Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Einfluß einer Maedi-Infektion auf die Funktion und die Morphologie der Lungen verschiedener
Schafrassen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Claudia Scherf
Berlin
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter
Klinik für kleine Klauentiere und
Forensische Medizin und Ambulatorische
Klinik, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Ganter
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 04.10.2010
Meiner Oma
Was wären wir ohne sie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ...7
1 Einleitung... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Maedi... 11
Einführung ... 11
Ätiologie des Maedi-Visna-Virus (MVV)... 11
Pathogenese und Epidemiologie... 12
Zielgewebe ... 18
Klinische Maedisymptome... 18
Pathologie ... 20
Rassedisposition ... 21
Diagnostik und Nachweisverfahren ... 23
Sanierungsmöglichkeiten ... 31
3 Material und Methoden ... 33
3.1 Tiere ... 33
3.2 Auswahlkriterien ... 34
3.3 Klinische Untersuchung ... 34
3.4 Röntgenologische Untersuchung des Thorax... 35
3.5 Hämatologische Untersuchung... 37
3.6 Blutgasanalyse ... 38
3.7 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ... 38
3.8 Serologische Untersuchung... 42
3.9 Virusnachweis... 42
3.10 Parasitologische Kotuntersuchung ... 47
3.11 Postmortale Untersuchungen ... 47
3.12 Statistik ... 49
4 Ergebnisse... 50
4.1 Auswahlkriterien ... 50
4.2 Klinische Befunde ... 52
Inhaltsverzeichnis
4.3 Röntgenologische Befunde... 53
4.4 Hämatologische Befunde... 55
4.5 Blutgase... 56
4.6 Bronchoskopische Befunde ... 61
4.7 Zytologische Befunde der bronchoalveolären Lavage ... 61
4.8 Lymphozytensubsets ... 63
4.9 Serologische und molekularbiologische Befunde ... 70
4.10 Postmortale Befunde ... 71
4.11 Beziehungen zwischen den Röngenscoresummen und den Lungengewichten... 75
5 Diskussion ... 77
5.1 Etablierung einer MVV-PCR ... 78
5.2 Auswahl der Versuchstiere ... 79
5.3 Klinische Untersuchung ... 80
5.4 Blutgase... 82
5.5 Röntgenuntersuchung Thorax ... 83
5.6 Hämatologische Untersuchungen... 85
5.7 Zytologische Untersuchung der BALF ... 85
5.8 Lymphozytensubsets ... 87
5.9 Pathologische Untersuchungen ... 89
6 Schlussfolgerungen und Bewertung der Methodik... 91
7 Zusammenfassung ... 94
8 Summary... 98
9 Literaturverzeichnis... 101
10 Anhang... 117
Materialien... 117
Abbildungsverzeichnis... 120
Tabellenverzeichnis... 122
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
∆A-aO2 Alveoloarterielle Sauerstoffdruckdifferenz ad. us.vet. zum Gebrauch in der Veterinärmedizin
AG Aktiengesellschaft
AGIDT Agargelimmunodiffusionstest
AIDS Aquired Immune Deficiency Syndrome
BAL Bronchoalveoläre Lavage
BALF Bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit
BALT Bronchusassoziiertes lymphatisches Gewebe
BE Base excess
BHM Blackheaded Mutton
bidest. bidestillata
bp Basenpaare
CAEV Caprines Arthritis Encephalitis Virus
CD Cluster of Differentiation
dest. destillata
diNaEDTA Di-Natrium-EDTA
DNAse Desoxyribonuklease
DNS Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
eitr. eitrig
ELISA enzyme-linked immunosorbant assay
et al. et alii
ggf. gegebenenfalls
ggr. geringgradig
HCO3 Bikarbonat
hgr. hochgradig
HIV Human Immunodeficiency Virus
hn heminested
i.v. intravenös
JSRV Jaagsiekte Retrovirus
Abkürzungsverzeichnis
Kat.-eitr. katarrhalisch-eitrig
KG Körpergewicht
Ln.med.caud. Lymphonodus mediastinalis caudalis
Ln. Lymphonodus
LTR long terminal repeat
Max. Maximum
mgr. mittelgradig
MHC Major Histocompatibility Complex
Min. Minimum
MVV Maedi-Visna-Virus
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
o.b.B. ohne besonderen Befund
OD optische Dichte
Orf open reading frame
PBS phosphate buffered saline
pCO2 Kohlendioxidpartialdruck
PCR Polymerasekettenreaktion
PMEA Phosphonylmetoxyethyladenin
pO2 Sauerstoffpartialdruck
RNS Ribonukleinsäure
RNAse Ribonuklease
RT-PCR PCR nach reverser Transkription
SD Standardabweichung
SKF Schwarzköpfiges Fleischschaf
Skg SKF Maedi negativ
Skk SKF Maedi positiv
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA
TE Tris-EDTA
Texelg Texelschafe Maedi negativ
Texelk Texelschafe Maedi positiv
UV ultraviolett
Einleitung
1 Einleitung
Maedi-Visna-Virus-Infektionen verursachen weltweit aufgrund von Pneumonien und Mastitiden hohe wirtschaftliche Verluste. Primäre Manifestation einer Maediinfektion sind Lungenveränderungen in Form von interstitiellen Pneumonien mit Hyperplasie des bronchusassoziierten lymphatischen Gewebes (BALT). Die Milchproduktion ist aufgrund von Mastitiden vermindert, die somatische Zellzahl ist erhöht und der Fettgehalt sinkt, da die erhöhte Atemfrequenz einen erhöhten Energieumsatz bei verringerter Futteraufnahme zur Folge hat. Im Endstadium kommt es bei einigen Rassen zu starken Gewichtsverlusten, bei trächtigen Tieren zu Aborten oder zur Geburt unterentwickelter Lämmer (CHRISTODOULOPOULOS 2006).
Sechs bis acht Monate nach Auftreten der ersten klinischen Symptome können die Tiere an Anorexie oder durch das Auftreten von bakteriellen Sekundärinfektionen sterben (DE MARTINI et al. 2000).
Verschiedene Studien an reinrassigen und gekreuzten Schafen zeigten deutliche Rasseempfindlichkeiten gegenüber der Erkrankung und weniger gegenüber der Infektion (BRODIE et al. 1998; STRAUB 2004; ZINK et al. 1994). In den letzten Jahren gewannen Untersuchungsverfahren, welche Veränderungen des Lungengewebes am lebenden Versuchstier qualitativ und quantitativ beschreiben, immer mehr an Bedeutung (GANTER 1996; SCOTT u. GESSERT 1996).
Ziel dieser Arbeit war es, am lebenden Tier Marker zu finden, die den Grad einer klinischen Erkrankung an Maedi charakterisieren können. Anhand solcher klinischen Marker wäre eine züchterische Selektion auf Maedi-Toleranz denkbar. Als Parameter wurden die Lungenauskultationbefunde, die zytologischen Befunde der bronchoalveolären Lavage (BAL) incl. der Lymphozytensubsets, die Röntgenbefunde des Thorax und die arteriellen Blutgaswerte in vivo bestimmt und anschließend mit den postmortalen pathomorphologischen und histologischen Befunden verglichen.
Zum Nachweis einer Infektion mit dem Maedi-Visna-Virus (MVV) wurden die Tiere mittels ELISA serologisch auf Antikörper gegen das MVV sowie mittels PCR auf spezifische Genomabschnitte des MVV untersucht. Die Untersuchungen wurden an
Einleitung
Maedi positiven und Maedi negativen Schwarzköpfigen Fleischschafen, die allgemein als wenig empfänglich gegenüber klinischer Maedi gelten und an Maedi positiven und Maedi negativen Texelschafen vorgenommen, die als hoch empfänglich gegenüber Maedi angesehen werden.
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht 2.1 Maedi
Einführung
Bei Maedi handelt es sich um eine virusinduzierte chronisch progressive interstitielle Pneumonie des Schafes, die schon 1918 in Holland als Zwoegers beschrieben wurde (PALSSON 1990). Die Bezeichnung Maedi wurde dieser Erkrankung in Island gegeben und bedeutet „schwere Atmung“. Maedi wird durch das Maedi-Visna-Virus (MVV) hervorgerufen, welches zu der Familie der Retroviridae gehört. Weitere Erkrankungsformen die durch das MVV induziert werden können, sind eine fortschreitende Encephalomyelitis („Visna“ = „Verfall, Schrumpfung“), interstitielle Mastitiden und in einzelnen Fällen auch chronisch-nichteitrige Arthritiden.
Seit den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde die Infektion in verschiedenen Ländern nachgewiesen. Bis auf Neuseeland und Australien treten Infektionen mit dem MVV weltweit auf (DAWSON 1980).
Die Erkrankung ist auch unter den Namen Ovine Progressive Pneumonia (OPP), Ovine Lentivirus (OvLV), la Bouhite, Graaff-Reinet disease und Zwoegerziekte bekannt. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer Genomstruktur, Pathogenität und ihrer Epidemiologie werden das MVV und das Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) als Small Ruminant Lentivirus (SRLV) zusammengefaßt.
Ätiologie des Maedi-Visna-Virus (MVV)
Das MVV gehört zur Subfamilie der Lentivirinae. Es ist eng verwandt mit anderen Lentiviren, wie zum Beispiel dem Caprinen Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) der Ziegen, dem Felinen Immunodeficiency Virus (FIV) und dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) (NARAYAN und CLEMENTS 1989). Kreuzinfektionen von Ziegen mit dem MVV und Schafen mit dem CAEV sind bekannt (PRITCHARD und DAWSON 2000).
Das MVV ruft eine latente Infektion hervor und wird somit zu den Erregern von
Literaturübersicht
Slow-Virus-Diseases gezählt.
Das Genom der Retroviren besteht aus den drei Strukturgenen:
gag - group-specific-antigen, codiert drei Glykoproteine des Prekursors: Capsid p25, Nucleocapsid p14 und Matrixprotein p17
pol - polymerase, beinhaltet unter Anderem die Erbinformation für die reverseTranskriptase (VIGNE et al. 1982; BOSGIRAUD et al. 1989), die Integrase, welche den Einbau der viralen Doppelstrang-DNS bewirkt und eine dUTPase, welche wichtig für die Infektion der Makrophagen ist (DE LA CONCHA- BERMEJILLO 1997; PEPIN et al. 1998) und
env - envelope, codiert zwei Glykoproteine des Virus: das Oberflächenglykoprotein SU und das glykolisierte transmembrane Protein TM
zusätzliche besteht das Genom aus den drei Regulatorgenen:
tat - transactivation translation
rev - regulator of virion protein expression und
vif - viral infectivity factor, welcher pol und env voneinander trennt (CLEMENTS und ZINK 1996; PEPIN et al.1998).
Pathogenese und Epidemiologie
Das Virus wird sowohl zellgebunden als auch frei in Flüssigkeiten übertragen.
Hauptansteckungsquellen sind der Respirationstrakt (CUTLIP et al. 1977) über das Nasensekret und die Milchdrüse via Kolostrum und Milch (PETURSSON et al. 1992) von infizierten Muttertieren. Die horizontale Übertragung durch das Beweiden der gleichen Flächen oder eine indirekte Übertragung durch Gegenstände und Personen konnte nicht nachgewiesen werden (Dawson 1980). Die Übertragung durch kontaminiertes Trinkwasser wurde beobachtet (SIGURDSSON et al. 1953).
Eine Übertragung durch Insekten und Parasiten wurde bis jetzt nicht beschrieben und es gibt auch keine epidemiologischen Ereignisse, welche diese als Vektoren in Betracht ziehen lassen (HOUWERS 1990).
Fälle von iatrogener Übertragung sind nicht bekannt. Eine Übertragung durch mehrfach genutzte Nadeln beim Impfen ist unwahrscheinlich, da diese Prozedur meist subcutan erfolgt und das Virus vor allem monozyten- / makrophagenassoziiert
Literaturübersicht
vorkommt. Blutprobenentnahmen stellen eine höhere Gefahr dar, wenn auch geringgradig. Diskutiert wurde auch eine Übertragungsgefahr durch Drenchpistolen, da an ihnen Speichel haftet und es teilweise zu Verletzungen im Rachenbereich kommt. Im Allgemeinen ist eine iatrogene Übertragung aber unwahrscheinlich (HOUWERS 1990).
Die Vermutung, dass es zu einer venerischen Übertragung des MVV durch den Deckakt oder künstliche Besamung von einem serologisch MVV positiven Bock auf serologisch MVV negative weibliche Tiere kommt, konnte nicht bestätigt werden (BLACKLAWS et al. 2004). TRAVASSOS et al. (1998) untersuchten die Samenflüssigkeit von 6 experimentell infizierten Böcken. Sie fanden des CAEV im Seminalplasma und in der spermatozoonfreien Zellfraktion bei einem Bock und bei einem zweiten Bock nur in der spermatozoonfreien Zellfraktion. Ein Jahr später konnte das Vorhandensein von CAEV-DNS und dem CAEV in diesen beiden Fraktionen bei 8 von 15 Böcken bestätigt werden (TRAVASSOS et al. 1999). Das Gleiche wurde auch bei 10 serologisch Maedi positiven Schafböcken beobachtet, die experimentell mit Brucella ovis infiziert worden waren (PREZIUSO et al. 2003).
Provirale CAEV-DNS konnte nicht in den Spermatozoon nachgewiesen werden (TRAVASSOS et al. 1999).
Auch DE LA CONCHA-BERMEJILLO et al. (1996) berichten über das seltene Auftreten von MVV im Sperma von Böcken, die eine sehr hohe Virusmenge in der Lunge hatten und bei denen es gleichzeitig aufgrund einer Brucella ovis Infektion zu einer Leukozytospermie gekommen war.
CUTLIP et al. (1981) und BRODIE et al. (1994) berichten von einer vertikalen intrauterinen Übertragung von der Mutter auf den Foetus. BLACKLAWS et al. (2004) gehen davon aus, dass bereits 5-10% der Infektionen intrauterin erfolgen. Bei einer Studie von BRODIE et al. (1994) waren 11% der neugeborenen Lämmer aus einer Herde mit endemisch auftretenden MVV-Infektionen in der Maedi-PCR positiv.
Die Wahrscheinlichkeit einer Infektion ist in den ersten Lebenswochen am höchsten, da der enge Kontakt zum Muttertier und das Saugen der Lämmer eine hohe Aufnahme virushaltiger Sekrete und Exkrete bedingt. ALVAREZ et al. (2005) haben beobachtet, dass Lämmer, die zwar bei der serologisch positiven Mutter leben, aber
Literaturübersicht
bovines Kolostrum bekommen, seltener infiziert werden als Lämmer, die bei ihren serologisch positiven Müttern Kolostrum und Milch saugen. Lämmer die nach der Geburt von ihren positiven Müttern isoliert werden und virushaltiges Kolostrum in großen Mengen bekommen, haben wiederum ein signifikant höheres Risiko sich zu infizieren als Lämmer, die bei ihren Müttern bleiben und physiologische Mengen Milch aufnehmen. Wo hierin die Ursache liegt, konnte noch nicht geklärt werden.
Eine Vermutung ist, dass der Speichel antivirale Stoffe enthält, die bei der Flaschenfütterung aufgrund der geringeren Speichelproduktion und der mengenmäßig größeren Aufnahme von Kolostrum / Milch pro Fütterung nicht ausreichend wirken können.
Eine Studie von PREZIUSO et al. (2004) hat die initiale virale Absorption durch die Apex der Villi der intestinalen Epithelzellen bei neugeborenen Lämmern demonstriert, die mit infiziertem Kolostrum gefüttert wurden. Anschließend erfolgte die Passage zu den mononukleären Zellen der Lamina propria unter Beteiligung der ilealen Peyer`schen Platten und der mesenterialen Lymphknoten.
Sind die Tiere entwöhnt, stellt der direkte Kontakt zum Nasensekret eines infizierten Tieres oder die Aerosolaufnahme hustender Virusausscheider die Hauptansteckungsquelle dar. Diese aerosole Übertragung führt zu großen Problemen in Regionen mit Winteraufstallung (HOUWERS 1990).
Nach Übertragung von Viruspartikeln werden diese in die Monozyten aufgenommen und persistieren dort für eine unbestimmte Zeit als Provirus. Solange die provirale DNS sich in den Monozyten befindet, ist die Vermehrung der DNS durch einen transkriptalen Block inhibiert. Da die viralen Proteine somit auch nicht exprimiert werden, gelangen die infizierten Zellen in die Gewebe, ohne vom Immunsystem erkannt zu werden. Wenn die Monozyten in das Lymphgewebe des Organes eindringen, reifen sie zu Makrophagen und der transkriptale Block wird beseitigt. Es wird vermutet, dass zelluläre Transkriptionsfaktoren an die Bindungsstelle des Viruspromotors binden und damit die Transkription des Virusgenomes initiieren (CLEMENTS et al. 1994).
THORMAR (2005) erklären die Latenz und Persistenz der MVV–Infektion dadurch, dass sich ein Reservoir an infizierten Blut-und Knochenmarkmonozyten bildet,
Literaturübersicht
welche in das Zielgewebe einwandern und dort zu Makrophagen reifen. In diesen Makrophagen erfolgt dann zwar eine provirale DNS-Transkription, aber nur eine geringe Virusreplikation. Die geringe Virusproduktion im infizierten Gewebe könnte das langsame Fortschreiten dieser Erkrankung erklären.
Versuche in Island zeigten, dass immunsupprimierte Tiere geringe bis gar keine Veränderungen im Gehirn nach einer intracerebellären Infektion mit dem MVV hatten, wobei die Virusreplikation nicht beeinträchtigt wurde. Diese Beobachtung legt nahe, dass die Veränderungen, zumindest bei Visna, immunvermittelt sind (NATHANSON et al. 1976; PÉTURSSON et al. 1978).
TORSTEINSDÓTTIR et al. (1992) fanden heraus, dass der Grad der ZNS- Veränderungen nach Infektion mit dem MVV eher mit dem Anstieg der zellvermittelten Immunität, als mit der Bildung virusspezifischer Antikörper korreliert.
Daraus wurde geschlossen, dass die zellvermittelte Immunität eine große Rolle in der Induktion der pathologischen Veränderungen bei Visna hat und dass die CD8+- zytotoxischen T-Lymphozyten wichtige Effektorzellen sind (BLACKLAWS et al.
1994).
Spätere Versuche haben gezeigt, dass schnell replizierende MVV-Stränge stärkere lymphoproliferative Veränderungen in der Lunge hervorrufen, wie langsamer replizierende Stränge (LAIRMORE et al. 1987).
Laut WATT et al. (1992) ist bei MVV infizierten Tieren die Zahl der Lymphozyten in der Lunge, sowohl im bronchusassoziierten lymphatischen Gewebe ( BALT ) wie auch in den Alveolarsepten erhöht. Vor allem bei den Tieren mit klinischen respiratorischen Problemen ist die Zahl der CD4+ und der CD8+ T-Zellen in den Alveolarsepten erhöht. Das Verhältnis CD4+ / CD8+ hingegen unterschied sich nicht von dem der gesunden Kontrollgruppe.
Im regionalen Lymphgewebe gab es eine erhöhte Anzahl von CD8+ und gamma- delta exprimierenden T-Zellen.
WATT et al. (1992) kamen zu der Erkenntnis, dass aktivierte T-Lymphozyten, und hier vor allem die CD8-Subsets, einen großen Anteil an der Pathogenese der durch das MVV induzierten Lungen- und Lymphknotenveränderungen haben.
Literaturübersicht
Aufgrund solcher Beobachtungen wurde bisher angenommen, dass die CD8+
Lymphozyten durch das Abtöten von infizierten Zellen, die Sekretion von Inhibitorchemokinen und Cytokinen die Virusladung kontrollieren. Um die Rolle der CD8+ Lymphozyten zu untersuchen, haben ERIKSON et al. (1999a) Schafe in vivo CD8+ -supprimiert.
Weder in den Lymphknoten, noch in der efferenten Lymphe konnten Unterschiede in der Virusreplikation festgestellt werden. Überraschenderweise zeigten diese Tiere eine normale Induktion von Precursor cytotoxischen T- lymphocyten (pCTL), während die virusspezifische Proliferationsantwort reduziert war.
Daraus folgerten ERIKSON et al. (1999a), dass noch CD8+ -Zellen verblieben waren oder dass CD8+ -Zellen keine Relevanz bei der Kontrolle einer primären MVV- Infektion haben.
In weiteren in vivo Versuchen von ERIKSON et al. (1999b) bei denen sie CD4+ - supprimierte Schafe verwendeten, fanden sie heraus, dass CD4+ Lymphozyten für die Infektion von Makrophagen benötigt werden, jedoch nicht für die Infektion von dendritischen Zellen. Diese CD4+ supprimierten Tiere hatten eine signifikant geringere Anzahl MVV infizierter Zellen in den Lymphknoten und den efferenten Lymphbahnen, nachdem die von ihnen drainierten Bereiche dem Virus ausgesetzt wurden.
Im Zuge der Abwesenheit des Virus und dem Mangel an CD4+ -Helferzellen bei CD4+ supprimierten Tieren ergaben sich folgende Veränderungen :
1. die virusspezifische Immunantwort war reduziert,
2. verringerte Induktion von cytotoxischen T-Zell-Vorläufern, 3. verringertes Auftreten MVV-spezifischer Antikörper.
ZHANG et al. (2000) haben die MVV-DNS Menge in den peripheren Blutmonozyten (PBM) und in den Alveolarmakrophagen mit Hilfe einer QC-PCR (quantitative competetive - PCR) gemessen.
Im Gesamtvergleich war die Virus-DNS-Menge in den Alveolarmakrophagen signifikant höher als die in den PBM. Alveolarmakrophagen sind gegenüber der DNS-Replikation wesentlich toleranter als PBM. Weiterhin erfolgte ein Vergleich
Literaturübersicht
zwischen Alveolarmakrophagen seropositiver Tiere mit und ohne histopathologischen Lungenveränderungen. Dabei stellte sich heraus, dass die Tiere mit den histopathologischen Veränderungen signifikant mehr Virus-DNS in ihren Alveolarmakrophagen hatten als die Vergleichstiere ohne Lungenveränderungen.
Diese Korrelation von MVV-DNS-Menge und Lungenveränderungen lässt vermuten, dass die Anzahl der infizierten Alveolarmakrophagen eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der interstitiellen Pneumonie spielen. Zu der gleichen Vermutung kamen auch BRODIE et al. (1992), sie konnten eine Korrelation zwischen der Virusmenge in Lungenmakrophagen und dem Grad der Veränderungen demonstrieren.
Abb. 1: Pathogenese der Schädigung des Lungengewebes nach THORMAR (2005).
Geringe Virusreplikation in den Makrophagen
induziert
Entzündungs- kaskade
Anstieg der Immunzellen Anstieg der
Lymphokinproduktion
stimuliert
Expression MHC-II-Antigene
Proliferationvon B-und CD8+Lymphozyten
kommt zum
plus
Immunkomplexe zwischen viralemAntigen und Antikörpern
ergibt
Schädigung des
Lungengewebes
Literaturübersicht
Zielgewebe
Die am häufigsten mit dem MVV befallenen Zellen sind die Makrophagen des Gehirns, der Lunge, des Euters und der Gelenke (EXTRAMIANA et al. 2002). Im Lymphgewebe MVV infizierter Lungen ist das Virus fast ausschließlich auf Makrophagen beschränkt, wobei aber nur rund 1% der Makrophagen Virusträger sind (CLEMENTS und ZINK 1996).
Weiterhin konnte das Virus aus dem Gewebe von Lymphknoten, Milz, Knochenmark (EXTRAMIANA et al. 2002; PREZIUSO et al. 2003), den Lymphfollikeln des dritten Augenlides (CAPUCCHIO et al. 2003) und den Nieren (ANGELOPOULOU et al.
2006) isoliert werden.
Laut CARROZZA et al. (2003) werden in der Lunge die Typ I- und Typ II- Pneumozyten, Interstitial- und Alveolarmakrophagen, Endothelzellen, Fibroblasten- ähnliche Zellen und in der Mamma Epithel-, Endothelzellen und Fibroblasten- ähnliche Zellen infiziert.
Die Tatsache, dass das Virus an eine solche Reihe ganz verschiedener Zellarten adsorbieren und eindringen kann lässt vermuten, dass die Rezeptoren ganz ordinäre Zellmembranmoleküle, eventuell Proteine, sind und somit kein determinierender Faktor für den Zelltropismus. Der Zelltropismus beruht wahrscheinlich eher auf einem zellspezifischen Replikationsfaktor (AGNARSDÓTTIR et al. 2000).
Trotz intensiver Studien und der Vorreiterrolle der HIV Forschung bei der Untersuchung von Lentivirusinfektionen konnten die Rezeptoren für die Adsorption und das Eindringen in die Zelle noch nicht genau identifiziert werden.
Klinische Maedisymptome
Es handelt sich hierbei um eine latente, nichtfebrile Erkrankung mit einer Prodromalphase von mehreren Monaten bis einigen Jahren. Die Tiere infizieren sich meist bei der Mutter. Klinisch äußert sich eine Infektion im Endstadium in Abmagerung trotz guter Futteraufnahme und fortschreitender Dyspnoe (BULGIN 1990). Diese beginnt mit Tachypnoe (40-120 Atemzüge pro Minute), welche anfangs nur bei verstärkter Bewegung des Tieres auftritt. Im fortgeschrittenen Stadium der
Literaturübersicht
Erkrankung bleiben die Tiere hinter der Herde zurück und zeigen bereits in Ruhe Tachypnoe. Im Endstadium besteht eine kontinuierliche Dyspnoe mit vermehrtem Einsatz der Abdominalmuskulatur und gelegentlich tritt Maulatmung auf.
Bei trächtigen Tieren kommt es zu Aborten oder zur Geburt unterentwickelter Lämmer. Die Milchproduktion ist vermindert und der Fettgehalt sinkt durch die verminderte Nahrungsaufnahme und den erhöhten Energiebedarf durch die verstärkte Atmung (CHRISTODOULOPOULOS 2006).
Mehr als 60 % der Muttern in MVV-infizierten Milchschafherden haben eine chronische lymphoide Mastitis mit daraus resultierender verringerter Milchproduktion (DAWSON 1987) und erhöhter somatischer Zellzahl (CHRISTODOULOPOULOS 2006). Es liegen bilateral diffuse, indolente Indurationen mit teilweise festen Knoten im ventralen Bereich des Euters vor. Die regionalen Lymphknoten sind geringgradig vergrößert (VAN DER MOLEN et al. 1985).
Einige Tiere entwickeln eine Lentivirus-assoziierte Arthritis, welche meist 2 – 3 Jahre post infectionem beginnt und mit geschwollenen Gelenken einhergeht (KENNEDY- STOSKOPF 1989). Die Karpalgelenke sind am häufigsten betroffen (PRITCHARD und DAWSON 2002).
Die Gelenke sind nicht schmerzhaft, die Gelenkkapsel und die Synovialmembran sind verdickt, mit einer periartikulären Fibrose. Es treten unterschiedliche Lahmheitsgrade auf (PALSSON 1990).
Sechs bis acht Monate nach dem Auftreten der ersten klinischen Symptome sterben die Tiere an Anorexie oder durch auftretende bakterielle Sekundärinfektionen (DE MARTINI et al. 2000). Diese Sekundärinfektionen werden durch die verringerte bronchiale Clearance gefördert und sind der Grund dafür, dass es infolge einer Maedierkrankung oft zu einer sekundären katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonie mit den entsprechenden klinischen Symptomen kommt (GANTER 1996).
In fortgeschrittenen Fällen wird oft eine hypochromatische Anämie beobachtet.
Weiterhin zeigt sich eine verlängerte Leukozytose vom lymphozytären Typ (PALSSON 1990).
Literaturübersicht
Pathologie
Im fortgeschrittenen Stadium sind die Veränderungen makroskopisch und palpatorisch deutlich erkennbar. Das Volumen der Lunge ist stark vergrößert und das Gewicht kann bis auf das 3,5-fache des Normalgewichtes ansteigen. Nach CHRISTODOULOPOULOS (2006) gibt es drei Muster für die makroskopisch sichtbaren Veränderungen.
1. Die Lungen zeigen scharf abgegrenzte verfestigte Bereiche. Diese Bereiche betreffen den cranialen Teil der caudalen Lobi, die mittleren Lobi und die cranialen Lobi. Das Gewebe ist gummiartig fest mit grau-blauer oder grau-brauner Farbe. Der größere Anteil dieser Veränderungen befindet sich dorsocaudal im rechten Lungenflügel. Schneidet man diese Bereiche transvers an, zeigen sie sich deutlich abgesetzt vom umliegenden Gewebe. Sie sind kirschrot und es sind diffus verteilte weiße Knötchen sichtbar mit einem Durchmesser von 1-4 mm.
2. Die Lunge ist im Ganzen vergrößert, die Konsistenz ist gummiartig und die Farbe ist rosa. Meist sind deutliche Rippenabdrücke zu sehen.
3. Auf der Oberfläche verstreut sind fokale blaß-weiße granuläre Veränderungen sichtbar. Diese sind meist nur oberflächlich, in wenigen Fällen erstrecken sie sich bis in das Parenchym. Sie sind meist rund, mit einem Durchmesser von 0,5-8 cm. Die Lungen sind meist geschwollen.
Die Lungenlymphknoten sind aufgrund einer gesteigerten Produktionsrate und damit erhöhten Anzahl von B-Zellen und T-Zellen in den Lymphfollikeln, den germinalen Zentren und im Paracortex beträchtlich vergrößert (ELLIS und DE MARTINI 1985).
Mikroskopisch betrachtet besteht diese lymphoide interstitielle Pneumonie in erster Linie aus einer Lymphozytenhyperplasie im Bereich der Atemwege und der Blutgefäße. Neben dieser lymphoretikulären Hyperplasie zeigt sich meist auch eine deutliche interstitielle Hyperplasie, die durch Infiltration von Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen gekennzeichnet ist. Die starke Gewichtszunahme der Lunge wird hauptsächlich durch die Hypertrophie der Muskelfasern der Alveolargänge und durch die Verdickung der interalveolären Septen hervorgerufen.
Oft tritt eine Fibrosierung auf (WATT et al. 1992b).
Literaturübersicht
Rassedisposition
Eine Rassedisposition wir seit langem kontrovers diskutiert. Verschiedene Studien in den Niederlanden, Deutschland und den USA an reinrassigen und gekreuzten Schafen zeigten eine deutliche Rasseempfindlichkeit gegenüber der Erkrankung und weniger gegenüber der Infektion (BRODIE et al. 1998; STRAUB 2004; ZINK et al.
1994; HOUWERS et al.1989).
Dass es Rasseunterschiede in der Ausprägung der klinischen Symptome gibt, erhärtet den Verdacht, dass diese auch auf genetischen Faktoren des Wirtes beruhen. Beobachtungen von GATES et al. (1978) und HOUWERS et al. (1989) lassen vermuten, dass Finnische Rassen wesentlich empfänglicher sind als Rambouillet, Ile de France oder Schafe der Rasse Columbia.
Auch Studien in Island unterstützen die These einer Rasseabhängigkeit. 1933 wurden 20 klinisch unauffällige Karakulschafe aus Halle an der Saale nach Island exportiert. Sechs Jahre später zeigten Tiere der bodenständigen Rassen eine bis dahin unbekannte Erkrankung, welche als „Maedi“ bezeichnet wurde. Weder die importierten Tiere, noch ihre in Deutschland verbliebenen Nachkommen zeigten bis 1970 klinische Symptome einer Maedi. In Island konnte man beobachten, dass das Fortschreiten der Lungenveränderungen durch Maedi bei Tieren der Kreuzung Islandschaf x Border Leicester gegenüber den reinen Islandschafen verlangsamt war (PALSSON 1976). In einer 20-jährigen Studie von PERK et al. (1996) zeigte sich, dass bei reinrassigen Awassischafen die Erkrankung nicht ausbricht, die Tiere zeigen keine klinischen Symptome. KENIGSWALD et al. (2009) verglichen die Milchproduktion und die Ablammrate von 43 serologisch (ELISA) Maedi positiven und 35 serologisch Maedi negativen Muttern einer Assaf-Milchschafherde. Dabei konnten sie weder in der Milchproduktion noch in der Ablammrate einen signifikanten Unterschied zwischen den serologisch Maedi positiven und den Maedi negativen Tieren feststellen. In den letzten sechs Jahren wurde kein Tier aufgrund klinischer Maedisymptome selektiert oder getötet. In dieser intensiv gehaltenen Herde hat die MVV-Infektion keinen registrierbaren Effekt auf die Tiergesundheit und die Milchproduktion.
Literaturübersicht
Von 1970 bis 2000 führte die Bundesforschungsanstalt für Viruserkrankungen der Tiere in Tübingen eine Studie zur Ausbreitung von Maedi bei den Rassen Texel, Finnschaf, Ile de France und Merino-Landschaf durch. Alle 4 Rassen waren serologisch positiv, klinische Symptome zeigten Tiere der Rassen Texel, Finnschaf und Ile de France, nicht jedoch die Merino-Landschafe (STRAUB 2004).
Die Erforschung der Rasseempfänglichkeit wird zusätzlich durch das Auftreten verschiedener Virustypen und der genetischen Varianz der Virusträger erschwert.
DE LA CONCHA-BERMIJILLO et al. (1995) infizierten 6 künstlich erzeugte isogenetische Zwillingslämmer (Paare B/B, C/C, D/D) mit 2 verschiedenen MVV- Stämmen (lysierender Stamm OvLV 85/34 oder persistierender Stamm OvLV 84/28).
Je ein Zwilling wurde mit dem lytischen Stamm und der zweite Zwilling mit dem persistierenden Stamm infiziert. Bei einem weiteren Paar (A/A) wurde ein Kontrolltier mit einer Zellsuspension und das zweite Tier mit dem lysierenden Stamm OvLV 85/34 infiziert. Es zeigte sich, dass das Ausmaß der interstitiellen Pneumonie bei den jeweiligen Geschwisterpärchen unabhängig von dem verwendeten Virusstamm (OvLV 85/34 oder OvLV 84/28) war. Der Grad der Lungenveränderungen bei den verschiedenen Paaren korrelierte aber mit der MVV-Menge in den Alveolarmakrophagen. Die Zwillinge B/B zeigten hochgradige Veränderungen in der Lunge, die Paare C/C und D/D zeigten nur geringgradige Veränderungen. Die Lungenlymphknoten waren bei allen Tieren, das Kontrolltier ausgenommen, vergrößert.
Aufgrund dieser Ergebnisse kommen DE LA CONCHA-BERMIJILLO et al. (1995) zu folgenden Schlussfolgerungen:
1. Der Unterschied in der Antikörperantwort zwischen den Paaren lässt vermuten, dass die beiden Virusstränge in vivo verschiedene immunogene Eigenschaften haben
2. Die Tatsache, dass der Grad der interstitiellen Pneumonie bei den Zwillingen gleich war lässt die Vermutung zu, dass die Genetik des Wirtes entscheidend für die Ausprägung der Entzündungsreaktion in der Lunge ist.
Literaturübersicht
Ein Ansatz zur Aufklärung einer Rasseempfänglichkeit ist die Erkenntnis, dass der major histocompatibility complex (MHC) einen großen Einfluß auf das Fortschreiten der Erkrankung zu haben scheint. Beim Menschen ist bekannt, dass bei HIV- positiven Personen, welche den MHC A1B8DR3 besitzen, die Entwicklung zum klinischen Stadium, dem Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), schneller voranschreitet als bei Personen, die diesen MHC nicht haben (PEIXINHO und MENDES 2005). Bei HIV-infizierten Kindern ist das DR3 Allel mit schnellem Fortschreiten zum klinischen AIDS verknüpft, das DPB1 hingegen sorgt für eine gute Überlebenschance (JUST et al. 1995).
Auch bei mit dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV)-infizierten Affen scheint das Voranschreiten der Erkrankung vom MHC-Genotyp abhängig zu sein. Bei Tieren, die kein Mamu-A26-Allel besitzen, schreitet die Erkrankung schneller zum SAIDS voran als bei ihren Artgenossen mit diesem Allel (BONTROP et al. 1996).
Bei Ziegen weiß man, dass im Falle einer CAEV-Infektion die Anfälligkeit gegenüber Arthritis mit Unterschieden in der Frequenz bestimmter capriner Leucozytenantigene assoziiert ist. Die Saanenziegen tragen häufig das Leucozytenantigen Be7 und sind wesentlich weniger gefährdet eine CAEV-induzierte Arthritis zu bekommmen wie ihre Artgenossen, welche dieses Antigen nicht besitzen (RUFF und LAZARY 1988).
Ein genetischer Hintergrund für die Empänglichkeit oder Toleranz zu klinischen Symptomen konnte von PEPIN et al. (1998) nicht bestimmt werden.
Diagnostik und Nachweisverfahren Klinische Untersuchung
Während sich die Tiere in der langen Inkubationszeit befinden, ist keine klinische Diagnose möglich. Geht die Infektion von der symptomlosen Prodromalphase in die klinische Phase über, zeigen die Tiere Tachypnoe (40-120 Atemzüge pro Minute) und später Dyspnoe als Leitsymptom. Die Tiere liegen vermehrt, was eine verringerte Futteraufnahme und dadurch bedingt eine Abmagerung zur Folge hat (CHRISTODOULOPOULOS 2006).
Es treten fauchende Atemgeräusche auf, die im fortgeschrittenen Stadium bereits ohne Phonendoskop zu hören sind. Diese Atemgeräusche sind Folge der
Literaturübersicht
Lungenveränderungen und nicht beweisend für das MVV als Ursache (GANTER 2006).
Untersuchungen mit Hilfe der Lungenperkussion haben gezeigt, dass dezentere Verdichtungen, wie sie z.B. bei einer durch das MVV hervorgerufenen interstitiellen Pneumonie auftreten, zu keiner hörbaren Dämpfung des normalen Lungenschalls führen (GANTER 1996).
Röntgenuntersuchung
Röntgenbilder des Thorax können Hinweise auf Veränderungen geben, die unter anderem durch das MVV hervorgerufen werden. Durch Vorziehen der Vordergliedmaße kann der gesamte Thorakalbereich röntgenologisch dargestellt werden (PRINGLE 1992). Veränderte Befunde bei lungenkranken Tieren beinhalten je nach Art der Erkrankung Verdichtungsherde (Verschattungen) unterschiedlichen Grades, Verteilungsmusters und unterschiedlicher Abgrenzbarkeit, Bronchographie, sowie eine diffuse, eher granuläre Strukturierung des Lungenparenchyms. Nach GANTER (1996) ist bei Maedi positiven Tieren gelegentlich im Bereich der Zwerchfelllappen eine fein granulierte Struktur des Lungengewebes und eine wallartige Verdichtung der Umgebung der Hauptbronchien erkennbar. Diese Befunde lassen zwar oftmals eine Verdachtsdiagnose zu, eine ätiologische Diagnose kann damit aber nicht gestellt werden (GANTER 1996).
Ultraschall
SCOTT u. GESSER (1998) führten Ultraschalluntersuchungen an 15 klinisch gesunden Schafen und an 10 Tieren mit respiratorischer Symptomatik durch. Die Diagnose wurde durch eine Sektion gestellt und durch pathohistologische und mikrobiologische Untersuchungen abgesichert.
Bei diesen Untersuchungen zeigte sich, dass die Diagnosen Pleuritis, Pleuraabszess und Lungenadenomatose mit dem Ultraschallgerät zuverlässig gestellt werden können, nicht jedoch die Diagnose Maedi.
Beim Pferd stellt sich eine interstitielle Pneumonie im Ultraschall als leberähnliches (homogenes Weichteilgewebe) echogenes Gewebe dar (NYKAMP et al. 1998). Für
Literaturübersicht
eine interstitielle Pneumonie beim Schaf sind ähnliche echogene Strukturen zu erwarten. Untersuchungen wurden dazu bislang nicht veröffentlicht.
Bronchoskopie mit Bronchoalveolärer Lavage (BAL)
Mithilfe flexibler Endoskope ist eine Beurteilung von Nase, Kehlkopf, Trachea und Bronchien möglich. Die normale Trachealschleimhaut des Wiederkäuers ist feuchtglänzend, weiß bis graurosa und von feinen Blutgefäßen durchzogen (STÖBER 1990; PRINGLE 1992).
Die Bronchoskopie ist für alle großen Haussäugetiere einschließlich des Schafes beschrieben worden und wird vielfach angewendet (PRINGLE et al. 1988; GANTER 1996). Nach GANTER (1996) ist die Bronchoskopie beim Schaf am stehenden, mit Hilfe eines Halfters und eines Helfers fixierten Tieres nach Lokalanästhesie der Nasenschleimhaut und des Kehlkopfes einfach durchzuführen. Nach seinen Angaben verhalten sich die Tiere dabei erstaunlich ruhig. Einige Schafe bekamen durch die mechanische Reizung Hustenanfälle, welche jedoch mit Hilfe weiterer Oberflächenanästhesie behoben werden konnten. Er verwendete jeweils 100 ml 0,9
% -ige NaCl-Lösung in 5 Fraktionen zu je 20 ml. Die gesamte Spülflüssigkeit kann nur selten zurückgewonnen werden. Das zurück gewonnene Flüssigkeitsvolumen liegt zwischen 55 % und 90 % des Instillationsvolumens (CHANANA et al. 1981;
GLAUSER et al. 1988). Nach GANTER (1996) sind 70-80 % Rück- gewinnungsvolumen beim Schaf realistisch. Der Rest wird zum Teil ausgehustet oder verbleibt in der Lunge und wird resorbiert.
Zellzusammensetzung in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit (BALF)
Die Gesamtzellzahl in der aspirierten BALF beträgt bei gesunden Schafen nach segmentaler fiberoptischer Spülung ca. 0,2 G/l. Bei der posmortalen Spülung der gesamten exenterierten Lunge liegt der Zellgehalt höher (BURRELS 1985). Bei GANTER (1996) variierte die Gesamtzellzahl von 0,1 bis 0,65 G/l. Bei kranken Tieren erhöhte sie sich um ungefähr eine Zehnerpotenz.
Im Differenzialzellbild der BALF überwiegen die Alveolarmakrophagen, wobei der Anteil bei gesunden Schafen über 70 % liegt (CHANANA et al. 1981; BURRELS
Literaturübersicht
1985). Mit einem Mittel von 2,8 % ± 3,6% stellen die Lymphozyten die zweitgrößte Fraktion dar (GANTER 1996). Der Anteil der Lymphozyten scheint bei Lämmern höher zu liegen als bei erwachsenen Schafen (CHANANA et al. 1981; BURRELS 1985). Die Verhältnisse der Lymphozytensubpopulationen bei den verschiedenen Altersklassen sind unterschiedlich. Das Verhältnis zwischen T- und B-Lymphozyten wird von 72 : 1 bei Lämmern unter 8 Wochen auf 9 : 1 bei über 2 Jahre alten Schafen reduziert. Gleichzeitig nimmt der Anteil sog. Null-Lymphozyten von 35 % auf 20-23 % ab (BURRELS 1985). Bronchialepithelzellen mit 2,2 ± 3,1% stehen an dritter Stelle, gefolgt von den neutrophilen Granulozyten mit 2,0 ± 3,1% und vereinzelten eosinophilen Granulozyten mit 0,5 ± 1% (GANTER 1996).
Veränderungen in der Zusammensetzung nach einer MVV-Infektion
Nach DAWSON et al. (2005) ist die BALF bei Maedi charakterisiert durch einen signifikanten Anstieg im Zellgehalt und in einem leichten aber signifikanten Anstieg im Prozentsatz der Lymphozyten. Aufgrund dieses typischen Zytologieprofiles gibt es nur eine Falschklassifizierung von 10%.
Bei Maedi kranken Tieren ist die Zellzahlerhöhung in erster Linie auf den Einstrom von Lymphozyten zurückzuführen, gefolgt von den neutrophilen Granulozyten und Alveolarmakrophagen. Mit einem Anteil von 11,0 ± 15,1% ist der Anteil der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe signifikant erhöht (GANTER 1996).
LUJAN et al. (1993) konnten zeigen, dass eine MVV-Infektion zu Veränderungen in den Lymphozyten-Subpopulationen führt.
Bei den Versuchen von BEGARA et al. (1995) zeigte sich in der BALF ein signifikanter Verlust an CD5+ Lymphozyten und eine Hochregulierung der DR und DQ MHC Klasse-II Moleküle.
BEGARA et al. (1996) haben bei weiteren Versuchen 6 Texelschafe experimentell mit dem infektiösen MVV Stamm EV1 (Gruppe 1), zwei Schafe mit einem hitzeinaktivierten EV1-Stamm (Gruppe 2) und zur Kontrolle weitere 4 Schafe mit virusfreiem Kulturmedium (Gruppe 3) belastet. Die Infektion wurde anschließend
Literaturübersicht
über 4 Monate beobachtet. 4 Wochen vor sowie 2, 4, 6, 8, 12 und 16 Wochen nach der Infektion erfolgte eine BAL des linken Zwerchfelllappens.
Infizierte Tiere (Gruppe 1) hatten einen signifikant gesunkenen Prozentsatz an Makrophagen und einen signifikant angestiegenen Prozentsatz von Lymphozyten in der BALF 4 Wochen nach der Inokulation.
Phänotypische Veränderungen an den T-Lymphozyten äußerten sich in einem signifikanten Abfall des Prozentsatzes von CD4+ und gammadelta+ T-Lymphozyten, einem signifikanten Anstieg von CD8+ Lymphozyten und einer Umkehr des Verhältnisses von CD4+/CD8+. Diese Veränderungen traten zwischen der 2. und 12.
Woche nach Belastung auf. Der Abfall des Anteils der Makrophagen und der Anstieg des Anteils der Lymphozyten zeigte sich sofort nach der Inokulation und hatte sein Maximum 4 Wochen danach. Anschließend kehrten die Werte wieder zu ihrer Ausgangslage zurück. Der Prozentsatz an neutrophilen Granulozyten veränderte sich während des Experimentes kaum.
Präzipitierende Antikörper wurden bei drei der sechs mit dem infektiösen Stamm infizierten Schafe (Gruppe 1) innerhalb der ersten 2 Wochen und bei den drei weiteren Tieren zwischen der 2. und 4. Woche post inoc. gefunden.
Alle drei Hauptlymphozytensubsets (CD4+, CD8+ und gammadelta+ T-Zellen) zeigten einen Anstieg in der Expression von MHC-Klasse II Molekülen bei den Tieren der Gruppe 1. Diese Hochregulation zeigte sich als signifikanter Unterschied zu den Gruppen 2 und 3 für die Parameter CD4+/MHC II-DQ+ zwei Wochen post inoc. und für gammadelta+/MHC II-DR+ vier Wochen post inoc.
Alle Gruppen zeigten einen Anstieg in der Interleukin-2R Expression auf allen Lymphozytensubsets. Die Resultate dieses Versuches zeigen, dass in der Schaflunge nach MVV-Inokulation eine kurze zelluläre Reaktion erfolgt und mindestens 8 Wochen andauert. Auch bei natürlichen Infektionen zeigen sich die beschriebenen Phänomene wie das Absinken des Anteils der Makrophagenzahl, der Lymphozytensubsets CD4+, CD5+ und gammadelta+ sowie dem gleichzeitigem Anstieg des Anteils der Lymphozyten. Die nachweisbaren Zellveränderungen in der BALF gegen das MVV wurden vor allem von den CD8+ Lymphozyten vorangetrieben. Auch bei natürlichen Infektionen wurde eine Lymphozytenaktivierung
Literaturübersicht
in der BALF beobachtet. Diese ist charakterisiert durch die Hochregulation von DR und DQ MHC II Molekülen auf BALF Lymphozyten, ohne Anstieg der Expression von IL-2 Molekülen.
Die beobachteten phänotypischen Veränderungen der Zellsubpopulationen in der BALF näherten sich gegen Ende der Versuche wieder der Normalität an. Die Vermutung liegt nahe, dass es kurz nach der Infektion zu einer starken Virämie kommt und anschließend zu einer Latenz. Bei HIV wurde beobachtet, dass es nach der Infektion zu einem starken Abfall der CD4+ Lymphozyten im Blut kommt. Die Virämie verschwindet nach kurzer Zeit und die CD4+ Lymphozyten kehren wieder zu ihrer normalen Konzentration zurück.
Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen auch LUJAN et al. (1995). Nachdem sie 16 von insgesamt 21 natürlich infizierten Schafen Blutproben entnommen hatten, entnahmen sie die Lungen von allen 21 Tieren und unterzogen sie einer BAL. Die Lymphozyten in der BALF und im Blut wurden mit monoclonalen Antikörpern gegen die Hauptuntereinheiten CD4+, CD5+, CD8+ und gammadelta-TCR markiert.
Anschließend erfolgte eine Flow-Zytometrie. Der Prozentsatz von CD4+, CD5+, gammadelta +T Zellen und das Verhältnis von CD4+/CD8+ in der BAL waren signifikant gesunken im Vergleich zu den Kontrolltieren. Im Gegensatz dazu war der Prozentsatz an CD8+ Lymphozyten erhöht. Es wurde beobachtet, dass nur die CD8+T-Zell-Untereinheiten in der BALF und dem Blut signifikant mit dem Grad der Lungenveränderungen korrelieren. Somit besteht die Vermutung, dass der Prozentsatz an CD8+ Lymphozyten in vivo ein Indikator für den Grad der Veränderungen im Lungengewebe bei einer MVV-Infektion darstellt.
Blutgasanalyse
Mit Hilfe der Blutgasanalyse werden die Säure-Basen-Verhältnisse im Blut untersucht. Parameter sind der pH-Wert, Sauerstoffpartialdruck (pO²), Kohlendioxidpartialdruck (pCO²) und das aktuelle Bikarbonat.
Soll die Lungenfunktion untersucht werden, ist arterielles Blut unabdingbar (KRAFT u. DÜRR 2005).
Literaturübersicht
Laut GANTER (1996) bewährt sich zur arteriellen Blutgewinnung die Punktion der Ohrarterie. Die Tiere müssen weder abgesetzt noch umgelegt werden. Meist genügt eine ruhige Fixation durch einen Helfer.
Die alveoloarterielle O²-Differenz ist bei kranken Schafen der empfindlichste Indikator für eine Beeinträchtigung der Atmung. Sie berechnet sich aus den Parametern Luftdruck, Partialdruck des Wassers, Sauerstoffgehalt der Luft, arteriellem Kohlendioxidpartialdruck und dem arteriellen Sauerstoffpartialdruck nach folgender Formel
∆A-aO2 (mmHg) =
[Barometerdruck-47(Partialdruck H2O)] x 0,2095(O2-Gehalt Luft) - art. pCO2 - art. pO2.
Laut GANTER (1996) stellt sie den einzigen Parameter dar, der einen signifikanten Unterschied zwischen gesunden Tieren und den Maedi kranken Schafen zeigt.
Referenzwerte der arteriellen Blutgase liegen für das Schaf nicht vor.
Nachweis einer MVV-Infektion in vivo
Am lebenden Tier wird die Diagnose meist durch den Nachweis von Antikörpern gegen das MVV gestellt. Am weitesten verbreitet ist der Nachweis mit Hilfe eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), aber auch andere serologische Verfahren wie der indirekte Immunofluoreszenztest, der Agargelimmunodiffusionstest (AGIDT) und der Western Blot finden Anwendung. Eine Serokonversion tritt bei experimentellen Infektionen bereits zwei bis acht Wochen p. infect. auf (BRODIE et al.1993; DE MARTINI et al. 1999). Nach natürlichen Infektionen erfolgt eine Serokonversion erst Monate später.
Probleme bei diesen Nachweisverfahren macht die unbekannte Anzahl der Tiere, die noch keine Antikörper gebildet haben oder die lebenslang latent infiziert bleiben und dabei keine serologisch nachweisbare Antikörpermenge produzieren. Bei einer Studie von BRODIE et al. (1994) machten dies 42% der Muttern einer Herde mit endemischer OvLV–Infektion aus.
Literaturübersicht
Seit einigen Jahren gewinnt der Antigennachweis mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) immer mehr an Bedeutung.
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR ist eine in-vitro-Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNS-Fragmente.
Sie wird seit einigen Jahren für den Nachweis des MVV angewendet. Aufgrund des erhöhten Kosten- und Arbeitsaufwandes gegenüber den serologischen Methoden und der hohen Rekombinationsrate des MVV-Genoms konnte sich diese Methode bisher jedoch nicht in der Routinediagnostik durchsetzen.
Weitestgehend stabile Regionen des Genomes werden als Primervorlagen verwendet. Im Falle des MVV sind dies die LTR, gag, pol und env Gene.
EXTRAMIANA et al. (2002) beschreiben eine single step, single-primer-set PCR die in der long terminal repeat –LTR- region des MVV Provirus ansetzt. Die untersuchten Substanzen waren Blut, Milch und Gewebe (Zwerchfelllappen der Lunge, periventrikuläre Bereiche des Dienzephalon mit choroiden Plexuszellen, zentrales Eutergewebe, zentrales Milzgewebe und Lymphknotengewebe) von natürlich infizierten Schafen. Ihre Ergebnisse haben die Autoren mit den parallel durchgeführten serologischen AGIDT und ELISA-Tests verglichen. Je nach klinischem Status erzielte die PCR mit Virus-RNS aus peripheren Blutleukozyten bei Tieren mit Maedisymptomen eine Sensitivität von 90% und bei subklinisch infizierten Tieren 78% im Vergleich zur Serologie. Betrachtet man die Ergebnisse aus allen untersuchten Materialien, so kommen EXTRAMIANA et al. (2002) auf eine Sensitivität von 97,7% (42 von insgesamt 43 serologisch positiven Tieren wurden richtig positiv diagnostiziert). Betrachtet man nur die Ergebnisse der Materialien, die am lebenden Tier untersucht werden können (Milch und periphere Blutleukozyten), ergibt dies eine Sensitivität von 92,2%. Die Spezifität liegt bei 100%.
Da die Virusmenge nach der Serokonversion geringer wird, ist die PCR nur vor der Immunantwort sensitiver als der ELISA. Aus diesem Grund wird empfohlen, immer beide Tests durchzuführen, um möglichst viele positive Tiere zu erkennen (ELTAHIR et al. 2006). Problematisch hierbei ist die hohe Rekombinationsrate im Genom des MVV und die molekularbiologischen Unterschiede der verschiedenen Stämme.
Literaturübersicht
Geeignete Materialien für den Nachweis mittels PCR sind Blut, Kolostrum, Milch und, im Falle von Arthritiden, Gelenkflüssigkeit.
Sanierungsmöglichkeiten
Weltweit haben sich verschiedene Methoden für die Eradikation des MVV aus den Herden als nützlich erwiesen. Island konnte sich innerhalb weniger Jahre sanieren, indem die gesamten Herden nach Auftreten von klinischer Maedi getötet und durch Tiere aus Maedi freien Teilen der Insel ersetzt wurden. Nach Etablierung serologischer Tests setzten sich die „test-and-cull“-Methode (alle Schafe über einem Jahr werden getestet und im positiven Fall sofort aus der Herde eliminiert) und die
„isolate-and-test“-Methode (die Lämmer von positiven Müttern werden sofort nach der Geburt isoliert und mit Milchaustauscher aufgezogen) durch. Eine weitere Methode ist die Separation der serologisch positiven Tiere von den serologisch negativen Tieren und somit die Bildung zweier Herden. Häufig kommt es zu Kombinationen dieser Methoden (PEPIN et al. 1998).
Freiwillige Sanierungsmaßnahmen mithilfe dieser Methoden haben sich in den Niederlanden, Belgien, Großbritannien und Deutschland bereits recht erfolgreich etabliert.
Da diese Methoden eine hohe Verlustrate und einen erheblichen Zeitaufwand beinhalten, sind sie gerade für Länder mit einer großen Schafpopulation und einer hohen MVV-Prävalenz unwirtschaftlich und kaum praktikabel. Aus diesen Gründen wurde an alternativen Kontrollstrategien, wie z. B. einer Impfung geforscht (BLACKLAWS et al. 1994), aber derzeit nicht weiter verfolgt (HARKIS 2009, persönliche Mitteilung).
Eine Impfung über die Schleimhaut mit einem attenuierten nichtpathogenen Virus konnte die Infektion mit dem gleichen nicht attenuierten hochpathogenen Virus nicht verhindern. Es zeigte sich jedoch, dass die Infektion wesentlich milder ausfiel und eine geringere Virusmenge aus den Tieren isoliert werden konnte (PÉTURSSON et al. 2005).
Bis jetzt ist kein Impfstoff auf dem Markt erhältlich, obwohl Versuche mit verschiedenen Impfstoffformen gelaufen sind (PEPIN et al. 1998). In weiteren
Literaturübersicht
Versuchen wurde auch mit antiviralen Medikamenten geforscht wie 9-(2- Phosphonylmethoxyethyl)-adenin (PMEA). Diese Substanz ist ein hochpotenter Inhibitor der lentiviralen Reversen Tanscriptase und der Virusreplikation in vitro. Die Tiere wurden intracerebral mit einem hoch neurovirulenten Klon des MVV inokuliert.
Wenn die Gabe (subcutan, 3 mal pro Woche über 6 Wochen) von PMEA gleichzeitig mit der Inokulation stattgefunden hatte, zeigte sich in den ersten sechs Wochen post infect. ein merklicher inhibitorischer Effekt auf die Infektion, mit einer geringeren Virusisolation aus den Blutzellen und weniger entzündlichen Veränderungen im Gehirn.
Wurde PMEA erst 4 Wochen nach der intracerebellären Infektion verabreicht, zeigte sich nur noch ein geringer Effekt hinsichtlich der Veränderungen im ZNS (THORMAR et al.1995, 1998).
Material und Methoden
3 Material und Methoden 3.1 Tiere
Texelschafe
Für die Untersuchungen wurden insgesamt 41 Texelschafe aus 4 Beständen angekauft.
Die Tierzahl und der Maedistatus der jeweiligen Bestände sind aus Tabelle 1 zu ersehen.
Tabelle 1: Anzahl und Maedistatus der Tiere je Bestand
Texelschafe Anzahl Bestände
A B C D
gesamt 40 23 15 1 1
mit klinischer Maedi 32 23 7 1 1
sanierter Bestand, kontrolliert Maedi unverdächtig
8 0 8 0 0
Bei Bestand B handelt es sich um einen Bestand in der Sanierung, so dass serologisch Maedi positive Schafe vor der Sanierung und mutterlos aufgezogene Schafe nach der Sanierung untersucht werden konnten.
Schwarzköpfige Fleischschafe (SKF)
Für die Studie wurden 21 SKF aufgekauft. Die Tierzahl und der Maedistatus der jeweiligen Bestände sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Anzahl und Maedistatus der Tiere je Bestand
SKF-Schafe Anzahl Bestände
E F G
gesamt 21 8 10 3
mit klinischer Maedi 13 0 10 3
sanierter Bestand, kontrolliert Maedi unverdächtig
8 8 0 0
Die 10 Maedi positiven Tiere aus Bestand F sind genetisch mit den 8 Maedi negativen Tieren aus Bestand E verwandt. Sie stammen aus einer SKF-Herde mit
Material und Methoden
klinischer Maedi. Dort wurden im Jahr 2000 alle serologisch positiven Muttertiere aus der Herde durch Verkauf eliminiert und die Lämmer mutterlos aufgezogen.
Diese 10 Maedi positiven Tiere gehörten zu diesen eliminierten Muttern und ihren Nachkommen, die negativen Schafe sind die ältesten Tiere der sanierten Teilherde.
Die 3 weiteren serologisch oder molekularbiologisch Maedi positiven Tiere stammen aus dem Bestand der Tierärztlichen Hochschule und sind nicht mit den erwähnten 18 SKF-Schafen genetisch verwandt.
3.2. Auswahlkriterien
Die Auswahl der einzelnen Tiere innerhalb der bekanntermaßen Maedi positiven Herden erfolgte anhand klinischer Symptome wie Abmagerung, einer im Vergleich zu den anderen Herdenmitgliedern erhöhten Atemfrequenz, Dyspnoe und einem auskultatorisch mittel- bis hochgradigen fauchenden Atemgeräusch.
In der Klinik erfolgte dann eine weitere Selektion anhand der Ergebnisse einer serologischen Untersuchung auf Maedi-Antikörper mittels ELISA und einer molekularbiologischen Untersuchung zum Nachweis der proviralen DNS des Maedi- Visna-Virus im Vollblut, der BALF, Lungengewebe oder Gewebe der Lungenlymphknoten mittels PCR. War das serologische oder molekularbiologische Ergebnis positiv, wurde das Tier als Maedi positiv eingestuft. Tiere mit fraglichen Ergebnissen wurden zu einem späteren Zeitpunkt erneut getestet. War das Ergebnis positiv, wurde das Tier in die Maedi positive Gruppe eingeteilt, bei negativem Ergebnis schied es von der Studie aus.
Weiterhin wurden alle Tiere mittels PCR nach der Methode von VOIGT (2004) auf Lungenadenomatose untersucht. War das PCR-Ergebnis Lungenadenomatose positiv, wurden die Tiere von der Studie ausgeschlossen. Dies war in der Gruppe Texelk zweimal und in der Gruppe Skk einmal der Fall.
3.2 Klinische Untersuchung
Nach Ankunft der Tiere in der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche
Material und Methoden
In der weiterführenden speziellen klinischen Untersuchung des Atmungsapparates wurde das Vorhandensein, Farbe und Konsistenz von Nasenausfluß kontrolliert, Atemtyp (costoabdominal, vermehrt abdominal, vermehrt costal) und Atemrhythmus wurden erhoben und der Husten, ob spontan oder auslösbar, wurde beurteilt.
Anschließend erfolgte die beidseitige Auskultation des Respirationstraktes an mindestens 5 Lokalisationen (Trachea, Region der Bifurkation und beiderseits zwei dorsale Lungenbereiche) und die Dokumentation der Befunde unter Benennung der Lokalisation (tracheal, tracheobronchial, bronchobronchulär, alveolär), des Grades (geringgradig, mittelgradig, hochgradig) und des Charakters (kontinuierlich/diskontinuierlich) auftretender Atemgeräusche.
Um andere Gründe außer Maedi für den meist schlechten Ernährungszustand der serologisch Maedi positiven Tiere auszuschließen, wurden die Zähne kontrolliert, Füllungszustand und Motorik des Pansens beurteilt, und es wurde eine Kotprobe für eine parasitologische Untersuchung entnommen.
3.3 Röntgenologische Untersuchung des Thorax
Je nach Gewicht und Verhalten der Tiere wurden sie in wachem oder anaesthesiertem (Ketaminhydrochlorid (Ursotamin®, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg) 10mg/kg Körpergewicht (KGW)) Zustand sowohl bei laterolateralem, wie auch bei dorsoventralem Strahlengang in Hartstrahltechnik bei 125kV geröntgt (Röntgengenerator CONVIX 360, Picker International GmbH, München;
Röntgentisch Typ 3203, Picker GmbH, Film-Fokus-Abstand 1,50 m;
Belichtungsautomat PRECIMAT, Picker International GmbH, Espelkamp;
Verstärkerfolien 3M, Trimax T8, Format 30 x 40 cm, Röntgenfilm Valmex® VA 990 G-T).
Es wurde versucht, die Belichtung immer in maximaler Inspiration manuell auszulösen.
Um die Befunde besser bewerten zu können, wurden beide Ebenen, wie in Abbildung 2 und 3 zu sehen, in jeweils 4 Segmente unterteilt (nach GANTER 1996).
Material und Methoden
Abb. 2: Einteilung der Beurteilungsfelder in der seitlichen Röntgenaufnahme
Die jeweils beurteilten Quadranten sind mit Zahlen versehen: 1 und 2 dorsale Lungenfelder, 3 und 4 ventrale Lungenfelder
Abb. 3: Einteilung der Beurteilungsfelder in der dorso-ventralen Röntgenaufnahme
Material und Methoden
Bei der Bewertung des Lungengewebes wurde ein semiquantitatives Bewertungssystem nach GANTER (1996) verwendet. Jedes Feld erhielt eine Scorenote mit folgenden Werten:
1 = unverändertes Lungengewebe,
2 = geringe bis mittelgradige Verdichtungen oder multiple kleine Verschattungen, 3 = hochgradige Verdichtungen oder großflächige Verschattungen.
Bei der Bewertung des Herz- und Zwerchfellschattens wurde in der seitlichen Aufnahme jeweils ein Score zugeordnet und in der dorso-ventralen (d.-v.) Aufnahme erhielt jede Hälfte einen Scorewert mit folgender Bedeutung:
1 = scharf abgegrenzte Schatten,
2 = verschwommene, aber noch deutlich sichtbare Schatten, 3 = kaum oder nicht mehr sichtbarer Organschatten.
Um den Grad der sichtbaren Bronchographie festzulegen, wurde für beide Ebenen je ein Score wie folgt vergeben:
1 = nur Trachea und Stammbronchien sichtbar, 2 = Verlauf einzelner Segmentbronchien dargestellt
3 = mehrere Segmentbronchien sind stark verdichtet oder werden durch vollständige Verschattung des umgebenden Gewebes als Aufhellung scharf dargestellt.
Durch Addition der Scores konnte das Ausmaß der Lungenveränderungen von
16 = „unveränderte Lunge“ bis 48 = „in allen beurteilten Parametern hochgradig veränderte Lunge“ quantifiziert werden (GANTER 1996).
3.4 Hämatologische Untersuchung
Um hämatologische Veränderungen bei allen Tieren ausschließen zu können, erfolgte eine Blutentnahme aus der Vena jugularis. Es wurden je 9 ml Lithium- heparinisiertes Blut (Vacuette®, Greiner bio-one, Essen) und 18 ml Kalium- EDTA- Blut (Monovette®, Sarstedt AG und Co., Nümbrecht) entnommen.
Material und Methoden
Aus dem entnommenen Blut wurde sowohl ein weißes, wie auch ein rotes Blutbild nach Standartmethoden (STAMM 1979) erstellt. Der Hämoglobingehalt und die Leukozytenzahl wurde mit dem Blutanalysegerät (Hematology Analyser Modell MEK- 6108G, Nihon Kohden, Bad Homburg) bestimmt.
3.5 Blutgasanalyse
Aus dem Ramus auricularis medialis der Arteria auricularis wurde mit einer 21G Kanüle (Microlance® 3, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA) und einer heparinisierten 250µl Kapillare Blut entnommen und mit dem Blutgasgerät (Osmetec OPTI™ CCA, Fa. Osmetech, Roswell, USA) folgende Parameter untersucht:
pH-Wert, pCO² (mmHg), pO² (mmHg), BE (mmol/l), HCO³ (mmol/l), Hämoglobin (g/dl). Das Gerät gibt jeweils die Werte für eine Standardkörpertemperatur von 37°C und für die aktuell gemessene Körpertemperatur an. Für die weiteren Berechnungen wurden diese individuellen Werte verwendet. Zur späteren Berechnung des alveoloarteriellen Sauerstoffpartialdruckes wurde der Barometerdruck zur Zeit der Blutentnahme notiert.
Der Zeitabstand zwischen Entnahme und Analyse des Blutes betrug maximal 15 Minuten. In dieser Zeit wurden die Kapillaren auf Eis gekühlt.
3.6 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Spülmethode
Nachdem die Tiere mit Hilfe eines Halfters fixiert waren, wurde die Nasenschleimhaut mit 5 ml 4%igem Isocainhydrochlorid (Isocain ad us. vet., Selectavet, Weyan- Holzollingen) anästhesiert und ein flexibles Endoskop (Olympus GIF-XP 20, Olympus optical Co. GmbH, Hamburg) in den ventralen Nasengang eingeführt. Durch den Instrumentierkanal des Endoskopes wurden weiterhin der Larynx- / Pharynxbereich und nach weiterem Vorschieben auch die Bifurkation der Lunge mit insgesamt maximal 10ml Isocainhydrochlorid 4% anästhesiert. Nach
Material und Methoden
Zwerchfelllappen vorgeschoben, bis die Spitze des Endoskopes das Bronchiallumen abdichtete (sog. „wedge“-Position). In dieser Position wurde über den Instrumentierkanal ein Polyäthylenkatheter (Portex® Fine Bore Polythene Tubing, 30m, Firma Smith, Außendurchmesser 1,52 mm) bis zur Spitze des Endoskopes und darüber hinaus weiter caudal vorgeschoben, bis er in einem kleinen Bronchus zu liegen kam und ein weiteres Vorschieben nicht möglich war.
Über diesen Katheter erfolgte die Spülung der ersten Fraktion (die für die kulturelle mikrobiologische Untersuchung verwendet wurde). Zunächst wurde mit Einwegspritzen 5 ml warme 0,9 %ige NaCl-Lösung (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) instilliert und über das Endoskop sofort wieder aspiriert. Diese Fraktion wurde in einem sterilen Tupferröhrchen ohne Nährmedium aufgefangen und zur kulturellen bakteriologischen Untersuchung in das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule weitergeleitet. Anschließend wurde der Katheter entfernt und über den Instrumentierkanal 5 x 20 ml 0,9%ige NaCl-Lösung in den bronchoalveolären Raum eingebracht und die Flüssigkeit nach jeder Fraktion sofort wieder vorsichtig mit leichtem Unterdruck durch eine Saugpumpe (Endoaspirator, System Endoparts, Fa. Georg Pauldrach, Hannover) aspiriert. Diese 5 Fraktionen wurden in einer autoklavierten und mit konzentriertem Heparin ausgespülten Gaswaschflasche nach Drechsel (Gebrüder Rettberg GmbH, Göttingen) aufgefangen.
Zytologische Untersuchung der bronchoalveolären Spülflüssigkeit (BALF)
Die zurückgewonnene BALF wurde direkt nach der Entnahme in das klinikeigene Labor verbracht, durch Schwenken resuspendiert, volumenmäßig erfasst und dann bei 200 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Vom Sediment wurde soviel in 0,9 % NaCl-Lösung gegeben, bis diese eine optisch sichtbare Trübung ergab. Dieser Anteil wurde anschließend mittels Zentrifugation (Multifuge 4 KR, Thermo Elekton Corporation, Osterode) für 10 Minuten bei 200 x g mittels Zytospotverfahren auf Objektträger verbracht (GANTER 1996). Jeweils ein Zytospot wurde nach Pappenheim gefärbt und 200 Zellen wurden auf ihre Integrität untersucht und differenziert.
Material und Methoden
Bakteriologische Untersuchung der BALF
Für die mikrobiologische Untersuchung wurde die erste Spülfraktion verwendet.
Durch die Verwendung eines Katheters ließen sich bakterielle Kontaminationen während der Passage durch die oberen Atemwege so weit wie möglich vermeiden.
Da sich durch die Verwendung des Katheters wiederholt Blutungen des Lungengewebes einstellten, wurde dessen Verwendung ab der 15. BAL eingestellt.
Die weiteren mikrobiologischen Untersuchungen erfolgten aus 3 ml einer dekantierten Fraktion der aspirierten Spülflüssigkeit.
Im Institut für Mikrobiologie wurden die Proben unter Verwendung von Standardmethoden auf aerobe und anaerobe Krankheitserreger untersucht.
Untersuchungen der Lymphozytensubsets
BALF mit Erythrozytenbeimengungen oder mit weniger als 33 lymphoiden Zellen wurden von der Analyse ausgeschlossen.
Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)
Bei dieser Methode bindet ein monoklonaler Primärantikörper an eine native Oberflächenstruktur, welche auf der Zelle exprimiert wird. An diesen Primärantikörper bindet ein zweiter, fluorochrommarkierter Sekundärantikörper. Der Anteil fluorochrommarkierter Zellen wird anschließend durchflußzytometrisch erfasst.
Durchführung der indirekten Membranimmunfluoreszenz (MIF)
Für die MIF wurden 2-3 x 105 Zellen pro Vertiefung einer Rundbogenmikrotiterplatte (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) eingesetzt, zentrifugiert (4 Min., 220 x g, 10°C) (Megafuge 1.0 R, Thermo Scientific, Osterode) , der Überstand dekantiert und die Platte mit dem Zellsediment auf dem Mikrotiterplattenrüttler (AM 69 Microshaker, Dynatech AG, Zug) für 5 Sekunden bei Raumtemperatur resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 150 µl MIF-Puffer (siehe Anhang) in die einzelnen Vertiefungen einmal gewaschen (bei 10°C für 4 Min. bei 200 x g abzentrifugiert, Dekantieren des Überstandes, Platte aufrütteln) und mit 25µl Primärantikörperlösung
