Archiv "Punktmutationen als Krankheitsursache" (25.09.1992)

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AKTUELLE MEDIZIN

DEUTSCHES ÄRZTEBLATT

Punktmutationen

als Krankheitsursache

Möglichkeiten

und Grenzen neuer molekularbiologischer Verfahren

in der Medizin

Matthias Volkenande Olaf M. Koch 2

Fritz von Weizsäcker'

Die Entwicklung neuer molekularbiologischer Verfahren bringt einen raschen Erkenntniszuwachs in vielen Bereichen der Medizin mit sich.

Bei einer zunehmenden Anzahl von Erkrankungen werden zugrundelie- gende genetische Alterationen, wie zum Beispiel Punktmutationen in Genen wichtiger Proteine, bekannt. Diese Veränderungen können bei einzelnen Patienten durch neue molekulare Verfahren, wie zum Bei- spiel die Polymerase-Chain-Reaction (PCR), mit bis vor einigen Jahren nicht vorstellbar gewesener Geschwindigkeit nachgewiesen werden.

Es sind jedoch auch die Grenzen der bisher verfügbaren Verfahren und die ethischen Implikationen molekularer Analysen in der Medizin in Betracht zu ziehen.

D

ie Kenntnis von moleku- largenetischen Verände- rungen, die zu verschiede- nen Erkrankungen in vielen Bereichen der Medizin führen, nimmt derzeit in unvorhersehbar ge- wesenem Maße zu. Eine rasch wach- sende Anzahl von Erkrankungen läßt sich auf molekulargenetische Defekte zurückführen, und in kurzen Zeitabständen erscheinen Publi- kationen, die Einblick in den molekularen Pathomechanismus weiterer Erkrankungen geben. Zu den häufig- sten Veränderungen im Genom ge- hören sogenannte Punktmutationen.

Dabei handelt es sich um den Aus- tausch eines einzelnen Nukleotids im genetischen Code. Punktmutationen können zu relevanten Veränderun- gen in der Struktur wichtiger Prote- ine führen. Das Resultat kann ein funktionsuntüchtiges oder zumindest minderwertiges Protein sein. Punkt- mutationen können in Zellen be- stimmter Organe im Verlauf des Le- bens auftreten (somatische Mutatio- nen). Dies ist zum Beispiel in der Tumorgenese von Bedeutung, wo vermutlich unter der Einwirkung exo- gener Noxen (Karzinogene) Punkt- mutationen in bestimmten Onkoge- nen entstehen können. Umschriebe- ne „aktivierende" Punktmutationen in Onkogenen, beziehungsweise „in- aktivierende" Punktmutationen in sogenannten Anti-Onkogenen kön- nen dann zu einem Tumorwachstum

führen. So wurden solche Punktmu- tationen in einem hohen Prozentsatz zum Beispiel beim hepatozellulären Karzinom (1, 2), beim Pankreaskar- zinom (3), wie auch beim Bronchial-, Mamma- und Kolonkarzinom (4) gesehen.

Punktmutationen können auch im genetischen Material von Keim- bahnzellen (Keimzellmutationen) auftreten und somit an alle Zellen eines Nachkommen vererbt werden.

Dies ist zum Beispiel bei vielen Stoff- wechselstörungen und hämatologi- schen Erkrankungen der Fall (siehe Tabelle 1). Zugrundeliegende molekulare Defekte bei weiteren Erkran- kungen werden in kurzen Abstän- den bekannt. Erst kürzlich wurden Punktmutationen, die vermutlich an der Genese der familiären Kardio- myopathie (5), des „langen QT- Syndroms" (6) und der Alzheimer- schen Erkrankung (7) beteiligt sind, beschrieben. An der Tumorgenese können auch beide Mechanismen (somatische und Keimzellmutatio- nen) beteiligt sein. So ist über die fa- miliäre Form des Retinoblastoms bekannt, daß ein Allel des Chromo- soms 13 mit bestimmten Deletionen

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Dermatologische Klinik und Poliklinik (Direktor: Prof. Dr. med. Gerd Plewig) der Ludwig-Maximilians-Universität München

2 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA

3 Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Charlestown, MA, USA

oder Mutationen im Bereich des sogenannten Retinoblastomgens vererbt wird. Bei Kindern, die erkran- ken, kommt es zusätzlich in einer Retinazelle zu Deletionen im Be- reich des verbliebenen normalen Al- lels dieses Gens. Kürzlich wurden bei Patienten mit einer familiären Häufung multipler Tumore, dem sogenannten Li-Fraumeni-Syndrom, Keimzellmutationen im p53(Anti-) Onkogen gesehen (8, 9). Der Nach- weis weiterer somatischer Verände- rungen, die zur manifesten Ausbil- dung eines Tumors in einem Organ führen, ist zu erwarten.

Bisher waren zur Aufdeckung einer Punktmutation sehr aufwendi- ge molekularbiologische Verfahren, wie etwa das Klonieren in Bakterien, nötig, da zur Analyse des interessierenden Genabschnittes mehrere Mil- lionen Kopien des Gens künstlich hergestellt werden müssen. Die Schnelligkeit des Wissenszuwachses über Mutationen ist in erster Linie auf die Entwicklung neuer molekularbiologischer Techniken, die das Klonieren in Bakterien in vielen Fäl- len überflüssig machen, zurückzu- führen. Hierbei kommt der Poly- merase-Chain-Reaction (PCR) eine zentrale Rolle zu*). Diese Methode

') Karin Mölling: PCR: Genanalyse ohne Gen- technik. Eine neue Methode revolutioniert die medizinische Diagnostik, Dt. Ärzteblatt 84 (1989) A-2531-2539 [Heft 37]

Dt. Ärztebl. 89, Heft 39, 25. September 1992 (59) A1^-3141

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defekte Proteine/Gene Hämatologische Erkrankungen

Beta-Globin Beta-Globin

NADPH-Dehydrogenase Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Beta-Thalassämie

Sichelzellenanämie Chronisch septische Granulomatose Favismus

Adenosindesaminase-Mangel Hämophilie (A, B)

von-Willebrand-Syndrom

Adenosindesaminase Faktor VIII, IX von-Willebrand-Faktor

Porphyria cutanea tarda Insulinresistenz

Familiäre

Hypercholesterinämie

Uroporphyrinogen-Decarboxylase Insulinrezeptor

LDL-Rezeptor Muskeldystrophie Duchenne

Tay-Sachs-Krankheit Lesch-Nyhan-Syndrom

Dystrophin

Beta-N-Acetyl-Hexosaminidase Hypoxanthinguanin-

Phosphoribosyl-Transferase Osteogenesis imperfecta

Ehlers-Danlos-Syndrom Marfan-Syndrom

Typ-I-Kollagen

Kollagen (verschiedene Typen) Fibrillin

Vitamin-D-resistente Rachitis Phenylketonurie

Mukoviszidose

Vitamin-D-Rezeptor Phenylalaninhydroxylase Cystic Fibrosis

Transmembran Regulator Protein

Chorea Huntington (Morbus Alzheimer

HD Locus

Amyloid-Precursor-Protein) Tabelle la: Beispiele von Erkrankungen mit vererbbaren Punktmuta- tionen (Keimzellmutationen)

Stoffwechsel- und Speicherkrankheiten

Neurologische Krankheiten

Tabelle lb: Beispiele von Erkrankungen mit (erworbenen) Punktmuta- tionen im erkrankten Gewebe (somatische Mutationen)

Adenokarzinom der Lunge Kolorektales Karzinom Pankreaskarzinom Harnblasenkarzinom Keratoakanthom

Ras-Onkogen- Familie

Mammakarzinom Kolonkarzinom Magenkarzinom

Hepatozelluläres Karzinom Basaliome

Lymphome

p53-(Anti-)Onkogen ermöglicht eine exponentielle und

spezifische In-vitro-Vermehrung eines interessierenden Genabschnittes innerhalb von wenigen Stunden (10, 11). Als Ausgangsmaterial für die PCR eignen sich geringste Mengen von DNA aus klinischen Proben (zum Beispiel Lymphozyten, abge- schilferte Epithelzellen, in Paraffin eingebettetes Material).

Die Effektivität und Schnellig- keit der PCR erlaubt erstmals die rasche Analyse einer größeren Anzahl von Proben. Tabelle 1 zeigt Beispiele von Erkrankungen, bei denen mit Hilfe der PCR Punktmutationen in bestimmten Genen nachgewiesen werden können.

Die Analyse

des PCR-Produktes Eine erste Analyse des PCR- Produktes geschieht durch einfache Agarose-Gelelektrophorese. Hierbei ist jedoch noch nicht erkennbar, ob eine Mutation im amplifizierten Genabschnitt vorliegt. Die vollstän- digste Untersuchung des PCR-Pro- duktes ist die Bestimmung der ge- samten Nukleotidsequenz des amplifizierten Gensegmentes durch soge- nanntes direktes Sequenzieren (12, 13). Obwohl das direkte Sequenzie- ren im Vergleich zu bisher üblichen Klonierungsverfahren in Bakterien viel Zeit erspart, ist die Analyse einer großen Anzahl von Proben den- noch weitaus zu arbeitsaufwendig.

Es sind daher verschiedene „Screen- ing-Methoden" entwickelt worden, die aufzeigen, ob im amplifizierten Genabschnitt (dem PCR-Produkt) eine Mutation vorliegt (Tabelle 2).

Durch eine Mutation im Gen kann eine Erkennungsstelle für ein spezifisches bakterielles Enzym, das DNA-Sequenzen spalten kann, ver- lorengehen. Bei der Verdauung des PCR-Produktes mit diesem Enzym (Restriktionsdigestion) kommt es dann nur bei Vorliegen der nicht mutierten Wildtypsequenz zu einer Spaltung des Produktes, was durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden kann. Dies erlaubt zum Bei- spiel die rasche Diagnose des genetischen Defektes der Sichelzellenan- ämie (14) oder der kürzlich bekannt

Ar3142 (60) Dt. Ärztebl. 89, Heft 39, 25. September 1992

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gewordenen häufigen Punktmutati- on im Kodon 249 des p53-Anti-On- kogens beim hepatozellulären Karzi- nom (1, 2). Abbildung 1 zeigt PCR- Produkte von p53-Genabschnitten von normalem und karzinomatösem Lebergewebe. Nach einer einfachen Verdauung der PCR-Produkte mit dem Restriktionsenzym Hae III läßt sich DNA von normalem und tumo- rösem Lebergewebe klar unterschei- den. Die allelspezifische Amplifika- tion setzt bereits bei der PCR modi- fizierte Primer ein, die ausschließlich ein mutiertes Gen amplifizieren und somit nur bei Vorliegen einer Muta- tion ein Amplifikationsprodukt er- zeugen. Bei der mutationsspezi- fischen Oligonukleotid-Hybridisie- rung wird das PCR-Produkt auf eine Nylonmembran übertragen (South- ern Blotting). Diese Membran wird dann mit einer spezifischen und zur mutierten DNA-Sequenz komple- mentären, radioaktiv markierten kurzkettigen DNA-Sonde (einem

„Oligonukleotid") inkubiert, was zur Bindung (Hybridisierung) der Sonde an die mutierte DNA führt. Die Bin- dung an nicht mutierte DNA ist we- sentlich labiler und kann durch defi- nierte Waschungen, deren Bedin- gungen jeweils genau erarbeitet werden müssen, wieder gelöst werden.

Ein positives Signal ist somit ein Hin- weis auf das Vorliegen einer Mutati- on. Mit diesem Verfahren sind zahl- reiche Studien, etwa zur Detektion von Onkogenmutationen in Kolon- tumoren und Melanomen durchge- führt worden (4, 15).

Die bisher genannten Verfahren haben den Nachteil, daß nur vorbe- schriebene, „erwartete" Mutationen an definierten Stellen im Gen erkannt werden' können, nicht jedoch bislang unbekannte, „neue" Muta- tionen. Von großer Bedeutung sind daher auch weitere, neuere Metho- den, die je nach Sensitivität jede be- liebige Punktmutation im PCR-Pro- dukt, unabhängig von ihrer Position, aufdecken können. Nach Abschluß der PCR kann das Produkt zum Bei- spiel mit Genproben hybridisiert werden, die komplementär zur nicht mutierten Wildtypsequenz sind. An Stellen einer Punktmutation im PCR-Produkt wird eine fehlende Ba- senpaarung vorliegen („mismatch").

Tabelle 2: Molekularbiologi- sche Methoden zum Nach- weis von Punktmutationen in PCR-amplifizierten Genab- schnitten

I. Direktes Sequenzieren II. Screening-Methoden zur Detektion von Punktmutationen:

Digestion mit einem Restriktionsenzym - allelspezifische

Amplifikation

- mutationsspezifische Oligo- nukleotid-Hybridisierung - enzymatische und chemische

Cleavage-Verfahren

denaturierende Gradienten- gel-Elektrophorese

- Konformations-Polymor- phismen von DNA und RNA

Abbildung 1: Amplifikation eines Abschnitts des p53-(Anti-)Onkogens durch Polymerase Chain Reaction. Die Agarose-Gelelektro- phorese zeigt nach Digestion mit einem Re- striktionsenzym bei normalem Lebergewe- be (Probe 1-4 und 6-8) ein verändertes Muster und zwei Fragmente (75 und 35 Ba- senpaare). Bei Probe 5 (Hepatomgewebe) und Probe C (positive Kontrolle, Tumorzelli- nie) erfolgt keine Spaltung, da durch das Vorliegen einer Mutation die Schnittstelle für das Enzym verlorenging.

Durch enzymatische oder chemische Verfahren werden die Proben an dieser Stelle gespalten („Cleavage").

Die Fragmente können durch Gel- elektrophorese sichtbar gemacht

werden und einen deutlichen Hin- weis auf das Vorliegen einer Mutati- on geben. Durch diese Verfahren wurde zum Beispiel bei 95 Prozent der untersuchten Pankreaskarzino- me eine Mutation im K-ras-Onkogen entdeckt (3). Bei der Analyse der PCR-Produkte durch die sogenannte denaturierende Gradientengel-Elek- trophorese (mit ansteigender Kon- zentration eines Denaturans in einem Polyacrylamidgel) kommt es bei einer bestimmten Stelle im Gel zu einer Trennung der DNA-Dop- pelstränge („Denaturierung") und einer drastischen Veränderung der Mobilität im Gel. Diese Stelle im Gel, bei der das PCR-Produkt dena- turiert, hängt von der Nukleotidse- quenz des amplifizierten Gens ab und wird somit bei Vorliegen einer Mutation verändert. Mit dieser Me- thode wurden unter anderem Muta- tionen bei der Thalassämie entdeckt (16). Weiterhin kann die Analyse von Konformations-Polymorphismen

von DNA erfolgreich als Screening- Methode eingesetzt werden (17).

Diese neuartige Methode führte zum Beispiel zur Identifikation von Punktmutationen im Neurofibroma- tosegen (18). Durch Hitze denatu- rierte PCR-Produkte haben eine be- stimmte Konformation, die streng von der Nukleotidzusammensetzung abhängt. Moleküle mit einer Mutati- on weisen eine andere Konformation auf und ergeben ein anderes Muster bei der Gelelektrophorese. Neueste Untersuchungen zeigen, daß die Um- schreibung des PCR-Produktes in eine komplementäre RNA und die A1^-3144 (62) Dt. Ärztebl. 89, Heft 39, 25. September 1992

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anschließende Analyse von RNA- Konformations-Polymorphismen die Sensitivität dieser Screening-Metho- de noch deutlich erhöhen kann (19).

Diskussion

Die Entwicklung neuer molekularbiologischer Techniken bringt einen Kenntniszuwachs ungeahnten Ausmaßes mit sich, und in den kom- menden Jahren ist mit Einblicken in den molekularen Pathomechanismus vieler weiterer Erkrankungen zu rechnen. Das in den USA begonnene

„Human Genome Project" mit dem Ziel, bis zum Jahre 2010 das gesamte menschliche Genom zu kennen, deu- tet in diese Richtung (20, 21). In der klinisch-pathologischen Diagnostik nehmen molekulare Analysen daher einen zunehmend wichtigen Stellen- wert ein. Dies macht jedoch auch nö- tig, die Grenzen der verfügbaren Verfahren zu sehen. Die Detektion von Punktmutationen in bestimmten Genen bei einzelnen Erkrankungen kann wichtige Hinweise zur molekularen Aufklärung der Pathogenese der Krankheit geben. Allerdings sind darüber hinaus auch viele andere Verfahren, zum Beispiel biochemi- scher Art, notwendig, um die patho- physiologische Bedeutung eines alte- rierten Proteins im Gesamtorganis- mus zu klären. Auch sind trotz der jüngsten Entwicklungen die oben genannten molekularen Analysen zum Teil sehr aufwendig und können nur mit großer Erfahrung sachgerecht durchgeführt werden. Die richtige Interpretation von Ergebnissen erfordert die Erfahrung von speziali- sierten Laboratorien. Zum jetzigen Zeitpunkt ist auch über die Sensitivi- tät und Spezifität der genannten Screening-Verfahren noch zu wenig bekannt, um sie als Routineverfah- ren in der Klinik einsetzen zu kön- nen. So werden beispielsweise durch das genannte enzymatische Cleava- ge-Verfahren von PCR-Produkten vermutlich nur etwa 50 Prozent der Mutanten eines Gens erkannt. Ins- gesamt erfordert gerade die grundle- gende Methode der PCR trotz au- genscheinlicher Einfachheit und weitreichender Anwendbarkeit gro- ße Kenntnis und Sorgfalt, zum Bei-

spiel zur Vermeidung falsch positiver und falsch negativer Resultate.

Die genannte schnelle Entwick- lung bringt auch mit sich, daß das Auseinander von diagnostischem und therapeutischem Vermögen der Medizin gegenwärtig noch größer werden kann. Bei fehlender Thera- piemöglichkeit kann das Wissen um einen genetischen Test sehr bela- stend sein, und es eröffnen sich Pro- bleme unter anderem der Versiche- rungsmedizin, der Betriebsmedizin (Einstellungsuntersuchungen) und der Pränatalmedizin. Es gibt erste Versuche, das rasch zunehmende molekularbiologische Wissen auch im therapeutischen Bereich der Me- dizin nutzbar zu machen (Genthera- pie) (22, 23). In allen diesen Ent- wicklungen sind neben wissenschaft-

Zeitpunkt

prophylaktischer Antibiotika-Gabe bei Operationen

Randomisierte, kontrollierte Studien haben gezeigt, daß pro- phylaktische Antibiotika-Gaben zur Verhinderung von Wundinfektionen nach Operationen wirksam sind. Es ist jedoch nicht geklärt, wie der Zeit- punkt der Antibiotika-Gabe das Ri- siko einer Infektion in der tatsächli- chen klinischen Praxis beeinflußt.

Die Autoren untersuchten pro- spektiv das Auftreten von Wundin- fektionen bei 2847 Patienten. Die Antibiotika-Gabe zwei bis 24 Stun- den vor dem operativen Eingriff wurde als „früh" definiert, während die Gabe zwei Stunden vor dem Eingriff als präoperativ, drei Stunden nach dem Eingriff als perioperativ und mehr als drei, aber weniger als 24 Stunden nach dem Eingriff als post- operativ definiert wurde. Von den 1708 Patienten, die präoperativ eine Antibiotika-Prophylaxe erhielten, er- litten 10 (0,6 Prozent) nachfolgend Wundinfektionen. Bei vier von den 282 Patienten (1,4 Prozent), die perioperativ Antibiotika erhielten, traten diese Infektionen auf (p = 0,12, re-

lichen Problemen stets auch rechtli- che, gesellschaftliche und ethische Fragen von Belang.

Dt. Ärztebl. 89 (1992) A 1-3141-3145 [Heft 39]

Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis im Sonderdruck, anzufordem über die Verfasser.

Anschrift für die Verfasser:

Dr. med. Matthias Volkenandt Dermatologische Klinik und Poliklinik der

Ludwig-Maximilians-Universität München

Frauenlobstraße 9-11 W-8000 München 2

FÜR SIE REFERIERT

latives Risiko im Vergleich zu der präoperativ behandelten Gruppe:

2,4). Von 488 Patienten mit postope- rativer Antibiotika-Gabe entwickel- ten 16 (3,3 Prozent) Wundinfektio- nen (p < 0,0001; relatives Risiko:

5,8). Von den 369 Patienten mit einer frühen Antibiotika-Behandlung hatten 14 (3,8 Prozent) Wundinfek- tionen (p < 0,0001; relatives Risiko:

6,7). Die statische Analyse bestätig- te, daß eine Behandlung mit Anti- biotika in der präoperativen Zeit mit dem niedrigsten Risiko für eine Ope- rationswundinfektion assoziiert war.

So kommen die Autoren zu der Schlußfolgerung, daß zwar in der chirurgischen Praxis beträchtliche Variationsmöglichkeiten beim Tim- ing der prophylaktischen Antibioti- ka-Gabe bestehen, daß aber die Be- handlung während der zwei Stunden vor der Operation das Risiko einer Wundinfektion am effektivsten redu- ziert. ing

Classen, D. C. et al.: The timing of prophy- lactic administration of antibiotics and the risk of surgical-wound infection, New Engl.

J. Med. 326 (1992) 281-286

Dr. John P. Burke, Department of Clinical Epidemiology, LDS Hospital, Eighth Ave.

and C. St., Salt Lake City, UT 84143, USA

Dt. Ärztebl. 89, Heft 39, 25. September 1992 (63) A1^-3145