Tierärztliche Hochschule Hannover
Fachgebiet Allgemeine Radiologie und Medizinische Physik
Evaluation der knöchernen Integration von
bioresorbierbaren Knochenimplantaten im Mausmodell sowie der simulierten Vaskularisation in Phantomen mittels
Mikro-Computertomographie
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
– Doctor rerum naturalium – (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Christian Martin Seiler Oettingen i. Bay.
Hannover 2019
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Tag der mündlichen Prüfung:
Medizinische Physik
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ.-Prof Dr. rer. nat. Hermann Seifert
Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte
Univ.-Prof. Dr. med. vet. Jürgen Rehage
13. Mai 2019
„A good scientific theory should be explicable to a barmaid“
Ernest Rutherford – Physiker (NZL)
Folgende Publikation ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit entstanden und wurde zur Publikation angenommen:
Osteointegration of Porous Poly-ε-Caprolactone-Coated and Previtalised Magnesium Implants in Critically Sized Calvarial Bone Defects in the Mouse Model
Christian Seiler†, Michael Grau†, Laura Roland, Julia Matena, Claudia Windhövel, Michael Teske, Hugo Murua Escobar, Matthias Lüpke, Hermann Seifert,
Nils-Claudius Gellrich, Heinz Haferkamp and Ingo Nolte Materials 11, 6 (veröffentlicht am 21. Dezember 2017)
†Die beiden Autoren Christian Seiler und Michael Grau trugen in gleicher Weise zu dieser Arbeit bei, wobei Christian Seiler die mikro-computertomographische Auswertung durchführte und Michael Grau die histologische Auswertung.
Folgende Publikation ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit entstanden und wurde zur Publikation eingereicht:
Determining the volume of fluid filled microchannels in micro-computed tomography below the resolution limit – a pilot study
Christian Seiler, Matthias Lüpke, Jan-Peter Bach, Hermann Seifert
eingereicht beim Journal Acta Veterinaria Scandinavica am 20. November 2018
47. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für medizinische Physik (DGMP) Würzburg 07-10.09.2016
Computertomographische Auswertung der knöchernen Integration von prävitalisierten PCL beschichteten Magnesiumimplantaten im Mausmodell C. Seiler, M. Grau, L. Roland, J. Matena, C. Windhövel, M. Lüpke, I. Nolte, H. Seifert
48. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für medizinische Physik (DGMP) Dresden 10.09.-13.09.2017
Bestimmung des flüssigkeitsgefüllten Hohlraumvolumens von Mikrokanälen in knochenähnlichen Modellen mittels Mikrocomputertomographie (µCT)
C. Seiler, M. Lüpke, F. Goblet, J.-P. Bach, H. Seifert
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 (Mikro-)Computertomographie ... 11
2.2 Knochenwachstum ... 13
2.3 Knochenimplantate ... 14
2.4 Titanimplantate ... 15
2.5 Magnesiumimplantate ... 15
2.6 Beschichtungen und Prävitalisation von Implantaten ... 16
2.7 Vaskularisation ... 17
2.8 Vaskularisation eines Implantats ... 18
3 Material und Methoden ... 19
3.1 Studie zur knöchernen Integration und Degradation von beschichteten und prävitalisierten Magnesiumimplantaten im Mausmodell mittels Mikro- Computertomographie ... 19
3.1.1 Implantate ... 19
3.1.2 Versuchstiere ... 20
3.1.3 Anfertigung der µCT-Scans ... 21
3.1.4 Statistische Auswertung ... 23
3.2 Pilotstudie zur Bestimmung des Volumens von flüssigkeitsgefüllten Mikrokanälen im Mikro-Computertomographen unterhalb der Auflösungsgrenze ... 24
3.2.1 Herstellung der Mikrokanal-Phantome ... 24
3.2.2 Analyse des Mikrokanalvolumens ... 25
3.2.3 Anfertigung der µCT Scans ... 27
3.2.4 Auswertung der µCT Scans ... 27
3.2.5 Statistische Analyse ... 28
4 Ergebnisse ... 29
4.1 Studie zur knöchernen Integration und Degradation von beschichteten und prävitalisierten Magnesiumimplantaten im Mausmodell mittels Mikro- Computertomographie ... 29
4.2 Pilotstudie zur Bestimmung des Volumens von flüssigkeitsgefüllten Mikrokanälen im Mikro-Computertomographen unterhalb der Auflösungsgrenze ... 53
5 Diskussion ... 71
6 Zusammenfassung ... 81
9 Abkürzungsverzeichnis ... 98 10 Danksagungen ... 99
Einleitung
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1 Einleitung
Die Mikro-Computertomographie (µCT) ist ein auf Röntgenstrahlen basierendes bildgebendes Verfahren, das Querschnittsbilder von Objekten erstellen kann, ohne diese dabei zu zerstören (STAUBER u. MÜLLER 2008). Daher findet die µCT in verschiedensten Bereichen Anwendung, vor allem aber in der Medizin. Besonders bei präklinischen Studien an Versuchstieren, die das Knochenwachstum oder den Knochenaufbau betreffen, wird die µCT bevorzugt eingesetzt (HOLDSWORTH u.
THORNTON 2002).
Darunter fällt auch die Untersuchung des Heilungsverlaufes von mit Implantaten versehenen Knochendefekten in der Schädelkalotte von Mäusen. Hierbei sind verschiedenste Parameter interessant. Besonders wichtig sind unter anderem ein guter Implantat-Knochen-Kontakt (BIC), das Knochenwachstum im Allgemeinen sowie eine schnelle Vaskularisation (SANTOS u. REIS 2010; BERNHARDT et al.
2012). Bei bioresorbierbaren Implantaten aus Magnesium spielt zusätzlich noch die Degradation des Implantats eine entscheidende Rolle. Die genaueste und als Referenz geltende Methode, um diese Parameter zu untersuchen, ist die histologische Untersuchung (HOLDSWORTH u. THORNTON 2002). Hierbei wird das Implantat beziehungsweise das betreffende Organ entnommen, und es werden davon mikrometerdünne Gewebsschnitte angefertigt. Diese Schnitte können gefärbt und anschließend unter dem Mikroskop betrachtet und beurteilt werden. Die Entnahme des Implantats ist für das Versuchstier jedoch meist tödlich. Möchte man die oben genannten Parameter mittels histologischer Untersuchung im zeitlichen Verlauf beurteilen, so muss man zu jedem Zeitpunkt eine repräsentative Anzahl an Versuchstieren opfern. Dies führt bei einer größeren Studie über mehrere Monate mit mehreren verschiedenen Implantatsvarianten zu einer sehr großen Zahl an Versuchstieren. Tierversuche sind in der Wissenschaft unerlässlich, dennoch sollten sie auf ein Minimum beschränkt werden. William Russel und Rex Burch prägten 1959 das 3R-Prinzip (Replace, Reduce, Refine – Vermeiden, Verringern, Verbessern), das auch heute noch als ethische Richtlinie beim Einsatz von Versuchstieren gilt (RUSSELL u. BURCH 1959; TIERSCHUTZGESETZ: ABSCHN. 5 - TIERVERSUCHE 2018). Der Einsatz der Computertomographie (CT) als nicht-invasives bildgebendes
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Verfahren bietet die Möglichkeit den Bedarf an Versuchstieren entsprechend des 3R- Prinzips zu reduzieren.
Daher soll in der vorliegenden Arbeit im Rahmen einer Implantats- und einer Phantomstudie evaluiert werden, inwieweit sich die Ergebnisse der Untersuchungen von µCT und histologischer Untersuchung decken und wo die Stärken und Schwächen der jeweiligen Verfahren liegen. Hierzu wurden prävitalisierte und beschichtete Magnesiumimplantate in die Schädelkalotte von Mäusen implantiert und die knöcherne Integration sowie die Degradation des Magnesium-Implantats in einem Vier-Wochen-Abstand über einen Zeitraum von 12 Wochen im µCT untersucht. Die Ergebnisse wurden anschließend mit den Ergebnissen einer histologischen Untersuchung verglichen.
Die Abmessungen der neugebildeten Blutgefäße sind jedoch so klein, dass sie unterhalb der Auflösungsgrenze des eingesetzten µCTs liegen und deshalb nicht direkt detektiert werden können. Deshalb wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, das es ermöglicht, die Vaskularisation eines Implantats untersuchen zu können, ohne die einzelnen Blutgefäße direkt sichtbar zu machen.
Dazu wurden spezielle Phantome mit Mikrokanälen angefertigt (BELLAN et al. 2009), die ein frisch vaskularisiertes Implantat simulieren. Diese Phantome wurden in verschiedene Kontrastmittelkonzentrationen gelegt und im µCT gescannt. Aus den unterschiedlichen CT-Zahlen zwischen Scans mit und ohne Kontrastmittel sollen Rückschlüsse auf das Gefäßvolumen gezogen werden, um damit die simulierte Vaskularisation beurteilen zu können.
Literaturübersicht
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2 Literaturübersicht
2.1 (Mikro-)Computertomographie
Die Computertomographie ist ein auf Röntgenstrahlen basierendes bildgebendes Verfahren und daher besonders für die Beurteilung von knöchernen Strukturen geeignet. Bei den meisten CTs rotiert das System aus Röntgenröhre und Detektor um den Patienten, sodass sehr viele Schwächungsprofile aus verschiedenen Winkeln, die sogenannten Projektionen, erzeugt werden. Der zugehörige Bildcomputer berechnet aus diesen Projektionen mit Hilfe mathematischer Algorithmen (z. B. gefilterte Rückprojektion) Schnittbilder des Patienten (MIHALJEVIC et al. 2009). Dabei haben unter anderem der Detektor (Anzahl und Größe der Detektorelemente), die Röntgenröhre (Brennfleckausdehnung) und die Zahl der Projektionen maßgeblichen Einfluss auf die räumliche Auflösung eines Schnittbildes (STAUDE u. GÖBBELS 2011). Klinische CTs erreichen eine Voxelgröße (Voxel = Volume Matrix Element) von nur wenigen hundert Mikrometern.
µCTs und nano-CTs erreichen sogar Voxelgrößen von nur wenigen Mikrometern bis sogar in den Nanometerbereich hinein (KAMPSCHULTE et al. 2016). Für diese höhere räumliche Auflösung bedarf es allerdings einer deutlich längeren Untersuchungszeit, um ein adäquates Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. So benötigen µCT-Scans oft mehrere Minuten, während klinische CTs für den gleichen Abschnitt nur wenige Sekunden benötigen (CNUDDE u. BOONE 2013;
BRAUWEILER et al. 2017; EPAH et al. 2018).
Für jedes Voxel wird ein Schwächungskoeffizient µ berechnet, der die Schwächung der Röntgenstrahlung im Voxel beschreibt. Dieser Wert wird jedoch nicht als absolute Größe, sondern als relative Abweichung des absoluten Schwächungswertes von einem Standardwert (Wasser) angegeben. Die sogenannte CT-Zahl ergibt sich entsprechend
− ℎ = − ∙ 1000
Die Einheit der CT-Zahl heißt Hounsfield Unit und wird mit HU abgekürzt.
Definitionsgemäß haben Wasser und wasseräquivalentes Gewebes eine CT-Zahl von 0 HU. Da Luft Röntgenstrahlen fast gar nicht absorbiert (µLuft = 0 cm-1), besitzt
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Luft eine CT-Zahl von -1000 HU (Minimum der Skala) (BRYANT et al. 2012).
Knochen hat eine CT-Zahl zwischen 400 und 3000 HU, je nach der chemischen Zusammensetzung des Knochens und der Energie der Röntgenstrahlung. Analysiert man die CT-Zahl des Knochens kann der Mineralisierungsgrad des jeweiligen Knochens abgeschätzt werden (BURGHARDT et al. 2008). Je mehr Mineralien bereits in die Knochenmatrix integriert wurden, desto höher sind seine Röntgenschwächung und damit seine CT-Zahl.
Mit Ausnahme von Knochen und Luft haben die meisten Gewebearten im Körper sehr ähnliche CT-Zahlen, sodass diese auf CT-Aufnahmen häufig nicht oder kaum differenziert werden können. Diesem Problem kann man mit dem Einsatz verschiedener Kontrastmitteln begegnen, da sich deren Absorptionsverhalten aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften (Ordnungszahl, Dichte) deutlich von wasseräquivalentem Gewebe unterscheidet. Jodhaltige Kontrastmittel haben wegen der hohen Ordnungszahl von Jod (Z=53) eine sehr hohe CT-Zahl, sodass sie auf CT- Bildern sehr hell dargestellt werden und gut zu erkennen sind. Sie werden wegen ihrer Wasserlöslichkeit meist intravenös verabreicht, verteilen sich im Blutkreislauf und eignen sich besonders zur Visualisierung von Blutgefäßen.
Das µCT ermöglicht somit ohne invasive Eingriffe detaillierte Blicke in das Innere des Organismus und eignet sich für in-vivo Studien. In zahlreichen Studien wurde das µCT daher zur in-vivo Beurteilung der knöchernen Integration von Implantaten eingesetzt (CHAPPARD et al. 2005; NYMAN et al. 2009; SCHAMBACH et al. 2010;
CASTELLANI et al. 2011). Jedoch gilt die histologische Untersuchung nach wie vor als Goldstandard, weshalb die Ergebnisse aus µCT und Histologie stets miteinander verglichen werden sollten (CHAPPARD et al. 2005; VANDEWEGHE et al. 2013; HE et al. 2017). Auch zur Beurteilung der Vaskularisation wird das µCT zunehmend eingesetzt. Unter Einsatz von Kontrastmitteln können ganze Gefäßbäume dreidimensional dargestellt werden (YAKUBOVICH et al. 2015; EPAH et al. 2018).
Mit den neuesten nano-CT Geräten sind sogar Darstellungen bis in den Kapillarbereich hinein möglich (SALMON u. SASOV 2007; KAMPSCHULTE et al.
2016).
CT-Studien über die indirekte, quantitative Bestimmung der Vaskularisation infolge unterschiedlicher CT-Zahlen findet man unter dem Namen „dynamic contrast- enhanced imaging“ oder „perfusion CT“ (MILES 1999; O'CONNOR et al. 2011;
Literaturübersicht
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MILES et al. 2012; GARCÍA-FIGUEIRAS et al. 2013). Nach Auswahl einer geeigneten Region of Interest (ROI) wird vom Patienten zunächst ein Basis-CT-Scan dieser Region aufgenommen. Anschließend wird dem Patienten intravenös ein Kontrastmittel verabreicht, wodurch sich die mittlere CT-Zahl der ROI verändert.
Durch viele aufeinanderfolgende CT-Scans der ROI im Abstand von nur wenigen Sekunden kann der Kontrastmittel-Bolus genau aufgezeichnet werden. Aus dem Verlauf der Funktion (CT-Zahl in Abhängigkeit von der Zeit) lassen sich Parameter wie z. B. das relative Blutvolumen in dieser Region ableiten. Diese Methode wird bevorzugt im Bereich der Onkologie eingesetzt, da die tumor-induzierte Gefäßneubildung eine der Hauptcharakteristika bei der Bildung von Tumoren und Metastasen ist und somit von besonderem Interesse ist (CARMELIET u. JAIN 2000;
GARCÍA-FIGUEIRAS et al. 2013). Vergleichbare Studien mit dem µCT gibt es bislang nicht.
2.2 Knochenwachstum
Das Knochengewebe zählt zu den härtesten Geweben im menschlichen Körper (SALOMON et al. 2015). Trotzdem ist es ein hoch dynamisches Gewebe, das ständigen Remodellierungsprozessen unterliegt, um sich an mechanischen Stress anzupassen oder um entstehende Ermüdungsbrüche zu reparieren (LOI et al. 2016).
Dies gelingt durch ein gut aufeinander abgestimmtes Zusammenspiel von knochenabbauenden Osteoklasten und knochenaufbauenden Osteoblasten (SALOMON et al. 2015). Letztere entstehen aus undifferenzierten Mesenchymzellen und sezernieren die Knochengrundsubstanz Osteoid, das durch die Aufnahme von Hydroxylapatit zu Knochen mineralisiert werden kann (MANOLAGAS 2000). Generell unterscheidet man zwei Formen der Knochenbildung. Bei der desmalen Osteogenese entwickelt sich der Knochen direkt aus mesenchymen Vorläuferzellen, während sich bei der chondralen Osteogenese zuerst knorpelige Skelettelemente bilden, die dann nach und nach zu Knochen umgebaut werden (SALOMON et al.
2015). Kommt es zu einer Knochenfraktur oder einem Knochendefekt, bildet sich meist ein sogenannter Kallus um die betroffene Stelle, der anschließend über die beiden Formen der Knochenbildung verknöchert (indirekte/sekundäre Frakturheilung). Über Remodellierungsprozesse wird der Kallus dann abgebaut und in Lamellenknochen umgewandelt. Unter stabilen Bedingungen und bei einer geringen Spaltbreite der Fraktur können Knochen auch ohne Kallusbildung direkt
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zusammenwachsen (direkte/primäre Frakturheilung) (DIETZ u. LITZKE 2003;
SALOMON et al. 2015).
Dabei ist Knochengewebe eines von wenigen Geweben, das ohne die Bildung einer Narbe heilen kann (MARSELL u. EINHORN 2011). Ab einer bestimmten Defektgröße ist jedoch ein natürliches Zusammenwachsen des Knochens ohne chirurgische Hilfe nicht mehr möglich. Dieser sogenannte „Critical Size Defect“ ist als die kleinste knöcherne Wunde eines bestimmten Knochens einer bestimmten Tierart definiert, die während der Lebensdauer des Tieres nicht mehr von selbst heilen kann (SCHMITZ u. HOLLINGER 1986; COOPER et al. 2010). Derartige Defekte können unter anderem durch Unfälle, Tumoren oder Entzündungen entstehen oder auch angeboren sein.
2.3 Knochenimplantate
Bei kritischen Defekten garantiert häufig eine Transplantation bzw. eine Implantation den bestmöglichen Erfolg. Jährlich werden in Deutschland über 100.000 Knochentransplantationen durchgeführt (DEUTSCHE GESELLSCHAFT FUER GEWEBETRANSPLANTATION 2018). Dabei unterscheidet man prinzipiell zwischen autogenen, allogenen und xenogenen Transplantaten sowie alloplastischen Implantaten. Bei autogenen Transplantationen wird Knochen von derselben Person entnommen - meist vom Beckenkamm - und an die Stelle des Bedarfs transplantiert.
Ein allogenes bzw. xenogenes Transplantat hingegen stammt von einer dritten Person bzw. einem Tier (DIETZ u. LITZKE 2003). Alloplastische Implantate sind künstlich hergestellte Knochenersatzstoffe. Daher handelt es sich bei ihnen nicht mehr um ein Transplantat im eigentlichen Sinne, sondern um ein Implantat, das z. B.
aus Titan, Hydroxylapatit oder Magnesium bestehen kann.
Um ein optimales Zusammenwachsen zu gewährleisten, sollten die Transplantate und Implantate folgende biologische Mechanismen unterstützen: Osteogenese, Osteoinduktion und Osteokonduktion (JAKOI et al. 2015). Als Osteogenese wird die Bildung von neuem Knochen bezeichnet, während die Osteoinduktion die Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoblasten stimuliert. Unter Osteokonduktion versteht man das Bereitstellen einer Leitstruktur, an der sich das Knochenwachstum orientieren und in die der Knochen eindringen kann. Zudem sollten die Transplantate möglichst stabil, steril sowie nicht immunogen sein, um
Literaturübersicht
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Abstoßungsreaktionen zu vermeiden. Des Weiteren sollten sie in möglichst beliebiger Form und Größe verfügbar und möglichst kostengünstig sein.
Autogene Transplantate erfüllen die meisten dieser Forderungen und gelten als Goldstandard. Sie sind jedoch nicht beliebig verfügbar, und es können durch den zusätzlichen Eingriff weitere Beschwerden wie z. B. Infektionen, Schmerzen und kosmetische Deformationen an der Entnahmestelle auftreten (KURZ et al. 1989;
BANWART et al. 1995; GOULET et al. 1997; SILBER et al. 2003). Alloplastische Implantate bedürfen keines Eingriffs an anderer Stelle, sind jedoch anfälliger für Infektionen und Abstoßungsreaktionen (FU et al. 2016) und haben schlechtere osteogenetische und osteoinduktive Eigenschaften (PETITE et al. 2000). Allerdings können sie frei in Größe und Form produziert werden. Für eine gute knöcherne Integration ist unter anderem die Implantatsgeometrie entscheidend. Studien zeigten, dass miteinander verbundene Poren mit einer Größe von etwa 200 – 900 µm, in die der Knochen einwachsen kann (LOGEART-AVRAMOGLOU et al. 2005; MATENA et al. 2015a; TANIGUCHI et al. 2016), besonders osteokonduktiv wirken.
2.4 Titanimplantate
Titan ist wegen seiner guten Biokompatibilität und seiner Korrosionsbeständigkeit ein häufig genutztes Material für alloplastische Implantate und gilt als Goldstandard (SIDAMBE 2014). Allerdings ist Titan wesentlich steifer als Knochen (höherer Youngscher Modul), weshalb das sogenannte „stress-shielding“ auftreten kann (HUISKES et al. 1992; ZHU et al. 2007; BIDAUX et al. 2013). Dies führt zu einer verminderten Lastübertragung auf den Knochen, wodurch eine Knochenatrophie und letztendlich eine Lockerung des Implantates auftreten kann. Dies kann im schlimmsten Falle zu Frakturen an anderen Stellen oder sogar zum Verlust des Implantates führen.
2.5 Magnesiumimplantate
Die mechanischen Eigenschaften von Magnesium und Magnesiumlegierungen sind denen von Knochen generell ähnlicher als die von Titan und verringern somit das Risiko des „stress-shielding“. Zudem wurden in diversen Studien die knochenwachstumsfördernde Wirkung sowie eine sehr hohe Biokompatibilität von
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Magnesium nachgewiesen (KRAUS et al. 2012; WAIZY et al. 2013; CHARYEVA et al. 2015). Eine weitere Besonderheit von Magnesium ist seine biologische Abbaubarkeit. In wässriger Umgebung kann ein Magnesiumimplantat unter Abgabe von Wasserstoffgas entsprechend
+ 2 → +
vollständig aufgelöst werden (WITTE et al. 2008). Damit bietet es dem Knochengewebe die Möglichkeit, langsam in das Implantat hineinzuwachsen und sowohl dessen Platz als auch seine stabilisierende Funktion zu übernehmen (JANNING et al. 2010; KRAUS et al. 2012; WAIZY et al. 2013). Die Auflösung der Mg(OH)2-Ionen führt zudem zu einer alkalischen pH-Änderung in der Nachbarschaft des Magnesium-Implantats, die primär für das erhöhte Knochenwachstum verantwortlich sein soll (BUSHINSKY 1996; JANNING et al. 2010). Andere Studien sehen in dieser pH-Änderung eher Nachteile für biomedizinische Anwendungen (HORNBERGER et al. 2012; AGARWAL et al. 2016). Das größte Problem bei der Verwendung von Magnesium und viele seiner Legierungen als Implantatmaterial stellt die initial sehr schnelle Korrosion dar (HORNBERGER et al. 2012), wodurch die osteokonduktive Wirkung des Implantats zu schnell verloren geht und zudem große Ansammlungen an Wasserstoffgas (Gastaschen) entstehen (GU u. ZHENG 2010;
HORNBERGER et al. 2012). Diesem Problem kann unter anderem eine Beschichtung des Implantats entgegenwirken.
2.6 Beschichtungen und Prävitalisation von Implantaten
Eine Beschichtung isoliert das Implantat von den umgebenden Flüssigkeiten des Körpers, steuert somit die Degradation und kann ein mögliches vorzeitiges mechanisches Versagen des Implantats verhindern (GU u. ZHENG 2010;
REIFENRATH et al. 2010; SHADANBAZ et al. 2014). Die Beschichtungen können in drei verschiedene Klassen eingeteilt werden: metallisch, anorganisch und organisch (HORNBERGER et al. 2012). Für biomedizinische Anwendungen sind die organischen Beschichtungen, speziell die aus Biopolymeren, am vielversprechendsten, da diese noch mit anderen Biomolekülen und entzündungshemmenden oder wachstumsfördernden Substanzen funktionalisiert werden können, sodass die Biokompatibilität erhöht werden kann (MATENA et al.
Literaturübersicht
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2015a; TIAN et al. 2015). Der einfachste und kostengünstigste Weg, ein Implantat mit solch einer Beschichtung zu überziehen, ist das „Dipping“, also das wiederholte Eintauchen des Implantats in eine entsprechende Biopolymerlösung (HORNBERGER et al. 2012).
Das Biopolymer Polycaprolacton (PCL) gilt unter anderem als sehr biokompatibel und bioabbaubar (LI et al. 2018) und besitzt zudem hydrophobe Eigenschaften (CHEN et al. 2011). Dies ist sehr vorteilhaft, da Magnesium vor allem in wässriger Umgebung schnell korrodiert. In diversen Studien konnte gezeigt werden, dass eine PCL-Beschichtung die Degradation von Magnesium signifikant verlangsamen kann (CHEN et al. 2011; YAZDIMAMAGHANI et al. 2014; MATENA et al. 2015b).
Zudem kann eine Prävitalisierung der Implantate, also eine Besiedelung mit in-vitro gezüchteten Zellen, zu einer noch rascheren knöchernen Integration der Implantate führen (CARVALHO et al. 2014). Als besonders vielversprechend gelten hierbei mesenchymale Stammzellen, die ein hohes Proliferations- und Differenzierungspotenzial besitzen und sich unter anderem auch in Osteoblasten differenzieren können (CARVALHO et al. 2014).
2.7 Vaskularisation
Die Hauptaufgabe des kardiovaskulären Systems ist es, Gase, Nährstoffe, Abfallstoffe und andere Substanzen von und zu den Zellen zu transportieren. Dabei bilden die Kapillaren die kleinsten Gefäße des Blutsystems. Sie sind für den Stoffaustausch zwischen dem Blut und den Zellen verantwortlich. Kleinere Moleküle können direkt aus den Kapillarwänden ins extrazelluläre Medium diffundieren, während größere spezielle Kanalöffnungen in der Kapillarwand benötigen (BETTS et al. 2013). Die durchschnittliche Diffusionstiefe von Sauerstoff und Nährstoffen sowie von Abfallstoffen im extrazellulären Medium beträgt nur etwa 100 – 200 µm (CARMELIET u. JAIN 2000; CASSELL et al. 2002; J. ROUWKEMA et al. 2010). Um Zellen, die weiter entfernt von bereits bestehenden Blutgefäßen liegen, effektiv versorgen zu können, ist eine schnelle Vaskularisation notwendig.
Neue Blutgefäße können sich auf zwei Arten bilden. Das Aussprossen von Gefäßen aus bereits existierenden Blutgefäßen nennt man Angiogenese, während die Entstehung von Kapillaren an Ort und Stelle als Vaskulogenese bezeichnet wird
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(NOMI et al. 2002). In beiden Fällen beträgt der Durchmesser dieser neu entstandenen Kapillaren nur einige Mikrometer (POTTER u. GROOM 1983;
SALOMON et al. 2015; PAL 2017).
Besonders beim Knochenwachstum, insbesondere während der Frakturheilung, spielt eine schnelle Vaskularisation eine entscheidende Rolle (MARSELL u.
EINHORN 2011; SARAN et al. 2014). Das rasche Aussprossen von Kapillaren in den Defekt sorgt zum einen für den Transport von Entzündungszellen und Wachstumsfaktoren, die die Differenzierung von Mesenchymzellen aktivieren. Zum anderen werden Sauerstoff für die Versorgung der Zellen sowie wichtige Mineralien für die Kalzifizierung in die Wundregion transportiert (LOI et al. 2016).
2.8 Vaskularisation eines Implantats
Die Vaskularisation spielt eine Schlüsselrolle bei der Integration eines Implantats.
Das Fehlen einer funktionierenden Mikrovaskularisation gilt daher als die Hauptursache vieler Implantatkomplikationen (SANTOS u. REIS 2010). Dies ist insbesondere beim Einsatz von prävitalisierten Implantaten wichtig, da die aufgebrachten Zellen absterben können, wenn sie nicht schnell genug über eine Mikrovaskularisation mit Nährstoffen versorgt werden (CASSELL et al. 2002; NOMI et al. 2002; MALDA et al. 2007). Die Vaskularisation des Implantats kann unter anderem mit einer porösen Form, in die die Kapillaren besonders gut einsprießen können, gefördert werden (LOGEART-AVRAMOGLOU et al. 2005; MATENA et al.
2015a; TANIGUCHI et al. 2016). Auch eine Beschichtung mit eingebrachten Wachstumsfaktoren beschleunigt die Vaskularisation (JEROEN ROUWKEMA et al.
2008; GARCIA et al. 2012).
Material und Methoden
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3 Material und Methoden
3.1 Studie zur knöchernen Integration und Degradation von beschichteten und prävitalisierten Magnesiumimplantaten im Mausmodell mittels Mikro- Computertomographie
Der hier folgende Methoden-Teil fokussiert sich hauptsächlich auf die mikro- computertomographische Auswertung der Implantate. Die Herstellung der Implantate wurde zusammengefasst (s. u.), und die histologische Auswertung, die durch Michael Grau erfolgte, wurde weggelassen. Beide Methoden sind im Kapitel 4.1 in der Publikation “Osteointegration of Porous Poly-ε-Caprolactone-Coated and Previtalised Magnesium Implants in Critically Sized Calvarial Bone Defects in the Mouse Model”
detailliert beschrieben.
3.1.1 Implantate
Alle Implantate wurden mit der Selective Laser Melting Technologie (SLM® 125 HL, SLM® Solutions GmbH, Lübeck, Deutschland) im Laserzentrum Hannover hergestellt. Hierbei wurde Titanpulver (Ti6Al4V) beziehungsweise pures Magnesiumpulver (ATOULTRA 325, SFM SA, Martigny, Schweiz) mit einem Laser zu festen Implantaten verschmolzen. Die so gefertigten Implantate bestehen aus Stegen mit einer Breite von 600 µm, die gemäß Abb. 1 zusammengesetzt wurden. Dabei entstand ein den späteren Knochendefekt bedeckender Grundkörper von 3,0 x 3,0 x 1,2 mm³ Größe mit einer Porengröße von 600 x 600 µm². Damit das Implantat nicht im Knochendefekt versinkt, wurden die äußeren Stege in eine Richtung um 1 mm und in die andere Richtung um 3 mm verlängert. Das längere Ende wurde zudem in einem Winkel von 15 Grad gebogen, um eine bessere Befestigung am Mäuseschädel zu gewährleisten.
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Abb. 1: Darstellung der Implantatgeometrie von oben (A), von der Seite (B) und drei- dimensional (C).
Alle Magnesium-Implantate wurden mit Poly-ε-Caprolactone (PCL, Mn=80 kg/mol, Cappa 6800, Perstorp UK Limited, Warrington, UK) beschichtet. Ein Teil der beschichteten Implantate wurde zusätzlich mit aus C57B16 Mäusen gewonnenen Osteoblasten prävitalisiert, ein weiterer Teil mit aus Fettzellen von BALB/c Mäusen gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (ADMSC).
3.1.2 Versuchstiere
Für die Studie wurden 40 zum Zeitpunkt der Operation zwölf Wochen alte, weibliche BALB/c Mäuse (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) verwendet und in fünf Gruppen von je acht Tieren unterteilt (s. Tab. 1). Jede Maus wurde mit Ketamin (100 mg/kg i.p.) und Xylazin (4-12 mg/kg i.p.) anästhesiert und mit einer Diamantfräse (MICROMOT 50/E, Proxxon GmbH, Föhren, Deutschland) ein 3 x 3 mm² großer, quadratischer Defekt in die Schädelkalotte gefräst. Anschließend wurden das jeweilige Implantat in den Defekt gesetzt und die verlängerten Stege mit einem Gewebekleber (EPIGLU®, Meyer-Haake Medical Innovations, Ober-Mörlen, Deutschland) auf der gegenüberliegenden Kalottenseite fixiert. Nachdem die Wunde wieder vernäht war, wurden die Mäuse direkt das erste Mal im µCT gescannt (Tag 0). Weitere Scans folgten jeweils an den Tagen 28, 56 und 84. Nach dem letzten Scan wurden die Mäuse euthanisiert (0,15 ml Pentobarbital i.p.) und für die histologische Untersuchung vorbereitet.
Material und Methoden
21 Tab. 1: Einteilung der Versuchstiere in Gruppen.
Gruppe Implantat Beschichtung Prävitalisation
Kontrollgruppe 1 - - -
Kontrollgruppe 2 Titan - -
Gruppe 3 Magnesium PCL -
Gruppe 4 Magnesium PCL Murine Osteoblasten
Gruppe 5 Magnesium PCL Murine ADMSC
3.1.3 Anfertigung der µCT-Scans
Alle µCT-Scans wurden im XtremeCT (Scanco Medical AG, Brüttisellen, Schweiz) der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit einer festen Röhrenspannung von 60 kV durchgeführt. Die Ortsauflösung betrug 41 µm, die Integrationszeit 700 ms. Um die Zeit in Narkose für die Mäuse zu verkürzen, wurde ein nur etwa 9 mm großer Teil des Schädels gescannt, in dem sich auch das Implantat befand. Ein Scan dauerte etwa 15 min und beinhaltete 220 Schnitte bei einer Schichtdicke von 41 µm.
Um die Energiedosis als Maß für die Strahlenexposition, die eine Maus pro Scan erhält, abschätzen zu können, wurde ein Zylinder aus Acrylglas mit kleinen Hohlräumen für Thermolumineszenzdosimeter (TLD) (TLD-100H, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) als Mausphantom verwendet (s. Abb. 2). Dieses mit TLDs bestückte Phantom wurde mit den gleichen Parametern wie die Mäuse im µCT gescannt. Anschließend wurden die TLDs in einem TLD-Reader (Harshaw TLD 5500, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) ausgewertet.
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Abb. 2: Zweiteiliges Mausphantom aus Acrylglas (Durchmesser 3 cm; Länge 10 cm).
Der innere Stift (Durchmesser 1 cm) enthält sechs Hohlräume für je ein TLD, um die Energiedosis während eines Scans zu messen. Drei Hohlräume befanden sich innerhalb von 1 cm (A: Kopfregion der Maus) und die anderen im Abstand von 2 cm (B: Lunge), 3,5 cm (C: Niere) und 5 cm (D: Abdomen) vom ersten Hohlraum.
Aus den µCT-Scans der Mäuse wurden mit der Software Amira (Version 5.5.0, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA) dreidimensionale Rekonstruktionen erzeugt und ausgewertet. Zunächst wurde zur besseren Visualisierung die CT-Zahl, oberhalb derer jedes Voxel als Knochengewebe eingestuft wird (Threshold), auf 450 HU gesetzt, um das Weichgewebe vom Knochengewebe zu separieren. Da das Magnesium-Implantat ähnliche CT-Zahlen wie das Knochengewebe aufwies, konnte es in den gleichen Threshold-Grenzen ausgewertet werden. Durch die charakteristische Implantatsform konnten Knochen und Implantat dennoch stets voneinander unterschieden werden.
Der Knochendefekt jeder Maus an Tag 0 (s. Abb. 3A) wurde manuell ausgeschnitten, so dass nur noch ein feiner Knochenrand um den Defekt übrigblieb (s. Abb. 3B).
Diese Form wurde dann als Schablone benutzt und auf die Schädel der Scans von den Tagen 28 (s. Abb. 3C, 3D), 56 sowie 84 projiziert, um die exakt selbe Region auszuschneiden (s. Abb. 3E). Das Volumen des Knochenrands wurde anschließend von der Software automatisch berechnet. Die Differenz zwischen den Volumina des jeweiligen Tages und dem Volumen am Tag 0 gibt an, wie stark der Knochendefekt zusammengewachsen ist. Um die contra-laterale Seite der Mäuseschädel zu
Material und Methoden
23
untersuchen, wurde eine quaderförmige ROI (3,7 x 3,7 x 2,0 mm³) in die Mitte der linken Kalottenseite gelegt und das Knochenvolumen ausgewertet.
Die Auswertung der knöchernen Integration von Kontrollgruppe 2 war leider nicht möglich, da die Titanimplantate zu massiven Artefakten in den µCT-Scans führten.
Die Analyse der Degradation der Magnesium-Implantate erfolgte in vergleichbaren Schritten. Das Implantat wurde mit der Ausschneide-Funktion von Amira von der Schädelkalotte separiert. Anschließend konnte das Volumen des Implantates berechnet werden. Für jede Versuchstiergruppe wurden an jedem Scan-Tag die Mittelwerte von Knochenwachstum sowie Implantatsdegradation bestimmt.
Abb. 3: µCT-Scans der Mäuseschädel. Dorsaler Blick auf die Kalotte einer Maus von Kontrollgruppe 1 am Tag 0 (A) und den ausgeschnittenen Knochenrand (B). Gleicher Blick auf die Kalotte am Tag 28 ohne (C) und mit überlagertem µCT-Scan von Tag 0 (D). Die Differenz der beiden Scans zeigt den Knochenzuwachs (E).
3.1.4 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten wurde mit dem Software-Programm SAS® (Version 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) vorgenommen. P-Werte kleiner als 0,05 wurden als signifikant angesehen. Da die Daten normalverteilt waren, wurden sowohl t-Tests für signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen als auch
24
Varianzanalysen (ANOVA) für signifikante Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt.
3.2 Pilotstudie zur Bestimmung des Volumens von flüssigkeitsgefüllten Mikrokanälen im Mikro-Computertomographen unterhalb der
Auflösungsgrenze
3.2.1 Herstellung der Mikrokanal-Phantome
Das Grundmaterial der Phantome ist Epoxidharz (Epoxy resin L 385, R&G Faserverbundwerkstoffe, Waldenbruch, Germany). Für die Herstellung der Mikrokanäle wurden Zuckerfäden mit einer handelsüblichen Zuckerwatte-Maschine (ZWM 3478, Clatronic, Kempen, Germany) erzeugt. Aus der gesponnenen Zuckerwatte wurde eine dünne Schicht entnommen und auf eine bereits ausgehärtete Grundschicht aus Harz gelegt. Aus karamellisiertem Zucker wurden etwa 0,5 bis 2 mm dicke Fäden gezogen und schachbrettartig über die dünne Zuckerwatteschicht gelegt, um später eine gleichmäßige Anbindung der Mikrokanäle zu gewährleisten. Gleichzeitig wurde dadurch das Harz-Zucker-Konstrukt in kleine Felder unterschiedlicher Größe unterteilt. Dieses Zuckernetzwerk wurde anschließend mit einer zweiten Schicht aus Epoxidharz übergossen und entgast.
Nach 24 Stunden war diese Harzschicht ausgehärtet. Mit einem Bohrer wurden durch das Harz Löcher (Ø ca. 2 mm) in die Kreuzungspunkte der dicken Fäden gebohrt, um Wasser einen Zugang zum Zuckernetzwerk zu ermöglichen. In einem beheizten Ultraschallbad wurde das Zuckernetzwerk dann vom Wasser vollständig aufgelöst, sodass die fertigen Mikrokanal-Phantome nur noch aus Epoxidharz bestehen und durch die Hauptkanäle in kleine Felder mit Mikrokanälen unterteilt sind (s. Abb. 4).
Material und Methoden
25
Abb. 4: Draufsicht eines Mikrokanal-Phantoms mit Haupt- (A) und Mikrokanälen (B) in den einzelnen Feldern.
3.2.2 Analyse des Mikrokanalvolumens
Der Durchmesser der Mikrokanäle wurde stichprobenartig an 217 Stellen der Phantome mit einem Lichtmikroskop (KF2, Zeiss, Jena, Deutschland) bei 400-facher Vergrößerung gemessen (s. Abb. 5). Es wurde eine repräsentative Verteilung der Größe der Mikrokanäle bestimmt. Zudem wurden der mittlere Durchmesser """" und ! die mittlere Querschnittsfläche #"""" der Mikrokanäle berechnet. Um das gesamte ! Mikrokanalvolumen eines Feldes zu bestimmen, wurden mit einem Auflichtmikroskop (Stereomikroskop, Phywe, Göttingen, Deutschland) Digitalbilder (Nex-5T, Sony, Tokio, Japan) bei 20-facher Vergrößerung gemacht und zusammengesetzt (s. Abb.
6a). Danach wurden die Bilder mit Hilfe der Software ImageJ (NIH, Bethesda, USA) konvertiert (8-Bit Darstellung) und mit einem Bandpass-Filter bearbeitet (s. Abb. 6b).
Mit der Threshold-Funktion konnten die Mikrokanäle vom Hintergrund getrennt und deren Fläche sowie prozentualer Anteil $! am Bild berechnet werden (s. Abb. 6c).
26
Unter der Annahme, dass die vorher bestimmte Verteilung der Mikrokanaldurchmesser für alle Felder gleichermaßen gilt, wurden die Hohlraumvolumina der Mikrokanäle %! eines jeden Feldes folgendermaßen berechnet,
%! = $! ∙ #& ∙ #""""!
""""!
' (1)
wobei $! den prozentualen Anteil der Kanäle im Digitalbild, #& die Fläche eines Feldes und #"""" bzw. ! """" die Mittelwerte der kreisrunden Querschnittsfläche bzw. des ! Durchmessers der Mikrokanäle bezeichnen.
Abb. 5: Darstellung eines einzelnen Mikrokanals mit Messskala im Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung.
Material und Methoden
27
Abb. 6: a - Digitalbild der Mikrokanäle im Auflicht bei 20-facher Vergrößerung; b - Durch die Konvertierung in die 8-Bit Darstellung und Anwendung des Bandpass- Filters konnten die Mikrokanäle deutlich vom Hintergrund abgehoben werden; c - Die Threshold-Funktion teilt das Bild in schwarz und weiß auf und ermöglicht so die Berechnung des prozentualen Anteils $!von schwarz im Bild.
3.2.3 Anfertigung der µCT Scans
Die Phantome wurden in Kontrastmittellösungen (Xenetix 350 (Iobitridol), Guerbet GmbH, Sulzbach, Germany) mit verschiedenen Konzentrationen gelegt. Hierfür wurde destilliertes Wasser mit dem Kontrastmittel in einer Konzentration von 0 bzw.
3, 6, 9, 12 oder 15 ml Kontrastmittel pro Liter Wasser gemischt (KMK0, KMK3, KMK6, KMK9, KMK12, KMK15). Um zu gewährleisten, dass die Kontrastmittellösung auch in die Mikrokanäle eindringt, wurden die Phantome vor dem Scannen mehrere Tage in der jeweiligen Lösung zusammen mit einem Kontrollkörper aus reinem Epoxidharz gelagert. Die Phantome und der Kontrollkörper wurden stets in der Lösung liegend gescannt.
Alle Scans wurden am XtremeCT (Scanco Medical AG, Brüttisellen, Schweiz) der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit einer festen Röhrenspannung von 60 kV durchgeführt. Für die räumliche Auflösung und die Integrationszeit wurden Werte von 81 µm bzw. 1400 ms gewählt.
3.2.4 Auswertung der µCT Scans
Alle Scans wurden mit der Software Amira (Version 6.5.0, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA) ausgewertet. Durch geeignete Fensterung war es möglich, die Hauptkanäle und damit die einzelnen Felder des Phantoms zu sehen.
Die Segmentierung jedes Feldes wurde manuell durchgeführt und orientierte sich an
28
den Hauptkanälen. Sowohl das Volumen als auch die mittlere CT-Zahl eines jeden segmentierten Feldes wurden von der Software Amira automatisch berechnet.
3.2.5 Statistische Analyse
Das geschätzte Mikrokanalvolumen wurde durch das bei der Segmentierung ermittelte Volumen des Feldes dividiert, um den prozentualen Anteil des Mikrokanalvolumens am Gesamtvolumen des Feldes (Hohlraumvolumenanteil: HVA) zu bestimmen. Die gemessenen CT-Zahlen wurden jeweils als Funktion des HVA und der KMK aufgetragen. Die entsprechenden Abhängigkeiten wurden mit einem gepaarten t-Test sowie einer Korrelations- und Regressionsanalyse mit dem Software-Programm SAS® (Version 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) getestet.
Ergebnisse
29
4 Ergebnisse
4.1 Studie zur knöchernen Integration und Degradation von beschichteten und prävitalisierten Magnesiumimplantaten im Mausmodell mittels Mikro- Computertomographie
Folgende Publikation wurde bei dem Journal „Materials“ eingereicht und wurde am 21. Dezember 2017 zur Publikation angenommen (Materials 11, 6):
Osteointegration of Porous Poly-ε-Caprolactone-Coated and Previtalised Magnesium Implants in Critically Sized Calvarial Bone Defects in the Mouse Model
Christian Seiler1,†, Michael Grau2,3,†, Laura Roland2,3, Julia Matena2,3, Claudia Windhövel2,3, Michael Teske4, Hugo Murua Escobar2,3, Matthias Lüpke1, Hermann Seifert1, Nils-Claudius Gellrich5, Heinz Haferkamp6 and Ingo Nolte2,*
1 Institute for Gerneral Radiology and Medical Physics, University of Veterinary Medicine Hannover,Foundation, D-30559, Hannover, Germany
2 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559, Hannover, Germany
3 Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, D-18057 Rostock, Germany
4 Institute for Biomedical Engineering, Rostock University Medical Center, D-18119, Rostock, Germany
5 Clinic for Cranio-Maxillo-Facial Surgery, Hannover Medical School, D-30625 Hannover, Germany
6 Institut fuer Werkstoffkunde, Leibniz Universitaet Hannover, D-30823 Garbsen, Germany
* Correspondence: ingo-nolte@tiho-hannover.de; Tel.: +49-511-953-6400;
† These authors contributed equally to this study.
Article
Osteointegration of Porous
Poly- ε -Caprolactone-Coated and Previtalised
Magnesium Implants in Critically Sized Calvarial Bone Defects in the Mouse Model
Michael Grau1,2,†, Christian Seiler3,†, Laura Roland1,2, Julia Matena1,2, Claudia Windhövel1,2, Michael Teske4, Hugo Murua Escobar1,2, Matthias Lüpke3 ID, Hermann Seifert3,
Nils-Claudius Gellrich5, Heinz Haferkamp6and Ingo Nolte1,*
1 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany; michael.grau@tiho-hannover.de (M.G.); laura.roland@yahoo.de (L.R.);
julia.matena@gmx.de (J.M.); claudia.windhoevel@tiho-hannover.de (C.W.);
hugo.murua.escobar@med.uni-rostock.de (H.M.E.)
2 Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, D-18057 Rostock, Germany
3 Institute for General Radiology and Medical Physics, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30173 Hannover, Germany; christian.seiler@tiho-hannover.de (C.S.);
matthias.luepke@tiho-hannover.de (M.L.); hermann.seifert@tiho-hannover.de (H.S.)
4 Institute for Biomedical Engineering, Rostock University Medical Center, D-18119 Rostock, Germany;
michael.teske@uni-rostock.de
5 Clinic for Cranio-Maxillo-Facial Surgery, Hannover Medical School, D-30625 Hannover, Germany;
gellrich.nils-claudius@mh-hannover.de
6 Institut fuer Werkstoffkunde, Leibniz Universitaet Hannover, D-30823 Garbsen, Germany;
haferkamp@iw.uni-hannover.de
* Correspondence: ingo.nolte@tiho-hannover.de; Tel.: +49-511-953-6400; Fax: +49-511-953-6203
† These authors contributed equally to this study.
Received: 9 September 2017; Accepted: 18 December 2017; Published: 21 December 2017
Abstract:Metallic biomaterials are widely used in maxillofacial surgery. While titanium is presumed to be the gold standard, magnesium-based implants are a current topic of interest and investigation due to their biocompatible, osteoconductive and degradable properties. This study investigates the effects of poly-ε-caprolactone-coated and previtalised magnesium implants on osteointegration within murine calvarial bone defects: After setting a 3 mm×3 mm defect into the calvaria of 40 BALB/c mice the animals were treated with poly-ε-caprolactone-coated porous magnesium implants (without previtalisation or previtalised with either osteoblasts or adipose derived mesenchymal stem cells), porous Ti6Al4V implants or without any implant. To evaluate bone formation and implant degradation, micro-computertomographic scans were performed at day 0, 28, 56 and 84 after surgery. Additionally, histological thin sections were prepared and evaluated histomorphometrically.
The outcomes revealed no significant differences within the differently treated groups regarding bone formation and the amount of osteoid. While the implant degradation resulted in implant shifting, both implant geometry and previtalisation appeared to have positive effects on vascularisation.
Although adjustments in degradation behaviour and implant fixation are indicated, this study still considers magnesium as a promising alternative to titanium-based implants in maxillofacial surgery in future.
Keywords: magnesium; poly-caprolactone; implant; calvarial defect; mouse; in vivo small animal imaging; micro-computed tomography; previtalisation; osteoblast; ADMSC
Materials 2018,11, 6; doi:10.3390/ma11010006 www.mdpi.com/journal/materials
Materials 2018,11, 6 2 of 22
1. Introduction
In maxillofacial surgery, the treatment of critically sized bone defects whether of neoplastic, traumatic or congenital origin, is still challenging due to insufficient vascularisation and therefore inadequate bone regeneration [1,2]. Originally, the term critically sized defect was defined as the smallest size of a defect that would not heal within the lifetime of the animal [3]. Several studies stated defects with 5 mm in diameter to be critically sized for calvaria of adult mice [4,5]. Due to convenience issues in animal research a critical defect often alternatively refers to a size that is not able to heal throughout the duration of the experiment [5,6]. Since different studies have shown that defects of 3 mm in diameter set within the calvaria of mice did not heal within a period of 12 weeks [7–9], the same criteria were chosen for this study both time and dimension wise. For closing critically sized defects, autografts harvested from intact bone are commonly used. However, this treatment is limited to a certain degree in terms of accessible bone material and also requires an additional surgical intervention, which elevates the patient’s morbidity and often remains painful after surgery [10–13].
In order to avoid such challenges the usage of metallic biomaterials in form of implants is required.
Titanium and its alloys are often used owing to their high biocompatibility and corrosion resistance but involve the risk of implant loosening as a result of stress shielding due to the discrepancy in Young’s modulus to cortical bone [14–16].
Magnesium and its alloys might conquer these difficulties since their mechanical properties are much more bone-like. Namely, its Young’s modulus is closer to that of osseous tissue and due to its biodegradability it enables ingrowing bone to slowly take over the implant’s space and stabilising function [17–21]. In recent years, magnesium has been proven to possess high biocompatibility in various studies [19,22,23]. However, the main challenge using magnesium-based implants is the gas formation due to the material’s degradation process, leading to displacement of surrounding tissues and a decrease in implant-bone contact area [24,25]. A possible way to contain the initial corrosion process is to create a coating around the implant in order to shield the metallic core against the surrounding tissue fluid [26]. In the following sections the combination of a metallic basic structure and a polymeric coating is referred to as a hybrid implant. For this study we decided to coat the implants with the synthetic resorbable polymer poly-ε-caprolactone (PCL) since it is an established biomaterial, while at the same time showing a lowering effect on the corrosion rate of magnesium implants [27–31]. Namely, several studies prove that PCL-coating of magnesium implants leads to an increased initial corrosion resistance resulting in a decreased release of gas and a lowering of the implants’ degradation rate which ultimately improves cytocompatibility for osteogenic cells [30,32,33].
In addition to the natural osteoconductive properties of magnesium, this quality can even become enhanced by creating a porous implant geometry, which allows newly formed bone tissue to grow inside the pores. Within this study, scaffold-shaped implants with a pore size of 600µm were created using the additive manufacturing process of Selective Laser Melting (SLM®, Lübeck, Germany) since pore sizes of 20 to 1500µm were reported to enable an optimal osteoblast activity and therefore a sufficient osteointegration of the implant [34]. In order to enhance the latter, even further implants can be previtalised with adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs), which have become a focus of research within recent years [35]. Since they are reported to be able to differentiate into osteoblasts, they are stated to have a positive effect on bone regeneration by producing new osseous tissue [36–38]. As a high amount of ADMSCs can be isolated fast and in a minimally invasive manner from the acceptor’s own adipose tissue [39,40] they may be preferable over already differentiated osteoblasts for implant previtalisation.
Overall, this study deals with finding an implant material that is able to act as an alternative treatment for critically sized calvarial defects to hitherto merchantable titanium implants. Namely, it describes the local interaction of the surrounding bone tissue and the inserted hybrid implant.
Therefore, the implants were tested within an in-vivo mouse model against uncoated titanium implants of the same geometry. As a negative control, mice without any implant were observed. In order to not consciously expose the animals to excessive gas production and possible side effects uncoated
magnesium scaffolds were not used as a negative control. The uncontrolled gas production can lead to subcutaneous gas pockets, tissue necrosis, infections, alkaline poisoning and sudden death due to gas-induced embolism as stated by several studies [41–44]. To test the influence of previtalisation the hybrid implants were either populated with osteoblasts, ADMSCs or left blank. After inserting the implants within a previously set critically sized calvarial defect, bone ingrowth and implant degradation were observed via µCT scans for three months. Additionally, histomorphometrical analyses were performed to gain a closer view of the histological changes within the defect region.
An enhanced amount of bone ingrowth in the hybrid implants due to the material’s osteoconductivity was expected. Also, an even higher osteointegration was suggested for the previtalised implants since bone regeneration could begin not just at the defect periphery but also at the implant itself. Since the PCL-coating was created to reduce the corrosion rate of magnesium, high bone-implant contacts as well as a balanced substitution rate (defined as the quotient of implant degradation and bone ingrowth) were anticipated.
2. Experimental Section
2.1. Selective Laser Melting of Titanium and Magnesium Implants
Using the SLM technology, three-dimensional porous titanium scaffolds were manufactured by SLM®Solutions GmbH, Lübeck, Germany. Thereby, an SLM®280HL Selective Laser Melting machine system was utilised in order to transform Ti6Al4V powder into solid scaffolds. The magnesium implants with identical geometry were manufactured from ATOULTRA 325 pure magnesium powder (SFM SA, Martigny, Switzerland) using an SLM® 125HL machine system. All implants were post-treated using a chemical deburring process in order to create a smooth implant surface [45].
The generated implants (geometry shown in Figure1) consisted of a 3 mm×3 mm×1.2 mm basic body with a pore size and strut width of 600µm. To prevent the implants from sinking into the bone defect, the two outer struts of the upper implant layer were elongated at both sides 1 or 3 mm, respectively. The longer elongated struts were bent at an angle of 15 degrees in order to ensure a proper fixation to the animal’s skull.
Figure 1.Schematic top view (A); side view (B) and three-dimensional view (C) of the scaffold geometry.
2.2. PCL-Coating of Magnesium Implants
The magnesium scaffolds were plunged 8 times into 0.8 wt. % chloroformic (p.a. quality, J. T. Baker, Deventeer, The Netherlands) PCL (Mn= 80.000 g/mol, Cappa 6800, Perstorp UK Limited, Warrington, UK) solution using a custom-designed sample holderwith fork type tongue rings (1.5–2.5 mm cross
Materials 2018,11, 6 4 of 22
section) to fix the samples mechanically between both forks. Between each dipping process the scaffolds were dried for 10 min at 23±2◦C to allow the chloroform to evaporate. After the final dipping step the scaffolds were dried at room temperature for 24 h. For the following step the implants were carefully removed from the sample holders and both uncoated contact points were covered with 3µL of a 5 wt % polymer solution of PCL. Therefore, the concentration was optimised, allowing a fast bonding with the existing coating without changes in coating thickness. Afterwards, the coatings were dried for 20 min at room temperature. The final drying process was performed in a vacuum cabinet drier for seven days at 40◦C and 40 mbar.
2.3. Murine Osteoblast Isolation
Calvariae of ten C57Bl6 mice were grinded into small pieces which were then digested five times, each time for 10 min at 37 ◦C in sterile Hank’s medium (HBSS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) containing 5 mL of 200 U/mL collagenase II (Cell Systems, Troisdorf, Germany).
After each digestion step the supernatant containing diluted cells was collected and substituted with new digestion medium, resulting in a pooled cell solution of all five digestion steps. After centrifuging the solution for 7 min at 1200 RPM at room temperature the cell pellet was washed twice with Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Biochrom AG, Berlin, Germany) containing 10% foetal calf serum (FCS, Biochrom AG, Berlin, Germany), 20 mM Hepes, 1000 IU/mL penicillin and 0.1 mg/mL streptomycin (both PAA, Coelbe, Germany). After resuspending the pellet the cells were seeded onto T25 tissue culture flasks (TPP, Trasadingen, Switzerland) filled with 5 mL DMEM containing 10%
FCS and incubated at 37◦C and 5% CO2. The culture medium was changed twice a week and cell populations were split at 80% confluence.
2.4. Murine ADMSC Isolation
Inguinal fat tissue was isolated from BALB/c mice and stored in sterile Hank’s medium until further processing. Afterwards, the tissue was washed three times with phosphate buffered saline (PBS, Biochrom AG, Berlin, Germany), separated from adhering connectiveand vascular tissue and shredded with a scalpel. The resulting material was then added to a tube filled with 5 mL 0.026% Collagenase solution and incubated for 1 h at 37◦C while being rotated within a MACmix™ Tube Rotator (Milteny Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). After incubation the resulting collagenase-cell-solution was added to 5 mL DMEM containing 10% FCS and centrifuged for 10 min at 1000 RPM at room temperature. Before resuspending the cell pelletin 1 mL culture medium the supernatant was removed. The resulting collagenase-free cell solution was then added to T25 tissue culture flasks (TPP, Trasadingen, Switzerland) filled with 5 mL DMEM containing 10% FCS and incubated at 37◦C and 5%
CO2. The culture medium was changed twice a week and cell populations were split at 80% confluence.
2.5. Implant Previtalisation
For previtalisation the implants were inserted into the wells of a flat bottomed 96 well plate filled with 150µL DMEM containing 10% FCS. After trypsinating murine osteoblasts (P 1) and murine ADMSCs (P 1) from culture flasks the upfacing surfaces of each of the eight hybrid implantswere previtalised with either 25×103osteoblasts or the same amount of ADMSCs according to Table1.
After an attachment time of one hour under cell culture conditions (37◦C, 5% CO2) the implants were flipped upside down, the procedure then being repeated on the other side of the scaffold. After an additional attachment time of one hour the implants were finally stored within the wells of a 6-well plate filled with 5 mL DMEM containing 10% FCS and kept at 37◦C and 5% CO2until the following morning (day of surgery). The attachment times were set at one hour to avoid any negative effects arising from magnesium corrosion products on cellular vitality.
Experimental animal grouping.
Experimental Group Number Surgery Implant Coating Previtalisation
Control group 1 Defect - - -
Control group 2 Defect Titanium - -
Group 3 Defect Magnesium PCL -
Group 4 Defect Magnesium PCL Murine Osteoblasts
Group 5 Defect Magnesium PCL Murine ADMSCs
2.6. Animal Grouping and Treatment
A total number of 40 eight-week-old female BALB/c mice (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) were allocated to five experimental groups of eight according to Table1 and kept in groups of four (two cages per experimental group) in cages bedded withArbocel® comfort natural bedding material (Altromin GmbH, Lage, Germany). Maintenance diet pellets (Altromin GmbH) as well as water via polycarbonate bottles were offered ad libitum during the whole experimental period. The cages were stored in a climatic chamber (Tecniplast S.p.A., Buguggiate, Varese, Italy) in a 12 h day-night rhythm, checking temperature and humidity each day using a digital thermohygrometer (TFA Dostmann GmbH, Wertheim, Germany). Before surgery the mice were kept for four weeks, handling them each day to ensure a proper acclimatisation and an overall low stress level.
After surgery the animals were treated analgesically (Carprofen 5 mg/kg s.c. and Tramadol 1 mg/mL drinking water p.o. for three days) and weighed constantly in order to monitor changes in health and eating behaviour. One mouse in group 3, two mice in group 4 and three mice in group 5 rejected their implant before the secondµCT scan. The resulting wounds healed properly within a few days under analgesic treatment (Tramadol 1 mg/mL drinking water for three days) without any signs of infectious inflammation and did not affect the animal’s eating, drinking or comfort behaviour.
Therefore, no intervention in form of early euthanasia was indicated.
2.7. Surgical Methods
After anaesthetising with ketamin (100 mg/kg i.p.) and xylazin (4–12 mg/kg i.p.) the skin above the implantation region was depilated, washed and disinfected. To avoid intraoperative hypothermia the animal was layed on a MouseMonitor™ S warming plate (Indus Instruments, Webster, TX, USA) which ensured a constant body temperature. The entire surgery was performed under sterile conditions using a Universal S3 surgery microscope (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany). The skin was cut and retracted in order to gain a proper view of the osseous calvarium. Using a diamond milling head on a MICROMOT 50/E milling machine (Proxxon GmbH, Föhren, Germany), an approximately 3 mm×3 mm square bone platelet was milled out, while preserving surrounding blood vessels and underlying meninges. Within this process the operating area was constantly cleared and cooled with sterile saline solution in order to ensure a clear view and to avoid any heat caused by the milling process. After removing the bone platelet a magnesium or titanium implant was inserted in the created defect according to the animal group number as described in 2.6. To avoid both damage to the meninges due to the implant sinking into the defect and implant shifting during the experiment, the elongated struts were attached to the opposite side of the calvarium using an ethyl-2-cyanoacrylate-based tissue glue (EPIGLU®, Meyer-Haake Medical Innovations, Ober-Mörlen, Germany). Thereafter, the skin was sutured with resorbable sewing material. In the case of control group 1 the skin was closed in a similar manner but without inserting any implant. After the following firstµCT scan the mice were treated analgesically with Carprofen (5 mg/kg s.c.) and received a subcutaneous saline infusion while lying under an infrared lamp to ensure a safe and proper recovery.
