Hemmung der gp130-abhängigen Signalkaskade der Inflammationsreaktion reduziert Atherosklerose im Mausmodell

Aus der Abteilung Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Direktor: Professor Dr. med. H. Drexler

Hemmung der gp130 – abhängigen Signalkaskade der Inflammationsreaktion reduziert Atherosklerose

im Mausmodell

Dissertation

z ur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Christian Sagebiel

aus Hameln

Hannover 2007

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 19.02.2008

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Bernhard Schieffer Referent: PD Dr. med. Talat Yelbuz

Korreferent: PD Dr. med. Jan Kielstein

Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2008

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Michael Peter Manns Prof. Dr. Arnold Ganser Prof. Dr. Marion Haubitz

III

ABKÜRZUNGEN

Abb. Abbildung

AHA American Heart Association ANG II Angiotensin II

apoE Apolipoprotein E

APP Akut-Phase-Proteine

AT1 Angiotensin II Typ 1 Rezeptor

bp Basenpaar

BSA bovine serum albumin

cDNA complementary DNA (zur mRNA komplementäre DNA) CCL2 CC chemokine receptor ligand-2

CCR2 CC chemokine receptor-2 CD36 cluster of differentiation 36 CD40L CD40-Ligand, Synonym: CD154 CLC cardiotrophin-like cytokine CNTF ciliary neurotrophic factor COX Cyclooxygenase

CRP C-Reaktives Protein

CT-1 cardiotrophin-1 DEPC Diethylpyrocarbonat

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinacid dNTP Desoxynukleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol

EC endothelial cells

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri (und andere)

FCS fetal calf serum

FK Fractalkine

g Gramm

gp130 Glykoprotein 130

GRO-α Growth-related Oncogene-α

h Stunde

HDL high density lipoprotein

HSP heat shock protein

ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1 IFN-γ Interferon-γ

IgG Immunglobin G

IL-6 Interleukin 6

IP-10 IFN-γ-Inducible Protein-10

I-TAC IFN-inducible T-cell Alpha-Chemoattractant JAK Janus Kinase, just another kinase

kb kilo Basenpaar

KC Keratinocyte Chemokine

kDa Kilodalton

KHK Koronare Herzkrankheit LDL Low Density Lipoprotein LIF leukemia inhibitory factor

MAP-Kinase mitogen-activated protein-kinase MASMC mouse aortic smooth muscle cells MCP-1 monocyte chemoattractant protein M-CSF macrophage colony stimulating factor MH-S Murine Makrophagenzelllinie

MIG Monokine Induced by Interferon-γ

min Minute

MIP Macrophage Inflammatory Protein MMP Matrix-Metallo-Proteinasen

MOMA-2 Monozyten/Makrophagen Oberflächenmarker mRNA messenger-RNA

n Anzahl

NADPH Nicotinamidadenindinucleotid-phosphat NO Nitric oxide, Stickstoffmonoxid

OD optische Dichte

OSM oncostatin M

oxLDL oxidiertes Low Density Lipoprotein PBS Phosphat gepufferte Saline

PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion) PDGF platelet-derived growth factor

RANTES Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Regulated

RT Raumtemperatur

V

s Sekunde

s.a. siehe auch

SAA Serumamyloid A

SDS Natriumdodecylsulfat SR-A scavenger receptor class A

STAT signal transducers and activators of transcription

Tab. Tabelle

Taq polymerase DNA-abhängige Polymerase aus Thermus aquaticus TBS Tris-Puffer mit NaCl

TBST Tris-gepufferte NaCl mit Tween-20 TEMED N,N,N´,N´ - Tetramethylendiamin

TF tissue factor

TGF-β transforming growth factor-β TNF-α tumor necrosis factor-α

Tris Tris-(hydroxymethyl) aminomethan U Units (Einheit der Enzymaktivität) UPM Umdrehung pro Minute

UV ultraviolettes Licht

v/v volume/volume (Volumenanteil pro Volumen) VCAM vascular cell adhesion molecule

VEGF vascular endothelial growth factor VSMC vascular smooth muscle cells

w/v weight/volume (Gewichtsanteil pro Volumen) xg (fache) Erdbeschleunigung

1 EINLEITUNG 1

1.1 Atherosklerose – eine chronisch inflammatorische Erkrankung 1

1.1.1 Historischer Rückblick 1

1.2 Pathophysiologie der Atherosklerose 2

1.2.1 Risikofaktoren und Endotheliale Dysfunktion 2

1.2.2 Initiation der Atherosklerose durch Endotheliale Dysfunktion 4

1.2.3 Entstehung von Schaumzell-Läsionen, sog. Fatty Streaks 5

1.2.4 Fortgeschrittene Läsionen, sog. Advanced Lesions 7

1.2.5 Komplizierte, instabile fibröse Plaques und Plaqueruptur 9

1.3 Chemokine in der Pathogenese der Atherosklerose 10

1.3.1 Rolle der CCL2-CCR2-Interaktion für die Monozyten-Migration 12

1.4 Die Akut-Phase-Reaktion und Atherosklerose 12

1.4.1 Akut-Phase-Proteine als Risikoprädiktoren von kardiovaskulären Erkrankungen 14 1.4.2 Das Akut-Phase-Protein SAA und seine Rolle bei der Atherogenese 15

1.5 Das Mausmodell 16

1.5.1 Die Apolipoprotein E Knockout (apoE^–/–)-Maus als Tiermodell der Atherosklerose 16

1.5.2 Die Zytokinrezeptor-Untereinheit gp130 17

1.5.3 Die gp130 Knockout Maus 17

1.6 Herleitung der Fragestellung 19

2 MATERIAL UND METHODEN 20

2.1 Chemikalien und Narkotika 20

2.2 Enzyme, Basenpaarleitern 20

2.3 Inhibitoren und Aktivatoren 20

2.4 Antikörper 21

2.5 Reagenzien, Puffer, Lösungen und Zellkulturmedien 21

2.6 ELISA Kits und sonstige Materialien 22

2.7 Geräte 22

VII

2.8 Methoden 23

2.8.1 Versuchstiere 23

2.8.2 Versuchsdiät 23

2.8.3 Genotypisierung 24

2.8.3.1 DNA-Isolierung aus Mäuseschwänzen 24

2.8.3.2 DNA-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 24

2.8.3.3 DNA-Agarose-Gelelektrophorese 26

2.8.3.4 Auswertung der PCR-Agarose-Gelelektrophorese 26

2.8.3.5 Genotypen der Versuchstiere 27

2.8.4 Systolische Blutdruckmessung 28

2.8.5 Plasmagewinnung und Gewebepräperation 28

2.8.6 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 30

2.8.7 Bestimmung der aortalen Plaquefläche ¹⁰⁹ 30

2.8.8 Immunhistochemie 32

2.8.8.1 Ölrot-Färbung bei Gefrierschnitten ¹⁰⁹ 32

2.8.8.2 Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen 33

2.8.8.3 Quantifizierung des Makrophagenanteils 33

2.8.9 Zellkultur 34

2.8.9.1 Zellkultur von murinen Hepatozyten 34

2.8.9.2 Zellkultur von aortalen murinen glatten Gefäßmuskelzellen (MASMC) 34

2.8.9.3 Zellkultur von murinen Makrophagen (MH-S) 35

2.8.9.4 Zellzahlbestimmung 35

2.8.9.5 Passagieren von adhärenten Zellen 36

2.8.9.6 Einfrieren und Auftauen von Zellen 36

2.8.9.7 Stimulationsexperimente 36

2.8.9.7.1 Stimulation von Hepatozyten mit LIF 36

2.8.9.7.2 Stimulation von MASMC 37

2.8.9.7.3 Stimulation von MH-S Zellen 37

2.8.10 Molekularbiologische Methoden 37

2.8.10.1 RNA-Extraktion 37

2.8.10.2 Spektralphotometrische Quantifizierung der RNA 38

2.8.10.3 Semiquantitative Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) 38

2.8.11 Makrophagen-Migrations-Assay 40

2.8.12 Statistik 41

3.1 Phänotyp der gp130 Knockout Maus unter Western Diät 42

3.1.1 Gewichtskontrollen 42

3.1.2 Blutdruckmessungen 43

3.2 Entzündungsmarker im Plasma: IL-6 und SAA 45

3.3 Atherosklerose-Entwicklung 46

3.3.1 Ausdehnung atherosklerotischer Läsionen in der Aorta 46

3.3.2 Makrophagen im atherosklerotischen Plaque 49

3.4 Hepatische Akut-Phase-Proteine, SAA und Atherosklerose 55

3.4.1 LIF-Stimulation von Hepatozyten und SAA-Sekretion 55

3.4.2 Expression und Ausschüttung von CCL2 in glatten Gefäßmuskelzellen 56

3.4.2.1 MASMC Stimulationsversuche mit SAA 56

3.4.2.2 MASMC Stimulation mit Hepatozytenüberständen 57

3.4.3 Das Akut-Phase-Protein SAA und Expression von CCR2 bei Makrophagen 58

3.4.4 Das Akut-Phase-Protein SAA und Makrophagen-Migration 60

4 DISKUSSION 62

4.1 Das Mausmodell 62

4.2 Ausprägung der Atherosklerose 64

4.3 Die Inflammationsmarker IL-6 und SAA 66

4.4 SAA und Akut-Phase-Proteine steigern die Rekrutierung von Makrophagen im atherosklerotischen

Plaque 69

4.4.1 Makrophagenrekrutierung, Atherogenese und Plaqueprogression 69

4.4.2 SAA und Makrophagenrekrutierung 70

4.4.3 Akut-Phase-Proteine aus LIF-stimulierten Hepatozytenüberständen und Makrophagenrekrutierung 71

4.5 Zukünftige Ansätze 72

5 ZUSAMMENFASSUNG 74

6 LITERATURVERZEICHNIS 76

IX

7 ANHANG 83

7.1 Lebenslauf 83

7.2 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO 85

7.3 Dissertationsanzeige bzgl. Tierschutz 86

7.4 Danksagung 87

7.5 Veröffentlichungen 88

1 Einleitung

Die Atherosklerose und ihre Folgeerkrankungen wie Koronare Herzkrankheit (KHK), Herzinfarkt, plötzlicher Herztod und zerebrale Insulte zählen nach wie vor zu den häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrienationen. Nach Angaben des statistischen Bundesamtes waren allein in Deutschland im Jahre 2004 mehr als 226.000 Todesfälle (27,6% der Verstorbenen) direkt oder indirekt auf die Atherosklerose zurückzuführen. In zunehmenden Maße gewinnt die Erkrankung auch weltweit an Bedeutung und wird in Zukunft eines der führenden Gesundheitsprobleme überhaupt darstellen ^1-3.

Durch die Folgen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit und der Atherosklerose im zerebrovaskulären System verlieren viele ältere Menschen ihre Autonomie und werden pflegebedürftig.

Die Einschränkung der Lebensqualität durch Folgezustände atherosklerotischer Gefäßveränderungen, die hohe Inzidenz akut letaler Verläufe sowie letztendlich auch die durch die Erkrankung entstehenden Kosten für das Gesundheitssystem machen es notwendig, die Pathogenese der Atherosklerose weiter zu erforschen und zu verstehen. Erst das genaue und umfassende Verständnis der Atherogenese wird es ermöglichen, gezielte Präventionsmaßnahmen und kausale Therapiekonzepte zu entwickeln.

1.1 Atherosklerose – eine chronisch inflammatorische Erkrankung

1.1.1 Historischer Rückblick

Mit großer Wahrscheinlichkeit beschrieb schon Leonardo da Vinci (1452–1519) als erster Wissenschaftler während einer Autopsie makroskopische Veränderungen im Gefäßsystem, die später als Atherosklerose definiert werden sollten ⁴. Im Jahre 1833 verwendete der Pathologe Jean Lobstein in Straßburg zum ersten Mal den Begriff Atherosklerose zur Beschreibung der pathologischen Befunde, die er bei den Obduktionen fand. Seitdem wird der Begriff Atherosklerose (umgangssprachlich auch Arterienverkalkung) zur Beschreibung von krankhaften Veränderungen der Arterienwand benutzt, die zur Verdickung, Verhärtung, Elastizitätsverlust und Lumeneinengung der Arterie führen ⁵.

Im 19. Jahrhundert wurden zwei Hypothesen zur Pathophysiologie der Erkrankung postuliert, die die damalige Forschung dominierten. Der pathologische Anatom Karl Rokitansky (1804–1878) entwickelte 1852 die Inkrustationshypothese. Danach waren Fibrinablagerungen, an denen nachfolgend eine Organisation durch Fibroblasten und eine Akkumulation von Lipiden stattfand, für

Einleitung

2

die Verdickung der Intima der Gefäße verantwortlich ^{6, 7}. Als vehementer Kritiker der Lehre Rokitanskys veröffentlichte der Berliner Pathologe Rudolf Virchow (1821–1902) dann 1856 seine Hypothese von der Entstehung der Atherosklerose ⁸. In dieser stand die gesteigerte Ablagerung von Lipiden aus dem Blut in die Intima und Media der Arterien als Initiator der Atherogenese im Vordergrund.

Diese Vorstellung wurde bis in das 20. Jahrhundert übernommen. Neue Erkenntnisse über die Bedeutung der Hypercholesterinämie und Dyslipoproteinämie für die Initiation der Atherosklerose führten in den 70er Jahren zur Entwicklung der response-to-retention-Hypothese ^{9, 10}. Nach dieser Hypothese wird die Atherogenese durch Retention von atherogenen Lipoproteinen im subendothelialen Raum induziert ¹¹.

Durch die neuen Erkenntnisse im Bereich der zellulären Gefäßbiologie wurde in den folgenden Jahren der Fokus der Forschung vermehrt auf den Einfluss von glatten Gefäßmuskelzellen, Wachstumsfaktoren und auf die Funktion der Endothelzellen gerichtet. Russel Ross präsentierte 1976 die response-to-injury-Hypothese, wonach eine mechanische, metabolische, toxische, immunologische oder virale Endothelschädigung zu einer Veränderung der endothelialen Funktion und dadurch zu einer erhöhten Permeabilität der Endothelzellen für atherogene Lipoproteine führt ^{4, 12}. Somit rückten die Ursachen und Folgen der endothelialen Dysfunktion mehr und mehr in den Mittelpunkt wissenschaftlicher Forschung.

Die Verknüpfung und die mehrfache Modifikation der vorgenannten Hypothesen führten schließlich Anfang dieses Jahrtausends zu der heute verbreiteten Auffassung zur Entstehung der Atherosklerose. Demnach ist die Erkrankung Atherosklerose während aller Stadien ein chronisch entzündlicher Prozess der Arterienwand, der von inflammatorischen Zellen wie Makrophagen und T-Lymphozyten und proinflammatorischen Mediatoren wie Chemokinen und Zytokinen initiiert und aufrecht erhalten wird ¹³.

1.2 Pathophysiologie der Atherosklerose

1.2.1 Risikofaktoren und Endotheliale Dysfunktion

Folgende Umstände werden derzeit als Risikofaktoren für die Entstehung von Atherosklerose und vaskulären Gefäßerkrankungen angesehen: Hypercholesterinämie und erhöhte LDL-Spiegel, Zigarettenrauch, Hypertonie, Diabetes mellitus, Gendefekte und erhöhte Homocysteinspiegel ¹³ (siehe Abbildung 1). Mehrere Studien haben weiterhin eine Korrelation zwischen der Inzidenz von Atherosklerose und einer Infektion mit Mikroorganismen wie Chlamydia pneumoniae oder Herpesviren aufdecken können ^14-16. Ein Beleg, dass diese Mikroorganismen aber auch ursächlich für die Entstehung der Atherosklerose verantwortlich sein können, konnte bisher noch nicht

gefunden werden. Daher bleibt ihre Rolle bei der Pathophysiologie der Atherosklerose bislang umstritten.

Abbildung 1: Vaskuläre Risikofaktoren und Endotheliale Dysfunktion

Alle Risikofaktoren induzieren oxidativen Stress, der auf die endothelialen Zellen der Gefäße einwirkt. Der erhöhte oxidative Stress ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion, die nach heutiger Ansicht den ersten Schritt bei der Entstehung von atherosklerotischen Läsionen darstellt ¹³. Ob aber der erhöhte oxidative Stress Initiator der Endothelialen Dysfunktion ist, oder erst im Verlauf nach initialer Schädigung der Zellen Einfluss nimmt, bleibt weiterhin umstritten und Gegenstand zukünftiger Forschung ¹⁷.

Die Qualität des auf die Gefäßwand einwirkenden Blutflusses (laminare Strömung oder turbulenter Blutfluss) ist ein weiterer wichtiger Faktor für die Atherogenese. Je nach Vorherrschen von einer der beiden Strömungsarten sind nicht alle Regionen des Gefäßsystems gleichermaßen für die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen prädisponiert ¹⁸. So findet man an Gefäßabgängen, Bifurkationen oder Gefässbögen hauptsächlich turbulenten Blutfluss ¹⁹ und es treten häufig atherosklerotische Läsionen auf; andere Gefäßabschnitte mit vorwiegend laminarer Blutströmung sind hingegen weniger von Atherosklerose betroffen.

Bestimmte Gene, die bei der Pathogenese der Atherosklerose eine Rolle spielen, haben in ihren Promotor-Abschnitten Elemente, die auf Scherkräfte reagieren ²⁰. Die Art der Scherkräfte, die auf die Endothelzellen einwirken, ist dabei von der Strömungseigenschaft des Blutes in diesem Gefäßabschnitt abhängig. So wird z.B. NO, das durch Verminderung des oxidativen Stress zur Reduktion der VCAM-1 (vascular-cell adhesion molecule-1) Expression führt und damit einen atheroprotektiven Einfluss nimmt, vermehrt in Gefäßregionen mit laminarem Blutfluss synthetisiert ^{21, 22}. Turbulenter Blutstrom erhöht hingegen z.B. die endotheliale Expression des Leukozytenadhäsionsmoleküls ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) ²³, das wie im apoE- Knockout-Mausmodell nachgewiesen werden konnte atherogen wirkt ²⁴. Somit werden sowohl

Einleitung

4

atheroprotektive als auch atherogene Mechanismen in Abhängigkeit von den lokalen Strömungseigenschaften des Blutes in diesem Gefäßabschnitt reguliert.

1.2.2 Initiation der Atherosklerose durch Endotheliale Dysfunktion

Durch die endotheliale Dysfunktion kommt es im Endothel zu einer erhöhten Permeabilität der Endothelzellen für Lipoproteine und zu einer Heraufregulierung der Leukozyten-Adhäsions- Moleküle E-Selektin, P-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 ²⁵. Im Bereich des geschädigten Endothels führt die Expression dieser Moleküle zu einer Adhäsion von T-Lymphozyten und Monozyten aus dem Blutstrom an das Endothel ²⁶. Nachfolgend kommt es dann zur gerichteten Migration der Leukozyten durch die Interzellulärspalten des Endothels in die Gefäßintima.

Die Migration der adhärenten Leukozyten wird durch so genannte Chemokine gefördert (siehe Abschnitt 1.3). Das wichtigste Chemokin für die Monozyten-Migration ist MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1, Synonym: CCL-2, CC chemokine receptor ligand-2) ²⁰. Es bindet an den von den Monozyten exprimierten Rezeptor CCR-2 (CC chemokine receptor-2). Weitere Studien haben auch einen Einfluss des Interleukins IL-8 auf die Monozyten-Migration nachweisen können ²⁷. Für die Migration der T-Lymphozyten ist ein Trio von CXC-Chemokinen (siehe Abschnitt 1.3) verantwortlich, die durch Interferon-γ induziert werden können ²⁸. Als dritte Leukozytenzellart findet man in den Atheromen Mastzellen, deren Migration durch das CC Chemokin Eotaxin gefördert wird ²⁹.

Abbildung 2: Die Endotheliale Dysfunktion führt zur Adhäsion und Migration von Monozyten und T- Lymphozyten in die Intima (mod. aus ¹³)

1.2.3 Entstehung von Schaumzell-Läsionen, sog. Fatty Streaks

Nachdem die T-Zellen und Monozyten die Intima infiltriert haben bildet sich die erste makroskopisch sichtbare atherosklerotische Läsion, der so genannte fatty streak. Er entwickelt sich schon bei Kleinkindern ³⁰ und ist eine rein entzündliche Läsion bestehend aus Schaumzellen und T-Lymphozyten ³¹.

Abbildung 3: Entstehung von Fatty Streaks (mod. aus ¹³)

Die Schaumzellen gehen aus den Monozyten hervor. Nach der Rekrutierung der Monozyten im Bereich der Läsion exprimieren diese unter Einfluss von M-CSF (macrophage colony stimulating factor) so genannte scavenger-Rezeptoren und werden zu gewebsresidenten Makrophagen. Über die scavenger-Rezeptoren SR-A (scavenger receptor class A) und CD36 (cluster of differentiation 36) nehmen die Makrophagen Lipoproteine auf, die z.B. durch Oxidation modifiziert worden sind und speichern diese im Zytoplasma ^{32, 33}. Die internalisierten Lipoproteine akkumulieren dann innerhalb der Makrophagen und lagern sich zu zytoplasmatischen Lipidtröpfchen zusammen. Dieser Prozess lässt die Makrophagen lichtmikroskopisch schaumig erscheinen, was zu dem Begriff Schaumzelle geführt hat. Des Weiteren sezernieren die Makrophagen nach ihrer Aktivierung Wachstumsfaktoren, TF (tissue factor), MMPs (Matrix- Metallo-Proteinasen) und proinflammatorische Zytokine, die bei der weiteren Plaqueprogression eine Rolle spielen (siehe auch Abbildung 4) ^34-36.

Einleitung

6

Abbildung 4: Die Rolle der Monozyten bei der Atherogenese (mod. aus ²⁰)

Die T-Zellen treffen nach ihrer Migration in die Gefäßintima auf verschiedene Antigene, darunter oxidiertes LDL (low density lipoprotein) und HSPs (heat shock proteins). Sie werden als Autoantigene von humanen T-Lymphozyten aus atherosklerotischen Plaques erkannt und induzieren eine zelluläre spezifische Immunantwort ^{37, 38}.

Durch die Bindung des Antigens an den spezifischen Antigenrezeptor kommt es zur Aktivierung der T-Zellen. Es findet eine klonale Vermehrung der Zellen unter Beibehaltung des jeweils spezifischen T-Zell-Antigenrezeptors statt ³⁹. Zusätzlich erfolgt eine Differenzierung in entweder den TH1- oder TH2 Subtyp. Die Lymphozyten des TH1- Subtyps überwiegen in den Atheromen und sezernieren hauptsächlich proinflammatorische Zytokine wie IFN-γ (Interferon-γ), IL-2 (Interleukin-2) und TNF-α (tumor necrosis factor-α) ⁴⁰, die wiederum zur Aktivierung von Makrophagen und Gefäßzellen führen. Die Lymphozyten des TH2- Subtyps findet man nur in geringer Anzahl; sie schütten überwiegend anti-inflammatorische Zytokine wie IL-4, IL-5 und IL-10 aus ⁴⁰. Jeder Subtyp reguliert die Immunantwort des jeweils entgegengesetzten Subtyps. So hemmt das vom TH2- Subtyp freigesetzte IL-10 die TH1- Zellen, während IL-12 die TH2- Antwort vermindert ⁴¹. IL-12 wird von durch TH1-Zytokin aktivierten läsionalen Zellen, wie Gefäßmuskelzellen oder Endothelzellen gebildet ⁴².

Neben der Aktivierung über oxLDL und HSP, die an den T-Zell-Rezeptor binden, können die T- Lymphozyten auch durch Makrophagen aktiviert werden. Die Makrophagen innerhalb atherosklerotischer Läsionen exprimieren Klasse II Histokompatibilitäts-Antigene (MHC-II), über die sie den T-Zellen Antigene präsentieren können ⁴³. Umgekehrt können die T-Zellen über die

Expression des proinflammatorischen CD40L (CD40-Ligand, Synonym: CD154) die Makrophagen über deren Rezeptor CD40 aktivieren ²⁰ (siehe auch Abbildung 5).

Abbildung 5: Die Rolle der T-Lymphozyten bei der Atherogenese (mod. aus ²⁰)

Zusammenfassend kann man die Schaumzell-Läsion als eine lokale Entzündungsreaktion der Gefäßwand auf Antigene wie oxLDL oder HSP beschreiben. Bei der Immunreaktion ist sowohl die spezifische Immunabwehr in Form der T-Lymphozyten, als auch die unspezifische Immunabwehr in Form der Monozyten/Makrophagen beteiligt. Beide Formen der Immunabwehr sind gemeinsam an der Entstehung atherosklerotischer Schaumzell-Läsionen (sog. Early Lesions) beteiligt und beeinflussen sich durch die Ausschüttung von Zytokinen und Rezeptor-Liganden-Interaktion gegenseitig.

1.2.4 Fortgeschrittene Läsionen, sog. Advanced Lesions

Durch die andauernde Inflammationsreaktion in der Gefäßintima kommt es zur Ausschüttung verschiedener Wachstumsfaktoren durch Makrophagen und andere läsionale Zellen. Glatte Gefäßmuskelzellen migrieren in die Intima und bilden mit zunehmender Anzahl die fibröse Kappe der fortgeschrittenen Läsion. Die Migration der glatten Gefäßmuskelzellen wird durch PDGF (platelet-derived growth factor) und TGF-β (transforming growth factor-β) stimuliert. Am Rand der fibrösen Kappe, der so genannten Schulter, migrieren weiterhin Makrophagen und T-Zellen in die Intima. Im Inneren der Läsion sammeln sich Schaumzellen, die große Mengen an Lipoproteinen aufgenommen haben. Ein Teil davon geht durch Apoptose oder Nekrose zugrunde und setzt dabei die im Zytoplasma gespeicherten Lipide frei. Die freigesetzten Lipide bilden zusammen mit den Zelltrümmern den „nekrotischen Kern“ der Läsion, der durch die fibröse Kappe als Barriere von dem Blutstrom getrennt wird. Die Barrierefunktion der fibrösen Kappe ist von großer Bedeutung, da

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8

somit der hochthrombogene Tissue Factor, der im Inneren der Läsion von den Makrophagen sezerniert wird, nicht in Kontakt mit der Gerinnungskaskade des Blutstroms kommen kann ^{13, 20}. Eine durch den Tissue Factor verursachte Thrombenbildung an anderer Stelle des Gefäßes wird somit durch die fibröse Kappe verhindert.

Die weitere Größenzunahme des fortgeschrittenen Plaques wird durch mehrere Mechanismen verursacht. Durch Vermehrung der glatten Gefäßmuskelzellen und der extrazellulären Matrix gewinnt die fibröse Kappe zunehmend an Dicke. Bei andauernder Expression von Adhäsionsmolekülen gelangen immer mehr Monozyten und Lymphozyten über die Schulter der Läsion in die Gefäßwand ¹³. Auch die Entwicklung des nekrotischen Kerns trägt zu der Größenzunahme bei. Bei zunehmender Dicke wird das Gefässlumen mehr und mehr durch den Plaque verlegt und der Blutfluss in den Gefäßen verringert. Es kann zur Manifestation erster klinischer Symptome kommen, wenn z.B. bei Belastung der koronare Blutfluss durch die Gefäßeinengung und die vasokonstriktorische Wirkung von Katecholaminen nicht mehr ausreichend ist. Es kommt zu einem Ungleichgewicht zwischen dem myokardialen Sauerstoffangebot und -bedarf. Klinisch findet man dann die Symptome einer belastungsinduzierten Angina pectoris ³.

Abbildung 6: Entstehung von Advanced Lesions (mod. aus ¹³)

1.2.5 Komplizierte, instabile fibröse Plaques und Plaqueruptur

Nach heutiger Ansicht kann es durch mehrere Ursachen zur Entstehung von instabilen Plaques und zur Plaqueruptur kommen. In Studien mit Patienten, bei denen innerhalb eines Jahres vier aufeinander folgende Koronarangiographien durchgeführt worden waren, konnte man eher eine diskontinuierliche Progression der Atherosklerose finden ⁴⁴. So erfolgt die Progression vom hämodynamisch stabilen Plaque zum instabilen, die Blutzirkulation beeinträchtigenden rupturierten Plaque nicht stetig. Vielmehr kann eine stabile Läsion über einen längeren Zeitraum nicht an Größe zunehmen, während es bei anderen Läsionen schlagartig zur Größenzunahme und Ruptur kommen kann. Diese Beobachtungen führten zu der These, dass verschiedene Mechanismen an stabilen Plaques zur plötzlichen Plaqueexpansion und Entstehung von Gefässthromben führen können ⁴⁵. In der Klinik findet man bei einem solchen Ereignis am Herz die Symptome des Akuten Koronarsyndroms ³.

Eine Ursache der Plaqueexpansion ist z.B. die superfizielle Erosion der fibrösen Kappe, bei der es lokal zur Desquamation von einzelnen Endothelzellen des einschichtigen Endothels kommt.

Subendotheliale Kollagenfasern und der Von-Willebrand-Faktor werden dadurch freigelegt und es kommt zur Thrombenbildung durch Adhäsion und Aktivierung von Thrombozyten aus dem Blutstrom ⁴⁶. Als mögliche Ursachen der Desquamation kommt einerseits das Absterben einzelner Endothelzellen durch Apoptose oder Nekrose, ausgelöst durch zytotoxische T-Lymphozyten oder inflammatorische Zytokine, in Frage. Andererseits induzieren die Entzündungsmediatoren und die oxidierten Lipoproteine innerhalb der Läsion die Expression und Aktivierung von MMPs, die die subendotheliale Basalmembran schädigen und abbauen ⁴⁷. Dadurch kann es ebenfalls zur superfiziellen Erosion kommen, wenn die Endothelzellen den Halt durch Wegfall der Basalmembran verlieren.

Neben der Intaktheit des Endothels sind auch die Dicke und Stabilität der fibrösen Kappe entscheidend für die Rupturgefährdung von atherosklerotischen Plaques. Instabile Plaques weisen eine dünnere, fragile fibröse Kappe und mehr inflammatorische Zellen auf als stabile Plaques ⁴⁸. Die mechanische Belastbarkeit der fibrösen Kappe wird hauptsächlich durch interstitielle Kollagenfasern gewährleistet, die von den glatten Gefäßmuskelzellen synthetisiert werden ⁴⁹. Die Syntheserate wird durch verschiedene Wachstumsfaktoren und Zytokine gesteuert. PDGF, TGF-β und IL-1 induzieren die Kollagensynthese der glatten Gefäßmuskelzellen, IFN-γ hemmt diese.

IFN-γ, das von aktivierten T-Zellen sezerniert wird, übt dabei den stärksten Einfluss auf die Synthese aus und hemmt diese selbst unter Einfluss von TGF-β ⁵⁰. Zusätzlich zu der verminderten Kollagensynthese wird die fibröse Kappe auch durch Abbau der Kollagenfasern durch MMPs geschwächt. Die MMPs werden unter anderem von den läsionalen Makrophagen sezerniert ⁵¹. Die Interaktion des T-Zell-gebundenen CD40L mit CD40 der Makrophagen induziert die Expression der MMPs, ebenso wie der Einfluss von IL-1 und TNF-α ⁵¹. Wenn also die von aktivierten TH1-

Einleitung

10

Zellen ausgeschütteten inflammatorischen Stimuli wie IL-1, TNF-α und IFN-γ im Plaque überwiegen, wird die fibröse Kappe durch die verminderte Kollagensynthese und vermehrten Kollagenabbau geschwächt. Es kann zur Ruptur der Kappe kommen, wobei der von den Makrophagen sezernierte Tissue Factor in Kontakt mit der Gerinnungskaskade des Blutstroms kommt. Die Gerinnungskaskade wird durch den Tissue Factor aktiviert und es kommt zur Thrombenbildung, die bis zur Gefäßokklusion führen kann.

Abbildung 7: Instabiler Plaque und Plaqueruptur (mod. aus ¹³)

1.3 Chemokine in der Pathogenese der Atherosklerose

Als Chemokine (Chemotactic Cytokines) bezeichnet man eine Familie von 60–70 Aminosäuren langen Polypeptiden, die die transendotheliale Migration von zirkulierenden Leukozyten aus dem Blutstrom in Bereiche von Inflammation oder Verletzungen steuern ⁵². Bis heute kennt man ungefähr 50 humane Chemokine, die abhängig von ihrer Struktur und Funktion in 3 Gruppen aufgeteilt werden: Die CC-, CXC- und CX3C-Chemokine. Die Aufteilung richtet sich nach der Position der ersten beiden von insgesamt 4 initialen Cystein-Aminosäuren am amino-terminalen Ende der Polypeptide, die charakteristisch für alle Chemokine sind ⁵³. Um ihre zellulären Effekte zu erzielen, müssen die Chemokine an bestimmte Chemokin-Rezeptoren binden. Diese Rezeptoren sind durch 7 transmembranöse Domänen charakterisiert; die Signalübertragung wird durch G- Protein-Kopplung realisiert. Welchen Einfluss die einzelnen Chemokine auf die Leukozyten haben, hängt von der Expression der passenden Rezeptoren auf den Zellen ab.

Bei der größten Zytokinfamilie, den CC-Chemokinen, sind die ersten beiden Cystein-Bausteine unmittelbar benachbart. Das am besten untersuchte Chemokin dieser Gruppe ist MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), heute auch bekannt als CCL2 (CC-chemokine receptor ligand 2). CCL2 nimmt bei der Initiation der Atherosklerose durch die Rekrutierung von Makrophagen in die Gefäßintima eine bedeutende Schlüsselrolle ein (siehe dazu Abschnitt 1.3.1).

Ebenfalls zu der Gruppe der CC-Chemokine gehören RANTES, MIP-1α und MIP-1β. Diese Chemokine wirken sowohl auf Monozyten als auch auf T-Lymphozyten chemotaktisch und werden im Bereich von atherosklerotischen Läsionen exprimiert ^{54, 55}.

Tabelle 1: Wichtige humane CC-Chemokine

Neue Nomenklatur Alte Bezeichnung

CCL2 MCP-1 (Macrophage Chemoattractant Protein-1) CCL3 MIP-1α (Macrophage Inflammatory Protein-1α) CCL4 MIP-1β (Macrophage Inflammatory Protein-1β)

CCL5 RANTES (Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Regulated)

Bei der Familie der CXC-Chemokine sind die beiden ersten Cystein-Bausteine durch eine weitere Aminosäure voneinander getrennt. Im Zusammenhang mit der Atherogenese sind von ihnen GRO- α, auch bekannt als KC und IL-8 von Interesse ^{27, 56}. In die Gruppe der CXC-Chemokine gehören auch IP-10, Mig und I-TAC. Diese drei Chemokine werden unter IFN-γ Einfluss von Endothelzellen und Makrophagen in humanen atherosklerotischen Plaques exprimiert ²⁸. Sie binden an den CXCR3-Rezeptor, der von läsionalen T-Zellen exprimiert wird. Es wird angenommen, dass sie eine Rolle bei der Chemotaxis und Aktivierung der T-Zellen spielen ⁵⁷ (siehe Abbildung 5).

Tabelle 2: Wichtige humane CXC-Chemokine

Neue Nomenklatur Alte Bezeichnung

CXCL1 GRO-α (Growth-related Oncogene-α)

KC (Keratinocyte Chemokine)

CXCL8 IL-8 (Interleukin-8)

CXCL? IP-10 (IFN-γ-Inducible Protein-10) CXCL? Mig (Monokine Induced by Interferon-γ)

CXCL? I-TAC (IFN-inducible T-cell Alpha-Chemoattractant)

Zu der CX3C-Chemokin Familie gehört bislang nur das Chemokin FK (Fractalkine, neu: CX3CL1).

Bei den CX3C-Chemokinen sind die beiden ersten Cystein-Bausteine durch 3 Aminosäuren voneinander getrennt. FK ist im Gegensatz zu den anderen bekannten Chemokinen ein membranständiges Protein ⁵⁸ und dient als Adhäsionsmolekül von Monozyten, T-Lymphozyten, NK-Zellen und Dendritischen Zellen ⁵⁹. Als lösliches Chemokin wirkt es chemotaktisch auf Monozyten, NK-Zellen und T-Lymphozyten ⁵⁸. Die Rolle von FK bei der Atherogenese als Adhäsionsmolekül und Chemokin wurde in verschiedenen Studien untersucht ^60-62.

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1.3.1 Rolle der CCL2-CCR2-Interaktion für die Monozyten-Migration

Schon 1991 konnte die Expression des Chemokins CCL2 in humanen atherosklerotischen Läsionen nachgewiesen werden ⁶³. Nach heutiger Ansicht spielt CCL2 eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von frühen atherosklerotischen Läsionen durch die Rekrutierung von Monozyten in die Gefäßwand. Minimal oxidiertes LDL, schon lange als Mediator der Atherosklerose und Schaumzellentwicklung bekannt ⁶⁴, kann die CCL2 Expression von glatten Gefäßmuskelzellen und Endothelzellen induzieren ⁶⁵. Inflammatorische Zytokine und lokale Strömungseigenschaften, ebenfalls bedeutsam für die Atherogenese, nehmen zusätzlich einen Einfluss auf die Expression von CCL2 ^{66, 67}.

Mehrere Studien an transgenen Mausmodellen konnten die Bedeutung von CCL2 und dessen Rezeptor CCR2 für die Monozyten-Rekrutierung belegen. In Knochenmarks- Transplantationsstudien führte die Überexpression von CCL2 in den läsionalen Makrophagen zu einer vermehrten Atherosklerose-Entwicklung beim apoE^–/–-Mausmodell ⁶⁸. Damit einhergehend waren LDLR^–/– Mäuse, bei denen das CCL2 Gen durch Knockout ausgeschaltet wurde, weniger anfällig für Diät-Induzierte Atherosklerose und Schaumzellentwicklung ⁶⁹. Dieses Ergebnis wurde auch beim apoE^–/–-Mausmodell durch Ausschalten des CCL2 Rezeptors CCR2 erzielt ⁷⁰.

1.4 Die Akut-Phase-Reaktion und Atherosklerose

Traumata und Gewebsschädigungen, lokale Entzündungen und Inflammationskrankheiten bis hin zur Sepsis bedrohen die Homöostase des Organismus und lösen im Körper aller Säugetiere einschließlich des Menschen die Akut-Phase-Reaktion aus. Die Akut-Phase-Reaktion ist durch eine Reihe von physiologischen und biochemischen Veränderungen des Organismus charakterisiert, die der Isolierung und Neutralisierung von pathogenen Agenzien dienen. Weiterhin schützt sie den Organismus vor einem weiteren Eintritt von Pathogenen, minimiert das Ausmaß der Gewebeschädigungen und leitet Reparaturprozesse ein ^{71, 72}. Folgende Merkmale sind charakteristisch für die Akut-Phase-Reaktion: Fieber, Neutrophilie, Veränderungen im Lipid- Metabolismus, gesteigerte Glukoneogenese, erhöhter Muskelproteinmetabolismus und Aminosäuretransfer zur Leber, Aktivierung der Komplement- und Gerinnungskaskade, Veränderungen im Hormonhaushalt und Induktion von Akut-Phase-Proteinen (APP) ^{71, 72}.

Als APP bezeichnet man eine Gruppe von Proteinen, deren Plasmakonzentration bei der Auslösung der Akut-Phase-Reaktion um mindestens 25% steigt (positive APP) oder um mindestens 25% sinkt (negative APP) ⁷³. Die Konzentrationsänderungen werden dabei hauptsächlich über die hepatische Synthese der Proteine gesteuert. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die wichtigsten Akut-Phase-Proteine beim Menschen:

Tabelle 3: Wichtige Akut-Phase-Proteine

Positive Akut-Phase-Proteine Negative Akut-Phase-Proteine

Komplementfaktoren C3, C4, C5 Fibrinogen (Typ-2 APP)

Plasminogen

Antiproteasen (z.B. α-1 Protease Inhibitor) Coeruloplasmin

Haptoglobin (Typ-2 APP) Sekretorische Phospholipase A2

C-reaktives Protein (CRP) (Typ-1 APP) Serumamyloid A (SAA) (Typ-1 APP)

Albumin Transferrin Transthyretin Alpha-Fetoprotein

Thyroxin-bindendes Globulin Insulin-like growth factor I Faktor XII

Am Anfang der Akut-Phase-Reaktion stehen Monozyten und Gewebsmakrophagen, die im Bereich der Gewebeschädigung durch inflammatorische Stimuli aktiviert worden sind. Daraufhin kommt es zur Ausschüttung von primär inflammatorischen Mediatoren, von denen die IL-1- und TNF- Zytokine am bedeutendsten sind. Diese bewirken in den umliegenden Zellen die Ausschüttung von sekundären Zytokinen und Chemokinen, darunter IL-6, IL-8 und CCL2. Dadurch werden weitere Leukozyten in den Bereich der Schädigung dirigiert, die wiederum proinflammatorische Zytokine sezernieren. Somit wird durch Auslösung der Zytokinkaskade und durch die Rekrutierung von Immuneffektorzellen eine schnelle, lokale Auseinandersetzung mit dem schädigenden Einfluss ermöglicht, um die Homöostase wiederherzustellen ^{74, 75}.

Die hepatische Synthese der APP wird durch Zytokine der IL-1-Familie (IL-1α, IL-1β, TNF-α, TNF-β) und der IL-6-Familie (IL-6, LIF, IL-11, OSM, CNTF, CT-1) induziert, wobei IL-6 nach den Ergebnissen von Studien an IL-6 Knockout Mäusen eine dominierende Rolle einzunehmen scheint ⁷⁶. Baumann et al. haben 1994 eine Einteilung der APP in Typ-1 und Typ-2 Proteine vorgenommen ⁷¹. Die Einteilung erfolgte nach der Zuordnung der Proteine zu den Zytokin-Klassen, die deren Produktion induzieren konnten. Typ-1 APP werden durch Zytokine der IL-1 Familie induziert. Zu ihnen gehören z.B. SAA (Serumamyloid A) und CRP (C-Reaktives Protein). Zu den Typ-2 APP gehören z.B. Fibrinogen und Haptoglobin; sie werden hauptsächlich durch Zytokine der IL-6-Familie induziert. Neben den Typ-2 APP können die IL-6-Zytokine auch die Synthese aller anderen APP beeinflussen. So wirken IL-6- und IL-1-Zytokine synergistisch bei der Induktion der Typ-1 APP, während die IL-1-Zytokine keinen Einfluss auf die Typ-2 APP Synthese nehmen oder diese sogar hemmen ⁷¹.

Generell ist die Zuordnung der APP Typen zu den verschiedenen Zytokinklassen nur als eine vereinfachende Klassifizierung anzusehen, aus der aber nicht notwendigerweise auf die Induktion der einzelnen APP in vivo geschlossen werden kann. Zytokine wirken in vivo nicht simultan sondern in sequentieller Abfolge auf die Zielzellen ein und beeinflussen sich gegenseitig in ihrer

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Expression ⁷⁴. Zusätzlich bestimmt die Art der Schädigung, die zur Auslösung der Akut-Phase- Reaktion führt, das Muster der ausgeschütteten Zytokine und damit die Synthese von APP ^{77, 78}.

Abbildung 8: Induktion von Akut-Phase-Proteinen während der Akut-Phase-Reaktion

1.4.1 Akut-Phase-Proteine als Risikoprädiktoren von kardiovaskulären Erkrankungen APP wie CRP und SAA sind aussagekräftige und beständige Inflammationsmarker, die mit der Inzidenz von kardiovaskulären Ereignissen, z.B. Myokardinfarkt, Schlaganfall, peripher arterieller Verschlusskrankheit (pAVK) und plötzlichem Herztod assoziiert sind. Diese Assoziation konnte sowohl bei gesunden Individuen als auch bei Patienten mit Koronarer Herzkrankheit (KHK) beobachtet werden ^{79, 80}. Bei klinisch stabilen Patienten, die in ihrer Vergangenheit schon einen Herzinfarkt erlitten haben, können die Messung von CRP und SAA zur Risikoeinschätzung von erneuten kardiovaskulären Ereignissen beitragen ⁸¹. Die „American Heart Association“ (AHA) und die „Centers for Disease Control and Prevention“ (CDC) empfehlen in einer Stellungnahme von 2003 die Messung von CRP als Risikomarker für die Entwicklung von kardiovaskulären Erkrankungen bei Patienten mit erhöhtem kardiovaskulärem Risiko ⁸².

Darüber hinaus stehen die Konzentrationen von CRP und SAA im Serum im engen Zusammenhang mit traditionellen Risikofaktoren von kardiovaskulären Erkrankungen. So konnten erhöhte CRP- und SAA-Werte bei Patienten mit Metabolischem Syndrom, Übergewicht, Insulin- Resistenz und Diabetes gefunden werden. Erhöhte CRP-Konzentrationen konnten weiterhin bei Patienten mit Bluthochdruck, Hypertriglyceridämie und Nikotinabusus beobachtet werden ⁸³.

Entzündung, Infektion, Trauma

Akut-Phase-Reaktion

Makrophagen

Zytokine: IL-1, TNF, IL-6

Transkription ↑

Expression ↑

Akut-Phase-Proteine

1.4.2 Das Akut-Phase-Protein SAA und seine Rolle bei der Atherogenese

Zu der SAA Familie gehören eine Reihe unterschiedlich exprimierter Apolipoproteine, die an HDL (High Density Lipoprotein)-Partikel gebunden im Blut zirkulieren. Abhängig von ihrer Induktion durch inflammatorische Stimuli werden sie in zwei Klassen eingeteilt: Akut-Phase Serum Amyloid A (A-SAA) und Constitutive Serum Amyloid A (C-SAA). Die A-SAA Apolipoproteine können bei allen Vertebraten gefunden werden und werden hauptsächlich in der Leber während der Akut-Phase-Reaktion synthetisiert (siehe dazu Abschnitt 1.4). Dabei kann die SAA- Konzentration im Plasma um bis auf das 1000-fache gesteigert werden. Die Struktur der A-SAA Proteine wurde während der Evolution kaum verändert und deutet auf eine wichtige Rolle bei der Akut-Phase-Reaktion hin. C-SAA Proteine wurden bisher beim Menschen und bei der Maus gefunden. Sie werden unabhängig von inflammatorischen Stimuli ebenfalls in der Leber synthetisiert, ihre Konzentration steigt während der Akut-Phase-Reaktion jedoch nur minimal an ⁷⁴. Beim Menschen besteht die SAA Multigenfamilie aus vier Genen (SAA1 bis SAA4), die sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 befinden. Bei der Maus wurden auf dem Chromosom 7 fünf SAA Gensequenzen (SAA1 bis SAA4 und SAA-ps1) identifiziert. Die SAA1 und SAA2 Gensequenzen kodieren für die A-SAA Proteine SAA1 bzw. SAA2, die von der Leber während der Akut-Phase-Reaktion synthetisiert werden. Dabei ersetzen die A-SAA Apolipoproteine das in HDL- Partikeln während inflammatorischen Zuständen vorherrschende Apolipoprotein A-1 (ApoA-1). Das SAA4-Gen kodiert für das C-SAA Protein SAA4 und wird von der Leber konstitutiv exprimiert. Das Apolipoprotein SAA4 ist ein Bestandteil von normalen und Akut-Phase HDL-Partikeln. Bei der Maus kodiert die SAA3 Sequenz für das A-SAA Protein SAA3. Im Unterschied zu SAA1 und SAA2 wird es aber nicht überwiegend hepatisch sondern hauptsächlich extrahepatisch von Adipozyten und Makrophagen synthetisiert. Beim Menschen ist SAA3 wie bei der Maus SAA-ps1 ein Pseudogen und wird nicht transkribiert ⁷⁴. Humanes SAA1, SAA2 und SAA4 kann neben der Leber auch aus extrahepatischen Quellen stammen. So wurde sowohl A-SAA als auch C-SAA mRNA in den Zellen von atherosklerotischen Läsionen gefunden ^{84, 85}.

Durch neuere in vivo und in vitro Studien konnten mehrere Funktionen von SAA identifiziert werden, die in den Mechanismus der Atherogenese eingreifen und die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen forcieren können. Als von der Leber synthetisiertes Apolipoprotein in HDL Partikeln übt A-SAA einen Einfluss auf den Lipid- und Cholesterinmetabolismus aus. HDL wirkt atheroprotektiv durch Inhibition der LDL Oxidation, die zur Schaumzellbildung beiträgt, und durch Förderung des Cholesterin- und Phospholipidefflux von Makrophagen in der Arterienwand.

Die atheroprotektiven Mechanismen von HDL werden unter Einfluss von A-SAA vermindert. So vermindert die Präsenz von A-SAA in HDL-Partikeln die Cholesterinaufnahme von HDL-Partikeln und die protektive Wirkung gegen LDL-Oxidation ^{74, 86}. In anderen in vitro Studien wurden Hinweise gefunden, die auf eine chemotaktische Funktion von SAA für Immunzellen wie Monozyten,

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polymorphonukleäre Leukozyten und T-Zellen hindeuten ^{87, 88}. Über die Induktion von Matrix- Metalloproteinasen übt SAA möglicherweise auch einen Einfluss auf die Stabilität von atherosklerotischen Plaques aus und trägt so zur Plaqueruptur bei ^{83, 89, 90}. Weitere Hinweise, dass SAA eine Rolle bei der Atherogenese spielt, wurden in einer Studie mit LDLR^–/–-Mäusen gefunden.

Durch Fütterung einer fett- und cholesterinreichen Diät stieg die SAA-Serumkonzentration signifikant und korrelierte mit dem Ausmaß der atherosklerotischen Läsionen in der Aortenwurzel ⁹¹.

1.5 Das Mausmodell

1.5.1 Die Apolipoprotein E Knockout (apoE^–/–)-Maus als Tiermodell der Atherosklerose Zur Erforschung der Pathogenese und potentiellen Therapie der Atherosklerose stehen heutzutage mehrere Mausmodelle zur Verfügung ⁹². Mausmodelle zeichnen sich durch die geringe genetische interindividuelle Varianz der einzelnen Tiere bei Inzuchtstämmen und durch die schnelle Zuchtfolge aus ⁹³. Das Genom des C57BL/6J Mausstammes ist seit 2002 sequenziert und ermöglicht dadurch das Ausschalten (Knockout) oder das Einfügen (Knockin) von bestimmten Genen ⁹⁴. Die bedeutendsten und am meisten verwendeten Mausmodelle in der Atherosklerose- Forschung sind die Apolipoprotein E-defiziente Maus (apoE^–/–-Maus) und die LDL-Rezeptor- defiziente Maus (LDLR^–/–-Maus), die durch gezielte genetische Manipulation generiert worden sind ^{95, 96}.

Apolipoprotein E (ApoE) ist ein hauptsächlich in der Leber und im Gehirn synthetisiertes Glykoprotein. Es ist mit der Ausnahme von LDL Partikeln als strukturelle Komponente in allen Lipoprotein Partikeln zu finden und spielt daher eine zentrale Rolle im Fettstoffwechsel. Als hoch affiner Ligand für den hepatischen ApoE/ApoB-Rezeptor und für den Chylomikronen-Rezeptor ermöglicht ApoE die Aufnahme von ApoE-haltigen Lipoproteinen in die Leber ⁹⁷. Wichtige anti- atherogene Funktionen sind die Homöostase des plasmatischen Cholesterinspiegels und Förderung des Cholesterin-Efflux von läsionalen Schaumzellen. Weiterhin modifiziert ApoE die von Makrophagen und T-Zellen in der Gefäßwand ausgelöste Immunreaktion, die für die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen verantwortlich ist ⁹⁸.

ApoE^–/–-Mäuse weisen in der Entwicklung der Atherosklerose eine hohe Ähnlichkeit zu humanen Veränderungen auf. Der plasmatische Cholesterinspiegel ist, wie beim Menschen, von der Diät abhängig und lässt sich durch eine lipid- und cholesterinreiche so genannte Western Diät steigern.

Ein hoher Cholesterinspiegel beschleunigt und verstärkt das Auftreten von atherosklerotischen Veränderungen. Aber auch unter Normaldiät entwickeln die Tiere ab einem Alter von 10 Wochen erste atherosklerotische Läsionen ⁹⁹. Die Entwicklung der atherosklerotischen Läsionen ist mit den Stadien der Plaqueentwicklung beim Menschen vergleichbar. Als erste sichtbare Veränderungen

bilden sich fatty streaks, die sich bis zu fortgeschrittenen Läsionen mit Bildung einer stabilen fibrösen Kappe weiterentwickeln können ⁹⁹. Instabile Plaques und Plaqueruptur können dagegen nicht oder nur selten beobachtet werden ⁹².

1.5.2 Die Zytokinrezeptor-Untereinheit gp130

Die Zytokine der IL-6-Zytokinfamilie sind bedeutende Mediatoren der Akut-Phase-Reaktion und regulieren die hepatische APP-Synthese ⁷⁶ (siehe Abschnitt 1.4). Zu den IL-6-Zytokinen rechnet man IL-6, IL-11, LIF (leukaemia inhibitory factor), OSM (oncostatin M), CNTF (ciliary neurotrophic factor), CT-1 (cardiotrophin-1) und CLC (cardiotrophin-like cytokine). Um ihre Wirkung zu erzielen, binden die Zytokine an zellmembrangebundene Rezeptoren, die die intrazelluläre Signalkaskade aktivieren. Diese Rezeptoren setzen sich aus verschiedenen Signaltransduktions-Untereinheiten zusammen: einer Glykoprotein 130 (gp130)- Polypeptidkette, dem LIF-Rezeptor (LIFR) und dem OSM-Rezeptor (OSMR). Alle Rezeptoren der IL-6 Zytokinfamilie enthalten mindestens eine gp130- Untereinheit; die weitere Zusammensetzung aus den verschiedenen Untereinheiten bestimmt, welches Zytokin der IL-6-Familie die Rezeptoren binden ¹⁰⁰ (siehe Abbildung 9).

Abbildung 9: Rezeptorkomplexe der IL-6-Zytokinfamilie. Die transmembranöse Signalübertragung erfolgt über verschiedene Kombinationen der Signaltransduktions-Untereinheiten gp130, LIFR und OSMR. Das Glykoprotein 130 (gp130) ist bei allen Rezeptoren der IL-6 Zytokinfamilie an der Signaltransduktion beteiligt (aus: ¹⁰⁰).

1.5.3 Die gp130 Knockout Maus

Gp130 ist eine entscheidende Komponente bei der Signaltransduktion der IL-6-Zytokine (siehe Abschnitt 1.5.2). Bisher durchgeführte Studien mit IL-6 Knockout Tieren haben im Hinblick auf die Atherosklerose-Entwicklung keine oder unerwartete Veränderungen im vaskulären Phänotyp gezeigt ^{101, 102}. Dieses wurde unter anderem darauf zurückgeführt, dass die Wirkung von IL-6 durch

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andere Mitglieder der IL-6-Zytokinfamilie, die ebenfalls an die Rezeptorkomponente gp130 binden, substituiert werden kann ^{78, 102}.

Tiere mit systemischem gp130 Knockout sterben in utero oder direkt nach der Geburt und zeichnen sich durch Wachstumsretardierung, Myokardhypoplasie, verminderte Hämatopoese in der fetalen Leber und erhöhte Osteoklastenzahlen aus ^{103, 104}. Um den Einfluss des gp130 Knockouts auf chronische Krankheitsprozesse wie die Atherosklerose in vivo zu erforschen, muss die Maus im Vergleich zu den Kontrollen ohne Knockout einen normalen Phänotyp und ein unbeeinträchtigtes Überleben aufweisen. Möglich wird dies durch den Einsatz des Cre/LoxP Rekombinationssystems, mit dem sich bei der Maus Gene gewebe- und/oder zeitspezifisch ausschalten lassen ¹⁰⁵. Dazu wird die gewünschte Genregion mit zwei loxP-Sequenzen markiert, die die Funktion des Gens nicht beeinflussen, und anschließend durch Bindung der DNA- Rekombinase Cre an die markierten Abschnitte aus dem Genom deletiert. Die Expression der Cre- Rekombinase kann dabei organ- und zeitspezifisch aktiviert werden, je nachdem an welchen Genpromotor das cre-Transgen gekoppelt ist. Für die Generation einer hepatozytenspezifischen gp130 Knockout-Maus wurde das gp130 Gen mit zwei loxP Sequenzen flankiert (auch gefloxt genannt) und die Cre-Rekombinase unter die Kontrolle des hepatozytenspezifischen Albumin- Promotors gestellt (alb-cre) ^{106, 107}. Dadurch wurde die gp130 Gensequenz ab dem 10. Tag post- gestationem aus dem Genom der Hepatozyten deletiert, während die restlichen Zellen des Organismus unbeeinträchtigt blieben und weiterhin die gp130 Gensequenz aufwiesen ¹⁰⁸.

alb-cre

gp130 loxP („gefloxt“)

cre-Rekombinase Albumin-

Promotor

Abbildung 10: Konditionaler gp130 Knockout. Das Exon 16 des gp130-Gens ist durch zwei loxP-sites flankiert. Die Cre-Rekombinase wird abhängig vom Albumin-Promotor exprimiert und anschließend aktiviert. Der gp130 Knockout erfolgt dann durch die Deletion des Exons 16 zwischen den loxP-sites durch die Cre-Rekombinase.

1.6 Herleitung der Fragestellung

Akut-Phase-Proteine wie CRP und SAA sind aussagekräftige Inflammationsmarker, die mit dem Auftreten von kardiovaskulären Ereignissen, wie Myokardinfarkt, plötzlichem Herztod, Schlaganfall und peripherer arterieller Verschlusskrankheit (pAVK) assoziiert sind und als Risikomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen beim Menschen angewandt werden (siehe Abschnitt 1.4.1). In neueren Studien konnten Hinweise gefunden werden, dass die Akut-Phase-Proteine z.B. durch ihre Beteiligung im Lipid-Metabolismus, auch einen direkten Einfluss auf die Atherogenese nehmen (⁸³, siehe auch Abschnitt 1.4.2). Die pathophysiologische Rolle der Akut-Phase-Proteine bei der Entstehung der Atherosklerose ist aber noch ungeklärt und Gegenstand aktueller wissenschaftlicher Forschung.

Daher sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht werden, welchen Einfluss die durch die Akut-Phase-Reaktion sezernierten Akut-Phase-Proteine auf die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen ausüben. Dazu wurde ein ApoE und leberspezifisch gp130 defizientes Mausmodell einer atherogenen Diät ausgesetzt und die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen mit zwei Kontrollgruppen ohne gp130 Knockout verglichen.

2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Narkotika

2-Propanol (Isopropanol) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Agarose A und G Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

β-Mercaptoethanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

BSA (Bovine Serum Albumine) Boehringer Mannheim GmbH, Penzberg, Deutschland

Bromphenolblau E. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Chloroform E. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

DTT (Dithiothreitol) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

Eisessig Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Ethanol Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

EDTA (Ethylen-diamin-tetra-essigsäure) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

dNTP-Set (100 mM) Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland FCS (Fetal Calf Serum) BioWest S.A.S, Nuaillé, Frankreich

Glycerol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

H2O ad injectibila B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschl.

H2O2 Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Haematoxylin Solution Gill No.1 (Sigma Accustain) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

KCl Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

KH2PO4 Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Ketanest S (25 mg/ml Ketamin) Pfizer Pharma GmbH, Karlsruhe, Deutschland

MgCl2 25 mM Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

NaCl Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Niederlande

Na2HPO4 Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Tissue-Tek O.C.T. Einbettmedium Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Niederlande Ölrot O (Solvent Red 27) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

PCR-Puffer (10-fach) Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Rompun 2% (Xylazin)  Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland

Xylen-Cyanol FF Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

2.2 Enzyme, Basenpaarleitern

Elastase, aus Schweinepankreas, 1250 U/ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschl.

Kollagenase CLSII, 293 U/mg Biochrom AG, Berlin, Deutschland Superscript Polymerase Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Taq DNA-Polymerase Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland 1 kb-Leiter (75 bp–12.216 bp) Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

2.3 Inhibitoren und Aktivatoren

Name Funktion Konzentration Firma

LIF (Recombinant Mouse Leukaemia

Inhibitory Factor) Zytokin der IL-6 Familie 10 µg/ml Chemicon Heparin (Liquemin N 25.000) Hemmung der

Gerinnungskaskade

5.000 I.E./ml Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland MCP-1 (Recombinant Mouse JE) CCR-2 Rezeptor Agonist 100 ng/µl BioSource International,

Camarillo, USA SAA (Recombinant Human apo-SAA) Akut-Phase-Protein 1 µg/µl Peprotech Inc., Rocky Hill, USA Kaninchenserum

(Normal Rabbit Serum S-5000) Blockiert unspezifische Antigene bei der Immunhisto

4 %ig Vector Laboratories, Burlingame, USA

2.4 Antikörper

Antikörper Firma Wirt

MOMA-2, monoklonales anti-Maus IgG Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland

Ratte Anti-Ratte IgG, biotinyliert Linaris Biologische Produkte GmbH,

Wertheim, Deutschland

Hase

2.5 Reagenzien, Puffer, Lösungen und Zellkulturmedien

Name Bestandteil Konzentration

AEC Substrate Chromogen Dako Cytomation, Carpinteria, USA

Ready-to-use DEPC-H2O

Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Diethylpyrocarbonat (DEPC) 0,1% (w/v) DNA-Probenpuffer für Agarose-

Gelelektrophorese Glycerol

EDTA

Bromphenolblau Xylen/Zyanol

50% (v/v) 100 mM 0,25% (w/v) 0,25% (w/v) DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)

Biochrom AG, Berlin, Deutschland

NaHCO3

D-Glukose L-Glutamin

3,7 g/l 1,0 g/l 1,028 g/l EDTA-Krebs-Ringer-Lösung (pH-Wert 7,4) NaCl

KCl D-Glukose NaHCO3

HEPES 1 M EDTA

9 g/l 0,42 g/l 0,99 g/l 2,1 g/l 20 ml 10ml PBS (Phosphate buffered saline) Na2HPO4

KH2PO4

NaCl KCl

10 mM 1,7 mM 136 mM 2,6 mM Penicillin/Streptomycin

Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Penicillin

Streptomycin 100 U/ml

10 µg/ml PeqGOLD TriFast RNA-Extraktionslösung

Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland

Guanidinisothiocyanat Phenol

RPMI 1640 Medium

Biochrom AG, Berlin, Deutschland L-Glutamin

D-Glukose 2 mM

4,5 g/l Solution A (Lysepuffer) Sterilfiltriertes dest. H2O

Tris, pH-Wert 8

0,5 M EDTA, pH-Wert 8 NaCl 1M

SDS 1%

132 ml 12 ml 48 ml 24 ml 24 ml

50x TAE Tris-HCL, pH 8,2

EDTA Eisessig

40 mM 2 mM 20 mM Trypanblau-Lösung (0,4%)

Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, Deutschland Trypsin/EDTA

Vectastain ABC Kit Elite PK-6100 Vector Laboratories, Burlingame, USA

Streptavidin

Biotinylierte Peroxidase