Angaben in Abschnitt 3.1.5.3. entsprechend, standardisiert wurde.
3.2.5. Patientenkollektiv
Das Patientenkollektiv umfaßt Früh - und Neugeborene einer neonatologischen In-tensivstation, im typischen Gestationsalterspektrum.
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 0 2 4 6 8 10 12
Anzahl der Kinder
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 SSW
Abb. 3.1.: Gestationsalter der 116 Früh- und Neugeborenen im Patienten-kollektiv.
3.3.
Material und Reagenzien:
3.3.1.
Material für die Säulenchromatographien
Höhe12.5 cm; Durchmesser 1 cm. (Für Protein G Sepharose 4 Fast Flow)
3.3.1.2. Chromatographiesäule Pharmacia Höhe 22.5 cm; Durchmesser 1 cm (Für Protein A Sepharose 4 Fast Flow)
3.3.1.3. Photometer: LKB Bromma; Multirac 2111, Uvicord S 2138, Wellenlänge 206 nm.
3.3.1.4. Peristaltikpumpe: LKB Bromma, Varioperex 2 pump 2129.
3.3.1.5. Kühlzentrifuge: Hereus Christ, Minifuge GL, 800 g Amicon Ultrazetrifugationsmembran GF 50
3.3.1.6. Titrierpumpe - Gradientenmischer: Pharmacia GM 1
3.3.2.
Puffer für die Säulenchromatographien
3.3.2.1 Puffer A ( Equilibrierungspuffer) 20 mM Phosphatpuffer pH 7.0
2.76 g NaH2PO4 *H2O Merck Art. 6364
3.56 g NaHPO4 *H2O Merck Art. 6580
ad 1000 ml Aqua dest.
3.3.2.2. Puffer B (Elutionspuffer) 0.1 M Glycin / HCL pH 2.7 7.507 g Glycin
ad 1000 ml Aqua dest.
Einstellung des pH mit 25% Salzsäure
3.3.2.3. Vorlagepuffer für das Eluat 1 M Tris / HCL Lösung pH 9.0 121.14 g Tris / HCL
ad 1000 ml Aqua dest.
3.3.2.4. Puffer A (Startpuffer): 1.5 M Glycin, 3 M NaCl; pH 8.9 112.605 g Glycin
175.32 g NaCl
ad 1000 ml Aqua dest.
3.3.2.5. Puffer E: 0.1 M citric acid NaOH; pH 3.0 19,2 g Zitronensäure ad 1000 ml Aqua dest. 3.3.2.6. PBS Puffer: 0.1 M ,pH 7.2 13.8 gNaH2PO4*H2O 17.8 gNa2 HPO4*H2O 8.76 g NaCl ad 1000 ml Aqua dest.
3.3.3.
Säulengele
3.3.3.1. Protein G Sepharose 4 Fast Flow Fa. Pharmacia LKB
Best. Nr. : 17- 0618-02 Lot. No. 226069
3.3.3.2. Protein - A- Sepharose 4 Fast Flow Fa Pharmacia LKB
Best. Nr. 17-0963-03 Lot Nr. DE 5020
3.3.4.
Proben für die Säulenläufe
Probe für den Protein G Säulenlauf: Es wurden 400 µl humanes 0 Serum, Restse-rum von freiwilligen, klinisch gesunden, Blutspendern verwendet.Vorbereitend wur-de dies zentrifugiert und durch einen Dialysierschlauch (5mm) gegen PBS Puffer filriert.
Probe für den Protein A Säulenlauf: Es wurden 2 ml humanes 0 Serum,Restserum von freiwilligen, klinisch gesunden Blutspendern verwendet. Es wurde zentrifugiert und gegen PBS dialysiert (Dialysierschlauch 5 mm).
3.3.5.
Material und Reagenzien für die radiale Immunodiffusion
IgG - Subklassen (human) SD Kits für die radiale Immunodiffusion (THE BINDING SITE).
3.3.6.
Neuraminidasen verschiedener Bakterien
Alle Neuraminidasen wurden lyophlisiert und teilweise tiefgefroren geliefert. Sie wurden mit der entsprechenden Menge PBS aufgefüllt, in erschütterungsfreier Ruhe 1h gelöst und portioniert wieder eingefroren. Für die Methoden wurden die verwen-deten Neuraminidasen auf eine katalytische Aktivität von 0,2 U/ml eingestellt.
• Neuraminidase Athrobacter ureafaciens, F. Sigma: Lot 64H1247
• Neuraminidase Clostridien, F. Sigma: Lot 82H80801
• Neuraminidase Salmonella typhimurium, F Sigma: Lot 94H6692
• Neuraminidase Streptococcus sp., F. Sigma: Lot 74H0065
3.3.7.
Lectin aus Arachis hypogaea (Anti T Ah )Es handelt sich um ein Phythämagglutinin, das aus der Erdnuß (Arachis hypogaea = Ah) gewonnen wird.
Wir bezogen das gereinigte Phythämagglutinin von der Firma Miles und verdünnten es mit PBS Puffer (pH 7.2), so daß es, standardisiert nach der in der Literatur be-schriebenen Methode, mit Vibrio cholerae Neuraminidase vorbehandelte Te-sterythrozyten bis zum Titer 64 agglutinierte (36).
4.
Ergebnisse
4.1.
Neuraminidasen verschiedener Bakterien
4.1.1.
In - vitro Wirksamkeit der Neuraminidasen verschiedener
Bakterien auf die Erythrozytenmembran
In vergleichenden Untersuchungen über das Verhalten der Abspaltung von Neura-minsäure aus der Membran menschlicher Erythrozyten zeigte sich, daß bei gleicher chemisch katalytischer Aktivität der verschiedenen Neuraminidasen, eine unter-schiedliche biologische Effektivität ihrer Aktivität an ihren Effektorzellen zu verzei-chenen war ( Abb. 4.1.)
Athrobacter Clostridien Streptokokken Salmonellen 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Titerstufen der Hämagglutination durch Anti T Ah
Athrobacter Clostridien Streptokokken Salmonellen verschiedene bakterielle Neuraminidasen
Abb. 4.1.: T-Antigen-Freilegung auf Erythrozytenmembranen durch bakte-rielle Neuraminidasen.
Hämagglutinationstiter des Anti T Lektin aus Arachis hypogaea (AntiT Ah) im NaCl -Milieu gegen humane Testerythrozyten nach standardisierter Behandlung mit 0.2 U/ml katalytischer Aktivität verschiedener bakterieller Neuraminidasen (3.3.6.) Titer = Stufe maximaler geometrischer Verdünnung des Lektins, die noch eine sichtbare Hämagglutination bewirkt (3.1.4.).
Die Neuraminidase der Streptokokken bewirkte eine starke Exposition von T Krypt-antigen Strukturen an der Erythrozytenmembran.
Die Neuraminidasen des Athrobacter ureafaciens und der Clostridien zeigten eine annähernd gleichwertige Wirksamkeit bezüglich der Freilegung von T Kryptantigen-strukturen.
Die deutlich schwächste Wirksamkeit an der Erythrozytenmembran zeigte die Neu-raminidase des Salmonella typhimurium.
4.1.2.
Spezifität des Neuraminidase Inhibitors im menschlichen
Serum
In der Bestimmung der Inhibition der bakteriellen Neuraminidasen durch menschli-ches Serum fanden sichnur schwache inhibitorische Aktivitäten gegen die Neura-minidasen des Athrobacter ureafaciens, der Clostridien und der Salmonellen. Die Neuraminidase wirkte auch nach Vorinkubation mit menschlichem Serum unge-hemmt auf die Erythrozytenmembranen ein und bewirkte eine starke Exposition von Kryptantigen T. Somit wurden selbst in Anwesenheit des unverdünnten Serums ho-heTiterstufen eines Anti- T Ah gegen die behandelten Erythrozyten nachgewiesen, nahezu übereinstimmend mit den entsprechenden Leerkontrollen.
Die Neuraminidasen der Streptokokken und Pneumokokken ließen sich jedoch durch humanes Serum hemmen und konnten keine Neuraminsäureabspaltung aus den Erythrozytenmembranen verursachen. Es wurden bei der Streptokokenneura-minidase, nur bei der Zugabe einer hohen Verdünnung des potentiell inhibitorischen Serums, Kryptantigen T Strukturen an Erythrozytenmembranen freigelegt.
Da sich die inhibitorische Aktivität des menschlichen Serums sowohl gegen Strep-tokokken- als auch Pneumokokkenneuraminidase richtet, läßt sich schlußfolgern, daß es sich hierbei um einen bakteriengruppenspezifischen Antikörper handeln könnte, der dabei jedoch Serotypen übergreifend wirkam ist.
Athrob. Clostr. Streptok. Salmon. Pneumok. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Athrob. Clostr. Streptok. Salmon. Pneumok. Neuraminidasen verschiedener Bakterienspezies im Ansatz mit humanem Serum
unterschiedlicher Verdünnung
Inhibition verschiedener bakterieller Neuraminidasen durch menschliches Serum
Serum 1:1 Serum 1:2 Serum 1:4 Serum 1:8 ohne Serum
Abb. 4.2.: Inhibition verschiedener bakterieller Neuraminidasen durch menschliches Serum
Verminderung der Hämagglutinationstiter des Anti T Lektin aus Arachis hypogaea (Anti-T Ah) im NaCl - Milieu gegen humane Testerythrozyten nach Inhibiton bakteri-eller Neuraminidasen (0.2 U/m katalytischer Aktivität) durch Vorinkubation mit menschlichem Serum in der Verdünnung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, Leerkon-trolle (PBS) (3.1.5.). Titer = Stufe maximaler geometrischer Verdünnung des Lektins, die noch eine sichtbare Hämagglutination bewirkt (3.1.4.).
4.2.
Isolierung des Immunglobulin G aus
menschli-chem Serum.
4.2.1
Isolierung der Immunglobuline G mit Hilfe einer
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Säule.
Mittels der Säulenchromatographie (3.1.1.) wurde Immunglobulin G aus humanem Serum isoliert.
Abb. 4.3: Photometrisches Bild nach säulenchromatographischer Auf-trennung von humanem Serum zur Isolierung von Im-munglobu- lin G
Im ersten Peak der säulenchromatographischen Auftrennung des Serums befindet sich die pass - through fraction der Säule, mit allen Serumbestandteilen, die nach Abtrennung des Immunglobulin G verbleiben. Im zweiten Peak befindet sich das isolierte Immunglobulin G (siehe 3.1.1.).
4.2.2
Charakterisierung des Neuraminidase Inhibitors als ein
Immunglobulin G
Es wurde eine Bestimmung der inhibitorischen Aktivität der säulenchromatogra-phisch isolierten Serumfraktionen gegen die, in Hämagglutinationstechnik nachge-wiesene, enzymatische Wirkung der Pneumokokkenneuraminidase durchgeführt. In der Fraktion des Peak 1 befand sich dabei die pass through fraction der säulen-chromatographischen Auftrennung. Sie beinhaltet alle Serumbestandteile, die nach Abtrennung des Immunglobulin G verbleiben. In der Fraktion des Peak 2 befand sich das isolierte Immunglobulin G.
Peak 1 = Serumproteine Peak 2 = IgG 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Titerstufen der Häm- agglutina-tion durch Anti T Ah Peak 1 = Serumproteine Peak 2 = IgG
säulenchromatographisch getrennte humane Serumfraktionen
Abb. 4.4.: Neuraminidase - Inhibition durch säulenchromatographisch ge-trennte humane Serumfraktionen.
Verminderung der Hämagglutinationstiter des Anti T Lektin aus Arachis hypogaea (Anti-T Ah) im NaCl - Milieu gegen humane Testerythrozyten nach Inhibiton bakteri-eller Neuraminidasen (0.2 U/ml katalytischer Aktivität) durch Vorinkubation mit den säulenchromatographisch getrennten humanen Serumfraktionen
(Peak 1 und Peak 2) in der Verdünnung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, Leerkontrolle (PBS) (3.1.5.). Titer = Stufe maximaler geometrischer Verdünnung des Lektins, die noch eine sichtbare Hämagglutination bewirkt (3.1.4.).
Aus der Graphik läßt sich ablesen, daß die Neuraminidase durch Zugabe des Peak 1 kaum gehemmt wurde. Die Neuraminidase wirkte bereits bei dreifacher Verdünnung ungehemmt auf die Testerythrozytenmembranen ein und legte Kryp-tantigen T frei, das mittels Anti T Lectin nachgewiesen wurde.
Der Peak 2, das isolierte Immunglobulin G, war sogar in hohen Verdünnungen bis 1: 16 in der Lage, die Neuraminidase vollständig zu hemmen, eine Erythozyten-membranschädigung war nicht nachweisbar.
Das Ergebnis bestätigt die Annahme, daß eine Hemmung der Neuraminidase durch menschliches Serum von Antikörpern des Typs IgG vermittelt wird.
4.3.
Isolierung der Immunglobulin G Subklassen aus
menschlichem Serum und Bestimmung der
Sub-klasse, die den Neuraminidase Inhibitor enthält
4.3.1.
Isolierung der Immunglobulin G Subklassen mit Hilfe einer
Protein A Sepharose 4 Fast Flow Säule
Die Immunglobulin G Subklassen wurden säulenchromatographisch aus humanem Serum isoliert.
Abb.4.5.: Photometrisches Bild nach säulenchromatographischer Auf-trennung von humanem Serum zur Isolierung der Im-munglobu- linsubklassen
B = pass - through - Fraktion der Auftrennung C = 2. Peak der Auftrennung
D = Erste Fraktion des zweigipfeligen 3.Peaks der Auftrennung E = Zweite Fraktion des zweigipfeligen 3.Peaks der Auftrennung
Auf dem photometrischen Bild erkennt man 3 Peaks, die mit vier Buchstaben ge-kennzeichnet sind. Der erste Peak (B) ist die Fraktion im Serum, die von der Säule nicht gebunden wird ( pass through fraction). Nach Einstellung des linearen pH -Gradienten ergab sich ein weiterer, wesentlich kleinerer Peak (C), indem sich spä-ter keine nachweisbaren Mengen einer Immunglobulin G Subklasse fanden. Zu einem späteren Zeitpunkt findet sich ein zweigipfeliger Peak (D,E), wobei der zweite Gipfel (E) deutlich größer ist als der erste.
Der erste Peak der Abbildung, Fraktion B genannt, sollte aufgrund der Spezifität der Säule, neben anderen Serumbestandteilen, das Immunglobulin G Subklasse 3 be-inhalten. Zur Isolierung dieser Immunglobulin Subklasse ließen wir diese Probe eine Protein G - Säule durchlaufen, um darin vorhandenes IgG 3 an die Säule zu binden und damit von den übrigen Serumbestandteilen zu trennen.
Im zweigipfeligen dritten Peak sollten sich die Immunglobulin G Subklassen 1 und 2 aufgetrennt haben. Im ersten Gipfel des Peaks sollte sich die Immunglobulin G Subklasse 2, im zweiten Gipfel des Peaks die Immunglobulin G Subklasse 1 befin-den.
4.3.2.
Bestimmung des IgG - Subklassengehalts der isolierten
Peaks durch radiale Immunodiffusion
In Bestätigung der erwarteten Auftrennungen der humanen Serumprobe in einzelne Immunglobulin G Subklassen, wurden in den Fraktionen mittels radialer Immu-nodiffusion der tatsächliche Gehalt an IgG Subklassen dokumentiert.
Proben IgG - 1 g/l IgG - 2 g/l IgG - 3 g/l IgG - 4 g/l A 4.4 4.9 0.378 1.04
B <0.14 <0.08 0.178 <0.05
C <0.14 <0.08 <0.12 <0.05
D <0.14 2.4 <0.12 0.378
E 2.925 0.498 <0.12 0.292
Abb. 4.6.: Bestimmung des Immunglobulinsubklassengehalts der isolier-ten Fraktionen mittels radialer Immunodiffusion.
A = 0 - Serum vor Auftrennung
B = pass - through - Fraktion der Auftrennung C = 2. Peak der Auftrennung
D = Erste Fraktion des zweigipfeligen 3.Peaks der Auftrennung E = Zweite Fraktion des zweigipfeligen 3.Peaks der Auftrennung
In der Fraktion A (0 - Serum) befanden sich alle Immunglobulin G Subklassen. In der Fraktion B fand sich die Immunglobulin Subklasse 3 . Die anderen Immun-globulin Subklassen befanden sich unter der Nachweisgrenze.
In der FraktionC ließ sich keine Immunglobulin Subklasse im meßbaren Bereich feststellen. Diese Probe wurde daher nicht in die weiteren Untersuchungen mitein-bezogen.
Im Peak D befand sich das Immunglobulin G Subklasse 2 und ein Anteil Immun-globulin G Subklasse 4.
Im Peak E befanden sich die Immunglobulin G Subklasse 1, ein geringer Teil Im-munglobulin G Subklasse 2 und ein Anteil ImIm-munglobulin G Subklasse 4.
Alle Werte der Auftrennung erreichten nicht die Höhe der physiologischen Subklas-sen - Konzentrationen. Dies läßt sich durch Verluste aufgrund der Aufreinigung er-klären.
4.3.3.
Der Neuraminidase Inhibitor in den
isolierten Immunglobulin G Subklassen
Die isolierten Immunglobulin G Subklassen wurden auf den Gehalt an Neuramini-dase Inhibitor untersucht.
A B D E 0 1 2 3 4 5 T- Antigen Expression in Titerstufen des Anti T Reagenzes A B D E
säulenchromatographische Auftrennung von humanem Serum, Peak A-E, die verschiedene
Immunglobulinsubklassen enthalten
Abb. 4.7.: Neuraminidase Inhibition durch Immunglobulin G Subklassen.
Verminderung der Hämagglutinationstiter des Anti T Lektin aus Arachis hypogaea (Anti-T Ah) im NaCl - Milieu gegen humane Testerythrozyten nach Inhibition bakteri-eller Neuraminidasen ( 0.2 U/ml katalytischer Aktivität) durch Vorinkubation mit den säulenchromatographisch getrennten humanen Immunglobulinsubklassen in der Verdünnung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, Leerkontrolle (PBS) (3.1.5.).
Titer = Stufe maximaler geometrischer Verdünnung des Lektins, die noch eine sicht-bare Hämagglutination bewirkt (3.1.4.).
A : alle Immunglobulinsubklassen, 0 Serum B : IgG 3
D : IgG 2 und IgG 4
E : IgG 1 und IgG 2 und IgG 4
In der vorangehenden Grafik wird deutlich, daß Serum (A) mit physiologischen Werten der IgG Subklassen in der Lage ist Neuraminidase zu hemmen.
Das Enzym schädigt nicht die Erythrozytenmembranen und legt somit kein Kryptan-tigen T frei, eine AnKryptan-tigen Demaskierung ist durch Anti T Lectin nicht nachweisbar. Peak B, der die IgG Subklasse 3 enthält ist nicht in der Lage die Neuraminidase vollständig zu hemmen. Eine erheblich Antigen Expression der Erythrozytenmebran ist die Folge.
Peak D, der die Immunglobulin Subklasse 2 enthält ist ebenfalls nicht in der Lage die Neuraminidase zu hemmen. Auch hier ist eine erhebliche Antigen Demaskie-rung der Erythrozytenmembranen zu verzeichnen.
Peak E, der die IgG Subklasse 1 und in geringen Mengen der Subklasse 2 enthält hemmt die Neuraminidase, auch in hohen Verdünnungstufen, vollständig.
Die Immunglobulin G Subklasse 4, die in den Peaks D und E zu gleichen Teilen enthalten ist, hat offensichtlich keinen Einfluß auf eine Neuraminidase Hemmung. Anhand dieses Ergebnisses wird deutlich, daß es sich bei dem Neuraminidase Inhi-bitor um ein Immunglobulin G der Subklasse 1 handelt.
4.4. Der Neuraminidase Inhibitor bei Früh- und
Neugeborenen
Im Serum von 116 Früh- und Neugeborenen wurden die Neuraminidase Inhibitorti-ter am ersten Lebenstag bestimmt. Hierbei ist die maximale Verdünnungsstufe des Früh- und Neugeborenenserums, die noch eine vollständige Hemmung der Pneu-mokokkenneuraminidase nachweist, die angegebene Titerstufe. Dies bedeutet, je höher der Titer ausfällt um so mehr Inhibitor ist im Serum der Untersuchten vorhan-den.
Die Ergebnisse finden sich in den folgenden Graphiken (Abb.4.8.- 4.10.).
Titer 8 Titer 4 Titer 2 Titer 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Anzahl der Kinder in Prozent
n = 46
Titer 8 Titer 4 Titer 2 Titer 1 Neuraminidase Inhibitortiter
Abb.: 4.8.: Neuraminidase Inhibitortiterverteilung bei Neugeborenen der 36.- 40. Schwangerschaftswoche.
Humane Testerythrozyten wurden vor standardisierter Behandlung mit 0.2 U/ml ka-talytisch aktiver Pneumokokkenneuraminidase mit Neugeborenenserum der 36.-40. SSW in der Verdünnung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, inkubiert (3.1.5.).Mittels Hämagglutinati-onstest wurde die Testerythrozytenschädigung ermittelt (3.1.4.). Der angegebene Inhibitortiter ist die maximale Verdünnungsstufe des Früh- und Neugeborenense-rums, die noch eine vollständige Hemmung der Pneumokokkenneuraminidase be-wirkt.
Titer 8 Titer 4 Titer 2 Titer 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Anzahl der Kinder in Prozent
n = 38
Titer 8 Titer 4 Titer 2 Titer 1 Neuraminidase Inhibitortiter
Abb.4.9.: Neuraminidase Inhibitortiterverteilung bei Früh- und Neugebore-nen der 31. - 35. Schwangerschaftswoche.
Humane Testerythrozyten wurden vor standardisierter Behandlung mit 0.2 U/ml ka-talytisch aktiver Pneumokokkenneuraminidase mit Früh- und Neugeborenenserum der 31.-35. SSW in der Verdünnung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, inkubiert (3.1.5.).Mittels Hämagglutinationstest wurde die Testerythrozytenschädigung ermittelt (3.1.4.). Der angegebene Inhibitortiter ist die maximale Verdünnungsstufe des Früh- und Neuge-borenenserums, die noch eine vollständige Hemmung der
Titer 8 Titer 4 Titer 2 Titer 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Anzahl der Kinder in Prozent
n = 32
Titer 8 Titer 4 Titer 2 Titer 1 Neurminidase Inhibitortiter
Abb. 4.10.: Neuraminidase Inhibitortiterverteilung bei Frühgeborenen der 25. - 30. Schwangerschaftswoche
Humane Testerythrozyten wurden vor standardisierter Behandlung mit 0.2 U/ml ka-talytisch aktiver Pneumokokkenneuraminidase mit Frühgeborenenserum der 25.-30. SSW in der Verdünnung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, inkubiert (3.1.5.).Mittels Hämagglutinati-onstest wurde die Testerythrozytenschädigung ermittelt (3.1.4.). Der angegebene Inhibitortiter ist die maximale Verdünnungsstufe des Früh- und Neugeborenense-rums, die noch eine vollständige Hemmung der Pneumokokkenneuraminidase be-wirkt.
Die Untersuchungsergebnisse sind in drei Gruppen zusammengefaßt und somit in drei Graphiken dargestellt.
In der ersten Graphik finden sich die Ergebnisse der Neugeborenen aus der 36. bis 40. Schwangerschaftswoche. Bei über 70 % von diesen untersuchten Kindern ließ sich ein Neuraminidase Inhibitor bis bis zur achtfachen Serumverdünnung (Titer 8) nachweisen. Es wurde kein Kind gefunden, dessen Neuraminidase Inhibitor nur im unverdünnten Serum (Titer 1) nachzuweisen war.
In der zweiten Graphik finden sich die Kinder der 31. bis 35. Schwangerschaftswo-che. Bei diesen Kindern ließ sich noch in über 40 % der Fälle ein Neuraminidase Inhibitor bis Titer 8 nachweisen. Jedoch konnte in 8 % der Fälle ein Neuraminidase Antikörper nur noch im unverdünntem Serum (Titer 1 ) nachgewiesen werden. Die Prozentzahl der Kinder die nur einen Inhibitortiter von 2 oder 4 besaßen nahm um bis zu 20 % zu.
In der dritten Graphik finden sich die Kinder der 25. bis 30. Schwangerschaftswo-che, die somit zu den deutlich frühgeborenen Kindern zählen.
Bei diesen Kinder ließ sich noch in 32 % der Fälle ein Neuraminidase Inhibitor bis Titer 8 nachweisen. Fast genauso häufig, in 26 % der Fälle, ließ sich jedoch nur
noch ein Inhibitortiter von 2 bzw. nur noch ein Inhibitor im unverdünntem Serum (Titer 1 ) nachweisen.
Nach Ermittlung der in jeder Gestationsalterswoche gefundenen Titermittelwerte lassen diese eine positive Korrelation mit Alter und Reife des Kindes erkennen, die der Steigerung des plazentaren Inhibitor - Transfers im letzten Schwangerschafts-trimenon entsprechen könnte.( Abb. 4.11.)
y = 0,2683x + 2,8193 0 1 2 3 4 5 6 7 8 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 SSW Titermittel
Abb. 4.11.: Mittlere Serumtiter eines Neuraminidase Inhibitors bei Früh- und Neugeborenen der 25. - 40. Schwangerschaftswoche
Es wurde für jede SSW des untersuchten Früh- und Neugeborenenkollektivs der mittlere Serumtiter des Neuraminidase Inhibitors errechnet und aufgetragen. Die eingetragene Gerade mit der Funktion y=0,2683x+2,8193 entspricht der errechneten Trendlinie der Zunahme der Titermittelwerte mit zunehmender SSW.
Zusammenfassend lassen die Egebnisse die Aktivität der
Pneumokokken-neuraminidase - Inhibition im menschlichen Serum als spezifische Eigenschaft ei-nes Immunglobulin G der Subklasse 1 erkennen, die entsprechend der Reifung des diaplazentaren Transfers gestationsalterabhängig im Neugeborenenserum nachzu-weisen ist.
Infektionen mit Neuraminidase - bildenden Bakterien verursachen vor allem bei Kin-dern und nur sehr selten bei Erwachsenen ein Krankheitsbild das, varierend vom Ausmaß der allgemeinen sytemischen Toxinwirkung, von einer passageren Hämo-lyse bis zum Hämolytisch - urämischen - Syndrom reicht.
Betroffen sind häufig Früh - und Neugeborene und Kinder bis zum 4. Lebensjahr. Im späteren Lebensalter wird diese Erkrankung nur noch selten beobachtet. Es sind nur vereinzelt Fälle bei Erwachsenen beschrieben worden, die allerdings in ganz ähnlicher Art und Weise verlaufen, wie die kindlichen Erkrankungen (21).
Die Erforschung der Pathophysiologie des durch mikrobielle Neuraminidase aus-gelösten Hämolytisch - urämischen - Syndroms, konzentrierte sich ursprünglich vor allem auf die Aufklärung der Pathomechanismen der Neuraminidasewirkung und die Entwicklung einer sicheren Methodik zur Früherkennung und Schweregradsde-finition der Erkrankung.
Als erstes diagnostisches Kriterium zeigt sich bei einsetzender Toxinwirkung eine Abspaltung von Neuraminisäureresten aus dem Glycophorin A der Erythrozyten, wobei eine ß - D Gal (1-3) GalNAC Struktur freigelegt wird. Sie ist Determinante des T - Antigens und Zielstruktur für ein Phythämagglutinin, das Anti T Lectin, das aus der Erdnuß gewonnen wird. Diese sehr sensitive Methode, der Hämagglutination zum Nachweis der T - Antigen Expression über das Anti T Lectin, läßt jedoch keine Rückschlüsse über das Ausmaß der Erkrankung zu. Zur genaueren Abgrenzung der Fälle, die eine ungehinderte Toxinwirkung entfalten und dabei schwerste Schä-digungen verursachen, stehen mittlerweile zwei monoklonale Antikörper zur Verfü-gung, mit deren Hilfe ein genaueres Abschätzen der Progredienz der Erkrankung möglich ist. Der Nachweis des Krypantigen T mit Hilfe des Phythämagglutinin ge-lingt meist schon bei Abspaltungen von 5 - 10 Prozent der Neuraminisäurereste aus der Erythrozytenmembran. Für eine eindeutige Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper 3 Y 12 ist die enzymatische Abspaltung von mindestens 10 - 25 Prozent der Neuraminsäure aus den Erythrozyten notwendig. Mit dem monoklonalen Anti-körper 1 C 4 liegt ein AntiAnti-körper vor, dessen Bindungstruktur erst freigelegt wird, wenn 45 - 55 % der Neuraminsäurereste aus der Erythrozytenmembran abgespal-ten sind. Diese prozentualen Abstufungen spiegeln den Schweregrad infektionsas-sozierter Neuraminidasewirkung in - vivo wider (36).
Ziel sollte es jedoch sein, eine gute und rasche Therapie dieser zum Teil auch töd-lich verlaufenden Krankheit zu finden.
Seit 1986 ist bekannt, daß sich im Serum Erwachsener ein Inhibitor befindet, der sich gegen Neuraminidase richtet und somit eine allgemeine Toxinwirkung
verhin-dern könnte (31). Seitdem wird die Option einer Immunglobulintherapie der durch Neuraminidasewirkung ausgelösten hämolytischen Anämie diskutiert.
Die vorliegende Arbeit hat diesen Neuraminidase Inhibitor als bakteriengruppen-spezifischen IgG1 Antikörper charakterisiert und somit eine theoretische Grundlage für das Therapiekonzept einer Immunglobulintherapie geschaffen.
Neuraminidasen verschiedener Bakterien unterschieden sich in den vorgelegten Untersuchungen in ihrer biologischen Wirksamkeit, der Abspaltung von Neuramin-säure aus Erythrozytenmembranen.
Die Neuraminidase der Streptokokken demonstrierte hierbei die stärkste biologi-sche Wirksamkeit. Die Neuraminidase von Athrobacter ureafaciens und Clostridium perfringens zeigten eine ähnlich starke Effektivität gegenüber Erythrozytenmem-branen. Die Neuraminidase des Salmonella typhimurium zeigte sich bei verglei-chenden Untersuchungen bei gleicher enzymatischer Aktivität, am biologischen Modell, der Freilegung erythrozytärer Kryptantigene, deutlich schwächer. Ob diese unterschiedlich starken biologischen Wirksamkeiten der Neuraminidasen an den Effektorzellen ein ebenfalls unterschiedliches Risiko der Entstehung eines Hämoly-tisch - urämischen - Syndroms widerspiegeln, läßt sich nicht eindeutig beantworten, der Verdacht liegt jedoch nahe.
Es erlangte daher besondere Wichtigkeit, zunächst das Antitoxin gegen die Neuraminidase des häufigsten Erreger potentiell bedrohlicher NeuraNeuraminidasewirkung in -vivo zu erforschen, so daß für die weiterführenden Untersuchungen die Pneu-mokokkenneuraminidase ausgewählt wurde.
In Hemmversuchen konnte eine deutliche Hemmung der Streptokokken- und Pneumokokkenneuraminidase durch menschliches Serum nachgewiesen werden. Gegen die Neuraminidasen, des Athrobacter ureafaciens, des Clostridium perfrin-gens und der Salmonnella typhimurium enthielt humanes Serum dagegen kaum inhibitorische Aktivität.
Daraus läßt sich schlußfolgern, daß es sich bei diesem Inhibitor um einen bakteri-engruppenspezifischen Antikörper handelt, der sich gezielt gegen Streptokokken-und Pneumokokkenneuraminidase richtet.
Dies bestätigt Untersuchungsergebnisse aus dem Jahre 1986, in denen postuliert wurde, daß es sich bei dem Pneumokokkenneuraminidase - Antikörper um einen serotypenübergreifenden Antikörper handelt und der Verdacht geäußert wurde, es könnte sich um einen gruppenspezifischen Antikörper handeln (31).
In allen von uns eingesetzten Erwachsenenseren einer mitteleuropäischen Popula-tion konnte ein Streptokokken/Pneumokokken - Neuraminidaseinhibitor nachgewie-sen werden.
Nachdem der Antikörper als gruppenspezifisch, serotypenübergreifend identifiziert war, gelang es mit Hilfe der Säulenchromatographie den Neuraminidase Inhibitor-nicht nur der Immunglobulinklasse G, sondern auch der Subklasse 1 zuzuordnen. Er gehört somit einer Subklasse an, die in der IgG - Gesamtfraktion mit über 60% am höchsten vertreten ist. Die anderen Subklassen verteilen sich wie folgt: IgG2: 29,6%, IgG3: 5,3%, IgG4: 4,2% (25).
Der Pneumokokkenneuraminidase Inhibitor gehört damit auch zu den diaplazentar übertragbaren Antikörpern, so daß bei Frühgeborenen eine Antitoxin Defizienz ein besonderes Risiko für die Entwicklung schwerer systemischer Toxinwirkung im Rahmen bakterieller Infektionen begründen könnte.
Im Menschen besteht ein selektiver Transport von Immunglobulinen während der Schwangerschaft von Mutter zu Kind.
Dieser einzigartige Prozeß findet sich in der Natur bei höher entwickelten Primaten, nicht aber bei anderen Tierarten.
Diese anderen Tierarten erhalten die für ihre immunologische Abwehr notwendigen Antikörper nach der Geburt durch die Muttermilch (z.B. Pferde, Kühe ) oder weisen einen passiven Transport über die Plazenta auf (Mäuse, Hasen) (11).
Der selektive Transport von Immunglobulinen, wie wir ihn beim Menschen finden, ist noch nicht vollständig aufgeklärt und zur Zeit noch Gegenstand der Forschung. Es lassen sich jedoch einige übereinstimmende Aussagen machen.
Die kindseigene Produktion von Immunglobulinen startet noch intra-uterin. Doch ist ihre Menge zum Zeitpunkt der Geburt vernachlässigenswert gering, im Vergleich zu der durch die Mutter diaplazentar übertragene Menge (25).
Die kindliche humorale Immunität nach der Geburt hängt somit im wesentlichen vom diaplazentaren Transport mütterlicher Immunglobuline ab.
Dieser Transport ist eng gekoppelt an die Reife der Schwangerschaft.
Ein Großteil des kindlichen Immunglobulin G wird im dritten Trimenon der Schwan-gerschaft von der Mutter auf das Kind übertragen (12,17,37,3). Der Transport der Immunglobuline ist ein Fc - Rezeptor vermittelter Prozeß (17).
Die Fc - Rezeptoren befinden sich auf den Syncytiotrophoblasten. Nach Bindung der Fc - Region des Immunglobulin G an den Rezeptor kommt es zur Endozytose.
