Entwicklung einer auf subtraktiver Hybridisierung basierenden Nachweismethode zur Identifizierung differentieller Genexpression in Eukaryonten

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(1)Entwicklung einer auf subtraktiver Hybridisierung basierenden Nachweismethode zur Identifizierung differentieller Genexpression in Eukaryonten. Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaft -Dr. rer. nat.-. Dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen. Li Li Bremen, 2003. 1. Gutachter: Prof. Dr. Hildebrandt 2. Gutachter: Prof. Dr. Beyersmann.

(2) Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung....................................................................................................................................1-19 1.1 Differentielle Genexpression..........................................................................................................1 1.2 Methoden zur Analyse differentieller Genexpression....................................................................2 1.3 Probleme, die bei der Genom-Subtraktion zu bewältigen sind....................................................13 1.4 Auswahl eines Testsystems zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems......................16 1.5 Transgene Solanum als Modellsystem zur Genom-Subtraktion bei hochkomplexen Eukaryonten.................................................................................................................................17 1.6 Das Ziel der Arbeit ......................................................................................................................19. 2 Material und Methoden...........................................................................................................20-52 2.1 Vorbereitung der cDNA ..............................................................................................................20 2.2 Genom-Subtraktion mittels SSH .................................................................................................28 2.3 Überprüfung der DSC.................................................................................................................. 33 2.4 Suche nach der Ursache des Versagens der DSC ........................................................................39 2.5 Entwicklung der NSC.................................................................................................................. 41 2.6 Subtraktion mittels SSH/NSC .....................................................................................................42 2.7 Die Logik der Methodenentwickelung.........................................................................................52.

(3) Inhaltsverzeichnis 3 Ergebnisse.................................................................................................................................53-84 3.1 Vorbereitung des Tester/Drivers zur Genom-Subtraktion...........................................................53 3.2 Analyse differentieller Genexpression in Kartoffeln mit SSH.....................................................58 3.3 Experiment zur Etablierung der DSC...........................................................................................62 3.4 Suche nach der Schwachstelle der DSC.......................................................................................65 3.5 Entwicklung der NSC...................................................................................................................68 3.6 Kombination SSH/NSC...............................................................................................................72 3.7 SN am Beispiel von Kartoffel-cDNA..........................................................................................78. 4 Diskussion.................................................................................................................................85-92 4.1 SN ist ein innovatives, elegantes Genom-Subtraktionssystem ...................................................85 4.2 Bei höheren Eukaryonten ist SNH zur Analyse differenzieller Genexpression gegenüber den bekannten Methoden zu bevorzugen; sie stellt auch eine gute Alternative zur Identifizierung genomischer Unterschiede dar...........................................................................................................87 4.3 Ausblick........................................................................................................................................90 Zusammenfassung............................................................................................................................91 Literaturverzeichnis.........................................................................................................................92 Anhang...............................................................................................................................................97 Danksagung.....................................................................................................................................107.

(4) 1 1 Einleitung 1.1 Differentielle Genexpression Organismen lassen sich anhand ihrer Gene unterscheiden. Ein vielzelliger Organismus wiederum exprimiert seine Gene je nach Zell- oder Gewebetyp unterschiedlich. Diese Unterschiede können dabei sowohl qualitativ als auch quantitativ sein. Das menschliche Genom codiert für bis zu 30,000-100,000 Gene (Bishop, 1974; Zhang, 1997; Venter, 2001; the genome international sequencing consortium, 2001). Zu einem gegebenen Zeitpunkt in einer bestimmten Zelle werden jedoch nur 15-20,000 Gene exprimiert. Ihren Konzentrationen nach können die eukaryontischen mRNAs in drei relativ homogenen Unterklassen eingeteilt werden: Nur wenige Sequenzen gehören der am höchsten konzentrierten Klasse an. In Hela Zellen haben 10-20 Gene in dieser Klasse in der Größenordnung von etwa 8,000 Kopien pro Zelle; 1 % (350 Sequenzen) sind in der mittel konzentrierten Klasse vorhanden, mit etwa 440 Kopien pro Zelle; die meisten Gene gehören dagegen der am niedrigsten konzentrierten Klasse an und besitzen durchschnittlich nur 8 Kopien pro Zelle. Den beiden höher konzentrierten mRNAKlassen wird eine große Bedeutung bei der Zelldifferenzierung zugesprochen. Die mRNAs in der höchsten Konzentrationsklasse scheinen gewebespezifisch zu sein, während sich die „housekeeping“ Gene in der am niedrigsten konzentrierten Klasse befinden (Hastie, 1976). Die Analyse differentieller Genexpression dient dazu, die biologischen Vorgänge zu verstehen, was wiederum ermöglichen könnte, ein bestimmtes Geschehen zu lenken. Die Identifizierung eines Gens oder Genprodukts, das tendenziell bei einem bestimmten Krankheitsbild auftritt, könnte eventuell zu einer früheren Erkennung und/oder neuen Therapien hinführen. Nahezu 60 % aller menschlichen Tumore exprimieren z. B. kein funktionsfähiges p53, ein Gen, das in der normalen Zelle verhindert, dass ein DNA-Schaden bei der Zellteilung an die Nachkommen weitergegeben wird; während Gene, die für ein robustes Wachstum charakteristisch sind, z. B. die für ribosomale Proteine codierenden Gene, im Vergleich zum umgebenden Gewebe überexprimiert werden (Levine, 1991; Zhang, 1997). Für Fragestellungen, bei denen der Zusammenhang eines Expressionsmusters und z. B. einer Erkrankung bereits bekannt ist, existiert ein breites Spektrum an Untersuchungstechniken. Wenn jedoch die Fragestellung darin liegt, ob sich zwei Proben überhaupt in ihren Expressionsprofilen.

(5) 2 voneinander unterscheiden, kann nur auf wenige und teilweise aufwendige Methoden zurückgegriffen werden. Neben der Auffindung von entwicklungs- und differenzierungsrelevanten Genen gilt dies u. a. auch für die Detektion von Transgenen. 1.2 Methoden zur Analyse differentieller Genexpression Da der Analyse differentieller Genexpression große Bedeutung beigemessen wird, ist in letzter Zeit eine dynamische Entwicklung der dazu dienenden Techniken zu beobachten, der sich viele Arbeitsgruppen widmen. Schematisiert lässt sich das Spektrum der Analysetechniken wie folgt in Abb. 1-1 darstellen. Die Bevorzugung einer bestimmten Methode bei einer bestimmten Fragestellung hängt von mehreren Faktoren ab, u. a. der Komplexität der Genome, der Expressionsstärke des Target Gens, dem. Bekanntsein. der. cDNA. Sequenzen,. der. technischen. Ausstattung. sowie. der. „Forschungstradition“ der jeweiligen Arbeitsgruppe.. Genom-Subtraktion SAGE Methoden zur Analyse differenzieller Genexpression. Mikroarray Differential Display. Abb. 1-1: Übersicht der gängigen Methoden zur Analyse differenzieller Genexpression. 1.2.1 mRNA Differential Display Die direkteste Methode zum Vergleichen von zwei mRNAs ist das Differential Display (Liang, 1994). Dabei werden die mRNAs systematisch in cDNAs umgeschrieben und die cDNAs dann parallel auf einem Sequenzierungsgel aufgetrennt und deren Bandenmuster verglichen. Um die Teilpopulation der zu vergleichenden cDNA-Fragmente zu verkleinern und die Auflösung der Banden zu erhöhen, werden Ankerprimer für die cDNA-Synthese an den polyA-Enden der.

(6) 3 mRNAs gebunden und die folgende Amplifikation durch PCR mit einem zusätzlichen willkürlichen Primer durchgeführt. Schematisch lässt sich diese Methode folgendermaßen in Abb. 1-2 veranschaulichen. Differential Display eignet sich gut für wenig komplexe mRNA-Populationen.. Bei höher. komplexen mRNA-Gemischen ist der optische Vergleich der cDNA Bandemuster erheblich erschwert, da die Auflösung der Banden auf Grund deren hohen Anzahl niedrig wird. Komplette Repräsentation einer komplexen mRNA Population mit angemessener Auflösung der Banden dagegen verlangt extrem hohen Arbeitsaufwand.. G (U oder C) AAAAAAAAAAAAAAAAAA. mRNA. 5´-TTTTTTTTTTTTTTTTTTC(A oder G) dNTPs. Reverse Transkription. Reverse Transkriptase G (U oder C) AAAAAAAAAAAAAAAAAA C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTT 5´-AAGCTTTTTTTTTTTC(A oder G) Abitrary Primer. PCR. dNTPs Taq Polymerase AbitraryPrimer. C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTT. AbitraryPrimer. C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTT. Gelanalyse RNA. A. B Differentielle Genexpression. Abb. 1-2: Schema des mRNA Differential Display mit einem einbasigen Oligo-dT Ankerprimer, nach Liang (1994).

(7) 4 1.2.2 Mikroarray Die Expression von bis zu 50,000 Genen kann mit der Mikroarray-Technik (Heller, 2002) parallel untersucht werden. Somit eignet sich diese Methode gut zur Herstellung gesamtgenomischer Genexpressionsprofile. Bei der Mikroarray-Technik werden bis zu 108 Oligos, die verschiedene cDNAs repräsentieren, auf Trägern (Chips) immobilisiert und mit den markierten. cDNAs. hybridisiert. Die Hybridisierungssignale reportieren dann das Vorhandensein sowie die Expressionsstärke jeder Sequenz (Abb. 1-3).. H yb rid izie ru n g au f M ik ro arra y. Z elle A. mRNA. cD N A. Z elle B L aser S can n in g. R o h d aten R o h e D aten. Q u an tifizie ru n g. E x p ressio n stä rk e. Abb. 1-3: Mikroarray zur Analyse differentieller Genexpressionsprofile Die. Anwendung. der. Mikroarray-Technologie. setzt. allerdings. voraus,. dass. die.

(8) 5 Sequenzinformationen der zu untersuchenden Fragmente vorhanden sind. Jedoch sind nur wenige Organismen durchsequenziert, daher ist die Herstellung eines passenden Chips zu jedem beliebigen Organismus und jeder beliebigen Fragestellung zurzeit unmöglich. Auch die hohen Kosten und die hohen. technischen. Ansprüche. bei. der. Chip-Herstellung,. die. wenig. standardisierte. Versuchsdurchführung und Dateninterprätation verhindern zurzeit in den meisten Fällen die Etablierung dieser Technik in Routinelabors. 1.2.3 SAGE Die SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ist wie das Mikroarray-Verfahren eine Computer gestützte Technologie (Velculescu, 1995). Durch ein kompliziertes Verfahren werden die cDNAs durch die Summe ihrer SAGE-Tags repräsentiert. Jeder Repräsentant wird dann sequenziert. Die Ergebnisse der darauffolgenden, vom Computer unterstützten Vergleich der beiden Pools von SAGE-Tags weist auf eine mögliche differentielle Genexpression hin (Abb. 1-4).. AAAAA TTTTT. cDNA Schnitte Schnittemit mit4-Basen 4-Base Endonuklease, Endonukease , binden bindenananStreptavidin Streptavidin. Biotin Streptavidin. AAAAA TTTTT. GTAC. In 2-Pools verteilen, Ligation mit mit Adaptoren Adapteren Ligation A CATG GTAC. AAAAA TTTTT. B CATG GTAC. AAAAA TTTTT. Schnitte mit Typ-2 Enzyme Primer A GGATGCATGXXXXXXXXX CCTACGTACXXXXXXXXX. Primer B GGATGCATGOOOOOOOOO CCTACGTACOOOOOOOOO. Ligation, PCR. Primer A GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGG Primer B Ditag Schnitte mit 4-Base Endonuklease, Schnitte mit 4-Basen Endonuklease, Isolierung derder Ditags, Cloning Isolierung Ditags, Klonierung GCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC. Abb. 1-4: Schema der SAGE.

(9) 6 Die mRNAs werden dabei zuerst mit biotinylierten Oligo-dT-Primern in cDNAs umgeschrieben. Die cDNAs werden dann mit einer 4-Basen Endonuklease geschnitten und die Fragmente, an die Biotin gebunden ist, mit Streptavidin isoliert. Die biotinylierten cDNAs werden dann in zwei Pools verteilt, und anschließend mit zwei Adaptoren versehen, die die Erkennungssequenz eines Typ-2 Enzyms tragen. Die Typ-2 Enzyme schneiden DNA-Sequenzen an den Stellen, die in einer bestimmten Distanz (8-15 Basen) zu ihrer Erkennungssequenz liegen (Szybalski, 1985). Nach der Restriktion mit dem Typ-2 Enzym ergeben sich dann Fragmente, die die Adaptorsequenz und einen kurzen Teil einer cDNA (5-10 Basen) enthalten. Dieser mit Adaptor verbundene cDNA-Teil ist für jede cDNA spezifisch und wird als deren SAGE-Tag bezeichnet. Die SAGE-Tags aus beiden Pools werden dann zusammenligiert und die dabei entstandenen Ditags durch PCR amplifiziert. Als Primer dafür dienen die Sequenzen der beiden Adaptoren. Die amplifizierten Ditags werden dann mit der gleichen Endonuklease geschnitten, danach gereinigt und kloniert. Es dauert durchschnittlich 2-3 Monate, um mit SAGE das Expressionsprofil eines eukaryontischen Organismus, herzustellen. Auch die technischen Ansprüche sind nicht niedrig und die Kosten der Laborausstattung hoch. 1.2. 4 Genom Subtraktion Die Analyse differentieller Genexpression wird in Forschungslabors oft mittels Genom-Subtraktion betrieben, wozu u. a. auch die damit verbundenen relativ niedrigen Kosten und die hohen technischen Ansprüche beigetragen haben. Es sind dabei keine teuren Geräte wie z. B. eine Sequenzierungsapparatur wie bei SAGE nötig. „Genom-Subtraktion“ bezeichnet den Vorgang, die gemeinsamen Sequenzen zwischen zwei Genomen durch Hybridisierung zu subtrahieren, und die einzigartigen Sequenzen, die nur in einer der zwei (c)DNA-Präparationen, oder in wesentlich höheren Konzentrationen in einer der (c)DNAPräparationen vorhanden sind, anzureichern. In diesem Zusammenhang nennt man die gesuchten einzigartigen Sequenzen das „Target“. Der „Tester“ ist dabei das Genom, welches das Target enthält, oder dessen Repräsentant als PCRAmplikon. Der „Driver“ ist dagegen das Referenz-Genom, das das Target nicht enthält, oder dessen Repräsentant als PCR-Amplikon. Alle anderen Sequenzen außer der des Targets bezeichnet man als „Hintergrundsequenzen“. Dieser Hintergrund ist desto höher, je komplexer die zu vergleichenden.

(10) 7 Genome sind. Der Einsatz dieser Genom-Subtraktion geht auf Versuche von Lamar et al. am Y-Chromosom von Mäusen zurück. In seiner Arbeit wurden DNA-Regionen untersucht, die in männlichen Mäusen vorhanden waren und in weiblichen jedoch fehlten (Lamar, 1984). Bei der Untersuchung wurde gescherte DNA weiblicher Mäuse im Überschuss gegen die mit Mbo1 verdaute DNA männlicher Mäuse hybridisiert. Bei der Hybridisierung entstanden drei Arten von Hybriden:. Männlich/männlich,. männlich/weiblich. und. weiblich/weiblich.. Nur. die. männlich/männlichen Hybride besaßen an beiden Enden die Erkennungssequenz von MBO I, sodass diese kloniert werden könnten. Eine Weiterentwicklung dieser Technik stellte die von Kunkel et al. 1985 verwendete Methode bei der Untersuchung der Duchenne Muskeldystrophie dar (Kunkel, 1985). Die Hybridisierung der DNA wurde hierbei in einem Phenol-haltigen Puffer durchgeführt. Das Phenol bewirkt eine Verkürzung der Reassoziationszeit während der Hybridisierung bei Raumtemperatur. 1990 ligierten Strauß et al. vor der Hybridisierung kurze Adaptoren an die mit Endonuklease verdauten Tester-Fragmente, sodass die Tester/Tester Hybride nach der Hybridisierung mit Hilfe einer PCR vermehrt werden können (Strauß 1990). 1993 stellten Lisitsyn et al. RDA („representional difference analysis“) vor (Lisitsyn, 1993). Bei dieser Methode werden vor der Hybridisierung Tester und Driver mit Endonuklease geschnitten, mit verschiedenen Adaptoren versehen und durch PCR vereinfachend repräsentiert. Diese Repräsentation durch PCR-Amplikons vereinfacht die Komplexität von eukaryontischen Genomen 80-100 fach, was die Hybridisierung erheblich beschleunigt. Dieser Repräsentationsschritt wurde von vielen späteren Subtraktionstechniken übernommen. Für den Tester werden dann die Adaptoren-Sequenzen des PCR-Amplikons wieder entfernt und nach Reinigung der DNA mit einen anderem Adaptor erneut ligiert. Als Driver dient das PCRAmplikon mit oder ohne dessen Adaptor-Sequenz. Die schrittweise Anreicherung des Targets erfolgt durch mehrere Runden Hybridisierung und die darauf folgende Anreicherung der Tester/Tester-Hybride durch PCR. Die Tester/Tester-Hybride sind dabei die Einzigen, die an beiden Enden die Tester-Adaptor-Sequenzen besetzen und so durch die PCR mit dem Tester-Primer exponentiell reamplifiziert werden. Das Subtraktionsprodukt aus der vorherigen Runde wird durch Restriktion und Ligation erneut mit einem anderem Adaptor versetzt und dient als Tester für die nächste Hybridisierungsrunde. Das Austausch des Tester-.

(11) 8 Adaptors zwischen den Subtraktionsrunden sollte die ungewollte überdurchschnittliche Anreicherung. mancher. Hintergrundsequenzen. durch. PCR. mindern,. die. eventuell. im. Subtraktionsprodukt das tatsächliche Target überdecken könnten (Abb. 1-5).. Tester. Driver Representation durch PCR-Amplikons. Restriktion Adapterumtausch Adaptor-Austausch. Ligation mit Ligationmit einem neuen neuem Adapter Adaptor. Hybridisierung. a: expontionelle Amplifikation. a. lineareAmplifikation Amplifikation b: lineale. b PCR. c: keine Amplifikation. c. Abb. 1-5: Schema der RDA. Im Jahr 2000 gelangt es A. Nekrutenko mit der RDA spezifische Gensonden für die Feldmausarten zu entwickeln (Nekrutenko, 2000). Jedoch werden mehrere PCRs und der Austausch des Adaptors zwischen den Subtraktionsrunden für die RDA benötigt. Daher ist diese Methode relativ arbeitsintensiv und kontaminationsanfällig..

(12) 9 Die 1996 von Diatchenko et al. entwickelte SSH (Supression Subtractive Hybridisation) ist ein zurzeit oft benutztes Genom Subtraktionssystem, was sich an der Vielzahl von Publikationen und auch der großen Resonanz und dem wirtschaftlichen Erfolg der teuren-Kits der Firma „Clontech“ zeigt, die auf diesem Prinzip basieren (Diatchenko, 1996). SSH beruht auf dem Suppressions PCR Effekt (Siebert, 1995), wobei nach der Hybridisierung nur das Target exponentiell durch PCR vervielfacht wird, während die Reamplifikation der anderen Sequenzen unterdrückt wird. Dies führt zu einer starken Anreicherung des Targets. Suppression der PCR entsteht bei ssDNAs, die an ihren beiden Enden lange, zueinander komplementäre Sequenzen besitzen. Die Kinetik der Hybridisierung bevorzugt die Formation einer Pfannen-ähnlichen Sekundärstruktur, was das Annealing der PCR-Primer erheblich erschwert und eine effiziente Amplifikation solcher Sequenzen stark unterdrückt.. Denaturierung. Annealing PCR Primer. Keine Primer-Annealing, kein Primer-Annealing durch Pfannen-ähnliche Pfanne-ähnliche Struktur, Struktur, Suppressions Suppression PCR PCR. Amplifikation. Abb. 1-6: Suppression PCR (Lukyanov, 1994; Siebert, 1995). Die Anwendung der Suppressions-PCR bei SSH beruht auf der eleganten Konstruktion von.

(13) 10 Adaptoren/Primern und der besonderen Strategie der Hybridisierung: Für den Tester werden zwei nicht phosphorylierte Adaptoren konstruiert, die aus je einem längeren (42-44 Basen) und einem kürzeren (12 Basen) Strang bestehen. Die Teilsequenzen an den Ligationsenden (22 sowie 24 Basen) sind. spezifisch für jeden Adaptor und die anderen Teilsequenzen (20 Basen) sind. gemeinsam zwischen den Adaptoren. Der Tester (geschnittene DNA oder cDNA) wird zuerst auf zwei Pools verteilt, mit je einem der beiden Adaptoren ligiert, dann in getrennten Ansätzen mit überschüssigem Driver ohne Adaptor solange hybridisiert, bis die Molaritäten der einzelsträngigen Fragmente von unterschiedlichen Sequenzen sich gerade ausgleichen. Von der Firma Clontech wird als Erfahrungswert für die Subtraktion eukaryontischer cDNA bei einer Tester Menge von 10 ng und einer Driver Menge von 300 ng eine Zeitspanne von 6-12h angegeben. Für die zweite Hybridisierung werden die beiden Ansätze dann unter erneuter Zugabe denaturierten Drivers zusammengeführt und der zweite Hybridisierungsschritt nahezu zur Völlständigkeit geführt. Clontech empfiehlt dazu eine übernacht-Hybridisierung. Dieser Hybridisierungsansatz wird dann verdünnt und ein Teil davon dient als Template für die PCR. Vor der Reamplifizierung werden die PCR-Ansätze ohne Polymerase für einige Minuten bei 75oC gehalten, um die kürzeren, nicht ligierten Stränge der Adaptoren vom Tester abzulösen. Dann werden die ligierten längeren Stränge der Tester-Adaptoren durch die Zugabe von Polymerase verdoppelt. Die erste PCR erfolgt mit einem Primer, der die gemeinsame Sequenz von beiden Adaptoren besitzt. Alle Tester/Tester-Hybride aus dem ersten Hybridisierungsschritt besitzen die gleiche Adaptor-Sequenz an deren beiden Enden. Dadurch wird ihre Amplifizierung während dieser PCR unterdrückt; exponentiell reamplifizierbar sind dabei nur die Tester/Tester-Hybride aus dem zweiten Hybridisierungsschritt, wobei das Target erheblich angereichert wird, weil es keine komplementären Sequenzen im Driver findet. Die Tester/Driver-Hybride vermehren sich dagegen nur linear, die einzelsträngigen Tester-Sequenzen und die nur Driver-haltigen Sequenzen gar nicht. Das Produkt der ersten PCR wird dann verdünnt und als Template für die zweite PCR verwendet, mit den speziellen Sequenzen der beiden Adaptoren als Primer. Die zweite PCR reichert das Target nochmals an (Abb. 1-7). Gegenüber der RDA ist die Handhabung der SSH mit nur relativ wenigen Hybridizierungsschritten ohne Adaptoraustausch eine Vereinfachung. Der Zeitaufwand des Verfahrens ist stark verkürzt und die Quellen der falsch-positiven Ergebnisse sind erheblich vermindert. Nach Clontech gelingt es mit SSH die Unterschiede nah verwandter prokaryontischer Genome zu detektieren. Bei der Applikation dieser Methoden bei eukaryontischen cDNAs werden die Targets ebenfalls.

(14) 11 stark angereichert, dennoch wird zur Identifizierung des Subtraktionsprodukts ein radioaktives, kostenintensives Screening-Verfahren empfohlen.. Tester mit Adaptor Adapter 1. Driver imÜberschuss. Tester Testermit mitAdapter Adaptor22. 1. Hybridisierung a b c. d 2. Hybridisierung mit 2. Hybridisierung mit denatuiertemDriver denaturiertemDriver a, b, c, d +. e Filling-in. a. a: keine Amplifikation b: keine Amplifikation. b PCR mit. c. c: lineale Amplifikation d: keine Amplifikation. d e. e: expontionelle Amplifikation. Abb. 1-7: Schema der SSH. 1999 veröffentlichten J.H. Luo et al. die Methode DSC (Differential Subtraction Chain, Luo, 1999). Wie bei der RDA werden auch bei der DSC die Genome von dem Tester und dem Driver vor der.

(15) 12 Subtraktion durch PCR vereinfacht repräsentiert.. Nach der Hybridisierung bleibt der Tester-. Adaptor in den Heterohybriden einzelsträngig und kann von Mungo Bohnen Nuklease (MBN) degradiert werden. Die Subtraktion wäre, wie bei der RDA, durch mehrere Hybridisierungsrunden zu bewältigen, aber ohne die lästigen Schritte des Adaptoraustausches und der PCR zwischen den Runden (Abb. 1-8), was die Handhabung erheblich vereinfacht und die Kosten niedrig hält. Die DSC schien elegant und effizient. Luo berichtete, dass es mit DSC möglich wäre, ein singuläres Target in hoch komplexen humanen Genomen zu detektieren. Aber bisher wird die DSC von keinem unabhängigen Forscher bestätigt.. Tester. Driver. Representation durch PCR-Amplikons. Hybridisierung. Mung Bean Nuklease. Abb. 1-8: Schema der DSC. PCR.

(16) 13 1.3 Probleme, die bei der Genom-Subtraktion zu bewältigen sind Wenn ein Tester mit einem Driver bis zur Vollständigkeit hybridisiert wird, entstehen dabei 3 Varianten doppelsträngiger Hybride: Tester/Tester, Tester/Driver und Driver/Driver. Wenn dabei der Driver noch in absolutem Überschuss vorliegt, bedeutet dies, dass alle Hintergrundsequenzen im Tester mit ihren Gegenstücken im Driver Heterohybride bilden. Die Tester/Tester-Hybride stellen dann das Target dar. Um das Target durch Genom-Subtraktion zu isolieren, sind somit theoretisch vier (miteinander zusammenhängende) Teilprobleme (markiert mit Stern) zu bewältigen:. Tester. Driver. Target. 1* überschüssiger Driver. Hintergrund Hybridisierung 2* Vollständige Hybridisierung. Trennung der Hintergrund und Target. 3* Trennung der Tester-TesterHybride von anderen. 4* Identifizierung des Targetes Hintergrund. Target. Identifizierung des Targets. Abb. 1-9: Probleme bei der Genom-Subtraktion.

(17) 14 Driver in absolutem Überschuss Obwohl ein großer Überschuss an Driver die Subtraktionseffizienz erhöht, und theoretisch durch Poolen einer großen Menge von (c)DNA, oder Driver-Amplikons, die aus vielen parallelen PCR-Ansätzen stammen, ein sehr hoher Überschuss an Driver erreicht werden könnte, ist jedoch die Löslichkeit der DNA in Hybridisierungspuffer begrenzt. Eine größere Menge an Driver erfordert ein größeres Volumen zur Hybridisierung und bewirkt eine Verdünnung des Targets, was wiederum zu einer Verlangsamung der Hybridisierung führt. Daher kann ein zu großer Überschuss an Driver negativ auf die Kinetik der Hybridisierung wirken. Aus diesem Gründe wurde der Driver lediglich in „verträglichem“ Überschuss eingesetzt. Bei eukaryontischen cDNAs erwies sich ein Driver/Tester-Verhältnis zwischen 10-100:1, mit einer Tester-Menge in der Größenordnung von 100 ng in einem Hybridisierungsvolumen von einigen Mikrolitern als optimal. Wenn für die Hybridisierung kein absoluter Überschuss an Driver benutzt wird, wird auch ein geringer Anteil an Tester-Hintergrundsequenzen Tester/Tester-Hybride bilden, was das Target im Subtraktionsprodukt. verunreinigen. würde.. Zur. weiteren. Verminderung. dieser. Hintergrundsequenzen wird die Subtraktion oft in mehreren Runden durchgeführt, z. B im Falle RDA (Birkenmeyer, 2002) und DSC (Luo, 1999). Hybridisierung bis zur Vollständigkeit Die eukaryontischen Genome sind hochkomplex, und der größte Anteil der Fragmente ist nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden. Um die Hybridisierung in absehbarer Zeit nahezu zur Vollständigkeit zu führen, werden diese bei hoch komplexen eukaryontischen Genomen in Form ihrer PCR-Amplikons vereinfacht repräsentiert. Dies ist z. B. bei RDA und DSC der Fall. Weil praktisch keine Hybridisierung zur absoluten Vollständigkeit geführt werden kann, sind theoretisch nach der Hybridisierung immer noch einzelsträngige Tester und Driver vorhanden, von denen das Target unterschieden werden muss. Trennung der Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen Um das Target zu isolieren, ist das Hauptproblem oft die Unterscheidung der Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen nach der Hybridisierung. Wenn die Tester/Tester-Hybride durch PCR.

(18) 15 angereichert werden sollen, muss man dafür sorgen, dass eine exponentielle Amplifikation aller anderen Sequenzen durch PCR unmöglich wird. Dazu werden außer den besprochenen Strategie wie bei RDA, SSH und DSC noch verschiedene anderen Strategien entwickelt, durch die sich einige (meist in den USA patentierten) Methoden voneinander unterscheiden. Patent 5871927 (Lin, 1999) Beim Patent 5871927 werden Nukleotid-Analoga vor der Hybridisierung in den Driver eingebaut. Ein Enzym greift dann nach der Hybridisierung die Analoga in den Tester/Driver- und den Driver/Driver-Hybriden an und erzeugt Lücken in diesen Sequenzen. Die darauf folgende S1Nuklease-Behandlung greift die lückenhaften Hybride an, wodurch diese Hybride nicht mehr durch PCR amplifizierbar sind. Bei jeder Subtraktionsrunde wird der Driver von Enzymen angegriffen und abgebaut, sodass vor jeder Hybridisierung neuer Driver zugegeben muss. Patent 5804382 (Sytkowski, 2002) Ein Teil des Tester-Adaptors in Tester/Driver-Hybriden ist beim Patent 5804382 wie bei DSC beschrieben einzelsträngig. Dieser Teil soll dann von Mung Bean Nuklease degradiert werden. Diese einzelsträngige Form wird bei NSC allein durch die innovative Konstruktion der Adaptors/Primers gewährleistet, während beim Patent 5804382 die Erkennungssequenzen einer Endonukleoase in den Driver-Adaptor eingebaut werden, und vor der Hybridisierung an dieser Stelle ein Teil des Driver-Adaptors von den Driver-PCR-Amplikons gespalten wird. Patent 5958738 (Lindemann, 1999) Der Primer zur Synthese der Driver-Amplikons wird bei dem Patent 5985738 so markiert (Phosphor), dass alle Hybride, die diese markierte Primer-Sequenz enthalten, die Tester/Driver- und Driver/Driver-Hybride sowie die einzelstängigen Driver und Tester von Nukleasen (Lambda Exonuklease und Mung Bean Nuklease) angegriffen werden können. Nach der Degradation mit den Enzymen bleiben nur noch die Tester/Tester-Hybride intakt und werden durch PCR amplifiziert. Identifizierung des isolierten Targets Solange die Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen getrennt werden, erfolgt die.

(19) 16 eventuelle Verifizierung des isolierten Targets bei allen bekannten Techniken auf ähnlichem Weg: Es wird zunächst durch PCR amplifiziert, dann kloniert und sequenziert. Die Unterscheidung des „echten“ Targets von den Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt erfolgt über ScreeningVerfahren mittels Northern- oder Southern-Blot. 1.4 Auswahl eines Testsystems zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems Nicht jedes Individuenpaar, welches sich im Phänotyp unterscheidet, ist auch als Tester und Driver geeignet. Genexpression bei Eukaryonten ist ein extrem komplexes Netzwerksystem, dessen Regulation bisher nur in Teilen verstanden wird. Es gibt in der Natur selten „durchschnittliche Gesunde“ und „durchschnittliche Kranke“, bei denen die Unterschiede ihrer Genexpression sich lediglich auf die des untersuchten Gens beziehen. Wenn die Unterschiede zwischen zwei Genomen aus vielen Sequenzen bestehen, von denen nur wenige niedrig konzentrierte Sequenzen jedoch auch tatsächlich mit dem untersuchten Phänotyp zusammenhängen, könnten diese „echten“ Targetsequenzen während der Genom-Subtraktion verloren gehen, wenn manche höher konzentrierte Hintergrundsequenzen durch PCR bevorzugt angereichert werden. Vor der Subtraktion ist somit immer darauf zu achten, dass der Hintergrund von beiden zu vergleichenden Genomen möglichst ähnlich sein sollte, wie dies z. B durch das Poolen der (c)DNA von vielen Individuen eines Phänotyps weitgehend ermöglicht werden könnte. Bei der Entwicklung einer Subtraktionsmethode, wobei deren Prinzip der Subtraktion noch zu überprüfen ist, kann man als einfaches Modell künstliche Tester und Driver benutzen, womit man eine effiziente Subtraktion von einer nicht effizienten leicht unterscheiden kann. Dies ist bei DSC der Fall. Tester und Driver sind dabei nur ein einziges Lambda-Fragment, das entweder mit dem Tester-Adaptor oder dem Driver-Adaptor versehen wird. Eine effiziente Subtraktion ist anhand der nicht Amplifizierbarkeit mittels PCR nach der Hybridisierung zu zeigen. Weil die Wahrscheinlichkeit der Isolierung einer Targetsequenz von ihrer Konzentration und der Art und Vielfalt des Hintergrunds abhängt, ist der Erfolg jeder Genom-Subtraktionsmethode nur an deren Praktizierbarkeit an einem Tester/Driver-Paar, das aus natürlichen Genomen stammt oder denen weitergehend ähnelt, zu beurteilen. Wenn ein künstliches Tester/Driver-Paar benutzt wird, ist dabei stets zu beachten, dass das Target nur in Konzentrationen zugegeben wird, wie es der relativen Expressionsstärke von natürlich vorkommenen mRNAs entspricht..

(20) 17 Eine phänotypische Eigenschaft könnte mit dem Vorhandensein oder dem Fehlen eines bestimmten Fragments in Zusammenhang stehen. Daher sind beide Genome wechselweise als Tester oder Driver in Betracht zu ziehen. 1.5 Solanum als Modellsystem zur Genom-Subtraktion bei hochkomplexen Eukaryonten Die Kartoffel, (solanum tubersorum, L., 2n = 4x = 48 Chromosomen, Genomgröße 1012 Bp) ist eine alte Kulturpflanze der Indianer Südamerikas (Hawkes, 1990; Arumuganathan, 1991). Sie kam um 1570 nach Europa, erlangte gegen Ende des 18. Jahrhunderts sehr große wirtschaftliche Bedeutung. Die Kulturkartoffeln stammen von tetraploiden Formen ab, die wahrscheinlich aus diploiden Wildkartoffeln entstanden sind. Solanum findet auch in der Forschung vielfach Verwendung. Die Kartoffel lässt sich leicht und schnell kultivieren. Frische Kartoffel-Blätter bieten ein gutes Ausgangsmaterial für die RNA- und mRNA-Isolierung. Das Kartoffeln Paar Gus und Desiree, stellt ein ideales Testsystem für Eukaryonten zur Beurteilung einer Genome-Subtraktion-Methode dar, daher dienen sie als Modellsystem zur Überprüfung der in dieser Arbeit zu entwickelnden Genom-Subtraktionsmethode. Morphologisch sind die beiden Stämme voneinander nicht zu unterscheiden. Der transgene Stamm Gus ist Desiree, mit dem Gen Gus aus E.coli mit Hilfe des Ti-Plasmides von Agrobakterium tumefaciens (Horsch R. B., 1985; Klee H. J., 1987) transformiert. Desiree ist dabei der Referenz-Stamm. Das Transgen, wenn es experimiert wird, kann als ein Reporter-Target zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems dienen. Zur Herstellung des transgenen Stamms durch Transformation wird der T-DNA-Komplex „35S Promoter-gus Gen-ocs Terminator-nos Promotor-npt2 Gen-nos Terminator“ mit Hilfe eines „entwaffneten“ Ti-Plasmides (Ti-Plasmid ohne ocs-Gen für die OctopineSynthethase) in das Zellinnere der Solanum eingeschleust. Das Gus Gen aus E. coli codiert für ß-Glukuronidase, eines der am häufigsten benutzten ReporterGene in transgenen Pflanzen (Gallagher, S. R. 1992). Anfänglich als ein Gen-Fusionsreporter für E. coli und C. elegans, wird das Gus Gen zurzeit am häufigsten zum Monitoring der Expression der chimeren Gene in transgenen Pflanzen benutzt. Es gibt keine oder nur geringe Enzym-Aktivität von ß-Glukuronidase in Pilzen, Drosophila, C. elegans und den meisten Pflanzen (es gibt keine GusGen in Solanum). Die ß-Glukuronidase hat eine Molekulargewicht von 68,200 kDa und ist stabil auch in Anwesenheit von Detergenzien und unter unterschiedlichen ionischen Bedingungen (Nester.

(21) 18 E. W., 1984). Außerdem lässt sich die Aktivität des Gus Gens leicht colorimetrisch oder durch einen sichtbaren blauen Farbkomplex nachweisen. Die Detektierung der Expression des Gus Gens erfolgt traditionell durch einen histochemikalischen Assay (Abb. 1-9), wobei das Substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc) am Ort der Enzym-Aktivität blaue Präzipitate erzeugt, oder durch einen fluorimetrischen Assay (Abb. 1-10) mit dem Substrat 4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide (MUG) oder 4-trifluoromethylumbelliferyl b-D-glucuronic acid (4-TFMUG) (Jefferson, R. A. 1987; Janssen, B. J., 1989).. Abb. 1-9: Histochemikalischer Assay zur Detektion von Gus-Aktivität. Gus-Tabak. Linke Seite, unter Licht gewachsen; rechte Seite, im Dunkel gewachsen. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Abb. 1-10: Fluorimetrischer Assay zur Detektion von Gus-Aktivität. 1.3, 5, Kontrolle. 2, 4, 6, Gewebe mit Gus-Aktivität.. Die Effizienz fast aller damaliger Transformationsmethoden ist so niedrig, dass man gezwungen ist, möglichst frühzeitig die transformierten von den nicht transformierten Zellen zu trennen. Dazu wird das selektierbare Markierungsgen npt2 (Walden, 1990), welches für das Toxin-abbauende Enzym Neomycin-Phosphotranferase codiert, mit in die Zellen transformiert. Beim Einsetzen der selektiv wirkenden Antibiotika Kanamycin, Neomycin oder Geneticin während der GewerbekulturPhase zur Herstellung der transgenen Pflanzen, werden alle nicht transformierten Zellen entweder abgetötet oder ihr Wachstum erheblich eingeschränkt, weil der Translationsprozess in den Plastiden blockiert wird. Der 35 S-Promotor ist dem Blumenkohlmosaikvirus entnommen. Der nos-Promotor steuert in dem Ti-Plasmid das Gen für die Nopalinsynthase. Beide sind fast uneingeschränkt in höheren Pflanzen aktiv, wobei der 35S-Promotor deutlich wirksamer ist (Sander, 1987)..

(22) 19 Wenn die Einschleusung eines Transgens durch Agrobakterien erfolgt ist, ist die Anzahl der gewünschten Konstruktionen, das heißt pro Zelle eine vollständige Einzelkopie von dem T-DNAKomplex, höher als bei den anderen bekannten Methoden (u.A Mikroinjektion, Elekroporation und Partikelbeschusstechnik). Der Ort der Integration des Transgens in den pflanzlichen Chromosomen ist rein zufällig. Die Expression eines Transgens schwankt erheblich. Es gibt heute viele Beispiele dafür, dass die Expression des fremden Gens in transgenen Pflanzen ganz ausbleibt oder unerwartet schwach ausfällt. Der genaue Mechanismus der trangenen Expression wird noch nicht vollständig verstanden. Es wird in manchem Falle beobachtet, dass sich das stark methylierte fremde Gen in einer Umgebung mit deutlich geringerem Methylierungsgrad befindet (Meyer, 1992). Pflanzen können durch Methylierung des Cytosins im Dinukleotid CG oder im Trinukleotid CNG (N kann jede beliebige Base sein) die Aktivität von Genen abschalten, indem das Methylcytosin nachteilig in die Protein-DNA-Interaktionen eingreift.. 1.6 Das Ziel der Arbeit Es handelt sich bei dieser Arbeit um eine Methodenentwicklung. Das Ziel der Arbeit ist es, eine relativ einfache, nicht-radioaktive, routinetaugliche und auf dem Prinzip der Genom-Subtraktion basierende Methode zur Analyse differentieller Genexpression für Eukaryonten zu entwickeln. Zunächst wird diese Methodenentwicklung von SSH und 2D-Gelelektrophorese ausgehen. Falls dieser Ansatz nicht erfolgversprechend sein sollte, ist dann die DSC zu überprüfen und darüber hinaus eine Subtraktionsmethode, basierend auf dem Prinzip der „negativen Subtraktion“ zu entwickeln und zu etablieren. Ferner soll geprüft werden, ob sich die Vorteile von SSH und der „negativen Subtraktion“ zu einer Methode kombinieren lassen. Als Testmodell für hoch komplexe Eukaryonten werden die cDNAs der beiden Solanum-Stämme als Tester und Driver der Genom-Subtraktion dienen. Für die Überprüfung der DSC wird dagegen zur Überschaubarkeit das viel einfachere Lambda Fragment verwendet. Zur Untersuchung der Sensitivität der Detektion differentieller Genexpression in Eukaryonten durch ein zu entwickelndes Genom-Subtraktionssystem wird dann ein künstliches Target konstruiert..

(23) 20 2 Material und Methoden. 2.1 Vorbereitung der cDNA Als Driver/Tester zur Genom-Subtraktion dienen die mit Endonukleasen geschnittenen cDNAs oder deren PCR-Amplikons. Die Gesamt-RNA wird aus jungen Blättern der Kartoffeln isoliert und daraus die mRNA angereichert. Die Intaktheit der mRNA sowie die Expression eines ReporterTargets werden mittels Northern-Blot überprüft. Die cDNA wird nach ihrer Synthese mit Endonuklease geschnitten. 2.1.1 Kultivierung der Kartoffeln Kartoffel-Knollen werden in Blumenerde gekeimt und die Jünglinge bei 25 oC für einen Monat wachsen lassen. Junge Blätter werden entweder zur sofortigen RNA-Isolation bearbeitet, oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 oC für den weiteren Gebrauch gelagert. 2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA Die Isolierung der Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol-Methode (Chomczynski, 1987) durchgeführt. Alle mit RNA in Berührung kommenden Glaswaren werden silikonisiert. 5g junge Blätter werden in flüssigem Stickstoff zu Pulver gemörsert und das gefrorene Pulver in 10 ml Denaturierungslösung überführt, dann 0,1 Vol. NaOAc, pH4, 2M und 1Vol. Wasser-gesättigtes Phenol, sowie 0,2 Vol. Chloroform/Isoamylalkohol werden addiert, mit sanftem Schütteln nach jeder Zugabe. Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis werden die Proben bei 4 oC , mit 10,000g für 20 Min. zentrifugiert und die RNA-haltige obere Phase in 0,8 Vol. Isopropanol überführt. Die RNA wird dann für 30 Min. bei -20 oC gefällt und anschließend für 20 Min. bei 4 oC, 10,000g zentrifugiert. Das Pellet wird in 75% Ethanol zwei Mal gewaschen und in 2-3 ml H2O aufgenommen. Zur Kontrolle ihrer Qualität wird die RNA auf einem 1% MOPS-Gel aufgetrennt. Dabei löst man in der Mikrowelle 0.25g Agarose in 24 ml MOPS Puffer, lässt die Lösung auf 60-65 oC abkühlen und mischt dann 0,75 ml Formaldehyd dazu, gießt sofort das Gel und lässt es bis zum Beladen für 0,5 bis 1 Stunde fest werden..

(24) 21 3µl (1,5 µg) RNA wird mit 9 µl RNA-Puffer vermischt, bei 55 oC für 10 Min denaturiert und dann das Gel geladen. Die Auftrennung der RNA erfolgt bei 10 Volt/cm für 40 Min. Die Absorption der RNA wird mittels Photometer gemessen und ihre Konzentration nach folgenem Schema berechnet: µg/µl RNA = OD260 x 0,04 µg/µl x Verdünnungsfaktor Die Konzentration der gesamten RNA wird auf 2 µg/µl nachjustiert und die RNA in Aliquots von 0,75 ml (1,5 mg) aufgeteilt und bei -80 oC gelagert. Denaturierungslösung 4 M Guanidinium Thiocyanat; 25 mM Na-Citrat, pH 4,0; 0,5% Na-Laurylsarcosinat; 0,1 M betaMercaptoethanol MOPS-Puffer 0,02 M MOPS; 8 mM Na-Acetat; 1mM EDTA, pH 7,0 RNA-Puffer 250 µl Formamid, deionisiert mit AG 501-X8; 50 µl Färbelösung (50% Glycerol; 1 mM EDTA; 0,4 % Bromphenolblau; 0,4% Xylencyanol); 10 µg Ethidiumbromid Phenol, Wasser gesättigt Phenol zusammen mit gleicher Menge H2O sowie etwas Isoamylalkohol kräftig schütteln und die Phasen sich trennen lassen. Das Phenol befindet sich in der unteren Phase. Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 (Vol.) 2M Natrium Acetat, pH4 2M Natrium Acetat ansetzen. PH mit Acetat justieren. 2.1.3 Anreicherung der mRNA 0,2g OligodT-Zellulose Pulver (Invitrogen) wird wiederholt in L-Puffer gewaschen (suspendieren und sanft zentrifugieren, den Überstand vorsichtig verwerfen und die Zellulose erneut.

(25) 22 suspendieren) bis der PH-Wert unter 8 liegt. 1,5mg RNA (750 µl) wird mit gleichem Volumen 2X L-Puffer versetzt und bei 65 oC für 5 Min. denaturiert. Nach Abkühlung auf RT wird die RNALösung auf die Zellulose gegeben, unter sanftem Schütteln für 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Zellulose wird dann bei 2000g, 4 oC für 2 Min. zentrifugiert und der Überstand vorsichtig verworfen. Das Pellet wird mit den Wasch Puffern I und II je 2 mal gewaschen. Anschließend wird die mRNA mit 1ml H2O eluiert. Die Anreicherung wird zweimal wiederholt. Die mRNA wird dann bei -20 oC, übernacht in der Anwesenheit von 0,1 Vol. 2M Natriumacetat, pH4 und 0,8 Vol. Isopropanol gefällt und durch Zentrifugation für 45 Min bei 10, 000g und 4 oC pelletiert. Das Pellet wird 2 mal mit 75% Ethanol gewaschen und anschließend in 30µl Aqua bidest. aufgenommen. Kontrollen der mRNA auf einem Gel und mit dem Photometer erfolgen wie unter 3.1.2 beschrieben. Die Konzentration der mRNA wird auf 0,5 µg/µl eingestellt, bevor sie in Volumina von 8µl aufgeteilt und bei -80 oC gelagert wird. 2x L-Puffer 40 mM Tris-Cl, pH7,6; 1M NaCl; 2 mM EDTA; 0,2% N-Laurylsarkosinat Wasch Puffer I 10 mM Tris-Cl, pH7,6; 0,3 M NaCl; 1 mM EDTA Wasch Puffer II 10 mM Tris-Cl, pH7,6; 0,15 M NaCl; 1 mM EDTA 2.1.4 Überprüfung der Intaktheit der mRNA Die Intaktheit der mRNA wird durch Northern-Blot überprüft. Dazu werden je 0,5 µg mRNA von beiden Stämmen auf einem 1,0% MOPS-Gel aufgetrennt. Die Vakuum-Übertragung der mRNA von dem Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Hybond N+) erfolgt bei 60 Bar und 2 Stunden mit 20X SSC. Die mRNA wird dann unter UV-Licht bei 325 µm für 30 Sek. fixiert. Die Prä-Hybridisierung erfolgt bei 42 oC für 2 Stunden, in 5 ml Prä-Hybridisierungspuffer. Die Hybridisierung erfolgt bei 42 oC über Nacht in 5 ml prä-Hybridisierungspuffer, der 50 ng denaturierte Sonde enthältet. Als Sonde dient ein mit Digoxigenin markiertes Actin-Fragment. Gewaschen wird die Membran dann je zweimal in 100 ml 0,5 x SSC bei RT und in 100 ml 0,1x.

(26) 23 SSC bei 63 oC. Nach einem kurzen Pufferausgleich in Puffer 1 wird die Membran in Puffer 2 für 30 Min. bei RT inkubiert. Die Bindung der Antikörper erfolgt durch eine 30 minütige Inkubation in Puffer2 plus 0,02% Antikörper bei RT. Die Membran wird dann 2 mal für je 15 Min. bei RT in Puffer 1 gewaschen. Nach kurzer Äquilibrierung in Puffer 3 erfolgt die Farbentwicklung in 1 ml Puffer 3, die 3,5 µl X-Phosphat und 4,5 µl NBT enthält, für mehrere Stunden bei RT. Prä-Hybridisierung-Puffer Böhringer Standard-Lösung plus 50% deionisiertes Formamid TAE-Puffer Tris-Acetat, 0,04 M; EDTA, 1 mM; pH 7,5 Das mit Digoxigenin markierte Aktin-Fragment wird durch PCR synthetisiert. Dazu wird ein wenig Blattmaterial von dem Stamm Gus in 0,5 ml H2O gegeben, für eine Minute stark gevortext und anschießend zentrifugiert. Der DNA-haltige Überstand dient dann als Template der PCR. Für die PCR werden folgende Komponenten zusammengeführt:. H2O. auf 25 µl auffüllen. PCR-Puffer. 1x. Mg2+. 1,5 mM. Nukleotide. je 2 mM A, G, C, T und 0,3 mM Digoxigenin-U. Primer Aktin-1. 1 mM. Primer Aktin-2. 1 mM. Taq Polymerase. 1U. Template. 1µl. Aktin-1: 5´-AGT TGT ATG TAG TCT CGT GGA TTC-3´ Aktin-2: 5´-ATG TAT GTT GCT ATT CAG GCT G-3´ Nach einer 2-minütigen initialen Inkubation bei 94oC erfolgt die Amplifikation durch 35 Zyklen: Denaturierung. bei 94 oC. für 30 Sek.. Annealing. bei 68 oC. für 30 Sek.. Elongation. bei 72 oC. für 60 Sek..

(27) 24 Die PCR-Produkte werden auf einem 1% TAE-Agarrose-Gel kontrolliert. Die Überprüfung der Digoxigenin-Markierung erfolgt durch Dot-Blot. Dazu werden die PCRProdukte in fünffachen Zentnerverdünnungen parallel zu denen der Kontrolle auf eine Membran aufgetragen. Die Menge der Digoxigenin-markierten DNA in der Kontrolle ist bekannt. Nach dem Trocknen der Membran erfolgt die Detektierung des Digoxigenins wie oben beschrieben. Die relative Stärke der Signale der Proben im Verhältnis zu denen bei der Kontrolle ist ein Maß für die Effizienz der Markierung. 2.1.5 Überprüfung der Expression des Gus-Gens Die Expression des Gus-Gens wird durch Northern-Blot überprüft. Je 1µg mRNA von beiden Stämmen wird auf einem MOPS-Gel aufgetrennt und geblottet. Als Sonde dient dabei ein mit Digoxigenin markiertes Gus-Fragment (Dig-Gus). Zur Quantifizierung der Stärke der Expression, werden auf dem Gel 0,3, 3 und 30pg Gus-Fragment in nicht markierter Form parallel zu den mRNAs aufgetragen. Blot und Hybridisierung erfolgen wie beschrieben. Die Probe Dig-Gus und das Gus-Fragment in nicht markierter Form werden durch RT-PCR erzeugt (TitanTM One Tube RT-PCR-System, Firma Roche). Als Template der RT-PCR dient die gesamte RNA von Stamm Gus. Die Zusammensetzung der RT-PCR-Komponenten ist:. Dig-Gus. Gus, nicht markiertes. H2O. auf 50 µl auffüllen. auf 50 µl auffüllen. RT-PCR-Puffer. 1x. 1x. Nukeotide. 2 mM dNTPs und 0,3 mM Digoxigenin-U 2 mM dNTPs. Primer Gus-1. 1 mM. 1 mM. Primer Gus-2. 1 mM. 1 mM. DTT. 2,5 µl. 2,5 µl. RNA Inhibitor. 0,2 µl. 0,2 µl. Reverse Transkriptase. 1µl. 1µl. Taq Polymerase. 1µl. 1µl. Gesamte RNA von Gus. 1,8 µl. 1,8 µl. Gus-1: CGACGCTCACACCGATACCATC (Nt1347-1368).

(28) 25 Gus-2: CCATACCTGTTCACCGACGACG (Nt1647-1626) Nach einer 2-minütigen initialen Denaturierung bei 94oC erfolgt die Amplifikation durch 35 Zyklen: Denaturierung. bei 94 oC. für 30 Sek.. Annealing. bei 68 oC. für 30 Sek.. Elongation. bei 68 oC. für 60 Sek.. Die PCR-Produkte werden auf einem Gel kontrolliert. Die Überprüfung der Markierungseffizienz erfolgt wie beschrieben durch Dot-Blot. Die Konzentration des nicht markierten Gus-Fragments wird mittels Photometer bestimmt. 2.1.6 Synthese der cDNA cDNA wird nach dem Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“ von der Firma Clontech synthetisiert. 2.1.6.1 Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“ Das Prinzip des Kits wird im Abb. 2-1 schematisiert. Zur Synthese des ersten cDNA-Stranges bindet man an den PolyA-Schwanz der mRNA einen Oligo(dT)-Anker-Primer. Die terminale Transferase-Aktivität der reversen Transkriptase addiert eine zusätzliche Sequenz, vorzugsweise Oligo(dC), an den neu hergestellten ersten Strang. Ein zweites Oligonukleotid, welches am 3´Ende Oligo(dG) trägt, bindet an das Oligo(dC). Die reverse Transkriptase verwendet dann dieses Oligo(dG)-haltige Oligonukleotid als Template und füllt es zu doppelstrangiger DNA auf, daher wird es auch „template-switch-oligonucleotide“ genannt. Dieses „template-switch-oligonucleotide“ und der Oligo(dT)-Primer enthalten außerdem die Primer-Sequenz für die PCR, durch die die cDNA amplifiziert wird. Die Oligo(dC) wird am effizientesten an den Enden der vollständigen ersten Stränge angehängt, daher ist der überwiegende Teil der synthetisierten cDNAs vollständig..

(29) 26. Poly A RNA 5´. Poly A 3´ 2 1. 1. Oligo dT-Anker- Adaptor 2. PCR- Primer 3. Template-Switch-Adaptor. Poly A 3´. CCC. 3 GGG CCC. Poly A 3´. Ds cDNA. Abb. 2-1: Prinzip des SmartTM PCR cDNA Synthesis Kits. 2.1.6.2 Synthese des ersten cDNA-Strangs Folgende Komponenten werden zusammenpipettiert:. mRNA. 1µl (500ng). OligodT-Anker-Adaptor. 1µl (10pmol). Templat-Switch-Adaptor. 1µl (10pmol). H2O. 2µl. Die Komponenten werden kurz vermischt und zentrifugiert. Nach einer Inkubation bei 72 oC für 2 Min. werden die Reaktionsgefäße für 2 Min. auf Eis gestellt, bevor folgende Zutaten hinzugefügt werden und die Ansätze für 1 Stunde bei 42 oC inkubiert werden:.

(30) 27. DTT. 1µl (20µM). dNTPs. 1µl (10µM). 5x Puffer für die Erststrang-Synthese. 2µl. Power Script Reverse-Transkriptase. 1µl. Die Adaptoren und Primer enthalten dabei die Erkennungssequenzen für Mbo1 (GATC) anstelle der von Ras1 wie bei Clontech. OligodT-Anker-Adaptor: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGATCT(30)N-1N-3´ N-1 = A, G oder C;. N= A, G, C oder T. Template-Switch-Adaptor: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGATCGCGGG-3´ 2.1.6.3 Amplifikation der cDNA durch PCR Folgende Komponenten werden zusammengemischt:. H2O. 80 µl. 10x PCR-Puffer. 10 µl. dNTPs. 2µl (100 mM). PCR Primer. 4µl (100µM). Polymerase Mix. 2µl. Erststrang-cDNA. 2µl. PCR Primer: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGA-3´ Die Amplifikation erfolgt nach folgendem Schema: Initiate Denaturiering dann 16 Zyklen bei:. bei 94oC. für 2 min..

(31) 28 bei 94 oC. Denaturiering. für 30 Sek.. Annealing. bei 65 oC. für 30 Sek.. und Elongation. bei 68 oC. für 6 Min.. Die synthetisierten cDNAs werden auf einem TAE-Gel kontrolliert. 2.1.7 Reinigung der cDNA Man gibt gleiche Volumen von Chloroform/Isoamylalkohol zu den cDNAs, vermischt die Proben durch Vortexen und zentrifugiert sie für 10 Min bei 13, 000g. Der Überstand wird erneut mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und die cDNA dann in 2,5 Vol. Ethanol und 0,1 Vol. NaOAc gefällt. Das cDNA-Pellet wird zweimal mit 75% Ethanol gewaschen und dann in H2O aufgenommen. 2.1.8 Restriktion der cDNA Folgende Bestandteile werden zusammengeführt: cDNA. 5µg. Mbo1. 10 U. 10X Puffer. 5 µl. H2O. auf 50 µl auffüllen. Die Restriktion erfolgt übernacht bei 37 oC. Die geschnittene cDNA wird dann auf einem Gel kontrolliert, gereinigt und nach der Photometer-Messung auf 400 ng/ul eingestellt.. 2.2 Genom-Subtraktion mittels SSH Die Eignung der SSH zur Analyse differenzieller Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wird am Beispiel von Kartoffeln verifiziert. Dazu wird zuerst SSH an Kartoffel-cDNA durchgeführt, dann der Effekt dieser SSH-Subtraktion mittels Southern-Blot verifiziert, und anschließend das SSH-Produkt durch 2D-Gel, Core-PCR und Sequenzierung analysiert. 2.2.1 SSH.

(32) 29 SSH an Kartoffel-cDNA wird nach dem Prinzip des „PCR select cDNA Subtraction Kit“ der Firma Clontech durchgeführt, mit geringfügiger Modifikation bezüglich der Adaptoren. Für SSHG/D dient die mit Mbo1 geschnittene cDNA von Desiree als Driver, die geschnittene cDNA von Gus als Tester. Für SSHD/D fungieren die cDNAs von Desiree als Tester und Driver zugleich. 2.2.1.1 Adaptoren/Primer Die modifizierten Adaptor/Primer enthalten die Erkennungssequenzen von Mbo1, anstelle die von Rsa1 wie bei Clontech (Abb. 2-2):. Adaptor 1. 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C TCG AGC GGC CGC CCG GGC AG-3´ 3´-GGC CCG TCC TAG-5´ Mbo1 Nested Primer 1. Primer 1. 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG-3´. Nested Primer 2 Adaptor 2. 5´-TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG A-3´. 5´-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GA-3´. 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C AGC GTG GTC GCG GCC GAG-3´ 3´-GC CGG CTC CTA G-5´ Mbo1. Abb. 2-2: Adaptoren/Primer der SSH naach Clontech. 2.2.1.2 Ligation der Adaptoren an den Tester Die Tester werden in zwei getrennten Ansätzen nach folgendem Schema mit den Adaptoren ligiert:. Ligation Adaptor. LT1 (Ligation Tester/Adaptor 1) LT2 (Ligation Tester-Adaptor 2) 10 pmol Adaptor 1. 10 pmol Adaptor 2. Tester-cDNA, geschnitten 100 ng. 100 ng. Ligase Puffer. 1x. 1x. Ligase. 200 U. 200 U. H2O. auf 10µl auffüllen. auf 10µl auffüllen.

(33) 30. Je 2 µl von LT1 und LT2 ergeben zusammen den Ligationsansatz LT. Die Ligation erfolgt übernacht bei 17oC. Der Erfolg der Ligation und der Effekt der Suppressions-PCR werden durch PCR überprüft. Als Template dazu werden die Ligationsansätze 1:1000 verdünnt. PCR. P1LT1. P1LT2. P1LT. Negative Kontroll. PCR-Puffer. 1x. 1x. 1x. 1x. Primer 1. 10 pmol. 10 pmol. 10 pmol. 10 pmol. Mg2+. 1,5 mM. 1,5 mM. 1,5 mM. 1,5 mM. dNTPs. 2 mM. 2 mM. 2 mM. 2 mM. Template. LT1, 1µl. LT1, 1µl. LT, 1µl. H2O. auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen. Die anfängliche 5-minütige Inkubation bei 75oC in Abwesenheit von Polymerase dient zur Abkoppelung der nicht ligierten, kürzeren Stränge der Adaptoren. 1 U Taq Polymerase wird dann dazugegeben, um die längeren Adaptor-Stränge durch eine 10-minütigen Inkubation bei 72 oC zu verdoppeln. Nach einer anfänglichen 3-minütigen Inkubation bei 94oC folgt die Amplifikation mit 27 Zyklen: Denaturierung. bei 94 oC. für 30 Sek.. Annealing. bei 66 oC. für 30 Sek.. Elongation. o. bei 72 C. für 90 Sek.. Die PCR-Produkte werden auf einem 1,5%igen TAE-Gel kontrolliert. 2.2.1.3 Subtraktive Hybridisierung Die Subtraktion erfolgt durch zwei Hybridisierungsschritte. In der ersten Hybridisierung werden die mit unterschiedlichen Adaptoren versehenen Tester in getrennten Ansätzen mit Überschuss an Driver subtrahiert und die molare Konzentration verschiedener Tester-Fragmente ausgeglichen. Das geschieht in folgendem Ansatz: Tester. H1. H2. 1,5µl LT1. 1,5µl LT2. Driver (geschnittene Desiree-cDNA) 1,5µl x 400 ng/µl 1,5µl x 400 ng/µl 4X Hybridisierungspuffer. 1 µl. 1 µl.

(34) 31 4X Hybridisierungspuffer 30mM Tris-HCl , pH8; 3mM EDTA, pH8; 2M NaCl Nach einer 2-minütigen Denaturierung bei 98 oC werden die Proben für 7 Stunden bei 63 oC inkubiert. Kurz vom Ende der ersten Hybridisierung werden 100ng Driver in 1x Hybridisierungspuffer durch eine 2-minütige Inkubation bei 98 oC denaturiert. Die beiden Ansätze der ersten Hybridisierung werden dann ohne erneute Denaturierung in Anwesenheit des frisch denaturierten Drivers zusammengeführt und bei 63 oC übernacht inkubiert. Um die unspezifischen Bindungen zu vermindern, wird wenige Minuten vor Ende der zweiten Hybridisierung zu dem Hybridisierungsansatz 90µl H2O zugegeben. 2.2.1.4 Amplifikation der SSH-Produkt mittels „Nested-PCR“ Die erste PCR erfolgt wie im 2.2.1.2 beschrieben, außer dass der zweite Hybridisierungsansatz unverdünnt als Template fungiert. Das Produkt der ersten PCR wird 1:10 verdünnt und als Template für die Nested-PCR verwendet. Als Positive-Kontrolle wird verdünnte LT als Template verwendet.. Template. 1µl. PCR-Puffer. 1x. Mg2+. 1,5 mM. dNTPs. 2 mM. Nested-Primer 1 und 2. 10 pmol. Taq Polymerase. 1U. H2O. auf 25 µl auffüllen. Nach einer anfänglichen 2-minütigen Denaturierung bei 94 oC folgen 12 Zyklen Amplifikation bei: Denaturing. bei 94 oC. für 30 Sek.. Annealing. bei 68 oC. für 30 Sek.. Elongation. bei 72 oC. für 90 Sek..

(35) 32 2.2.2 Überprüfung der SSH-Produkte durch Southern-Blot Mittels Southern-Blot wird überprüft, ob durch SSH die differentiell erprimierten Gene angereichert wurden. Als Sonde dienen dabei die mit Digoxigenin markierten SSH-Produkte, die auf die cDNA vom Tester und Driver hybridisiert werden. Je 1µg geschnittene cDNA von beiden Stämme wird auf einem 1,2%igen TAE-Gel aufgetrennt. Der Vakuum-Blot der cDNA auf die positiv geladenen Nylonmembranen erfolgt bei 60 Bar und 2 Stunden mit 0,4 M NaOH. Die Hybridisierung erfolgt wie oben beschrieben. Die Markierung der SSH-Produkte wird mit einem „Random Primed DNA Labeling Kit“ der Firma Roche durchgeführt. Man mischt dabei 10µl (1µg) gereinigte SSHG/D-Produkte mit 2 µl Hexanukleotiden (10 µM), kocht die Probe für10 Min und stellt sie sofort auf Eis. Anschließend gibt man folgende Komponenten dazu und inkubiert die Proben für 15 Stunden bei 37 oC: 10X Dig-Labeling-Mix, 2µl 10X Random-Priming-Puffer, 2µl und Klenow Enzym, 1µl 2.2.3 Analyse der SSHG/D-Produkte Das SSHG/D-Produkt wird auf den 2D-Gelen aufgetrennt und das Fragment mit höchster DNAKonzentration dann mittels „Core-PCR“ erneut amplifiziert. Sequenzierung und das anschließende Alignment der Sequenz mittels Blastn dient zur Klärung der Identität des SSH-Produktes. 2.2.3.1 2D-Gel Auftrennung Zuerst werden 10 µl von dem durch PCR amplifizierten SSHG/D-Produkt wie herkömmlich nach ihrer Größe auf einem 1,5%igen TAE-Agarose-Gel aufgetrennt. Der Gel-Streifen, auf dem sich das SSH-Produkt befindet, wird ausgeschnitten und quer zur Laufrichtung an die Obererkante eines zweiten 2%igen Agarrose-Gels angelegt und bei 1,5 V/cm übernacht aufgetrennt. Dieses 2. Gel enthält einen Farbstoff (Bisbenzimid) von 1µg/ml, der vorzugsweise in AT-Clustern der DNAHelix interkaliert. Dieser Farbstoff wird durch eine kovalent gebundene Polyethylenglycol-Kette (PEG) modifiziert. DNA-Fragmente gleicher Länge werden im zweiten Gellauf je nach AT-Gehalt.

(36) 33 und damit je nach Menge des gebundenen Farbstoff-PEG-Konstruktes verschieden stark bei der Wanderung im elektrischen Feld des Gels behindert. Der Farbstoff ist kommerziell erhältlich (ehem. Hansa Analytik). 2.2.3.2 Core-PCR Aus der Mitte des stärksten DNA-Signals wird ein kleines Stück aus dem 2D-Gel ausgestanzt und in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt. Die PCR wird anschließend wie in 2.2.1.4 (nur die zweite PCR) beschrieben zwecks Reamplifikation durchgeführt. 2.2.3.3 Direkte Sequenzierung Das Produkt der Core-PCR wird sequenziert (Auftragssequenzierung). Als Sequenzierungsprimer dient einer der beiden Nested-Primer. Das Sequenzen-Alignment erfolgt mit der Software „Blastn“. 2.3 Überprüfung der DSC DSC wird als eine sehr elegante Methode zur Genom-Subtraktion beschrieben. Jedoch wird diese Methode bisher von keinem unabhängigen Forscher bestätigt, oder gar benutzt. Um das Prinzip von DSC zu überprüfen, wird einerseits ein Modellversuch aus der DSC-Literatur wiederholt, und anderseits das Prinzip der DSC an eukaryontischer cDNA getestet. 2.3.1 DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments In der Literatur wird effiziente Subtraktion durch DSC am Beispiel eines sehr einfachen Modellsystems beschrieben. Sowohl der Tester als auch der Driver stammen dabei von dem selben Lambda-Fragment. Der Tester würde durch den Driver subtrahiert, wodurch im DSC-Produkt kein intakter Tester mehr vorhanden wäre, der durch PCR mit den Tester-Primer erneut amplifiziert werden kann. Dieser Versuch wird wiederholt. 2.3.1.1 Vorbereitung des Tester/Driver.

(37) 34 Zuerst wird 1 µg von der mit HindIII/EcoRI geschnittene Lambda-DNA auf einem 1%-igen TAEAgarose-Gel aufgetrennt und das 564 Bp-Fragment aus dem Gel eluiert, gereinigt, quantifiziert und für die Ligation verwendet:. Ligation. LT (Ligation-Tester). LD (Ligation-Driver). Adaptor. 10 pmol Tester-Adaptor. 10 pmol Driver-Adaptor. Lambda Fragment 1ng. 1 ng. Ligase Puffer. 1x. 1x. Ligase. 100 U. 100 U. H2O. auf 10µl auffüllen. auf 10µl auffüllen. Tester-Adaptor: 5´-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3´ 3´-AGTGGCGTTCGA-5´ Driver-Adaptor: 5´-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3´ 3´-GTACTTGTTCGA-5´ Zur Herstellung eines Adaptors werden gleiche Mengen zweier Primer-Stränge zusammengeführt, für 5 Min. bei 65 oC denaturiert, dann langsam auf 16 oC (in 4 Stunden) abgekühlt. Die Ligation erfolgt für 2 Stunden bei 17 oC. Die längeren Stränge der Adaptoren fungieren auch als Primer zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons durch PCR:. T (Tester-Amplikon). D (Driver-Amplikon). Template. 1µl LT. 1µl LD. PCR-Puffer. 1x. 1x. Mg2+. 1,5 mM. 1,5 mM. dNTPs. 2 mM. 2 mM. Primer. 10 pmol Tester-Primer. 10 pmol Driver-Primer. Taq Polymerase. 1U. 1U. H2O. auf 25 µl auffüllen. auf 25 µl auffüllen. Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 35 Zyklen bei:.

(38) 35. Denaturierung bei 94 oC für 1Min., Annealing bei 68 oC für 1 Min., und Elongation bei 72 oC für 1 Min. Nach der finalen Elongation bei 72 oC für 3 Min. werden die PCR-Produkte auf einem Gel kontrolliert, die Tester- und Driver-Amplikons aus dem Gel eluiert und quantifiziert. 2.3.1.2 Subtraktive Hybridisierung Die subtraktive Hybridisierung erfolgt bei 67 oC, in einem 0,5 M NaCl-haltigen Puffer für drei Stunden, mit einem Tester/Driver-Verhältnis von 1:100 und einer Tester-Menge von 1 ng. 1 ng Tester und 100 ng Driver werden zusammen gereinigt, in 32 µl 3x EE Puffer ( 30 mM EPPS, pH8; 3 mM EDTA) aufgenommen und mit Öl überschichtet. Nach einer 5-minütigen Denaturierung bei 99 oC werden 8 µl 5M NaCl dazugegeben. Darauf folgt eine 3-stündige Inkubation bei 67 oC, bevor die DNA erneut gereinigt und in 20 µl H2O aufgenommen wird. Die anschließende MBNBehandlung erfolgt für 30 Min bei 37 oC in:. DNA. 20 µl. MBN. 10 U. 10x Puffer. 3µl. H2O. auf 30 µl auffüllen. Die MBN-Reaktion wird dann zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und 1µl der DNA in 40 µl H2O überführt. Diese verdünnte DNA dient als Template für die PCR zur Überprüfung der Subtraktion. Die restliche DNA wird erneut gereinigt und für die zweite Subtraktion in 32 µl 3x EE Puffer aufgenommen. Insgesamt werden 3 Runden Subtraktion durchgeführt. 2.3.1.3 Amplifikation der DSC-Produkte durch PCR Die Amplifikation der DSC-Produkte durch PCR erfolgt mit dem gleichen PCR-Profil wie in 2.3.1.1 beschrieben (wie bei der Synthese der Tester-Amplikons)..

(39) 36. 2.3.2 DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird überprüft, ob differenzielle Genexpression in Eukaryonten mit DSC analysiert werden kann. 2.3.2.1 Anwendung der DSC auf Kartoffel-cDNA Die mit Mbo1 verdaute Desiree- cDNA dient dabei als Driver, die verdaute Gus-cDNA als Tester. Zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons wird folgende Ligation angesetzt:. Ligation. LT (Ligation-Tester). LD (Ligation-Driver). Adaptor. 100 pmol Tester-Adaptor *. 100 pmol Driver-Adaptor *. DNA. 100 ng geschnittene Gus-cDNA. 100 ng geschnittene Desiree-cDNA. Ligase Puffer. 1x. 1x. Ligase. 200 U. 200 U. H2O. auf 10µl auffüllen. auf 10µl auffüllen. * Die Adaptoren beinhalten die Erkennungssequenzen von Mbo1. Tester-Adaptor: 5´-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3´ 3´-AGTGGCGTCTAG-5´ Driver-Adaptor: 5´-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3´ 3´-GTACTTGTCTAG-5´ Die Ligation erfolgt übernacht bei 17 oC. Die PCR zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons erfolgt in 20 Zyklen, mit gleichen PCR-Profilen wie in 2.3.1 beschrieben. Die Subtraktion erfolgt mit 100 ng Tester und 10 µg Driver. Die Zeit der Hybridisierung wird auf 12 Stunden verlängert. Insgesamt werden 4 Runden Subtraktion durchgeführt. Alle anderen.

(40) 37 ungenannten Schritte erfolgen wie in 2.3.1 beschrieben.. 2.3.2.2 Überprüfung der DSC-Produkte mittels Southern-Blot Zwei Fragen sollen durch die Southern-Blots beantwortet werden: 1) ist das DSC-Produkt spezifisch für den Tester? 2) Ist das Reporter-Target (Gus) noch in dem DSC-Produkt aufzufinden? Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden Informationen über die Effektivität der Subtraktion sowie die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch DSC liefern. Zur Beantwortung der Frage 1 wird das durch Random-Priming mit Digoxigenin markierte DSCProdukt auf je 200 ng Tester- und Driver-cDNA hybridisiert. Zur Beantwortung der Frage 2 wird das Dig-Gus ( 2.1) mit dem DSC-Produkt hybridisiert. Als Positive Kontrolle werden 3 pg nicht markiertes Gus-Fragment parallel zu dem DSC-Produkt auf das Gel aufgetragen. 2.3.2.3 Identifizierung des DSC-Produktes Zur Identifizierung des DSC-Produktes wird dieses kloniert, einige positive Klone willkürlich ausgewählt, deren Plasmide isoliert und die Inserts sequenziert. Klonierung Die DSC-Produkte werden mit dem „TOPO TA Cloning Kit for Sequencing“ Kit von der Firma Invitrogen kloniert. Die Ligation des DSC-Produktes und der Plasmide erfolgt in folgender Zusammensetzung:. Frische DSC-Produkte aus der PCR. 1µl. Salz (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2). 1µl. Plasmide. 1µl. H2O. 3µl.

(41) 38. Die Probe wird für 30 Min bei RT inkubiert und dann sofort für die Transformation verwendet. 2µl des Ligations-Ansatzes werden zu 50 µl frisch aufgetauten, kompetenten E.coli gegeben und für 10 Min. auf Eis gestellt. Dann wird 500 µl SOC-Puffer zu den Zellen gegeben und die Zellen bei 37 oC für 50 Min inkubiert. Die E. coli werden anschließend auf LB-Agarose-Platten, die 5mg/L Kanamycin enthalten, ausplattiert und über Nacht bei 37 oC inkubiert. Isolierung der Plasmide Die meisten in Anwesenheit des Antibiotikums entstandenen Klone beinhalten auch Plasmide. Einige Klone werden zufällig ausgewählt und in je 1,5 ml LB-Medium mit 5 mg/L Kanamycyn bis zum Ende der Log-Phase kultiviert. Die Bakteriensuspension werden kurz zentrifugiert, mit PBS-Puffer gewaschen, in 100 µl RNase Hhaltigem GTE Puffer erneut suspendiert und für 5 min. bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl NaOH/SDS werden die Proben durch leichtes Schütteln vermischt und für 5 min. auf Eis gestellt, dann 150 µl PAS-Puffer zugegeben, durch kurzes Vortexen vermischt und erneut für 5 min. auf Eis gelagert. Nach der Zentrifugation bei 13,000 g für 20 min. wird der Plasmid-haltige Überstand zweimal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:48:2) extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Nach zweimal Waschen mit 75% Ethanol werden die Plasmide-Pellets in je 10 µl H2O aufgenommen. RNAase H haltiger GTE-Puffer 50 mM Glucose; 25 mM TrisHCl, pH8; 10 mM EDTA; 0,1 µg/µl RNase H NaOH/SDS 0,18 N NaOH; 1% SDS PAS-Puffer 29,5 ml Essigsäure, mit KOH-Plättchen auf pH4,8 einstellen, mit H2O auf 100 ml auffüllen. Sequenzierung.

(42) 39. Die Sequenzierung der Inserts wird als Auftragsarbeit vergeben. Als Sequenzierungsprimer dienen die T7- oder SP6-Sequenzen im Plasmide. Das Sequenz-Alignment erfolgt mit der Software Blastn. 2.4 Suche nach der Ursache des Versagens der DSC Die Wiederholung des DSC-Modellversuches ist misslungen. Auch DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA zeigt keinerlei Effekt der Subtraktion. Verschiedene Faktoren, darunter die MBNAktivität und die Adaptoren, werden überprüft, um herauszufinden, was für das Nichtfunktionieren der DSC ursächlich ist. 2.4.1 Überprüfung der MBN-Aktivität Um festzustellen, ob die fehlende MBN-Aktivität für das Versagen der DSC verantwortlich ist, wird die MBN-Aktivität überprüft: Zwei Ansätze, je 8 µl (100 ng) gereinigte DNA (die überschüssigen DSC-Tester aus 2.3.1) werden in Gefäße gegeben: Die Probe 1 bleibt unbehandelt; die Probe 2 wird für 2 Min denaturiert und sofort auf Eis gestellt, dann 1µl 10x MBN-Puffer und 1µl (0,1 U) MBN zugegeben. Die MBNBehandlung erfolgt für 10 Min. bei 37 oC. Der Effekt der MBN-Behandlung wird auf einem Gel kontrolliert. 2.4.2 Überprüfung des Zusammenhanges zwischen dem Aufbau der Adaptoren und der Funktionalität der DSC Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die fehlende Funktionalität der DSC mit dem Design der Adaptoren zusammenhängt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wird ein Modellsystem entwickelt, wobei zugleich zwei Tester, die sich nur durch ihre Adaptoren voneinander unterscheiden, von einem Driver zu subtrahieren versucht werden. Das DSC-Driver-Amplikon von 2.3.1 dient erneut als Driver. Das DSC-Tester-Amplikon von 2.3.1 und ein zweiter Tester werden zusammen im gleichen Reaktionsgefäß zu subtrahieren versucht. Der neue Tester besteht aus dem 564 Bp Lambda-Fragment sowie je 11 Bp Überhang an seinen beiden Enden. Der Tester-Überhang in den Heterohybriden beträgt bei der DSC 24 Bp, bei der Subtraktion mit dem neuen Tester ist er jedoch mit 11 Bp viel kürzer..

(43) 40. Der zweite Tester, der wegen seiner im Vergleich zum DSC-Tester kürzeren Sequenz als Tk bezeichnet wird, wird durch „Nested-PCR“ hergestellt. Dazu werden folgende Primer verwendet: Tk1L 5´- CAGAGAGTCGAAGCTTTAGAGCGATTTATCTTCTG -3´ Tk2L 5´- CAGAGAGTCGA AGC TTT CCT GAC GGA ATG TTA ATT -3´ Tk1 5´- CAGAGAGTCGAAGCTTTAGAGC -3´ Tk2 5´- CAGAGAGTCGAAGC TTT CCT GAC -3´ Wobei die unterstrichenen Teile der Primer den 11 Bp Tester-Überhängen in den Heterohybriden entsprechen. Die nicht unterstrichenen Teile der Primer stammen von den Sequenzen des LambdaFragmentes. Die erste PCR erfolgt in folgendem Ansatz:. Template. 1 ng Lambda-Fragment. PCR-Puffer. 1x. Mg2+. 1,5 mM. dNTPs. 2 mM. Primer. Tk1L, Tk2L, je 10 pmol. Taq Polymerase. 1U. H2O. auf 25 µl auffüllen. Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 5 Zyklen bei: Denaturierung bei 94 oC für 1Min.,.

(44) 41 Annealing bei 68 oC für 1 Min., und Elongation bei 72 oC für 1 Min.. Das Produkt der ersten PCR dient als Template für die zweite PCR: Template. 0,5 µl PCR-Produkt aus erster PCR. PCR-Puffer. 1x. Mg2+. 1,5 mM. dNTPs. 2 mM. Primer. Tk1, Tk2, je 10 pmol. Taq Polymerase. 1U. H2O. auf 25 µl auffüllen. Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 30 Zyklen bei: Denaturierung bei 94 oC für 1Min., Annealing bei 68 oC für 1 Min., und Elongation bei 72 oC für 1 Min.. Das PCR-Produkt Tk wird auf einem Gel kontrolliert, aus dem Gel eluiert und mittels Photometer quantifiziert. Je 1ng von Tk und DSC-Tester-Amplikon sowie 100 ng DSC-Driver-Amplikon werden zusammengeführt, mit Ethanol gefällt und in 32 µl 3x EE Puffer aufgenommen. Die weiteren Schritte der Subtraktion sind wie bei der DSC beschrieben. Die erneute Amplifikation des Produktes der Tk-Subtraktion erfolgt wie oben beschrieben mittels einer PCR. 2.5 Entwicklung der NSC Nachdem gezeigt wurde, dass die fatale Schwäche der DSC auf deren Adaptoren/Primer zurückgeht, werden entsprechende neue Adaptoren/Primer für eine effiziente Subtraktion konstruiert. Das daraus resultierende neue Subtaktionssystem mit innovativen Adaptoren/Primern wird später als NSC (Negative Subtraktion Chain) bezeichnet. NSC und DSC unterscheiden sich lediglich durch deren Adaptoren/Primer. Für NSC werden die.

(45) 42 folgenden Adaptoren/Primer konstruiert: NSC-Tester-Adaptor (BamH1): A-Ta: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACA-3´ A-b: 3´-GAGAGTGTTCGA-5´ NSC-Tester-Primer (BamH1): P-T: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACAAGCT-3´ NSC-Driver-Adaptor (BamH1): A-Da: 5´-GACACTCTCACCTCTCACA-3´ A-b: 3´-GAGAGTGTTCGA-5´ NSC-Driver-Primer (BamH1): P-D: 5´-GACACTCTCACCTCTCACAAGCT-3´ NSC und DSC werden in parallelen Ansätzen am Beispiel des 564 Bp Lambda-Fragments überprüft. Abgesehen von den unterschiedlichen Sequenzen der Adaptoren/Primer erfolgen alle Schritte der Subtraktion in gleicher Weise und wie in 2.3.1 beschrieben. 2.6 Subtraktion mittels SSH/NSC (SNH) Die beiden Techniken, SSH und NSC, werden zur Analyse differenzieller Genexpression in Eukaryonten kombiniert. Die Idee, auf der diese Kombination beruht, ist, zuerst mittels SSH das Target anzureichern, dann mittels NSC den restlichen Hintergrund zu eliminieren. Das Prinzip der SNH (subtraktive, negative Hybridisierung), wird am Beispiel von Kartoffel-cDNA überprüft. Ferner wird die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression in Eukaryonten durch SNH festgestellt, und diese Methode bezüglich der Effektivität der Subtraktion sowie der Sensitivität der Detektion optimiert. 2.6.1 Subtraktion mittels SNH am Beispiel Kartoffel-cDNA Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird das Prinzip der SNH überprüft. Als Driver dient dabei die Desiree-cDNA, als Tester die Gus-cDNA. Die Identität des SNG/D-Produktes wird durch SouthernBlot, Klonierung und Sequenzierung festgestellt..