Aus dem Zentrum Anästhesiologie der Medizinischen Hochschule Hannover Direktor: Professor Dr. med. Siegfried Piepenbrock
Einfluss von Rauchen auf die Qualität von Thrombozytenapheresepräparaten
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Christian Renken aus Braunschweig
Hannover, 2005
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 06.06.2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. Siegfried Piepenbrock
Referent: PD Dr. Mario von Depka Prondzinski
Korreferent: Prof. Dr. Bernhard Panning
Tag der mündlichen Prüfung: 06.06.2006
Promotionsausschussmitglieder: PD Dr. med. Michael Przemeck Prof. Dr. Georg M. Eisenbach Prof. Dr. Winfried Beil
Meinen Eltern und Brüdern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 5
1.1 Thrombozyten 5
1.1.1 Morphologie 5 1.1.2 Primäre Hämostase 7
1.1.3 Oberflächenantigene und ihre immunologischen Marker 11
1.1.3.1 Glykoprotein IIb–IIIa 11
1.1.3.2 P-Selektin 12 1.1.3.3 Glykoprotein Ib 13 1.1.3.4 Glykoprotein IV 13 1.1.4 Thrombozytenaktivierung durch Agonisten 16
1.2 Apheresepräparate 16
1.2.1 Bedeutung von Apheresepräparaten 16 1.2.2 Einflüsse auf die Qualität von Apheresepräparaten 17
1.3 Einfluss von Rauchen auf Thrombozyten 18 1.4 Zielsetzung der Arbeit 19
2 Material und Methoden 20 2.1 Materialien 20
2.1.1 Probanden 20 2.1.2 Durchflusszytometrie 20
2.1.3 Aggregometrie 22 2.2 Durchflusszytometrie 23
2.2.1 allgemeines Prinzip 23 2.2.2 Aufbereitung des Probenmaterials 26
2.2.3 Immunfluoreszenzfärbung und Stimulierung der Thrombozyten 27
2.2.3.1 unstimulierte Proben 27 2.2.3.2 Stimulation mit TRAP-6 28 2.2.3.4 Tot–Lebend–Diskriminierung 29 2.2.4 Messung der Immunfluoreszenzen 30
2.2.5 Probandenkollektive 31 2.2.6 Lagerungsversuche 31 2.2.7 Messdatenauswertung 32 2.3 Aggregometrie 34
2.3.1 allgemeines Prinzip 34 2.3.2 Aufbereitung des Probenmaterials 39
2.3.3 Aufbereitung der Aggregationsreagenzien 39 2.3.4 Messung der Aggregationsparameter 40
2.3.5 Probandenkollektive 41 2.3.6 Lagerungsversuche 42
2.4 Statistische Auswertung 42
2.4.1 Signifikanzniveau 42 2.4.2 Untersuchungsgruppen, Messzeitpunkte und Untersuchungsparameter 42
2.4.3 Datenexploration 43 2.4.4 Vergleichbarkeit der Patientengruppen 43
2.4.5 Untersuchung der Parameterintensität 43
3 Ergebnisse 45 3.1 Durchflusszytometrische Messungen 45
3.1.1 Einfluss von Lagerungszeit und Rauchen auf die Rezeptorexpression 45
3.1.1.1 Expression von P-Selektin 45 3.1.1.2 Expression von GP IIb-IIIa 46 3.1.1.3 Expression von GP Ib 48 3.1.1.4 Expression von GP IV 50 3.1.2 Tot-Lebend-Diskriminierung 51 3.2 Aggregometrische Messungen 52
3.2.1 Einfluss von Lagerungszeit und Rauchen auf die Maximalaggregation 52
4 Diskussion 56 5 Zusammenfassung 70
6 Literaturverzeichnis 72 7 Publikationen und Präsentationen 79
8 Erklärung 80 9 Lebenslauf 81 10 Danksagung 82
Abkürzungen
In der vorliegenden Arbeit wurden einige englische Abkürzungen verwendet, da diese gebräuchlicher und damit allgemein verständlicher als die deutschen Übersetzungen sind.
µl µm µM µMol Abb.
ADP ATP BCT BSA CD CMFDA Fa.
FACS FITC FL1 FL2 FSC g GP L
Mikroliter Mikrometer Mikromol Mikromol Abbildung
Adenosindiphosphat Adenosintriphosphat
Behring Coagulations Timer Rinderserumalbumin
Cluster of differentiation, Einteilung der Oberflächenmoleküle 5-Chloromethyl fluorescin diacetate
Firma
Fluorescence activated cell scanner Fluoreszeinisothiocyanat
Fluoreszenz 1 Fluoreszenz 2
Forward light scatter, Vorwärtsstreulicht Gramm
Glykoprotein Liter
Kap.
MFI mg MHH min.
ml mMol nm NSAID PBS PCs PDGF
PE PF4 PRP PPP s.
Sek.
SPSS SSC TRAP-6 TxA2 vWF
Kapitel
Mittlere Fluoreszenzintensität Milligramm
Medizinische Hochschule Hannover Minute
Milliliter Millimol Nanometer
Non steroidal anti-inflammatory drugs
Phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung Platelet concentrates
Platelet-derived-growth-factor, von Thrombozyten abgeleiteter Wachstumsfaktor
Phycoerythrin Plättchenfaktor 4 Platelet rich plasma Platelet poor plasma siehe
Sekunde
Statistical Package for the Social Sciences Side scatter, Seitwärtsstreulicht
Thrombin-receptor agonist-peptide Thromboxan A2
Von-Willebrand-Faktor
1 Einleitung
1.1 Thrombozyten
1.1.1 Morphologie
Thrombozyten sind kernlose Blutzellen mit einem Durchmesser von 2 – 4 µm und einer Dicke von 0,75 µm. In ihrem ruhenden Zustand besitzen sie die Form von Scheiben, weshalb sie auch als Blutplättchen bezeichnet werden. Sie entstehen im Knochenmark durch Abschnürung von Megakaryozyten und zirkulieren in einer Konzentration von 150.000 bis 300.000 Zellen / µl im Blut (Gawaz, 1999). Außer im Knochenmark befinden sich Megakaryozyten im venösen Blut und in der Lunge, wo die Abschnürung zu Thrombozyten durch Scherkräfte des zirkulierenden Blutflusses erfolgt (Behnke et al., 1998). Die Entwicklung der Megakaryozyten und Produktion der Thrombozyten wird hauptsächlich durch das Hormon Thrombopoietin reguliert (Gurney et al., 1994). Ein Drittel aller Thrombozyten wird in der Milz gespeichert und steht in direktem Austausch mit den verbleibenden zirkulierenden Thrombozyten.
Nach einer durchschnittlichen Lebenszeit von 7 Tagen werden die Thrombozyten im retikulären System von Leber und Milz abgebaut (Gawaz, 1999). Um ihre Hauptfunktion, die Mitwirkung bei der Blutgerinnung (Hämostase) ausüben zu können, nehmen sie einen aktivierten Zustand an.
Morphologisch kann der Thrombozyt in 4 Bereiche unterteilt werden: periphere Zone, strukturelle Zone, Zone der Organellen und die Membransysteme (s. Abb. 1.1).
Die periphere Zone besteht aus einer Zytoplasmamembran, die außen eine Glykokalix trägt. In die Zytoplasmamembran sind Proteine eingebettet, die als Rezeptoren für Agonisten und Adhäsionsproteine fungieren. Über diese Rezeptoren werden Enzyme aktiviert, die sich auf der Innenseite der Zytoplasmamembran
befinden. Bei Thrombozytenaktivierung verändert sich die Zytoplasmamembran und es kommt zur Bildung und Freisetzung von Faktoren der Signalübertragung und Arachidonsäure.
Die strukturelle Zone besteht aus Mikrotubuli, Aktin- und Myosinfilamenten. Diese Strukturen bilden das Zytoskelett des Thrombozyten. Sie sind für die Aufrechterhaltung der diskoiden Form zuständig und an der Formveränderung bei Thrombozytenaktivierung beteiligt. Die Komponenten besitzen Verbindungen zu den Zellorganellen, die sie während des Aktivierungsvorganges reorganisieren.
Die Zone der Organellen befindet sich im Zytoplasma und enthält Mitochondrien, Glykogenspeicher und verschiedene Formen von Speichergranula (dichte Granula, α–Granula, Lysosomen). Die dichten Granula enthalten Verbindungen, die die Aggregation fördern (ADP, ATP, Kalzium, Serotonin). Die α–Granula enthalten Proteine, die Adhäsion, Aggregation, Koagulation und andere Funktionen beeinflussen (Fibrinogen, vWF, GP IIb–IIIa, Faktor V, Faktor XI). Die Lysosomen enthalten hydrolytische Enzyme (s. Tab. 1.1).
Es gibt zwei Membransysteme. Das „offene kanalikuläre System“ besteht aus gewundenen Kanälen, die durch Poren Zytosol und Extrazellulärraum miteinander verbinden. Es dient der Oberflächenvergrößerung und als Transportroute der α– Granula. Das „dichte tubuläre System“ dient als Kalziumspeicher, analog zum endoplasmatischen Retikulum in anderen Zelltypen (Ostendorf und Seeberer, 1997).
Kalzium spielt eine zentrale Rolle bei der Thrombozytenaktivierung.
Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Ultrastruktur ruhender Thrombozyten, nach:
Gawaz, das Blutplättchen, 1999
1.1.2 Primäre Hämostase
Die primäre Hämostase lässt sich in Adhäsions-, Aktivierungs-, Sekretions- und Aggregationsphase unterteilen.
Die Adhäsion der Thrombozyten an subendotheliales Gewebe und später die Aggregation zu einem primären Thrombozytenaggregat wird durch membranständige Glykoproteine der Thrombozyten vermittelt (Shattil et al., 1998; Santoro et al., 1995;
Santoso et al., 1999; Lopez et al., 1998). Unter physiologischen Bedingungen herrschen sowohl zwischen den Thrombozyten als auch zwischen Thrombozyten und Endothel abstoßende Kräfte, da deren Oberflächen negativ geladen sind.
Kommt es zu einer Schädigung des Gefäßendothels, liegen Strukturen frei, an die der Thrombozyt durch spezielle Rezeptoren adhärieren kann (Schmitz et al., 1998).
Diesen Vorgang bezeichnet man als Adhäsion (Adhäsionsphase). Eine erste Kontaktaufnahme (initiale Kontaktaufnahme) erfolgt dabei zwischen dem thrombozytären GP Ib–V–IX und endothelialem kollagenimmobilisierten vWF (Lopez et al., 1998). Der Vorgang wird durch den Kontakt zwischen speziellen Adhäsionsrezeptoren des Thrombozyten und Strukturen der extrazellulären Matrix des Endothels (Kollagen, Fibronektin, Laminin, Thrombospondin, elastische Fasern, vWF) stabilisiert (Stabilisierungsphase).
Durch Adhäsion an Strukturen der extrazellulären Matrix, aber auch durch die Aktivatoren ADP, Kollagen, Adrenalin und Thrombin werden über Rezeptoren metabolische und biochemische Mechanismen in Gang gesetzt, die eine Aktivierung des Thrombozyten bewirken (Aktivierungsphase).
Durch Aktivierung des Zytoskeletts ändert der Thrombozyt seine bisher diskoide in eine kugelige Form und bildet Pseudopodien. So vergrößert er seine Oberfläche und begünstigt die Interaktion mit dem Plasma. Die Ausspreizung des Thrombozyten sorgt für einen schnelleren Verschluss der Endothelläsion (siehe Abbildung 1.1).
Thrombozytenaktivierung führt zur Konformationsänderung von Oberflächenrezeptoren und im Bereich des GP IIb-IIIa - Rezeptors zur Freilegung von Bindungsstellen für Fibrinogen (Shattil et al., 1998). Der Rezeptor kann nun mobilisiertes Fibrinogen binden und trägt damit wesentlich zur Thrombozytenaggregation bei.
Aufgrund einer Änderung der Ausrichtung der Phospholipiddoppelschicht kommt es zur Anlagerung von Gerinnungsfaktoren, wie dem Prothrombinasekomplex. Dieser sorgt für eine erhöhte Thrombinbildung und damit auch für eine Fibrinvernetzung der Thrombozytenaggregate. Er spielt damit eine wesentliche Rolle bei der irreversiblen
Stabilisierung der Fibrinogenbindungen zwischen den GP IIb–IIIa – Rezeptoren während der sekundären Thrombozytenaggregation.
Aktivierte Thrombozyten schnüren kleine Membranvesikel ab (Mikrovesikelbildung), die die prokoagulatorische Aktivität im Bereich eines Thrombozytenaggregates steigern.
Während der Aktivierung wird vermehrt Arachidonsäure aus der Phospholipidmembran gespalten, was zu einer erhöhten Bildung und Sekretion von Thromboxan A2 führt. TxA2 aktiviert über Rezeptoren den Thrombozyten (autokrine Aktivierung) und ist für eine Vasokonstriktion im Bereich der Läsion zuständig. Die Vasokonstriktion bewirkt eine Verlangsamung des Blutflusses und fördert damit die Entstehung eines Thrombozytenaggregates.
Abb. 1.2: ruhende und aktivierte Blutplättchen. Rechts ruhende diskoide Form; links aktivierte Form, nach: Gawaz, das Blutplättchen, 1999
Während der Thrombozytenaktivierung kommt es zur Sekretion von Granulainhaltsstoffen (Sekretionsphase). Diese ist abhängig von der intrazellulären Kalziumkonzentration und geschieht in der Reihenfolge dichte Granula - α–Granula – Lysosomen, wobei es jeweils charakteristische Schwellenwerte der Kalziumkonzentration gibt. Der Sekretionsvorgang ist ATP – abhängig. Die Stoffe
gelangen entweder durch Verschmelzung der Granula mit dem offenen kanalikulären System oder durch Exozytose in den Extrazellulärraum. Dort binden sie an Rezeptoren desselben Thrombozyten (autokriner Aktivierungsmechanismus) oder anderer Thrombozyten (parakrine Plättchenrekrutierung), werden als Rezeptoren in die Zytoplasmamembran integriert oder beeinflussen die Proliferation anderer Zellen.
Einen Überblick über einige Granulainhaltsstoffe und ihre Funktion gibt Tabelle 1.1.
Granula Inhaltsstoffe Funktion
Dense Granula Kalzium ADP Serotonin ATP
Fibrinogenbindung an GP IIb–IIIa Thrombozytenaktivierung
Vasokonstriktion Antagonist von ADP α – Granula vWF
P – Selektin
Fibrinogen PDGF PF 4
Adhäsion und Aggragation von Thrombozyten
Rezeptor für Thrombozytenadhäsion an Leukozyten
Thrombozytenaggregation mitogen für Fibroblasten
stimuliert Chemotaxis von Leukozyten und Fibroblasten
Lysosomen Hydrolasen - Kollagenase - Elastase - Heparinase
Auflockerung subendothelialer Strukturen Umbau des Kollagens
degradiert elastisches Gewebe
hemmt Wachstum glatter Muskelzellen
Tabelle 1.1: Granulainhaltsstoffe und ihre Funktion
Einer Aktivierung adhärenter Plättchen im Bereich einer Endothelläsion folgt die Sekretion von Granulainhaltsstoffen und damit auch die Rekrutierung anderer noch nicht aktivierter Thrombozyten (parakrine Plättchenrekrutierung). Dieser Vorgang, eine hohe Scherkraft (hohe Kontaktwahrscheinlichkeit der Thrombozyten untereinander), freies Kalzium und Fibrinogen (aus den α–Granula) sind Voraussetzungen für die Bildung eines reversiblen Plättchenaggregates (Aggregationsphase). Dabei lagern sich aktivierte Thrombozyten über Fibrinogenbrücken zu so genannten Koaggregaten zusammen. Das thrombozytäre GP IIb–IIIa dient hier als Fibrinogenrezeptor. Da die Zusammenlagerung der Thrombozyten noch sehr locker ist, spricht man von reversibler (primärer) Aggregation. Nach Freisetzung der Granulainhaltsstoffe (10 bis 30 min.) kommt es zu einer irreversiblen Stabilisierung dieses primären Plättchenaggregates (sekundäre Plättchenaggregation). Dies geschieht durch Anlagerung von Koagulationsenzymen, wie dem Prothrombinasekomplex, die unter Thrombinbildung Fibrinogen in Fibrin umwandeln und so ein irreversibles Plättchenaggregat erzeugen.
1.1.3 Oberflächenantigene und ihre immunologischen Marker
1.1.3.1 Glykoprotein IIb–IIIa
Thrombozyten besitzen 60.000 bis 100.000 GP IIb–IIIa – Rezeptoren. 70 % befinden sich auf der Oberfläche nicht aktivierter Thrombozyten, 30 % in den α –Granula.
Diese werden nach Thrombozytenaktivierung und Degranulation auf der Oberfläche exprimiert. GP IIb-IIIa ist ein Rezeptor für Fibrinogen, vWF, Fibronectin und
Vitronectin, dass ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Thrombozytenaggregation spielt (Phillips et al., 1988).
Bei dem GP IIb-IIIa - Rezeptor können 3 verschiedene Funktionszustände unterschieden werden. Der Rezeptor nicht aktivierter Thrombozyten bindet an immobilisiertes Fibrinogen. Nach Thrombozytenaktivierung werden hochaffine Fibrinogenbindungsstellen frei, so dass nun auch lösliches Fibrinogen gebunden werden kann. Dieser ligandenbesetzte Zustand induziert eine weitere Konformationsänderung infolge derer Mechanismen für die transmembrane Signaltransduktion und eine irreversible Fibrinogenbindung in Gang gesetzt werden.
Die verschiedenen Funktionszustände können durch verschiedene Antikörper nachgewiesen werden. Es gibt Antikörper gegen den Rezeptor ungeachtet seines Aktivierungsgrades (Nachweis der Oberflächendichte), Antikörper gegen Fibrinogenbindungsstellen (Nachweis der Thrombozytenaktivierung) (Shattil et al., 1985) und Antikörper gegen ligandeninduzierte Bindungsstellen (LBS, Nachweis des ligandenbesetzten Funktionszustandes) (Freilinger et al., 1988).
Der monoklonale Antikörper „anti – CD 41“ richtet sich gegen alle GP IIb–IIIa – Rezeptoren und dient somit dem Nachweis der Oberflächendichte.
1.1.3.2 P-Selektin
P-Selektin befindet sich in den thrombozytären α–Granula. Es wird nach Thrombozytenaktivierung und Degranulation zur Oberfläche transportiert, freigesetzt und exprimiert (McEver, 1990). Dort vermittelt es die Adhäsion aktivierter Thrombozyten an Monozyten und neutrophile Granulozyten (Palabrica et al., 1992).
Es löst eine Inflammation in den Leukozyten aus und spielt so eine wesentliche Rolle bei der sekundären Hämostase.
Der monoklonale Antikörper „anti – CD 62P“ ist gegen P–Selektin gerichtet und dient dem Nachweis der Degranulation aktivierter Thrombozyten. In vitro ist die erhöhte Oberflächenexpression von P-Selektin auf aktivierten Thrombozyten irreversibel (Michelson et al., 1994). In vivo ist sie jedoch reversibel; so werden im Anschluss daran weder Zirkulation noch Funktion beeinträchtigt (Michelson, 1996; Berger et al., 1998).
1.1.3.3 Glykoprotein Ib
GP Ib ist Teil des GP Ib-IX-V - Rezeptors. Dieser befindet sich auf der Oberfläche ruhender Thrombozyten. GP Ib dient als Adhäsionsrezeptor zirkulierender Thrombozyten für den in Kollagenfibrillen immobilisierten vWF. Die Interaktion zwischen GP Ib und vWF und hohe Scherkräfte in bestimmten Gefäßbereichen führen letztendlich zu einer Thrombozytenaktivierung und zur Bindung weiterer Liganden (vWF, Fibrinogen) (De Marco et al., 1985; Weiss et al., 1989). GP Ib trägt damit wesentlich zur primären Adhäsion während der primären Hämostase bei. Nach Thrombozytenadhäsion und – aktivierung kommt es zu einer Internalisierung des Rezeptors, somit zu einer Abnahme seiner Dichte auf der Oberfläche.
Der monoklonale Antikörper „anti – CD 42b“ ist gegen GP Ib gerichtet und dient der Charakterisierung des Aktivierungsgrades von Thrombozyten, besonders nach Aktivierung mit einem Agonisten.
1.1.3.4 Glykoprotein IV
GP IV ist unter anderem Bestandteil der Membran ruhender und aktivierter Thrombozyten. Der Rezeptor vermittelt die Adhärenz von Thrombozyten an
Thrombospondin und Kollagen. Ihm ist somit eine Funktion in der Stabilisierungsphase während der primären Hämostase zuzuschreiben.
Der monoklonale Antikörper „anti – CD 36“ richtet sich gegen diesen Rezeptor und kann so als Marker für alle Zellen mit erythroider Differenzierung angesehen werden.
Tabelle 1.2 gibt einen Überblick über die Oberflächenantigene, ihre Funktionen und und ihre immunologischen Marker.
Tabelle 1.2 : Oberflächenantigene, ihre Funktionen und ihre immunologischen Marker
Oberflächen – Antigen
Nomenklatur Immunologische Antikörper
Vorkommen Funktion GP IIb–IIIa CD 41 Anti – CD 41 Thrombozyten
- Oberfläche - α - Granula Megakaryozyten
Zustand:
• nicht aktiviert: Bindung von immobilisiertem Fibrinogen
• aktiviert: Bindung von löslichem Fibrinogen (primäre Aggregation), Fibronektin, vWF, Vitronektin,
Thrombospondin
• ligandenbesetzt: transmembrane Signaltransduktion, irreversible Fibrinogenbindung (sekundäre
Aggregation) P – Selektin CD 62P Anti – CD 62P Thrombozyten
- α - Granula Megakaryozyten Endothelzellen -Weibel-Palade- Körperchen
• Interaktion zwischen Thrombozyten und Leukozyten (Monozyten und neutrophile Granulozyten)
• Interaktion zwischen Endothelzellen und Leukozyten (Monozyten und neutrophile Granulozyten)
GP Ib–V–IX CD 42b Anti – CD 42b Thrombozyten - Oberfläche Megakaryozyten Endothelzellen
Adhäsion zirkulierender Thrombozyten an in Kollagen immobilisierten vWF (Kontaktphase der Adhäsion während der primären Hämostase)
GP IV CD 36 Anti – CD 36 Thrombozyten Retikulozyten Monozyten Endothelzellen Tumorzellen
Adhäsion von Thrombozyten an Kollagen und
Thrombospondin (Stabilisierungsphase der Adhäsion während der primären Hämostase)
1.1.4 Thrombozytenaktivierung durch Agonisten
Agonisten sind Stoffe, die den Thrombozyten aktivieren. Sie werden vom umliegenden Gewebe, aber auch vom Thrombozyten selbst synthetisiert oder befinden sich schon im Plasma. Zu Untersuchungszwecken werden Agonisten auch in vitro hinzugegeben. Bei dieser Studie verwendete physiologische Agonisten waren TRAP-6 und ADP in der Durchflusszytometrie (Michelson, 1996) und Kollagen, ADP und Epinephrin in der Aggregometrie. Sie binden an Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche und bewirken über Signaltransduktion die Bildung von weiteren Botenstoffen (Second Messenger). Diese spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulation des intrazellulären Kalziumspiegels. Zwischen der intrazellulären Kalziumkonzentration und dem Stimulierungsgrad der Thrombozyten besteht eine direkte Korrelation (Gawaz, 1999).
1.2 Apheresepräparate
1.2.1 Bedeutung von Apheresepräparaten
Die Transfusion von Thrombozytenkonzentraten ist in verschiedenen klinischen Situationen indiziert. In den letzten beiden Jahrzehnten stieg die Gabe von Thrombozytenpräparaten für die Prävention thrombozytopenischer Blutungen rasch an (Slichter, 1991; Consensus conference, 1987). Bei thrombozytopenischen Patienten werden sie des Weiteren vor chirurgischen oder invasiven Eingriffen, wie dem Legen von Kathetern, verabreicht (Murphy et al., 1992). Um starke Blutverluste und tödliche Komplikationen zu vermeiden, brauchen die Präparate eine ausreichende Zahl funktionierender Thrombozyten. Sie werden entweder aus
Blutpräparaten („buffy coat“) oder durch Apheresetechniken (Apherese-PCs) hergestellt. Eine Arbeitsgruppe um Böck fand 2002 heraus, dass die Apherese-PCs bezüglich der hämostatischen Qualität der Thrombozyten den „buffy coats“
vorzuziehen sind (Böck et al., 2002).
1.2.2 Einflüsse auf die Qualität von Apheresepräparaten
Viele in vitro Tests haben sich in den letzten Jahren mit den Veränderungen von Thrombozyten in gelagerten Apheresepräparaten auseinandergesetzt (Murphy et al., 1994). Es konnte gezeigt werden, dass während der Lagerungszeit eine Thrombozytenaktivierung (Lee et al., 1988; Moroff et al, 1991; Bode et al., 1986) und eine Desensibilisierung gegenüber Agonisten (Cesar et al., 1990; Peerschke, 1991) auftritt. Um eine ausreichende Qualität zu gewährleisten, werden die Apheresepräparate deshalb bei Raumtemperatur in speziellen Aufbewahrungsbeuteln maximal 5 Tage gelagert (Chernoff et al., 1992; Rao et al., 1993). Eine Aufbewahrung über diese Zeit hinaus geht mit einem Abfall der Thrombozytenfunktion und mit dem Risiko bakterieller Kontamination einher (Braine et al., 1986; Esber, 1986). Eine Ausweitung der Lagerungszeit auf 7 Tage ist deshalb nur in speziellen Fällen nach Screening der Thrombozytenkomponenten auf bakterielle Kontamination indiziert (Blajchman, 1995; Brecher et al., 2000).
Neben der Lagerungszeit gibt es spenderassoziierte Faktoren (z.B. „thromboxan genetic polymorphism“, Häufigkeit der Thrombozytenspende), die die Thrombozytenfunktion in Thrombozytenkonzentraten beeinträchtigen (Jilma- Stohlawetz et al., 2001). Auch Medikamente wie beispielsweise NSAID hemmen die
Thrombozytenfunktion (Cronberg et al., 1984). Die Einnahme solcher Medikamente ist deshalb ein Ausschlusskriterium für die Thrombozytenspende.
1.3 Einfluss von Rauchen auf Thrombozyten
Rauchen ist ein wesentlicher Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen (Meade et al., 1987). Deren Ursache ist die arterielle Thrombose, die häufiger bei Rauchern als bei Nichtrauchern auftritt (Murphy et al., 1966). Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Entstehung arterieller Thromben (Deykin, 1967). Einige Studien setzen sich mit dem Einfluss von Rauchen auf die Thrombozyten auseinander (Frederiksen et al., 1970; Engelberg et al., 1967; Hawkins, 1972).
Eine Arbeitsgruppe um Mustards fand bereits 1963 heraus, dass die Lebensspanne von Thrombozyten während Perioden starken Rauchens reduziert ist (Mustard et al., 1963). Nur wenige Jahre später konnte eine chronisch erhöhte Thrombozytenaggregation bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern nachgewiesen werden (Glynn et al., 1966; Hawkins, 1972). 2001 zeigte Nair, dass sich bei chronischen Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern eine signifikant erhöhte Anzahl zirkulierender Thrombozyten im aktivierten Zustand befindet (Nair et al., 2001). Rauchen verstärkt also die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten und stellt damit einen wesentlichen Faktor für die Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen dar (Blache, 1995; Ross, 1993).
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass Rauchen eine Thrombozytenaktivierung bewirkt. Die Einwirkung von Rauchen auf die Funktion gelagerter Thrombozyten wurde jedoch bisher nicht untersucht. Dahinter könnte sich ein weiterer Grund für den Qualitätsverlust von Thrombozytenapheresepräparaten verbergen. Es sollte herausgefunden werden, ob das derzeitige Vorgehen, Raucher zur Thrombozytenspende zuzulassen, modifiziert werden muss.
Des Weiteren sollte überprüft werden, ob das Vorgehen, Thrombozytenkonzentrate 5 Tage zu lagern, beibehalten werden kann.
Im Einzelnen ergaben sich folgende Fragestellungen:
1. Welchen Einfluss hat Rauchen auf die Aktivierbarkeit von Thrombozyten aus Apheresepräparaten?
2. Welchen Einfluss hat die Lagerungszeit auf die Aktivierbarkeit von Thrombozyten aus Apheresepräparaten?
3. Welchen Einfluss hat Rauchen auf die Vitalität von Thrombozyten aus Apheresepräparaten?
4. Welchen Einfluss hat die Lagerungszeit auf die Vitalität von Thrombozyten aus Apheresepräparaten?
5. Welchen Einfluss hat Rauchen auf das Aggregationsverhalten von Thrombozyten aus Apheresepräparaten?
6. Welchen Einfluss hat die Lagerungszeit auf das Aggregationsverhalten von Thrombozyten aus Apheresepräparaten?
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Probanden
Bei den 30 Probanden handelte es sich um männliche Thrombozytenspender (mittleres Alter: 45 ± 19,6 Jahre) des Blutspendedienstes der Abteilung für Transfusionsmedizin der MHH. 15 von ihnen waren Raucher (20-30 Zigaretten pro Tag), 15 waren Nichtraucher. Die Spender erhielten einen Informationszettel, den sie bei Zustimmung zur Studienteilnahme unterschrieben. Alle Teilnehmer wurden apheresiert. Die Apherese wurde mit der Fresenius Com.Tec. durchgeführt. Das Sammelvolumen des Thrombozytenkonzentrates betrug 450 ml, wurde in einen Beutel (Compoflex 300 ml, Fresenius Hemo Care) überführt und auf einem Thrombozytenschüttler (Fa. Melco Engineering, Fa. Fresenius Transfusions GmBH, Dreieich) bei 22° C gelagert. Diesem Beutel wurden jeweils vor den Messungen 2 ml Thrombozytensuspension entnommen.
2.1.2 Durchflusszytometrie
Geräte
• Durchflusszytometer, Epics XL® (Fa. Beckmann Coulter, Krefeld)
• Unbegaster Brutschrank, Typ B 5060 EK/CO (Heraeus)
• Präzisionswaage (Fa. Sartorius, Göttingen)
• Minishaker, MS 2 (Fa. Omnilab, Gerden)
Zubehör
• Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml), (Fa. Sarstedt, Nümbrecht)
• Facs-Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht)
• Eppendorf-Pipetten 05-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl (Fa. Sarstedt, Nümbrecht)
• Pipettenspitzen 05-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl (Fa. Sarstedt, Nümbrecht)
Pufferlösungen
• PBS-Puffer, Phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung, pH
7,2 (eigene Herstellung) o 40 g NaCl
o 6,9 g NaH2PO4H2O o 5.000 ml aqua dest.
• PBS/BSA-Puffer [1 mg BSA/1 ml PBS], pH 7,2 (eigene Herstellung)
o 50 ml PBS-Puffer (s. oben)
o 50 mg BSA (Bovines Serum Albumin), Fa. Dade Behring, Marburg)
Aktivatoren
• TRAP-6: Thrombin-Receptor-Activator-Peptide-6 (Fa. Bachem, Heidelberg) o Stammlösung: 5 mg TRAP-6 + 6,67 ml PBS-Puffer, entspricht [1 mMol]
o Studie: 50 µl Aliquot + 450 µl PBS-Puffer, entspricht [100 µMol]
• ADP: Adenosin-5`-Diphosphat (Fa. Sigma Chemicals, Deisenhofen) o Stammlösung: 2,136 ADP + 5 ml PBS-Puffer, entspricht [1 mMol]
o Studie: 50 µl Aliquot + 450 µl PBS-Puffer, entspricht [100 µMol]
Antikörper
Es handelte sich um Antikörper der Firma Beckmann Coulter®, Krefeld. Zur Tot- Lebend-Diskriminierung wurde 5-Chloromethyl fluoreszin diacetate (CMFDA, Fa.
Molcular Probes, Leiden, Holland) verwendet.
Antigen Spezies Form Klon Bestell-Nr.
CD 36 Maus mAK / FITC FA 6 – 152 IM0766
CD 41 Maus mAK/PE P 2 IM1416
CD 42b Maus mAK/PE SZ 2 IM1417
CD 62 P Maus mAK / FITC CLB–Thromb/6 IM1164
Tab. 2.1: verwendete monoklonale Antikörper
Datenverarbeitung
• Datenaufnahme: EXPOTM Cytometer Software (Fa. Coulter, Sheffield, England)
• Datenauswertung: Software WinMDI (Windows Multiple Document Interface, Version 2.8, Fa. Joseph Trotter)
2.1.3 Aggregometrie
Gerät
• BCT, Behring Coagulations-Timer (Fa. Dade Behring, Marburg)
Zubehör
• Behring Coagulations Cups (Fa. Dade Behring, Marburg)
Aktivatoren
• ADP (200 µMol, Fa. Dade Behring, Marburg)
• Kollagen (2 mg/l, Fa. Dade Behring, Marburg)
• Epinephrin (2 mg/l, Fa. Dade Behring, Marburg)
Lösungen
• 0,9 % ige NaCl-Lösung
Datenaufnahme
• BCT Analyser Software, Version 2.0 (Fa. Dade Behring, Marburg)
2.2 Durchflusszytometrie
2.2.1 allgemeines Prinzip
Bei der Durchflusszytometrie handelt es sich um eine Methode zur immunphenotypischen Analyse verschiedener Zelltypen. Dabei wird eine Zellsuspension aus einem Probenröhrchen über eine Stahlkapillare in eine Messküvette gesaugt. Überdruck und ein laminar fließender Hüllstrom isotoner Flüssigkeit (Sheath) sorgen für eine hydrodynamische Fokussierung der Zellsuspension, somit für eine Beschleunigung des Zellflusses, eine Trennung von Zellaggregaten und eine Hintereinanderreihung der Zellen (wie Perlen einer
Perlenkette). So passieren die Zellen einzeln die Detektionszone eines Laserstrahls.
Aufgrund der Streuung des Laserstrahls lassen sich Rückschlüsse auf Größe, Granularität, Struktur der Zellmembran, Zellform und Zellkern ziehen.
Das Vorwärtsstreulicht (forward light scatter - FSC), das in einem Winkel von 5° zur Achse des Laserstrahls gemessen wird, charakterisiert die Größe der Zelle. Das Seitwärtsstreulicht (side scatter - SSC), das in einem Winkel von 90° zur Achse des Laserstrahls gemessen wird, gibt Auskunft über die Granularität der Zelle. FSC und SSC werden von Detektoren aufgenommen, erst in ein elektronisches, dann in ein digitales Signal umgewandelt, auf dem Bildschirm angezeigt und abgespeichert.
Der Argonlaser des Durchflusszytometers emittiert Licht von 488 nm. Bei dieser Wellenlänge werden Elektronen bestimmter Farbstoffe auf ein höheres Energieniveau gehoben. Bei Rückkehr dieser Elektronen auf ihr ursprüngliches Energieniveau kommt es zur Freisetzung von Lichtquanten. Diese Eigenschaft der Farbstoffe, nach Anregung durch den Laser Licht einer bestimmten Wellenlänge auszusenden, bezeichnet man als Fluoreszenz. Diese Eigenschaft macht sich die Immunfluoreszenzzytometrie zunutze.
Dabei werden Antikörper, die gegen bestimmte Antigene einzelner Zelltypen gerichtet sind , mit fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelt und der Zellsuspension beigemischt. Bei der durchflusszytometrischen Messung dieser Zellsuspension lassen sich nun Zellen durch Nachweis bestimmter Antigene charakterisieren.
Abb. 2.1 zeigt schematisch Funktionsprinzip und Aufbau eines Durchflusszytometers.
Abb. 2.1 : Vereinfachtes Schema der Funktionsweise eines Durchflusszytometers.
Nach: G. Beutel, M. Schott, Dissertation, Med. Hochschule Hannover, 2000
Fluoreszierende Farbstoffe sind Fluoreszinisothiocyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE). FITC emittiert Licht mit einer Wellenlänge von 519 nm, PE mit einer Wellenlänge von 560 nm. Da es sich dabei um Emissionsmaxima handelt, jeder Farbstoff aber eigentlich ein Spektrum von Licht emittiert, kommt es zu Überschneidungen der Spektren des emittierten Lichtes zweier Farbstoffe (s. Abb.
2.2).
Abb. 2.2 : Darstellung der Emissionswellenlängen zweier Fluoreszenzfarbstoffe (FITC und PE)
Aus diesem Grund werden Bandpassfilter eingesetzt, die Licht einer definierten Wellenlänge separieren können. Durch unterschiedliche Emissionsmaxima und spezielle Filterung können so verschiedene Fluoreszenzen gleichzeitig gemessen werden (B. Jüttner, Dissertation, MHH, 2001). Somit können auch verschiedene Antigeneigenschaften einzelner oder verschiedener Zelltypen in einer Messung nachgewiesen werden.
2.2.2 Aufbereitung des Probenmaterials
Vor jeder Messung wurden mittels großlumiger Kanüle dem Thrombozytenapheresebeutel 2 ml Thrombozytensuspension entnommen (s. Kap.
2.1.1). Da es sich bei den Proben um Thrombozytenkonzentrat handelte, waren keine Zentrifugationsschritte zur Trennung anderer korpuskulärer Bestandteile nötig.
Die Thrombozytensuspension wurde mittels PBS/BSA – Puffer auf 200.000 Zellen pro µl verdünnt und in 10 FACS-Röhrchen pipettiert.
Die Messung der Thrombozyten erfolgte in einem Zeitfenster von einer halben Stunde nach Probenentnahme.
2.2.3 Immunfluoreszenzfärbung und Stimulierung der Thrombozyten
Thrombozyten tragen Glykoproteine auf ihrer Oberfläche, die sich mittels fluoreszierender Antikörper spezifisch anfärben lassen (s. Kap. 1.1.3). Durch Messung der Fluoreszenzintensitäten dieser Antikörper lassen sich dann quantitative und qualitative Aussagen über diese Antigene treffen und somit Rückschlüsse auf den Aktivierungsgrad der Thrombozyten ziehen (s. Tab. 1.2).
2.2.3.1 unstimulierte Proben
Im ersten Schritt wurden in 2 Röhrchen jeweils 40 µl verdünnte Thrombozytensuspension gegeben. Dann wurde die Probe im ersten Röhrchen mit 5 µl des FITC–markierten Antikörpers gegen CD 62P und mit 10 µl des PE–markierten
Antikörpers gegen CD 41 gefärbt. Der Probe im zweiten Röhrchen wurden im folgenden 5 µl des FITC–markierten Antikörpers gegen CD 36 und 10 µl des PE–
markierten Antikörpers gegen CD 42b hinzugegeben. Nach vorsichtigem Mischen der nun fluoreszenzmarkierten Proben durch Ansaugen mit der Pipette wurden die Proben 5 Minuten bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert. Dann wurde die Reaktion
durch Zugabe von 2 ml eiskaltem PBS/BSA – Puffer abgestoppt, die Proben im Dunkeln auf Eis gelagert und anschließend gemessen.
2.2.3.2 Stimulation mit TRAP-6
TRAP-6 (Thrombozytenaktivierungspeptid) bewirkt als Ligand des Thrombin- Rezeptors eine Freisetzung der Granulainhaltsstoffe des Thrombozyten und führt zu einer Fusion der Organellenmembran mit der Plasmamembran. Auf diesem Wege kommt es zu einer Aktivierung des Thrombozyten und zu einer Präsentation bestimmter Proteine auf seiner Oberfläche (s. Kap. 1.1.2).
In die ersten beiden Röhrchen wurden 39,2 µl, in die zweiten beiden Röhrchen 37,6 µl Thrombozytensuspension gegeben. Im Folgenden wurden die Proben mit 0,8 µl
beziehungsweise 2,4 µl TRAP-6 so stimuliert, dass sich im Anschluss daran in jedem Röhrchen 40 µl Probenflüssigkeit befand. Es folgte eine 10 minütige Inkubation im Brutschrank bei 37°C. Der Vorgang der Färbung mit immunfluoreszierenden Antikörpern war identisch mit dem der unstimulierten Proben (s. Kap. 2.2.3.1). So konnte sowohl die Fluoreszenzintensität der Antikörper gegen CD 62P und CD 41 als auch die der Antikörper gegen CD 36 und CD 42b nach Stimulation mit TRAP-6 in jeweils 2 verschiedenen Konzentrationen gemessen werden.
2.2.3.3 Stimulation mit ADP
Im Gegensatz zu TRAP-6 befindet sich ADP physiologischerweise in den dichten Granula der Thrombozyten (s. Kap. 1.1.2). Nach Degranulation und Sekretion oder
nach Zugabe „von außen“ umgibt ADP den Thrombozyten, bindet an Rezeptoren und sorgt über Signaltransduktion für eine Thrombozytenaktivierung (s. Kap. 1.1.4).
In 2 der 4 Röhrchen wurde 38 µl, in die anderen 2 Röhrchen 36 µl Thrombozytensuspension pipettiert. Dann wurden die Proben mit 2 µl beziehungsweise 4 µl ADP so stimuliert, dass sich im Folgenden in jedem Röhrchen 40 µl Probenflüssigkeit befand. Inkubations- und Färbevorgang waren dabei identisch mit dem der mit TRAP-6 stimulierten Proben (s. Kap. 2.2.3.3), so dass im Anschluss daran sowohl die Fluoreszenzintensität der Antikörper gegen CD 62P und CD 41 als auch die der Antikörper gegen CD 36 und CD 42b nach Stimulation mit ADP in 2 verschiedenen Konzentrationen gemessen werden konnte.
2.2.3.4 Tot–Lebend–Diskriminierung
Die Tot-Lebend-Diskriminierung erfolgte mithilfe von 5-Chloromethyl fluorescin diacetate (CMFDA). CMFDA ist eine farblose, nichtfluoreszierende Verbindung. Es trägt eine reaktive Chloromethylgruppe und passiert frei die Zellmembran lebender Thrombozyten. Intrazellulär reagiert CMFDA mit Thiolen und verwandelt sich so in eine farbige Verbindung. Nachdem zytosolische Esterasen noch die Azetat-Gruppe von CMFDA zerspalten, entsteht eine hell fluoreszierende Verbindung (Baker et al., 1997). Die Fluoreszenz konnte durch Detektion von Fluoreszenzkanal 1 gemessen werden.
Bei der Passage von CMFDA durch die Zellmembran handelt es sich um einen aktiven Prozess, dieser findet ausschließlich in lebenden Thrombozyten statt. Somit kann auch nur in lebenden Zellen eine fluoreszierende Verbindung entstehen. Auf
diese Weise ist eine Diskriminierung zwischen toten und lebenden Thrombozyten möglich (Lim et al., 2002).
Mittels PBS – Puffer wurde die Thrombozytensuspension auf 20.000 Zellen pro µl verdünnt. 100 µl dieser Suspension wurden dann mit 24 µl CMFDA durch vorsichtiges Ansaugen mit der Pipette vermischt und im Folgenden 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss daran wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml eiskaltem PBS – Puffer abgestoppt und die Probe im Dunkeln auf Eis gelagert. Sie konnte nun gemessen werden.
2.2.4 Messung der Immunfluoreszenzen
Bezüglich der Durchführung der Messungen gab es zwischen Rauchern und Nichtrauchern keinen Unterschied. Auch der Messzeitpunkt hatte keinen Einfluss auf den Ablauf der Messungen.
Alle Proben wurden vor der Messung mit dem Minishaker gemischt. Dann wurde die Fluoreszenz für CMFDA und die mittlere Fluoreszenzintensität für CD 41 PE, CD 42b PE, CD 62P FITC und CD 36 FITC untersucht. Der Fluoreszenzkanal FL 1 wurde dabei sowohl für die Detektion der mit FITC markierten Antikörper angefärbten Thrombozyten, als auch für die mit CMFDA angefärbten Thrombozyten verwendet.
Der Fluoreszenzkanal FL 2 war für die Detektion der mit PE markierten Antikörper angefärbten Thrombozyten bestimmt.
Es wurden für jede Probe 20.000 Ereignisse gemessen. Die Messzeit betrug für alle Proben eines Probanden an jedem Messtag 15 Minuten.
2.2.5 Probandenkollektive
Ziel der Studie war es unter anderem, den Einfluss von Nikotin auf die Funktion von Thrombozyten aus Apheresepräparaten festzustellen. Aus diesem Grund wurden die Messungen an 2 Probandenkollektiven durchgeführt; es wurden die Thrombozyten von 15 männlichen Rauchern, sowie von 15 männlichen Nichtrauchern untersucht.
Bei allen Probanden handelte es sich um gesunde Thrombozytenspender des Blutspendedienstes der Abteilung für Transfusionsmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover (s. Kap. 2.1.1).
2.2.6 Lagerungsversuche
Ein weiteres Ziel der Studie war es, den Einfluss der Lagerungszeit auf die Stimulierbarkeit von Thrombozyten aus Apheresepräparaten festzustellen. Aus diesem Grund wurden die Messungen der gleichen Thrombozytenkonzentrate an 3 verschiedenen Tagen durchgeführt: am Tag der Thrombozytenspende, 2 Tage und 4 Tage später. In der Zwischenzeit wurden die Thrombozytenkonzentrate in einem dafür vorgesehenen Beutel in einem Thrombozytenschüttler bei 22 °C gelagert (s.
Kap. 2.1.1). Die Aufbereitung der Proben, sowie die Stimulierungen und Färbungen erfolgten erst unmittelbar vor der Messung in einem Zeitfenster von 2 Stunden.
2.2.7 Messdatenauswertung
Die Messdatenauswertung erfolgte mit der Software WinMDI 2.8 (Windows Multiple Document Interface).
Da es sich bei den Proben um aufbereitete Thrombozytenkonzentrate handelte, waren keine Schritte zur Identifizierung der Thrombozyten und Abgrenzung anderer Zellpopulationen notwendig.
Im ersten Schritt wurde die Thrombozytenpopulaton durch logarithmische Auftragung der Parameter Zellgröße (FSC) gegen Granularität (SSC) in einem Zweiparameter- Punktehistogramm („dot plot“) dargestellt (s. Abb. 2.3).
Zur Trennung anderer korpuskulärer Bestandteile (wie beispielsweise „Zelltrümmer“) wurden bestimmte Auswertfenster definiert. Dieses Verfahren nennt man „gating“ (s.
Abb. 2.4).
Abb. 2.3: „dot plot“ zur Darstellung Abb. 2.4: „gating“ eines „dot plots“ zur einer Thrombozytenpopulation Trennung von Zelltrümmern
Von nun an wurden nur noch die in dem Gate befindlichen Zellen in die Messungen der Fluoreszenzen einbezogen.
Es erfolgte die endgültige Messung der Fluoreszenzen für die Antikörper CD 62 P FITC (Fluorenzkanal 1) und CD 41 PE (Fluoreszenzkanal 2), die in einem Histogramm mit logarithmischer Einteilung dargestellt wurden. Auf der Abszisse wurden die Signalintensitäten (1024 Kanäle) und auf der Ordinate die Anzahl der Zellen aufgetragen (s. Abb. 2.5 und 2.6).
Abb. 2.5: Histogramm zur Messung Abb. 2.6: Histogramm zur Messung der Fluoreszenzen des Antikörpers der Fluoreszenzen des Antikörpers CD 62 P CD 41
Die Messung und Darstellung der Fluoreszenzen für die Antikörper CD 36 FITC (Fluoreszenzkanal 1) und CD 42 b PE (Fluoreszenzkanal 2) war mit der eben beschriebenen identisch.
Ebenso wurden die Fluoreszenzen der Antikörper nach Aktivierung der Thrombozyten mit ADP und TRAP-6 gemessen.
Bezüglich der Durchführung der Auswertung gab es keinen Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern. Auch hatte der Messzeitpunkt keinen Einfluss auf den Ablauf der Auswertungen.
2.3 Aggregometrie
2.3.1 allgemeines Prinzip
Bei der Aggregometrie werden die Aggregationseigenschaften von Thrombozyten gemessen. Die Thrombozyten befinden sich dabei als Konzentrat oder als Bestandteil in plättchenreichem Plasma (PRP) in einer Küvette eines Aggregometers.
Sie werden bei 37°C mit definierter Geschwindigkeit gerührt und zwischen einer Lichtquelle und einer Fotozelle platziert. Die Fotozelle misst permanent die Transmission des Lichtes durch die Suspension.
Durch Zugabe von Plättchenagonisten wie beispielsweise ADP, Kollagen und Epinephrin werden die Thrombozyten aktiviert. Dies führt zu einer Formveränderung (shape change), zu einer primären und dann zu einer sekundären Aggregation (s.
Kap. 1.1.2). Diese verschiedenen Zustandsformen der Thrombozyten verursachen Veränderungen der Lichttransmission, die das Aggregometer im Verlaufe der Zeit als Aggregationskurven aufzeichnet (s. Abb. 2.7).
Abb. 2.7: schematische Darstellung der Zustandsformen ruhender beziehungsweise aktivierter Thrombozyten (s. A, B, C, D) und mögliche Verlaufsformen von Aggragationskurven (s. 1, 2, 3)
Bei einem biphasischen Kurvenverlauf sind primäre und sekundäre Aggregation deutlich voneinander zu unterscheiden (Kurve 1). Ein monophasischer Kurvenverlauf (Kurve 2) entsteht, wenn durch hohe Agonistenkonzentrationen ein direkter Übergang von primärer zu sekundärer Aggregation stattfindet. Im Falle des dritten Kurvenverlaufes (Kurve 3) kommt es zwar zu einer reversiblen
Thrombozytenaggregation, im Folgenden jedoch aufgrund zu geringer Agonistenkonzentration zu einer Desaggregation.
ADP aktiviert über Signaltransduktion den GP IIb-IIIa – Rezeptor, dies führt zu einer Thrombozytenaggregation. Kollagen sorgt für eine Sekretion von ADP aus den Organellen des Thrombozyten und für eine Erhöhung des intrazellulären Kalziums, dies führt ebenfalls zu einer Thrombozytenaktivierung. Hohe Kollagenkonzentrationen aktivieren den Thrombozyten direkt. Epinephrin hat nur ein sehr geringes Aktivierungspotential, wirkt aber synergistisch mit anderen Agonisten.
Die Software des angeschlossenen Computers ermittelte Werte für die Maximalaggregation, die maximale Aggregationsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit.
Die Maximalaggregation wird normalerweise mithilfe von plättchenarmem Plasma (PPP) berechnet. Die Formel lautet:
100 x (Absorption PRP bei 0 Sek. – Absorption PRP bei 600 Sek.)
Max. Agg. =
—————————————————————————————Absorption PRP bei 0 Sek. – Absorption von PPP
Nach Fa. Dade Behring (Application sheet for Dade® Cluster® Platelet Aggregation Reagents on BCT) ist jedoch der Einfluss des PPP-Wertes auf das Ergebnis der Maximalaggregation von Thrombozytenaggregaten nicht ausschlaggebend und kann aus diesem Grund vernachlässigt werden. Eine Formel für die Maximalaggregation ohne den Einfluss des PPP liefert das gleiche Ergebnis. Die Formel lautet:
100 x (Absorption PRP bei 0 Sek. – Absorption PRP bei 600 Sek.)
Max. Agg. =
—————————————————————————————Absorption PRP bei 0 Sek.
Abschnitt A in Abbildung 2.8 beschreibt die Maximalaggregation. Die maximale Aggregationsgeschwindigkeit kann auf 2 verschiedene Weisen dargestellt werden.
Zum einen kann der Winkel, der aus dem Schnittpunkt einer Geraden, die die Kurve im Punkt des steilsten Anstiegs schneidet, mit der x –Achse entsteht, als Maß für die maximale Aggregationsgeschwindigkeit angesehen werden (Winkel B in Abbildung 2.8). Zum anderen kann die maximale Aggregationsgeschwindigkeit durch das Verhältnis zweier Strecken zueinander (Strecken C und D in Abbildung 2.9) errechnet werden. Die Formel lautet:
Strecke C (Transmission)
V max =
————————————Strecke D (Zeit)
Der Zeitpunkt der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit lässt sich graphisch darstellen, indem man ein Lot vom Punkt des steilsten Anstiegs der Aggregationskurve fällt; der Schnittpunkt mit der X – Achse entspricht dabei dem Zeitpunkt der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit (E in Abbildung 2.8).
Abb. 2.8: graphische Darstellung von Maximalaggregation (Abschnitt A), maximaler Aggregationsgeschwindigkeit (Winkel B) und Zeitpunkt der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit (Abschnitt E)
Abb. 2.9: graphische Darstellung zur Verdeutlichung der Berechnung der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit
2.3.2 Aufbereitung des Probenmaterials
Vor jeder Messung wurden dem Thrombozytenbeutel mittels großlumiger Kanüle 2 ml Thrombozytensuspension entnommen (s. Kap. 2.1.1). Da sowohl die Aggregationseigenschaften reiner Thrombozytenkonzentrate (800.000 – 1.300.000 Zellen pro µl) als auch die von Proben mit physiologischen Thrombozytenkonzentrationen untersucht werden sollten, wurde ein Teil der Thrombozytensuspension mittels 0,9 % iger NaCl-Lösung auf 300.000 Zellen pro µl verdünnt. Im Folgenden wurden jeweils 600 µl jeder Probe vorsichtig in die Cups pipettiert.
Verdünnung und Pipettierung der Proben verursachen eine Voraktivierung der Thrombozyten. Diese hat Einfluss auf die Aggregationseigenschaften, führt somit zu Unregelmäßigkeiten der Messergebnisse. Um dies zu vermeiden wurden die Proben vor der Messung 30 Minuten stehen gelassen. In dieser Zeit konnten die Thrombozyten wieder einen ruhenden Zustand einnehmen, fielen aber auch, der Schwerkraft folgend, zu Boden. Aus diesem Grund wurde die Thrombozytensuspension direkt vor Positionierung im Aggregometer durch vorsichtiges Schwenken des Cups vermischt.
Ziel war es also, eine homogene Lösung nicht aktivierter Thrombozyten messen zu können.
2.3.3 Aufbereitung der Aggregationsreagenzien
Die Aggregationsreagenzien ADP, Kollagen und Epinephrin wurden in ungelöster Form geliefert, bei 8 °C dunkel gelagert und mussten vor Gebrauch mit jeweils 1 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Ihre maximale Haltbarkeit betrug 2 Wochen.
Für die Messungen mussten die Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmt werden.
Im Anschluss daran wurden jeweils 135 µl in die Cups gefüllt und im Aggregometer positioniert.
Bei ADP und Epinephrin handelte es sich um klare Lösungen. Nach Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser hatte ADP eine Konzentration von 200 µMol, Epinephrin hatte eine Konzentration von 100 µMol.
Kollagen musste nach Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser 20 Sek. geschüttelt (so als würde man ein Fieberthermometer ausschlagen) und im Anschluss daran ungefähr 10 min. geschwenkt werden. Bei Kollagen handelte es sich um eine trübe Flüssigkeit, die auch vor jeder Messung erneut mithilfe des Minishakers gemischt werden musste. Kollagen hatte eine Konzentration von 2 mg pro ml.
2.3.4 Messung der Aggregationsparameter
Vor den Messungen wurde das Aggregometer mehrmals gewaschen. Die in den Cups befindlichen Proben und Aggregationsreagenzien konnten im Folgenden in die dafür vorgesehenen Cup-Positionen des Aggregometers platziert werden. Der Messvorgang startete nach Auswahl der Messparameter durch Schließen der Aggregometerhaube. Im Anschluss daran ermittelte die Software des angeschlossenen Computers Werte für die Maximalaggregation, die maximale Aggregationsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit (s. Kap. 2.3.1). Die Messungen wurden jeweils für 2 verschiedene Konzentrationen eines Probanden (s. Kap. 2.3.2), nach Stimulation mit 3 verschiedenen Aktivatoren (s. Kap. 2.3.4) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden
sowohl in Form von Zahlen, als auch in Form von Aggregationskurven (s. Abb. 2.6) angezeigt und automatisch gespeichert.
Bezüglich der Durchführung der Messungen gab es keinen Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern. Auch hatte der Messzeitpunkt keinen Einfluss auf den Ablauf der Messdurchführungen.
Die Messung einer Probe nach Stimulation mit einem Aktivator dauerte maximal 600 Sekunden.
Abb. 2.10: Reaktionsverläufe der Aggregationskurven nach Stimulation mit Kollagen (Kurve A), ADP (Kurve B) und Epinephrin (Kurve C)
2.3.5 Probandenkollektive
Die Probanden waren identisch mit denen für die durchflusszytometrischen Untersuchungen (s. Kap. 2.2.5).
2.3.6 Lagerungsversuche
Die Messzeitpunkte zur Untersuchung der Lagerungsfähigkeit waren identisch mit denen der durchflusszytometrischen Untersuchungen (s. Kap. 2.2.6).
2.4 Statistische Auswertung
Die Daten und Messwerte wurden in das Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft® Excel 2000 (siehe Literatur) eingegeben. Die anschließende statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm SPSS® Version 11.0.1 (siehe Literatur).
2.4.1 Signifikanzniveau
Allgemein sollte bei der Überprüfung von Verteilungen, Homogenitäten der Varianzen und Testentscheidungen die Nullhypothese bis zu einer Irrtumswahrscheinlichlichkeit von 5 % angenommen werden.
2.4.2 Untersuchungsgruppen, Messzeitpunkte und Untersuchungsparameter
Die Probanden wurden in den Gruppen Raucher und Nichtraucher unterschieden.
Die Untersuchungsparameter sind am Tag der Thrombozytenspende, am dritten Tag und am fünften Tag der Lagerungszeit gemessen worden. An jedem Messzeitpunkt wurden durchflusszytometrisch die Fluoreszenz für CMFDA und die thrombozytäre
Rezeptorexpression von CD 36, CD 41, CD 42b und CD 62P quantifiziert sowie aggregometrisch die maximale Aggregation, die Aggregationsgeschwindigkeit (Vmax), der Winkel von Vmax und der Beginn von Vmax bestimmt.
2.4.3 Datenexploration
Im ersten Schritt wurde eine explorative Datenanalyse für die ermittelten Parameter und Variablen der Probanden durchgeführt. Hierbei wurden die Kennwerte zur Beurteilung von mittlerer Lage, Verteilung, Schiefe der Verteilung und Varianzhomogenität berechnet. Die objektive Überprüfung des Datenmaterials auf Vorliegen einer Normalverteilung wurde für alle stetigen Merkmale mit Hilfe des nichtparametrischen Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstests durchgeführt (Kreyszig).
Das Ergebnis zur Homogenität der Varianzen lieferte der Levene-Test.
2.4.4 Vergleichbarkeit der Patientengruppen
Ob eine gruppenabhängige Verteilung des Alters und Gewichts vorlag, wurde univariat mit einer einfaktoriellen ANOVA (analysis of variance) überprüft.
2.4.5 Untersuchung der Parameterintensität
Der Einfluss der Lagerungszeit wurde für die einzelnen Parameter bei Normalverteilung und gegebener Varianzhomogenität mit einer univariaten
einfaktoriellen ANOVA nach dem allgemeinen linearen Modell untersucht. Konnte ein Signifikanzniveau p≤0,05 nachgewiesen werden, wurde ein post-hoc Test verwendet, um festzustellen, welche Messzeitpunkte voneinander abwichen. Zur Anwendung kam bei Homogenität der Varianzen der Bonferroni Test, konnte keine Varianzgleichheit vorausgesetzt werden, der Games-Howell Test.
Die Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen wurden für jeden Messzeitpunkt bei Normalverteilung und einer Schiefe |γ|≤0,4 in einem paarweisen Vergleich mit dem Student-t-Test für unverbundene Stichproben geprüft. Konnten diese Voraussetzungen nicht angenommen werden, wurde der Mann-Whitney-U- Test verwendet.
3 Ergebnisse
3.1 Durchflusszytometrische Messungen
3.1.1 Einfluss von Lagerungszeit und Rauchen auf die Rezeptorexpression
3.1.1.1 Expression von P-Selektin
Bei Betrachtung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) für die Oberflächenexpression von P-Selektin zeigte sich eine Zunahme der Rezeptorexpression und damit auch eine Erhöhung der Thrombozytenaktivierung im Laufe der Zeit. Signifikante Unterschiede bestanden dabei in beiden Gruppen zwischen Tag 1 und 5 und Tag 3 und 5 (p < 0,05).
Die Stimulierbarkeit der Rezeptorexpression durch TRAP-6 nahm hingegen in beiden Gruppen im Laufe der Zeit ab. Dies zeigte sich besonders deutlich in der Rauchergruppe nach Stimulation mit 6 µMol TRAP-6. Am 1. Tag bewirkte die Stimulation noch eine Zunahme der MFI um 3,1 auf 5,4, während sich die MFI am 3.
Tag um 1,5 auf 4,0 erhöhte und am 5. Tag lediglich ein Anstieg von 1,0 auf 3,9 festzustellen war.
Die Stimulierbarkeit der Rezeptorexpression durch ADP sank im Laufe der Zeit ebenfalls. Am Beispiel der mit 10 µMol ADP stimulierten Proben der Rauchergruppe sieht man, dass die MFI am ersten Tag noch um 1,4 auf 3,7 stieg, während sie am 3.
Tag um 0,6 auf 3,1 und am 5. Tag lediglich um 0,5 auf 3,6 zunahm.
Die Thrombozyten der Nichtrauchergruppe ließen sich durch TRAP-6 besser stimulieren als die der Rauchergruppe. Dies zeigte sich am deutlichsten am 3. Tag nach Stimulation mit 6 µMol TRAP-6. Während in der Nichtrauchergruppe ein Anstieg der MFI um 4,1 auf 6,5 gemessen wurde, nahm die MFI in der Rauchergruppe lediglich um 1,5 auf 4,0 zu.
Spender Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher
Tag 1 Tag 3 Tag 5
P-Selektin
Baseline 2,3 ± 0,1 2,3 ± 0,1 2,5 ± 0,1 2,4 ± 0,1 2,9 ± 0,1#$ 2,9 ± 0,1#$
2µM TRAP-6 2,6 ± 0,1 3,0 ± 0,2 2,6 ± 0,1 2,7 ± 0,1 3,0 ± 0,1 3,2 ± 0,1 6µM TRAP-6 5,4 ± 0,4 6,0 ± 0,7 4,0 ± 0,4 6,5 ± 1,4 3,9 ± 0,3# 4,3 ± 0,2 5µM ADP 3,5 ± 0,2 3,4 ± 0,1 3,0 ± 0,1 3,1 ± 0,1 3,3 ± 0,2 3,4 ± 0,1 10µM ADP 3,7 ± 0,3 3,7 ± 0,2 3,1 ± 0,1 3,3 ± 0,2 3,4 ± 0,2 3,5 ± 0,1
Tab. 3.1: MFI für die Oberflächenexpression von P-Selektin ohne und nach Stimulation mit TRAP-6 und ADP.
#P < 0,05 Tag 1 vs. Tag 5
$P < 0,05 Tag 3 vs. Tag 5
3.1.1.2 Expression von GP IIb-IIIa
Bei Betrachtung der MFI für die Oberflächenexpression von GP IIb-IIIa zeigte sich eine Abnahme der Rezeptorexpression im Laufe der Zeit. Signifikante Unterschiede bestanden dabei in beiden Gruppen zwischen Tag 1 und 5 (p < 0,05).
Die Stimulierbarkeit der Rezeptorexpression durch TRAP-6 in verschiedenen Konzentrationen nahm im Laufe der Zeit ebenfalls ab. Dies zeigte sich besonders deutlich nach Stimulation mit 6 µMol TRAP-6. Am ersten Tag bewirkte die Stimulation der Proben der Rauchergruppe eine Zunahme der MFI um 7,4 auf 27,5, während die MFI an den anderen Tagen nur um 2,7 auf 21,4 (Tag 3) beziehungsweise um 2,0 auf 19,6 (Tag 5) anstieg.
Auch die Stimulierbarkeit der Rezeptorexpression durch ADP nahm im Laufe der Zeit ab. Am Beispiel der mit 10 µMol ADP stimulierten Proben der Nichtrauchergruppe sieht man, dass die MFI nach Stimulation am ersten Tag um 8,3 auf 28,7 anstieg, während sie am 3. Tag nur noch um 5,2 auf 22,5 und am 5. Tag lediglich um 2,5 auf 20,0 zunahm.
Die Rezeptorexpression auf den Thrombozyten der Nichtrauchergruppe ließ sich durch TRAP-6 besser stimulieren als die auf den Thrombozyten der Rauchergruppe.
Dies zeigte sich unter anderem nach Stimulation mit 6 µMol TRAP-6. In der Nichtrauchergruppe führte die Stimulation am 1. Tag zu einer Zunahme der MFI um 10,6 auf 31,0, während es in der Rauchergruppe lediglich zu einem Anstieg um 7,4 auf 27,5 kam. An den anderen Messtagen stieg die MFI nach Stimulation in der Nichtrauchergruppe um 6,6 auf 23,9 (Tag 3) beziehungsweise um 4,0 auf 21,5 (Tag 5), unterdessen bewirkte die Stimulation in der Rauchergruppe nur eine Zunahme der MFI um 2,7 auf 21,3 (Tag 3) beziehungsweise um 2,0 auf 19,6 (Tag 5).
Spender Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher
Tag 1 Tag 3 Tag 5
GP IIb-IIIa
Baseline 20,1 ± 0,9 20,4 ± 1,4 18,6 ± 0,5 17,3 ± 0,8 17,6 ± 1,0# 17,5 ± 1,0# 2µM TRAP-6 21,9 ± 0,8 22,7 ± 1,5 18,7 ± 0,4* 20,6 ± 0,9 17,8 ± 0,9# 18,2 ± 1,2 6µM TRAP-6 27,5 ± 1,0 31,0 ± 2,5 21,3 ± 0,8* 23,9 ± 1,3 19,6 ± 1,0# 21,5 ± 1,3# 5µM ADP 26,0 ± 1,0 27,0 ± 2,0 20,6 ± 0,8* 19,8 ± 1,1* 19,5 ± 1,2# 18,7 ± 0,9# 10µM ADP 29,5 ± 0,9 28,7 ± 1,9 21,1 ± 1,0* 22,5 ± 1,2* 20,6 ± 0,7# 20,0 ± 1,0#
Tab. 3.2: MFI für die Oberflächenexpression von GP IIb-IIIa ohne und nach Stimulation mit TRAP-6 und ADP.
*P < 0,05 Tag 1 vs. Tag 3
#P < 0,05 Tag 1 vs. Tag 5
3.1.1.3 Expression von GP Ib
Bei Betrachtung der MFI für die Oberflächenexpression von GP Ib zeigte sich in beiden Gruppen eine leichte nicht signifikante Abnahme der Rezeptorexpression im Laufe der Zeit.
Die Stimulierung der Proben mit TRAP-6 führte zu einer Abnahme der Oberflächendichte von GP Ib. Es konnte eine ausgeprägtere Abnahme, also eine zunehmende Stimulierbarkeit im Laufe der Zeit festgestellt werden. Dies zeigte sich besonders deutlich in der Rauchergruppe nach Stimulation der Proben mit 6 µMol TRAP-6. Während die Stimulation am ersten Tag lediglich zu einer Abnahme der MFI
um 0,5 auf 30,9 führte, sank die MFI am 5. Tag nach Stimulation um 2.9 auf 25,5.
Dieser Unterschied war signifikant.
Die Stimulierung der Proben mit ADP führte an Tag 1 noch zu einer Zunahme der Rezeptorexpression, die sich jedoch im Laufe der Zeit in eine Abnahme änderte. So bewirkte beispielsweise an Tag 1 die Stimulierung mit 10 µMol ADP eine Zunahme der MFI um 1,0 auf 32,4, an Tag 3 sank die MFI nach Stimulation schon um 0,7 auf 29,8 und an Tag 5 sogar um 2.9 auf 25,7.
Bezüglich der Rezeptorexpression von GP Ib unstimulierter Proben und nach Stimulation mit TRAP-6 und ADP konnten keine Unterschiede zwischen Rauchern und Nichtrauchern festgestellt werden.
Spender Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher
Tag 1 Tag 3 Tag 5
GP Ib
Baseline 31,4 ± 1,0 30,9 ± 1,7 30,5 ± 0,9 29,1 ± 1,5 28,4 ± 1,2 27,7 ± 1,3 2µM TRAP-6 31,7 ± 1,1 31,4 ± 1,6 30,3 ± 1,3 28,7 ± 1,7 27,4 ± 1,4 26,1 ± 1,1 6µM TRAP-6 30,9 ± 1,1 30,4 ± 1,7 27,7 ± 0,9 26,9 ± 1,4 25,5 ± 1,1# 25,2 ± 1,1 5µM ADP 32,8 ± 0,8 32,4 ± 2,2 29,1 ± 0,9 27,5 ± 1,3 26,2 ± 1,3# 26,3 ± 1,0 10µM ADP 32,4 ± 1,2 31,7 ± 2,3 29,8 ± 1,2 29,2 ± 1,6 25,7 ± 1,5# 26,5 ± 1,4
Tab. 3.3: MFI für die Oberflächenexpression von GP Ib ohne und nach Stimulation mit TRAP-6 und ADP.
#P < 0,05 Tag 1 vs. Tag 5
3.1.1.4 Expression von GP IV
Bei Betrachtung der MFI für die Oberflächenexpression von GP IV zeigte sich eine leichte nicht signifikante Abnahme der Rezeptorexpression zwischen Tag 1 und 3 in beiden Gruppen.
Die Stimulierung der Proben mit TRAP-6 (besonders in hoher Konzentration) führte am 1. Tag zu einer Zunahme der Rezeptorexpression von GP IV. Die Stimulierbarkeit der Rezeptorexpression durch TRAP-6 sank jedoch im Laufe der Zeit. Am 3. Tag war noch eine geringe Zunahme der Rezeptorexpression zu beobachten, während die Oberflächendichte von GP IV am 5. Tag nach Stimulierung sogar leicht abnahm.
Die Stimulierung der Proben mit ADP bewirkte eine Zunahme der Rezeptorexpression von GP IV. Die Stimulierbarkeit der Rezeptorexpression durch ADP nahm im Laufe der Zeit ebenfalls ab. So stieg die MFI beispielsweise nach Stimulation mit 5 µMol ADP in der Rauchergruppe am ersten Tag um 5,0 auf 42,2, veränderte sich an Tag 3 kaum und sank sogar am 5.Tag etwas um 0,9 auf 34,4.
Im Vergleich der beiden Gruppen zeigte sich eine leicht erhöhte Rezeptorexpression von GP IV auf Thrombozyten unstimulierter Proben der Rauchergruppe. Die Thrombozyten der Nichtrauchergruppe ließen sich durch TRAP-6 und ADP am 1.
und 3. Tag besser stimulieren als die der Rauchergruppe. Am deutlichsten war dieser Unterschied am ersten Messtag nach Stimulierung mit 6 µMol TRAP-6 und 10 µMol ADP. Während die MFI in der Rauchergruppe um 4,6 auf 41,8 (TRAP-6), beziehungsweise 1,8 auf 39,0 (ADP) stieg, erhöhte sie sich in der Nichtrauchergruppe um 5,9 auf 41,4 (TRAP-6) beziehungsweise um 3,2 auf 38,7 (ADP).
Spender Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher Raucher Nichtraucher
Tag 1 Tag 3 Tag 5
GP IV
Baseline 37,2 ± 3,4 35,5 ± 2,7 35,0 ± 2,8 33,5 ± 2,6 35,1 ± 2,6 33,6 ± 2,0 2µM TRAP-6 38,1 ± 3,5 36,9 ± 2,9 35,0 ± 2,7 33,4 ± 2,6 34,6 ± 2,6 33,3 ± 1,9 6µM TRAP-6 41,8 ± 3,5 41,4 ± 3,5 35,1 ± 2,8 34,7 ± 2,8 34,4 ± 2,4 34,1 ± 1,9 5µM ADP 42,2 ± 3,7 40,9 ± 3,4 35,6 ± 2,8 35,2 ± 2,7 34,2 ± 2,8 34,4 ± 2,1 10µM ADP 39,0 ± 3,2 38,7 ± 3,4 36,0 ± 2,9 36,1 ± 2,9 33,9 ± 3,1 34,5 ± 2,1
Tab. 3.4: MFI für die Oberflächenexpression von GP IV ohne und nach Stimulation mit TRAP-6 und ADP.
3.1.2 Tot-Lebend-Diskriminierung
In beiden Gruppen fand sich ein nicht signifikanter Abfall lebender Thrombozyten im Laufe der Lagerungszeit (s. Abb. 3.1). Dies zeigte sich in einer Abnahme von 96,22
% (±1,53) an Tag 1 auf 92,74 % (±2,04) an Tag 5 in der Rauchergruppe und von 96,68 % (±1,64) an Tag 1 auf 91,08 % (±2,26) an Tag 5 in der Nichtrauchergruppe.
Der prozentuale Verlust lebender Thrombozyten variierte damit zwischen 1,6 % (zwischen Tag 1 und 3 in der Nichtrauchergruppe) und 4 % (zwischen Tag 3 und 5 in der Nichtrauchergruppe). An keinem der Messtage bestanden signifikante Unterschiede zwischen Rauchern und Nichtrauchern.
80 90 100
Tag 1 Tag 3 Tag 5
% lebende Thrombozyten
Raucher Nichtraucher
Abb. 3.1: graphische Darstellung der Anzahl lebender Thrombozyten in Apheresepräparaten in Prozent im Laufe der Zeit
3.2 Aggregometrische Messungen
3.2.1 Einfluss von Lagerungszeit und Rauchen auf die Maximalaggregation
Der starke Plättchenaktivator Kollagen führte an allen Tagen in beiden Gruppen zu einer Maximalaggregation der Thrombozytenkonzentrate. Es konnte ein signifikanter Abfall der Maximalaggregation zwischen Tag 1 und 5 gemessen werden (p < 0,05).
Es konnte an keinem der Messtage ein Unterschied zwischen den Gruppen (Raucher und Nichtraucher) festgestellt werden.
Abb. 3.2: Maximalaggregation der Thrombozytenkonzentrate nach Stimulation mit Kollagen
Der schwächere Plättchenagonist ADP führte in beiden Gruppen lediglich am ersten Tag zu einer messbaren Maximalaggregation der Thrombozytenkonzentrate. An den anderen Messtagen reichte die ADP-Konzentraion nicht aus, um eine sekundäre, irreversible und damit maximale Thrombozytenaggregation herbeizuführen. Ein signifikanter Unterschied konnte somit zwischen Tag 1 und 3 und Tag 1 und 5 gemessen werden (p < 0,05).
Am ersten Messtag wurde in der Nichtrauchergruppe eine höhere Maximalaggregation gemessen als in der Rauchergruppe. Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant.
Abb. 3.3: Maximalaggregation der Thrombozytenkonzentrate nach Stimulation mit ADP
Der schwache Plättchenagonist Epinephrin bewirkte in beiden Gruppen nur am ersten Messtag eine Maximalaggregation. An den anderen Messtagen reichte die Agonistenkonzentration nicht aus, um eine messbare Maximalaggregation hervorzurufen. Somit fand sich ebenfalls ein signifikanter Unterschied zwischen Tag 1 und 3 und Tag 1 und 5 (p < 0,05).
Am 1. Messtag wurde in der Nichtrauchergruppe eine signifikant höhere Maximalaggregation als in der Rauchergruppe gemessen (p < 0,05).
Abb. 3.4: Maximalaggregation der Thrombozytenkonzentrate nach Stimulation mit Epinephrin
