ORGANIC REACTIVITY
Vol. XXIII
IS S U E 3 ( 8 3 )
September 1986
TARTU STATE UNIVERSITY
ORGANIC REACTIVITY
Vol. XXIII ISSUE 3 ( 83 ) September 1986
TARTU
The Editorial Board:
V. Palm, Editor-in-Chief V.I. Minkin
A.P. Popov I.A. Koppel M.M. Karelson
Title of original:
Реакционная способность органических соединений.
Том ХХШ, вып. 3(83), Сентябрь 1986.
Тартуский государственный университет.
М
i m o t u k o g u j
9J.A9
O r g a n i c R e a c t i v i t y V o l • 2 3 3 ( 8 3 ) 1 9 8 6
D E P E N D E N C E O F T H E I N H I B I T O R L E A V I N G G R O U P E F F E C T O N T H E S T R U C T U R E O F ITS P H O S P H O R Y L P A R T IN T H E R E A C T I O N O F C H Y M O T R Y P S I N W I T H O - n - A L K Y L M E T H Y L P H O S P H O N I С A C I D T H I O E S T E R S
P . F . S i k k , M . M . P e i p s , V .S .A b d u k a k h a r o v , A . A . A b d u v a k h a b o v a n d A .A .A a v i k s a a r I n s t i t u t e o f C h e m i c a l P h y s i c s a n d B i o p h y s i c s o f t h e E s t o n i a n S S R A c a d e m y o f S c i e n c e s , T a l l i n n
I n s t i t u t e o f B i o o r g a n i c C h e m i s t r y o f t h e U z b e k S S R A c a d e m y o f S c i e n c e s , T a s h k e n t
Received August 26, 1986
It is s h o w n t h a t t h e i n f l u e n c e o f t h e s t r u c t u r e o f t h e a l i p h a t i c l e a v i n g g r o u p - S X in t h i o p h o s p h o n a t e s
( C 2 H 5 0) ( C H 3 ) P ( 0 ) S X (I) a n d ( n - C ^ H ^ O ) ( C H 3 ) P ( 0 ) S X ( I I ) ,
„ h e r e X - - C n H 2 n t , a n d - ( C H ^ S C ^ , , u p o n t h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e i n h i b i t i o n o f C h y m o t r y p s i n a c t i v i t y c a n b e d e s c r i b e d b y t h e e q u a t i o n
l o g k. * l o g к. + p о # * + фП, w h e r e b o t h t h e i n d u c t i v e
I 1 , 0
e f f e c t a n d t h e h y d r o p h o b i сi t y o f X a r e c o n s i d e r e d . T h e s u b s t i t u t i o n o f t h e e t h y l g r o u p in (I) f o r n - h e x y l in ( I I ) r e s u l t e d in a c h a n g e in t h e f o r m o f t h e d e p e n d e n c e o f t h e r e a c t i o n r a t e u p o n t h e l e a v i n g g r o u p h y d r o p h o - b i c i t y , a n d a d e c r e a s e in p . T h e d a t a p o i n t t o e l e c t - r o p h i l i c s o l v a t i o n o f t h e r e a c t i o n c e n t e r o f t h e i n h i b i t o r in t h e " o x y a n i o n h o l e " o f t h e e n z y m e a s a r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n o f t h e n - h e x y l c h a i n o f (II) w i t h t h e h y d r o p h o b i c b i n d i n g p o c k e t in t h e C h y m o t r y p s i n a c t i v e s i t e .
251
T h e H a m m e t t p v a l u e f o r t h e l e a v i n g g r o u p e f f e c t in a - c h y m o t r y p s i n - c a t a1y z e d h y d r o l y s i s o f a r o m a t i c e s t e r s u b s t
r a t e s h a s b e e n s h o w n t o d e p e n d o n t h e s t r u c t u r e o f t h e a c y l p o r t i o n o f t h e c o m p o u n d s . T h u s , t h e v a l u e s o f p = 0 . 4 5 a n d
1 9 О. 63 h a v e b e e n o b t a i n e d f o r N - a c y l a m i n o a c i d d e r i v a t i v e s ’ w h e r e a s t h e h i g h e r v a l u e p = ~ 2 h a s b e e n d e t e r m i n e d in a s e r i e s o f p h e n y l a c e t a t e s ’ .
It h a s b e e n s u g g e s t e d b y W i l l i a m s t h a t t h e l o w p v a l u e s in t h e a c y l a t i o n o f C h y m o t r y p s i n ( C T ) b y a m i n o a c i d s u b s t r a t e s a r e d e t e r m i n e d b y e1e c t r o p h i1iс a s s i s t a n c e o f t h e f o r m a t i o n o f t e t r a h e d r a l t r a n s i t i o n s t a t e b y h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n t h e o x y a n i o n , d e v e l o p e d f r o m t h e c a r b o n y l g r o u p o f t h e s u b s t r a t e , a n d t h e b a c k b o n e N H g r o u p s o f G l y 1 9 3 a n d S e r 1 9 5 o f t h e e n z y m e , I . e . t h e o x y a n i o n h o l e ^ ’^. A l t e r n a t i v e l y , h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n t h e e n z y m e N H g r o u p s a n d t h e s u b s t r a t e l e a v i n g g r o u p o x y g e n h a s b e e n p r o p o s e d .2
B y a n a l o g y w i t h n o n - e n z y m i c n u c l e o p h i l i c d i s p l a c e m e n t a t t h e t e t r a h e d r a l p h o s p h o r u s in 0,0- d i a l k y l p h o s p h a t e s a n d
7 8
O - a l k y l a 1k y1p h o s p h o n a t e s ' ’ it is r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t t h e r e a c t i o n o f o r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s (R Q ) ( C H ^ )P (0)SX w i t h C T p r o c e e d s via t h e d i r e c t d i s p l a c e m e n t a s w e l l , a n d t h e P * 0 d o u b l e b o n d is n o t a f f e c t e d b y t h e p r o c e s s . T h e p v a l u e o f t h e r e a c t i o n s h o u l d t h e n b e p r i m a r i l y a f f e c t e d b y t h e s o l v a t i o n o f t h e i n h i b i t o r l e a v i n g g r o u p r a t h e r t h a n t h e P = 0 b o n d . H e n c e it is o f i n t e r e s t t o s t u d y w h e t h e r t h e l e a v i n g g r o u p i n d u c t i v e e f f e c t in t h e r e a c t i o n o f C T w i t h t h e s e c o m p o u n d s d e p e n d s o n t h e s t r u c t u r e o f t h e i r p h o s p h o r y l p a r t . T o c l a r i f y t h i s q u e s t i o n w e h a v e s t u d i e d t h e k i n e t i c s o f t h e r e a c t i o n o f C T w i t h t w o s e r i e s o f t h e i n h i b i t o r s
( R O ) ( C H j ) P ( 0 ) S X . In t h e s e r i e s ( I ) , t h e s u b s t i t u e n t R - ”^ 2 H 5 * S t 0 ° s h o r t f o r b i n d i n g in t h e h y d r o p h o b i c p o c k e t in t h e a c t i v e s i t e o f C T w h e r e a s t h e n - h e x y l g r o u p a s R in t h e s e r i e s ( II) is o f o p t i m a l l e n g t h f o r b i n d i n g in t h i s p o c k e t 1 0 .
T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e a c t i v e s i t e o f C T b y t h e a b o v e c o m p o u n d s a r e l i s t e d
in T a b l e 1. F i g u r e 1 s h o w s t h e d e p e n d e n c e o f l o g k. u p o n t h e s u b s t i t u e n t h y d r o p h o b i сi t y c o n s t a n t f o r t h e i n h i b i t o r s o f t h e s e r i e s (I) w i t h n - a l k y l c h a i n in t h e l e a v i n g g r o u p . It c a n b e s e e n t h a t , u p t o t h e l e n g t h o f n o r m a l h y d r o c a r b o n c h a i n w i t h n * 9» a l i n e a r r e l a t i o n s h i p
l o g к, = С + ФПХ (1)
h o l d s f o r t h e s e r i e s w h i c h p o i n t s t o h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e l e a v i n g g r o u p o f t h e i n h i b i t o r s a n d t h e e n z y m e s u r f a c e . T h e h y d r o p h o b i сi t y c o n s t a n t s П w e r e c a l c u l a t e d b y a d d i t i v e s c h e m e 11 u s i n g t h e v a l u e 0 . 5 0 f o r m e t h y l a n d m e t h y l e n e g r o u p s .
in ( I I ) . l o g kj f o r t h e c o m p o u n d s w i t h n - a l k y l g r o u p s in t h e i r l e a v i n g p a r t - i n c r e a s e in a c c o r d a n c e w i t h E q . (1) o n l y u p t o X = - C ^ H g - n . F u r t h e r i n c r e a s e in t h e c h a i n l e n g t h
( f r o m n = k t o 7) d o e s n o t r e s u l t in a n y c o n s i d e r a b l e c h a n g e in l o g k. v a l u e s ( s e e F i g . 2 ) . A p p a r e n t l y , in t h e s e r i e s o f i n h i b i t o r s in w h i c h t h e l e n g t h o f t h e s u b s t i t u e n t in t h e i r a c i d m o i e t y is o p t i m a l f o r t h e i n t e r a c t i o n w i t h t h e h y d r o - p h o b i c p o c k e t in t h e a c t i v e s i t e o f C T , t h e i n t e r a c t i o n o f t h e i r l e a v i n g g r o u p w i t h t h e e n z y m e a c t i v e surface appea rs o n l y if i t s l e n g t h d o e s n o t e x c e e d t h a t o f и- b u t y l r a d i c a l .
In c a l c u l a t i o n o f ф- c o e f f i сi e n t s f o r t h e s e r i e s (I) a n d ( I I ) t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n
X * *
l o g к. = С + p a Y + фП , (2)
1 * * x *
w h e r e t h e t e r m p a c c o u n t s f o r t h e l e a v i n g g r o u p i n d u c t i v e e f f e c t , w a s u s e d . In t a k i n g i n t o a c c o u n t t h e i n d u c t i v e effect o f s u b s t i t u e n t X w e h a v e a p p l i e d t h e s c a l e o f a* c o n s t a n t s in w h i c h a n i n f i n i t i v e l y l o n g p o l y m e t h y l e n e c h a i n is c o n s i d e r e d a s t h e r e f e r e n c e s u b s t i t u e n t w i t h о ■ O 1 2 ’1 ^. T h i s e n a b l e s o n e t o t r e a t t h e a l k y l a n d e l e c t r o n e g a t i v e s u b s t i t u e n t s in a c o m m o n s e r i e s . T h e a v a l u e s for the s u b s t i t u e n t s - ( C H 0 ) SC H w e r e e q u a l i z e d w i t h a f o r t h e s u b s t i t u e n t s
^ m n "* * •
~ ^ C H 2 ^ m S C 2 H 5 C o n s i d e r i n g t h a t in t h e s e r i e s (II) o n l y t h e f r a g m e n t o f t h e l e a v i n g g r o u p w i t h t h e l e n g t h n o t e x c e e d i n g t h e l e n g t h o f t h i o b u t y l c h a i n c a n i n t e r a c t w i t h t h e e n z y m e a c t i v e s u r f a c e , t h e " e f f e c t i v e " П v a l u e s f o r X
253
h a v e b e e n u s e d f o r t h e s e c o m p o u n d s ( s e e T a b l e 1). T h e П c o n s t a n t s f o r t h e s u b s t i t u e n t s - ( C H „ ) S C , w e r e c a l c u l a t e d
z m n Z n + 1
b y a d d i t i v e s c h e m e m a k i n g u s e o f t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t o f d i e t h y l s u l f i d e in t h e o c t a n o l - w a t e r s y s t e m 1 1 .
T h e p a r a m e t e r s o f t h e c o r r e l a t i o n o f l o g k. w i t h a a n d П a c c o r d i n g t o E q. (2) a r e g i v e n in T a b l e 2. It is e v i d e n t
f r o m t h e T a b l e t h a t t h e v a l u e s o f <p a r e c l o s e in t w o s e r i e s
*
o f t h e i n h i b i t o r s w h e r e a s t h e p v a l u e in t h e s e r i e s (II) w i t h R ■ ~ C g H1 в"n * s 1 * 5 t i m e s l e s s t h a n in t h e s e r i e s (I) w i t h R - -1*2Н5 ’ ancl c o i n c i ( *e s w ' t h p f o r a l k a l i n e h y d r o l y
s i s o f t h e c o m p o u n d s ( R O ) (CH ) P ( 0 ) S X in w a t e r 11*.
j *
T h e o b s e r v e d d e c r e a s e in p f o r t h e r e a c t i o n o f C T w i t h t h e i n h i b i t o r s (и-С^Н^О) ( C H j ) P ( 0 ) S X c o u l d b e e x p l a i n e d a s s u m i n g t h a t t h e c o n v e r s i o h o f t h e i n i t i a l c o m p l e x o f t h e e n z y m e w i t h t h e s e i n h i b i t o r s p r o c e e d s in a c c o r d a n c e w i t h t h e f o l l o w i n g s c h e m e :
Eft [ EQ)
In t h e p r o p o s e d s c h e m e , t h e o r i e n t a t i o n o f t h e a l k o x y c h a i n R O - is a s s u m e d t o r e m a i n u n c h a n g e d in t h e i n i t i a l c o m p l e x E Q , t r a n s i t i o n s t a t e [ E Q ] * a n d p h o s p h o r y 1 a t e d e n z y m e E Q 1 . T h e l e a v i n g g r o u p o f t h e i n h i b i t o r is d i r e c t e d t o w a r d s t h e p o s i t i v e e n d s o f t h e p e p t i d e b o n d d i p o l e s M e t 1 9 2 - G 1 у 1 9 3 a n d S e r 1 9 5 - G 1 у 1 9 6 , i . e . t o w a r d s t h e o x y a n i o n h o l e . T h e i n t e r a c t i o n o f t h e d i p o l e s w i t h t h e l e a v i n g g r o u p in t h e b i - p y r a m i d a l t r a n s i t i o n s t a t e [ E Q ] * , in w h i c h t h e P = 0 , P - 0 a n d P -С b o n d s a r e l o c a t e d o n t h e s a m e p l a n e , p r o v i d e s t h e s o l v a t i o n o f t h e n e g a t i v e c h a r g e o n t h e l e a v i n g g r o u p s u l f u r a t o m . In t h e p h o s p h o r y 1 a t e d e n z y m e E Q 1 , t h e P = 0 g r o u p is o . i e n t e d a s t h e l e a v i n g g r o u p in t h e i n i t i a l n o n c o v a l e n t c o m p l e x . T h e b i n d i n g o f a l k y l c h a i n in t h e h y d r o p h o b i c
254
T a b l e 1 T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e r e a c t i o n o f a - c h y m o t r y p s i n w i t h 0 - n - a 1 k y 1 - S - a 1 k y 1 m e t h y l t h i o p h o s p h o n a t e s ,
( R O ) ( C H 3 ) P ( 0 ) S X . T e m p e r a t u r e 2 5 - 0 - 0.1°C, p H 7 . 6 0 - 0 . 0 2 , p h o s p h a t e o r N a - v e r o n a l - H C 1 b u f f e r s o l u t i o n s , у = 0 . 0 5 » 0 - 0 . 8 % ( v / v ) a c e t o n i t r i l e
N o X k . , M' -1
s *
^ X
c)
* e f f R = -
‘i V ’ R = ' C 6 H 13
. „ Ю °x
1 " C 2 H 5 4 . 0 1 0 _l* 0 . 7 7 0 . 0 6 7 1 .0 1 .0
2 • C 3 V ” 4 . 7 ю " 2* 0 . 8 6 0 1 . 5 1 .5
3 - < W « 7 . 3 10 1 . 6 6 0 2 . 0 2 . 0
4 - С5 Н1 Г ” 1 . 4 i o " 3 1 . 5 5 0 2 . 5 2 . 0
5 ' C 6 H 1 3 " n 2 . 3 i o " 3 - 0 3 . 0 -
6 - C 7 H 1 5 - n 3 . 4 i o -3 1 . 7 2 0 3 . 5 2 . 0
7 - C 9 H 1 9 - » 1 .0 i o " 2 - 0 4 . 5 -
8 - C H 2 S C 2 H 5 3 . 6 t o “2 1 4 . 9 0 . 5 6 1 . 4 5 1 . 4 5
9 - ( C H 2 ) 2 S C 2 H 5 6 . 1 i o " 3 3 . 7 6 0 . 2 8 1 . 9 5 1 . 4 5
10 - ( C H 2 ) 2 S C 3 H 7 - M 1 . 2 i o " 2 - 0 . 2 8 2 . 4 5 -
11 - ( C H ^ S C ^ - n 1 . 4 i o -2 - 0 . 2 8 2 . 9 5 -
12 - (c h2 ) 3s c2h5 3 . 8 i o " 3 - 0 . 1 4 2 . 4 5 -
13 - (c h2 ) „s c2h5 3 . 2 i o -3 4 . 1 6 0 . 0 7 2 . 9 5 2 . 0
14 - ( C H 2 ) 5 S C 2 H 5 5 . 8 i o " 3 - 0 . 0 3 5 3 . 4 5 -
15 “( C H 2 ) 6 S C 2 H 5 2 . 6 8 0 . 0 1 8 3 . 9 5 2 . 0
M e a n e x p e r i m e n t a l e r r o r in k. - 1 0 Ž .
b ) *
M e a n e x p e r i m e n t a l e r r o r in k. - i\%.
c ) E f f e c t i v e П- c o n s t a n t s f o r t h e s e r i e s ( I I ) w i t h R = - C6H i3- n * s e e t e x t .
p o c k e t e n s u r e s t h e p r o p e r o r i e n t a t i o n o f t h e l e a v i n g g r o u p t o w a r d s t h e t w o p e p t i d e b o n d d i p o l e s t h u s c r e a t i n g a p o l a r ( e l e c t r o p h i 1 iс) m i c r o e n v i r o n m e n t in t h e v i c i n i t y o f t h e s c i s s i b l e b o n d , w h i c h is c o m p a r a b l e w i t h t h a t o f w a t e r m e d i u m . B y t h e i n t e n s i t y o f t h e l e a v i n g g r o u p i n d u c t i v e e f f e c t ,
255
- 2.0
-2.5
-ao
-3.5
F i g . 1. D e p e n d e n c e o f t h e l o g a r i t h m s o f t h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e r e a c t i o n o f a - c h y m o t r y p s i n w i t h 0 - i e t h y l - S - a l k y l m e t h y l th i o p h o s p h o n a t e s
( C 2 H 5 0) ( C H 3 ) P ( 0 ) S X , X = - C n H 2 n + | , u p o n П- p a r a m e t e r s o f X. F o r t h e c o m p o u n d w i t h X = - C 0 H _ , t h e c o n t r i -
2 5 * *
b u t i o n o f t h e a l k y l g r o u p i n d u c t i v e e f f e c t , p a , in a c c o r d a n c e w i t h E q . ( 2 ) , h a s b e e n s u b t r a c t e d f r o m t h e e x p e r i m e n t a l v a l u e o f l o g k . . T h e n u m b e r s a t t h e p o i n t s r e f e r t o t h e i n h i b i t o r s l i s t e d in T a b l e 1.
F i g . 2. D e p e n d e n c e o f t h e l o g a r i t h m s o f t h e s e c o n d - - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e r e a c t i o n o f a - C h y m o t r y p s i n w i t h 0 - n - h e x y l - S - - a l k y l m e t h y 1 t h i o p h o s p h o n a t e s (n-C6 H 130 ) ( C H 3 )P(0)SX.
T h e m e a n i n g o f t h e n u m b e r s a n d t h e p r o c e d u r e o f t h e n o r m a l i z a t i o n o f t h e l o g k. v a l u e f o r t h e i n h i b i t o r w i t h X - ^ 2 H 5 a s in F i g . 1
.
T a b l e 2 D e p e n d e n c e o f t h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e r e a c t i o n o f a - c h y m o t r y p s i n w i t h o r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s u p o n t h e s t r u c t u r e o f t h e i r l e a v i n g p r o u p . T h e r e s u l t s o f t h e c o r r e l a t i o n a n a l y s i s o f t h e d a t a in T a b l e 1 b y E q . (2 ).
R e a c t i o n P a r a m e t e r s C o r r e l - C o r r e 1 -
s e r i e s o f E q . (2) n a t i o n
c o e f f ., r
S . D . a t i o n c o e f f . b e t w e e n 0 * a n d П,
rX 0II
C 2 H 5°"P _ S X
{нз
p * = 3 - 3 6 — 0 . 1 0 Ф = 0 . 4 6 - 0 . 0 2 p * ^ 1 . 9 0 * 0 . 0 3 a)
1Ц 0 . 9 9 5 0 . 0 5 9 0 . 3 6 6
0
D
n - C , H , . 0 - P - 6 13 1
CH
S X p * = 2 . 2 1 - 0 . 2 1 3 Ф = 0 . 6 0 - 0 . 1 1
9 0.97** 0 . 1 0 3 0 . 4 2 6
p f o r a l k a l i n e h y d rol y s i s 1 **.
t h e r e a c t i o n t h e n r e s e m b l e s t h e a l k a l i n e h y d r o l y s i s o f o r g a n o p h o s p h o r u s e s t e r s in w a t e r ( s e e T a b l e 2 ) . If t h e a l k - o x y g r o u p in t h e p h o s p h o r y l p a r t o f i n h i b i t o r s , a s ~ C2 H5 in ( I ) , is t o o s h o r t f o r e f f e c t i v e b i n d i n g in t h e h y d r o p h o b i c p o c k e t , t h e l o c a l i z a t i o n o f t h e l e a v i n g g r o u p r e l a t i v e t o t h e d e s c r i b e d s o l v a t i o n c e l l m a y p r o b a b l y r e m a i n i n e x a c t . F o r t h e h i g h l y p o l a r t r a n s i t i o n s t a t e it s h o u l d m e a n a t r a n s f e r e o f t h e r e a c t . i o n i n t o a l e s s p o l a r m e d i u m w i t h c o n -
*
c o m i t a n t i n c r e a s e in p u p t o t h e v a l u e s c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n t h e p v a l u e s o f a l k a l i n e h y d r o l y s i s o f t h e c o m p o u n d s in w a t e r .
T h e h i g h v a l u e o f p in t h e r e a c t i o n o f C T w i t h p h e n y l a c e t a t e s 3, c o u l d b e e x p l a i n e d s i m i l a r l y . It h a s b e e n s h o w n ,
2 57
2
p a r t i c u l a r l y , t h a t p° f o r a l k a l i n e h y d r o l y s i s o f t h e a r y l - s u b s t i t u t e d p h e n y l a c e t a t e s i n c r e a s e d f r o m t h e v a l u e s o f p ° = 0 . 9 ^ 7 " О.О37 in w a t e r u p t o t h e v a l u e s o f 1 . 6 - 1 . 8 in w a t e r - d i o x a n , w a t e r - e t h a n o l a n d w a t e r - a c e t o n e m i x t u r e s 1 ^ ’^
t h u s r e a c h i n g t h e v a l u e o b s e r v e d in t h e i r r e a c t i o n w i t h C T 3 , 4 .
In c o n c l u s i o n , it m a y b e s t a t e d t h a t t h e d e p e n d e n c e o f t h e l e a v i n g g r o u p i n d u c t i v e e f f e c t u p o n t h e s t r u c t u r e o f a c y i p a r t in t h e r e a c t i o n s o f C T w i t h o r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s o r c a r b o x y l i c e s t e r s u b s t r a t e s c o u l d b e e x p l a i n e d w i t h o u t i n t r o d u c i n g s p e c i a l r e q u i r e m e n t s i n t o d e t a i l e d m e c h a n i s m o f t h e r e a c t i o n w i t h " g o o d " ( a m i n o a c i d ) s ubs t r a t e s , e . g . t h e f o r m a t i o n o f a d d i t i o n a l h y d r o g e n b o n d s a t t h e i r c o n v e r s i o n . It is s u f f i c i e n t t o a s s u m e t h a t t h e l o w v a l u e s f o r t h e l e a v i n g g r o u p i n d u c t i v e e f f e c t in t h e r e a c t i o n s o f C T w i t h i t s s p e c i f i c s u b s t r a t e s a r e b r o u g h t a b o u t b y e l e c t r o - p h i l i c s o l v a t i o n O f t h e s u b s t r a t e r e a c t i o n c e n t e r in t h e c e l l f o r m e d b y N H g r o u p s o f G l y 1 9 3 a n d S e r 1 9 5 in t h e e n z y m e .
E x p e r i m e n t a l s e c t i o n
O r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s w e r e p r e p a r e d b y c o n v e n -
17 18 19
t i o n a l m e t h o d s a n d p u r i f i e d o n a s i l i c a g e l c o l u m n T h e s t r u c t u r e a n d p u r i t y o f t h e c o m p o u n d s w e r e c o n f i r m e d b y t h e i r 1 3 C N M R s p e c t r a , e l e m e n t a l a n a l y s i s d a t a , i n f r a - r e d s p e c t r a a n d b y t i t r a t i o n o f t h e t h i o l s l i b e r a t i n g in t h e c o u r s e o f t h e i r a l k a l i n e h y d r o l y s i s 2 0. T h e i n h i b i t i o n o f C T a c t i v i t y in l a r g e e x c e s s o f i n h i b i t o r s w a s p e r f o r m e d , a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e 21 , b y m e a s u r i n g t h e r e s i d u ä l a c t i v i t y o f t h e e n z y m e . T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e i n h i b i t i o n r e a c t i o n ( T a b l e 1) w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e d e p e n d e n c i e s o f p s e u d o m o n o m o l e c u l a r r a t e c o n s t a n t s u p o n t h e
i n h i b i t o r c o n c e n t r a t i o n s . S p o n t a n e o u s i n a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e in t h e c o u r s e o f t h e i n h i b i t i o n r e a c t i o n h a s b e e n t a k e n i n t o a c c o u n t .
258
R e f e r e n c e s
1. A . W i l l i a m s , B i o c h e m i s t r y , 9, 3 3 8 3 ( 1 9 7 0 ) .
2. R . E . W i 1 1 i a m s , M . L . B e n d e r , C a n . J. B i o c h e m , 4_9, 2 1 0 ( 1 9 7 1 ) .
3. M . L . B e n d e r , К.J . N a k a m u r a , J. A m . C h e m . S o c . , 8 ± t 2 5 7 7 (1 9 6 2).
4. K . l k e d a , S . K u n u g i , N . l s e , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 2 1 7 , 3 7 ( 1 9 8 2 ) .
5. J .D. R o b e r t u s , J . K r a u t , R . A . A I d e n , J . J . В i r k t o f t ,• B i o c h e m i s t r y , П_, 4 2 9 3 ( 1 9 7 2 ) .
6. J . K r a u t , A n n . R e v . B i o c h e m . , 4 6 , 3 3 1 ( 1 9 7 7 ) .
7. N . A . L o s h a d k i n , M e c h a n i s m s o f n u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n a t t h e t e t r a h e d r a l p h o s p h o r u s , in R . D . O ' B r i e n , T o x i c P h o s p h o r u s E s t e r s ( R u s s i a n t r a n s l a t i o n , M i r P u b l i s h e r s , M o s c o w 1 9 6 4 ) , p p . 4 8 7 - 5 0 4 .
8. A . J . K i r b y , S . G . W a r r e n , T h e O r g a n i c C h e m i s t r y o f P h o s p h o r u s ( R u s s i a n t r a n s l a t i o n , M i r P u b l i s h e r s , M o s c o w 1 9 7 1 ) , p p . 3 1 9 - 3 5 0 .
9. R . A . H e r b s t , A .A .A b d u v a k h a b o v , A . A .A a v i k s a a r , O r g a n i c R e a c t i v i t y 1 0 , 8 2 5 ( 1 9 7 3 ) .
10. P . F . S i k k , A .A .A b d u v a k h a b o v , A .A .A a v i k s a a r , O r g a n i c R e a c t i v i t y 12, 2 4 5 ( 1 9 7 5 ) .
11. A . L e o , C . H a n s c h , D . E l k i n s , C h e m . R e v . , 7J_, 5 2 5 ( 1 9 7 1 ).
12. V . A . P a l m , T . O . P Ü s s a , V . M . N u m m e r t , I . V . T a l v i k , O r g a n i c R e a c t i v i t y 10 , 2 4 3 ( 1 9 7 3 ) .
1 3. V . A . P a l m , Q u a n t i t a t i v e T h e o r y o f O r g a n i c R e a c t i o n s ( in R u s s i a n ) , K h i m i y a P u b l i s h e r s , L e n i n g r a d 1 9 7 7 » P P - 1 3 3 "
- 1 4 5 .
14. J . L . J ä r v , A . A . A a v i k s a a r , N .N, G o d o v i ко.*-, N. A . M o r o z o v a , O r g a n i c R e a c t i v i t y 9, 8 1 3 ( 1 9 7 2 ) .
1 5. В.I . I s t o m i n , В. N . B a z h e n o v , G . D . E 1 i s e y e v a , B . L . F i n k e l - s h t e i n , O r g a n i c R e a c t i v i t y 1 6 , 1 9 7 ( 1 9 7 9 ) .
1 7. A . A .A b d u v a k h a b o v , I . I .A g a b e k o v a , N . N . G o d o v i k o v , M . I . K a - b a c h n i k , V . I . R o z e n g a r t , I z v . A c a d . N a u k S S S R , k h i m i y a , N o 7, 1588 ( 1 9 7 0 ) .
259 2*
18. J . L . J ä r v , A . A .A a v i k s a a г, D . I . L o b a n o v , N . N . G o d o v i k o v , I z v . A c a d . N a u k S S S R , k h i m i y a , N o 2, 4 2 6 ( 1 9 7 6 ) . 19. J . L . J ä r v , A .A .A a v i k s a a r , I zv. A c a d . N a u k E s t . S S R ,
K h i m i y a - G e o l o g i y a , 2 5 , 1 6 9 ( 1 9 7 6 ) .
2 0 . Y . L a n g e l , J . J ä r v , A . A a v i k s a a r , A c t a e t c o m m e n t . U n i v . T a r t u e n s i s , 9 ( 3 3 2 ) , 1 7 2 ( 1 9 7 4 ) .
21. P . F . S i k k , A .A .A a v i k s a a r , N . N . G o d o v i k o v , N. A .M o r o z o v a , V . A . P a l m , O r g a n i c R e a c t i v i t y 7, 9 8 6 ( 1 9 7 0 ) .
260
O r g a n i c R e a c t i v i t y V o 1 . 2 3 3 (83) 1 9 8 6
H Y D R O P H O B I C I N T E R A C T I O N IN T H E A C T I V E S I T E S O F S E R I N E P R O T E A S E S F R O M T H E R M O A C T I N O M Y C E T S
M . M . P e i p s , P . F . S i k k a n d A . A . A a v i k s a a r I n s t i t u t e o f C h e m i c a l P h y s i c s a n d B i o p h y s i c s o f t h e E s t o n i a n S S R A c a d e m y o f S c i e n c e s , T a l l i n n
Received August 26, 1986
T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e r e a c t i o n s o f t h e r m i t a s e a n d a s e r i n e p r o t e a s e f r o m Thermoactinomyces vulgaris s t r a i n R A l l - 4 a w i t h t h e s u b s t r a t e s
C H ^ C ( 0 ) N H C H ( R ) С( 0 ) O C H ^ (I) a n d i r r e v e r s i b l e o r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s ( R O ) ( C H ^ J P f O j O C g H ^ N O ^ - p ( I I ) , w h e r e R s t a n d s f o r a l k y l a n d / o r a r y l a l k y l s u b s t i t u e n t s , h a v e b e e n d e t e r m i n e d . T h e s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f b o t h e n z y m e s in t h e s e r e a c t i o n s h a s b e e n s h o w n t o b e t h e s a m e . A t h e l e n g t h o f R n o t e x c e e d i n g t h a t o f t h e n - b u - tyl g r o u p , t h e d e p e n d e n c e o f t h e r a t e o f e n z y m i c h y d r o l y s i s o f s u b s t r a t e s (I) u p o n t h e i r s t r u c t u r e is d e s c r i b e d b y t h e e q u a t i o n l o g к j j = 3 * 5 4 + 1 . 1 9 l o g P, w h e r e P is t h e s u b s t r a t e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t in t h e o c t a n o l - w a t e r s y s t e m . F o r ( I I ) t h e l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l o g к j j a n d t h e c o m p o u n d h y d r o p h o b i сi t y h o l d s f o r t h e i n h i b i t o r s w i t h R f r o m - C , H - n t o - C , H , , - n . It
5 7 b 1 3
is s u g g e s t e d t h a t , a s in a - c h y m o t r y p s i n , ttie p r i m a r y s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f t h e p r o t e a s e s f r o m Thermo
aetinomyoes vulgaris is d e t e r m i n e d b y a s p e c i a l h y d r o - p h o b i c s l i t in t h e i r a c t i v e s i t e s , w h i c h p r i n c i p a l l y d i f f e r e n t i a t e s t h e m f r o m b a c t e r i a l s u b t i l i s i n s w h i c h d o n o t s h o w h y d r o p h o b i c s e l e c t i v i t y w i t h r e s p e c t t o (I).
R e c e n t l y a n u m b e r o f s e r i n e p r o t e a s e s w h i c h s p l i t p e p t i d e b o n d s a f t e r h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s a n d c o n t a i n a f r e e t h i o l g r o u p , e s s e n t i a l f o r t h e i r e n z y m i c a c t i v i t y , h a v e b e e n p u r i f i e d f r o m v a r i o u s s t r a i n s o f t h e r m o p h i l i c a c t i n o -
261
m y c e t s a n d s o m e o t h e r m i c r o o r g a n i s m s . T h e r m i t a s e , a t h e r m o s t a b l e s e r i n e p r o t e a s e f r o m Thermoaotinomyoes vul g a r i s \ h a s b e e n m o s t e x t e n s i v e l y s t u d i e d in t h i s s u b f a m i l y 7 8 o f s e r i n e p r o t e a s e s . O n t h e b a s i s o f t h e c o m p a r i s o n o f t h e
9 - 1 2
a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h e m i c r o b i a l e n z y m e s ä s w e l l a s t h e i r s p e c i f i c i t i e s a g a i n s t s o m e s h o r t p o l y p e p t i d e s u b s t r a -
13 14
t e s , t h e r m i t a s e h a s b e e n c l a s s i f i e d a s a s u b t i l i s i n - - 1 i k e e n z y m e .
H o w e v e r , a s t u d y o f t h e i n t e r a c t i o n o f a n o t h e r S H - c o n - t a i n i n g s e r i n e p r o t e a s e , o b t a i n e d f r o m Thermoactinomyoes vulgaris s t r a i n R A l l - 4 a , w i t h a s e r i e s o f N - a c e t у 1 - L - a m i n o
a c i d m e t h y l e s t e r s , C H j C ( 0 ) N H C H ( R ) С( 0 ) 0 C H 3 , h a s s h o w n t h a t t h e e n z y m e p r i n c i p a l l y d i f f e r s f r o m s u b t i l i s i n s in p r i m a r y s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y . F o r t h e p r o t e a s e f r o m Thermoaotino- myoes vulgaris s t r a i n R A l l - 4 a , a l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n 1 o g (*<са(-/К^*5 ) a n d t h e h y d r o p h o b i с i t y o f t h e s u b s t i t u e n t R, c o v e r i n g t h e c h a n g e o f t h e r a t e c o n s t a n t w i t h i n t w o o r d e r s o f m a g n i t u d e , h a s b e e n f o u n d 3 , w h i l e s u b t i l i s i n s d o n o t d i s p l a y h y d r o p h o b i c s e l e c t i v i t y w i t h r e s p e c t t o t h e s e s u b s t r a t e s ^ . T h e i n t e r a c t i o n o f R w i t h a h y d r o p h o b i c s l i t in t h e a c t i v e s i t e o f t h e p r o t e ä s e a s w e l l a s t h e o c c u r r e n c e o f t h e r e l a t i o n s h i p " b e t t e r b i n d i n g : b e t t e r r e a c t i o n " 3 in t h i s s e r i e s o f s u b s t r a t e s m a k e t h e e n z y m e l o o k r a t h e r similar t o a - c h y m o t r y p s i n .
In t h e p r e s e n t w o r k t h e s t u d y o f t h e i n t e r a c t i o n o f t h e s e r i e s o f N - a c e t y l - L - a m i n o a c i d m e t h y l e s t e r s w i t h m i c r o b i a l p r o t e a s e s h a s b e e n e x t e n d e d t o t h e r m i t a s e , in o r d e r t o c o r r e l a t e t h e p r i m a r y s u b s t r a t e s p e c i f i c i t i e s o f S H - c o n t a i n - i n g s e r i n e p r o t e a s e s f r o m d i f f e r e n t s t r a i n s o f Thermoaotino- myoes vulgaris. T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e h y d r o
l y s i s o f t h e s u b s t r a t e s , к j ^ , o b t a i n e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f h a v e b e e n u s e d t o q u a n t i f y t h e s p e c i f i c i t i e s o f t h e s t u d i e d e n z y m e s .
T o a c c o u n t f o r t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s u b s t r a t e s w e h a v e u s e d t h e l o g a r i t h m s o f t h e i r p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s in t h e o o t a n o l - w a t e r m o d e l s y s t e m ; t h e h y d r o p h o b i сi t y c o n s t a n t s
П f o r a m i n o a c i d s i d e c h a i n s a s c a l c u l a t e d f r o m t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s o f v a r i o u s a m i n o a c i d d e r i v a t i v e s » h a v e b e e n f o u n d t o b e a t v a r i a n c e w i t h e a c h o t h e r
In t h e s t u d y o f t h e t o p o g r a p h i e s o f t h e a c t i v e s i t e s o f t h e p r o t e a s e s f r o m Thermoaotinomyoes w e h a v e a l s o u s e d a s e r i e s o f o r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s , ( R O X C H ^ P ^ O C g H ^ N C ^ - p , w h e r e R = -С H. ,,-n ( n = 2 - 8 ) . T h e s e r i e s h a s b e e n u s e d
n Z n + l 1 7 l 8
e a r l i e r in t h e s t u d i e s o f s u b t i l i s i n s ’ a n d i n t r a c e l l u l a r p r o t e a s e s 1 8 f r o m Bacillus amyloliquefaoiens.
E x p e r i m e n t a l s e c t i o n
T h e p r o t e a s e f r o m Thermoaotinomyoes vulgaris R A I I - 4 a w a s p u r i f i e d o n S e p h a d e x G - 5 0 a n d C M - c e l l u l o s e c o l u m n s a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e 3 .
T h e r m i t a s e f r o m S e r v a ( F R G ) w a s u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n .
T h e e n z y m e s t o c k s o l u t i o n s , p H 5 * 0 , y = 0 . 0 5 , w e r e m a d e in a c e t a t e b u f f e r c o n t a i n i n g 10 -2 M C a C I ^ * T h e a c t i v e s i t e s o f t h e e n z y m e s w e r e t i t r a t e d b y 0 - « - h e x y 1 - p - n i t r o p h e n y l m e t h y l p h o s p h o n a t e ; t h e r e l e a s e o f p - n i t r o p h e n o 1 w a s m o n i t o r e d a t 25°C, p H 7 . 6 , N a - v e r o n a l - H C 1 b u f f e r , y = 0 . 0 5 ( e =
= 1 3 7 0 0 a t 4 0 0 n m ) o n a V a r i a n T e c h t r o n 6 3 5 o r B e c k m a n 5 2 6 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r .
N - a c e t y 1 - L - a m i n o a c i d m e t h y l e s t e r s w e r e p r e p a r e d as d e s c r i b e d e a r l i e r 3 . P u r i t y o f t h e c o m p o u n d s w a s c h e c k e d b y t i t r a t i n g t h e a m o u n t o f a c i d w h i c h l i b e r a t e d in t h e c o u r s e o f t h e i r c o m p l e t e t h e r m i t a s e - c a t a 1 y z e d h y d r o l y s i s . S u b s t r a t e s t o c k s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d in a c e t o n i t r i 1 e .
K i n e t i c m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t o n a p H - s t a t ( R a d i o m e t e r , T T T 2 / S B R 3 / A B U 12) a t 25°C a n d p H 7 . 6 in t h e s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 2 M K C 1 , 10 2 M C a C l 2 a n d 5% ( v / v ) a c e t o n i t r i 1 e .
In a c c o r d a n c e w i t h t h e r e a c t i o n s c h e m e
KM k 2 . k 3
H „ 0 2 ’
E + ES- ^ > E A — > E + P 0 , (1)
I
1
263
a t [S] « K * p p t h e r e a c t i o n f o l l o w s t h e f i r s t - o r d e r k i n e t i c s ,
о M
w i t h k = ( k , / K u ) [E] = k . . [ E ] , w h i c h e n a b l e s t o c a l c u l a t e
2 M о И о
t h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t o f t h e e n z y m e a c y l a t i o n a s k . . = k / [ E ] ; t h e k v a l u e s w e r e o b t a i n e d b y t h e d i f f e r e n t i a l
° 19
m e t h o d o f R u d a k o v .
T h e s y n t h e s i s a n d p u r i f i c a t i o n o f 0 - n - a 1 k y 1-p-ni t r o - p h e n y l m e t h y l p h o s p h o n a t e s h a v e b e e n d e s c r i b e d e a r l i e r 2 о S t o c k s o l u t i o n s o f t h e c o m p o u n d s w e r e m a d e in a b s o l u t e e t h a n o l .
P r o t e a s e i n h i b i t i o n w a s c a r r i e d o u t u n d e r t h e p s e u d o - m o n o m o 1 e c u 1 a r r e a c t i o n c o n d i t i o n s ( [ I ] > ^ t E ] ) a t 25°C a n d
® ® _ 2
pH 7 . 6 in 0 . 0 4 M N a - v e r o n a l - H C 1 b u f f e r c o n t a i n i n g 10 M C a C l ^ a n d 2% ( v / v ) o f e t h a n o l . A t p r e d e t e r m i n e d t i m e i n t e r v a l s a l i q u o t s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e r e a c t i o n v e s s e l s a n d a s s a y e d f o r t h e r e s i d u a l e n z y m e a c t i v i t y u s i n g 7 * 1 0 3 M N - a c e t y 1 - L - p h e n y l a l a n i n e m e t h y l e s t e r a s s u b s t r a t e . T h e f i r s t - o r d e r r a t e c o n s t a n t s k = ( k „ / K u ) [ l ] = k . . [ l ] w e r e
2 M о II О
o b t a i n e d f r o m t h e p l o t s o f 1 o g ( A % ) a g a i n s t t in a c c o r d a n c e w i t h t h e e q u a t i o n
l o g ( A Ž ) = 2 - k , ,[ l ] Q t / 2 . 3 0 3 3 (2) w h i c h f o l l o w s f r o m s c h e m e (1) w i t h k ^ = 0. T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e i r r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n o f p r o t e a s e a c t i v i t i e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e s o f t h e s t r a i g h t l i n e s in t h e c o o r d i n a t e s k versus [I] ( s e e 1 8).
о
P a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s o f N - a c e t y l - L - a m i n o a c i d m e t h y l e s t e r s in t h e o c t a n o l - w a t e r s y s t e m (0.1 M a m m o n i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 2 . 2 ) w e r e d e t e r m i n e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . I n i t i a l ( 0 . 1 - 1 . 0 ) 1 0 3 M s o l u t i o n s o f t h e c o m p o u n d s w e r e p r e p a r e d e i t h e r in t h e b u f f e r s o l u t i o n s a t u r a t e d w i t h o c t a n o l o r in o c t a n o l s a t u r a t e d w i t h t h e b u f f e r s o l u t i o n . T h e n 2 . 0 ml o f e a c h o f t h e s o l u t i o n s in s t o p p e r e d t e s t t u b e s w e r e m i x e d w i t h t h e s e c o n d p h a s e b y i n v e r s i o n o f t h e t u b e f o r 2 0 0 t i m e s d u r i n g 10 m i n . A f t e r t h e s e p a r a t i o n o f t h e p h a s e s , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d s in b o t h p h a s e s w e r e d e t e r m i n e d b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y (Du P o n t 8 8 0 0 , Z o r b a x O D S c o l u m n , 4 . 6 m m x 2 5 c m , 5 0 : 5 0 m e t h a n o l a n d 0.1 M
264
a m m o n i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 2 . 2 , 35°C, d e t e c t i o n b y t h e a b s o r b a n c e a t 2 0 5 n m ) . T h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e s h o w n t o b e i n d e p e n d e n t o f t h e n u m b e r o f t u b e i n v e r s i o n s a n d t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d s ; t h e c a l c u l a t e d v a l u e s o f the p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s a l s o r e m a i n e d u n c h a n g e d w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d 10 h o u r s a f t e r m i x i n g t h e p h a s e s . T h e l o g a r i t h m s o f .the o b t a i n e d p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s , l o g P, f o r N - a c e t y 1 - L - a m i n o a c i d m e t h y l e s t e r s a r e g i v e n in T a b l e 1.
R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n
A s c a n b e s e e n f r o m T a b l e 1, a n i n c r e a s e in t h e s u b s t r a te s i d e c h a i n h y d r o p h o b i сi t y l e a d s t o t h e i n c r e a s e in t h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f a c y l a t i o n o f t h e a c t i v e s i t e s o f t h e s t u d i e d p r o t e a s e s . T h e d e p e n d e n c e o f l o g k | ( u p o n l o g P f o r t h e c o m p o u n d s N o 1 - 4 ( T a b l e 1) w i t h n o r m a l h y d r o c a r b o n r a d i c a l s a s R, is g i v e n b y a c o m m o n e q u a t i o n f o r b o t h p r o t e a s e s ,
l o g k , , = ( 3 • 5 5 “0. 0 3 ) + ( 1 . 1 9 * 0 . 0 7 ) l o g P , (3) w h e r e r = 0 . 9 9 1 , s = 0 . 0 9 6 a n d n = 8. In F i g u r e 1 t h e s e d a t a a r e p r e s e n t e d a s a l o g k (| versus l o g P p l o t . A s a c h a r a c t e r i s t i c f a c t , it is s e e n in F i g u r e 1 t h a t l o g k |( f o r N - a c e t y 1 - L - p h e n y 1 a 1 a n i n e m e t h y l e s t e r s u b s t r a t e w i t h a r o m a t i c a m i n o a c i d s i d e c h a i n R = - C H q u i t e s a t i s f a c t o r i l y f a l l s o n t h e e x t e n s i o n o f t h e s t r a i g h t l i n e c o n d u c t e d t h r o u g h t h e p o i n t s f o r l o g к j j o f a l i p h a t i c a m i n o a c i d s u b s t r a t e s f r o m a l a n i n e (R = - C H ^ ) t o n o r l e u c i n e (R - - C ^ H g - n ) . I n c l u s io n o f t h e p h e n y l a l a n i n e s u b s t r a t e a s w e l l a s t h e d e r i v a t i v e o f l e u c i n e w i t h a b r a n c h e d s i d e c h a i n R ■ - C H j C H ^ H ^ J j i n t o t h e c o r r e l a t i o n d o e s n o t c h a n g e t h e s l o p e o f t h e s t r a i g h t l i n e b u t o n l y l o w e r s t h e q u a l i t y o f t h e c o r r e l a t i o n in s o m e e x t e n t :
l o g к j j - ( 3 . 5 4 * 0 . 0 6 ) + ( 1 . 1 9 * 0 . 0 8 ) l o g P , (4) w h e r e r = 0 . 9 7 6 , s = 0 . 1 6 3 a n d n = 12. A t t h e s a m e t i m e , t h e s u b s t r a t e s w i t h n o r m a l h y d r o c a r b o n r a d i c a l s in t h e i r s i d e c h a i n s l o n g e r t h a n n - b u t y l g r o u p g i v e s y s t e m a t i c n e g a t i v e d e v i a t i o n s o f l o g k | ( f r o m t h e c o r r e l a t i o n l i n e ( s e e F i g . 1 ) .
265 3
T a b l e 1 H y d r o l y s i s o f N - a c e t y 1 - L - a m i n o a c i d m e t h y l e s t e r s , C H ^ С( 0 ) N H C H ( R ) С( 0 ) O C H j , c a t a l y z e d b y t h e r m i t a s e a n d t h e s e r i n e p r o t e a s e f r o m Thermoaotinomyoes vulgaris R A l l - 4 a . T e m p e r a t u r e 25°C, p H 7 - 6 , 0 . 2 M K C I , 5% ( v / v ) a c e t o n i t r i I e . T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s a r e g i v e n w i t h * S . E .
N o R l o g P k. 1 0 “2 , H _1 s' 1
t h e r m i t a s e p r o t e a s e R A I I - 4 a - C H 3
- C 2 H 5
- W ”
- C 4 V ”
"C5H11
- C 6 H 1 3 - ”
-CHjCH( си 3) 2
8 " CH2 C6 H 5 9 -c h2c6h4o h-p
- 0 . 5 7 9 , 9 * 0 . 2 5 . 3 * 0 . 1
О1 2 2 * 1 2 0 - 2
0 . 3 3 9 5 * 1 1 1 4 ± 3
0 . 7 9 2 8 2 * 9 2 7 7 * 6
1 . 2 8 оо о 1+ о 2 1 6 * 9
1 . 7 0 2 9 * 1 3 2 , 8 - 0 , 9
О OO 4r* 1 7 9 * 7 2 3 2 * 4
CM<т\
о
7 6 0 * 1 0 6 6 0 * 2 0
о.. 3 3 3 2 3 * 6 4 4 5 * 6
T h e o b s e r v e d d e p e n d e n c e o f l o g к j j u p o n t h e l e n g t h a n d h y d r o p h o b i сi t y o f t h e h y d r o c a r b o n r a d i c a l s in t h e a c y l p a r t o f s u b s t r a t e s is q u i t e s i m i l a r t o t h e s t r u c t u r e - a c t 1v i t y r e l a t i o n s h i p in c h y m o t r y p s i n - c a ta 1y z e d h y d r o l y s i s o f t h e s e
2 1 - 2 ^
c o m p o u n d s S i n c e t h e p r i m a r y s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f c h y m o t r y p s i n h a s b e e n s h o w n t o b e d e t e r m i n e d b y a s p e c i f i c h y d r o p h o b i c s l i t in it s a c t i v e s i t e 2 4 f o r t h e b i n d i n g o f t h e s i d e c h a i n s o f a m i n o a c i d s in t h e P ^ - p o s i t i o n o f p o l y p e p t i d e s u b s t r a t e s ( n o t i o n o f a m i n o a c i d r e s i d u e s in s u b s t r a t e s a s in S c h e c h t e r a n d B e r g e r 2 с o n e c a n c o n c l u d e t h a t t h e p r i m a r y s p e c i f i c i t y o f S H - c o n t a i n i n g m i c r o b i a l s e r i n e p r o t e a s e s is d e t e r m i n e d b y t h e b i n d i n g o f t h e a m i n o a c i d s u b s t r a t e s i d e c h a i n in a s p e c i a l h y d r o p h o b i c s l i t in t h e e n z y m e a c t i v e s i t e a s w e 11.
H o w e v e r , b y t h e s i z e a n d t h e i n t e n s i t y o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n w i t h t h e s u b s t r a t e s i d e - c h a i n , t h e h y d r o p h o b i c s l i t in t h e a c t i v e s i t e s o f t h e p r o t e a s e s f r o m a c t i n o m y c e t s
m u s t b e d i f f e r e n t f r o m t h a t in c h y m o t r y p s i n . F o r C h y m o t r y p s i n t h e l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l o g к j j a n d l o g P in t h i s s e r i e s o f s u b s t r a t e s h o l d s u p t o о- a m i n o h e p t a n o i с a c i d m e t h y l e s t e r (R = -С^Н^-.и) a n d t h e s l o p e o f t h e o b s e r v e d s t r a i g h t l i n e is a b o u t t w o :
l o g к,, = ( 1 . 5 4 - 0 . 1 0 ) + ( 1 . 9 6 * 0 . 1 3 ) l o g P , (5) w h e r e r = 0 . 9 9 3 , s = 0 . 0 4 3 a n d n - 5 ( t h e c o m p o u n d s N o 1 - 5
in. T a b l e 1, t h e val-ues o f k | ( b y J o n e s e t a l . 2 1). In a d d i t i o n , it is c h a r a c t e r i s t i c f o r c h y m o t r y p s i n t h a t t h e r e a c t i v i t i e s o f t h e d e r i v a t i v e s o f a r o m a t i c a m i n o a c i d s P h e a n d T y r d o n o t o b e y E q u a t i o n ( 5 ) ; 'l og k ® * p - l o g is 1 . 3 f o r P h e a n d 2 . 8 f o r T y r .
2 6 2 7
I n c o n s i s t e n c y o f t h e e x t r a c t i o n m o d e l * t o d e s c r i b e t h e h y d r o p h o b i c s e l e c t i v i t y o f c h y m o t r y p s i n in t h e r e a c t i o n w i t h a r o m a t i c a m i n o a c i d s u b s t r a t e s if t h e " i n i t i a l " p a r a m e t e r s l o g P f o r s u b s t r a t e h y d r o p h o b i сi t y a r e u s e d , n e e d s s p e c i a l a n a l y s i s e l s e w h e r e . A c c o r d i n g t o t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y , t h e S H - c o n t a i n i n g s e r i n e p r o t e a s e s f r o m Thermoaotinomyoes d o riot p r e f e r P h e o v e r t h e a l i p h a t i c a m i n o a c i d s b u t l o g k (| f o r N - a c e t y 1 - L - t y r o s i n e m e t h y l e s t e r s t i l l h a s t h e v a l u e o f 0 . 6 l o g u n i t s h i g h e r t h a n p r e d i c t e d b y E q u a t i o n s (3) a n d (4).
It is i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t f o r a l i p h a t i c a m i n o a c i d s u b s t r a t e s t h e l o g k ( | v a l u e s f o r p r o t e a s e s f r o m Ther
moaotinomyoes a r e c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n l o g к f o r c h y m o t r y p s i n . V i c e v e r s a , in t h e r e a c t i o n o f o r g a n o p h o s p h o r u s i n h i b i t o r s 0-м-а1 k y 1 - p - n i t r o p h e n y 1 m e t h y l p h o s p h o n a t e s w i t h t h e a c t i v e s i t e s o f m i c r o b i a l p r o t e a s e s , t h e k . . v a l u e s (in T a b l e 2) a r e l o w e r t h a n f o r c h y m o t r y p s i n 2 7. T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l o g k.. a n d t h e h y d r o p h o b i сi t y p a r a m e t e r
I8 2 8
П ’ f o r s u b s t i t u e n t R in ( R O ) ( C H ^ ) P ( 0 ) O C g H ^ N O j - p is g i v e n in F i g . 2. T h e s t r a i g h t l i n e c o v e r s t h e t h e l o g k | ( v a l u e s f o r t h e i n h i b i t o r s w i t h R f r o m - C , H , - « t o - C , H , , - n
i / b 1 3 a n d is c h a r a c t e r i z e d b y a c o r r e l a t i o n e q u a t i o n
l o g k M = ( - 0 . 6 9 * 0 . 1 5) + (0 . 5 7 * 0 . 0 7 ) П , (6) w i t h r = О.9 6 2, s “ 0 . 1 0 4 a n d n = 8. F u r t h e r i n c r e a s e in t h e l e n g t h o f n - a l k y l c h a i n R l e a d s t o a d e c r e a s e in l o g к((
267
3 *
F i g . 1. D e p e n d e n c e o f l o g u p o n l o g P f o r t h e h y d r o l y s i s o f t h e s u b s t r a t e s C H ^ C ( 0 ) N H C H ( R ) С( 0 ) O C H j c a t a l y z e d b y t h e r m i t a s e Co) a n d t h e s e r i n e p r o t e a s e f r o m Thermoaotinomyoes vulgaris R A I I - 4 a ( • ) . T h e n u m b e r s r e f e r t o t h e s u b s t r a t e s l i s t e d in T a b l e 1.
F i g . 2. D e p e n d e n c e o f l o g k (| u p o n П f o r t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e a c t i v e s i t e s o f t h e r m i t a s e (o) a n d t h e s e r i n e p r o t e a s e f r o m Thermoaotinomyoes vulgaris R A I I - 4 a (•) by 0 - n - a l k y l - p - n i t r o p h e n y l m e t h y l p h o s p h o n a t e s , (R O ) ( C H j ) P ( 0 ) O C g H ^ N O ^ - p . T h e n u m b e r s r e f e r t o t h e i n h i b i t o r s l i s t e d in T a b l e 2.
268
T a b l e 2 T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s o f t h e i n h i b i t i o n o f t h e a c t i v i t i e s o f t h e r m i t a s e a n d t h e s e r i n e p r o t e a s e f r o m Thermoaotinomyoes vulgaris R A l l - 4 a b y 0 - n - a 1 k y 1 - p - n i t r o p h e - n y l m e t h y l p h o s p h o n a t e s , (R O ) (C H ^ ) P ( 0 ) O C ^ H ^ N O j - p . T e m p e r a t u r e 25°C, p H 7 . 6 , 0 . 0 4 M N a - v e r o n a 1 - H C 1 b u f f e r w i t h ю “3 M C a C l ^ J 2% ( v / v ) e t h a n o l . T h e c o n s t a n t s a r e g i v e n w i t h * S . E .
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t h e r m i t a s e p r o t e a s e R A l l - 4 a 1
* C 2 H 5 1 . 0 2 . • 1 * 0 , . 5
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a ^ A d d i t i v e v a 1 u e s 1 8 .
w h i c h p o i n t s t o t h e b i n d i n g o f t h e i n h i b i t o r a l k o x y g r o u p in a h y d r o p h o b i c a r e a o f l i m i t e d s i z e in t h e a c t i v e s i t e s o f the s t u d i e d p r o t e a s e s . T h i s h y d r o p h o b i c a r e a is a p p a r e n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e h y d r o p h o b i c s l i t f o r t h e b i n d i n g o f a m i n o a c i d s i d e c h a i n R o f t h e s u b s t r a t e s C H ^ (0) N H C H (R) С (0) 0 C H 3 s i n c e t h e l e n g t h o f t h e s e v e n - m e m b e r e d a l k o x y g r o u p - 0 С^ Н^ - и a t w h i c h l o g k j ( in t h e s e r i e s o f t h e i n h i b i t o r s r e a c h e s its m a x i m u m v a l u e , d i f f e r s f r o m t h e l e n g t h o f t h e g r o u p - C H - C ^ H g - n in t h e s u b s t r a t e w h i c h h a s t h e h i g h e s t r a t e c o n s t a n t o f t h e a c y l a t i o n o f t h e e n z y m e a c t i v e s i t e in t h e s t u d i e d s e r i e s .
In c o n c l u s i o n it m a y b e s a i d t h a t d e s p i t e r a t h e r e x t e n s i v e s e q u e n t i a l h o m o l o g i e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s o f e n z y m e s t h e S H - c o n t a i n i n g s e r i n e p r o t e a s e s f r o m Thermoaotinomyoes p r i n c i p a l l y d i f f e r f r o m b a c t e r i a l s u b t i l i s i n s b y t h e i r p r i m a r y s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y * T h e s p e c i f i c i t y o f t h e e n z y m e s
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