Etablierung des Ovalbumin-induzierten Mausmodells der atopischen Dermatitis zur Beurteilung
pharmakologischer Wirkstoffe
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Hanna Kathrin Köchling Dortmund
Hannover 2015
1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2015
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.
Für meine Familie
-In Liebe und Dankbarkeit-
I Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Tiermodelle der atopischen Dermatitis ... 3
2.1.1 Spontan atopische Dermatitis entwickelnde Mausmodelle ... 3
2.1.2 Epikutane Sensibilisierung als Model der AD ... 4
2.1.3 Genetisch veränderte Mäuse als Model der AD ... 5
2.2 Histamin ... 9
2.3 Histaminrezeptoren ... 10
2.3.1 Histamin 1-Rezeptor ... 10
2.3.2 Histamin 4-Rezeptor ... 13
2.4 H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen Dermatitis und Kontaktallergie ... 18
3 Material und Methoden ... 24
3.1 Material ... 24
3.1.1 Material für In-vivo-Versuche ... 24
3.1.2 Material für Zellkultur-Versuche ... 25
3.1.3 Material für ELISA ... 26
3.1.1 Material für Histologie ... 26
3.1.2 Material für FACS ... 27
3.1.3 Puffer und Lösungen ... 28
3.1.4 Versuchstiere und Tierhaltung ... 29
3.2 Versuchsübersicht ... 30
3.3 Methoden ... 31
3.3.1 Protokoll des OVA-Modells ... 31
3.3.2 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-induzierten Modells der atopischen Dermatitis ... 32
3.3.3 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell ... 33
3.3.4 Untersuchte Parameter im OVA-Modell ... 36
3.4 Statistische Auswertung ... 41
4 Ergebnisse ... 42
II
4.1 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des Ovalbumin-induzierten Modells der
atopischen Dermatitis (OVA-Protokoll) ... 42
4.1.1 Klinischer Hautscore ... 42
4.1.2 Histologie ... 44
4.1.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl ... 46
4.1.4 Milzzellzahl ... 47
4.1.5 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum ... 48
4.2 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA- Modell ... 48
4.2.1 Klinischer Hautscore ... 48
4.2.2 Histologie ... 51
4.2.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl ... 55
4.2.4 Milzzellzahl ... 58
4.2.5 Zytokinsekretion Splenozyten ... 59
4.2.6 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum ... 61
4.2.7 Juckreiz ... 62
4.2.8 Vergleich der Vehikelgruppen ... 63
5 Diskussion ... 64
5.1 Das OVA-Modell als Mausmodell der AD ... 65
5.2 Einfluss der zusätzlichen Störung der Hautbarriere auf das OVA-Modell ... 66
5.3 Stabilität des OVA-Modells ... 67
5.4 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA- Modell ... 69
5.4.1 Effekt des Glukokortikoids Betamethason im OVA-Modell ... 69
5.4.2 Effekte von Histaminrezeptor-Antagonisten im OVA-Modell ... 71
5.5 Schlussfolgerung ... 74
6 Zusammenfassung ... 76
7 Summary ... 78
8 Literaturverzeichnis ... 80
9 Anhang ... 100
III Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AD Atopische Dermatitis
Aqua ad inj. Aqua ad injectionem, Wasser für Injektionszwecke
BSA Bovines Serumalbumin
C Challenge, Provokationswoche
ca. circa
CD Cluster of differentiation
DC Dendritische Zellen
DNCB Dinitrochlorobenzol D. farinae Dermatophagoides farinae
Dfb Hausstaubmilben
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay et al. und andere
FACS Fluorescense Activated Cell Sorting FITC Fluoresceinisothiocyanat
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
HE Hämatoxylin-Eosin
H1R Histamin 1 Rezeptor H2R Histamin 2 Rezeptor H3R Histamin 3 Rezeptor H4R Histamin 4 Rezeptor
IDEC Inflammatorische dendritische epidermale Zellen
IFN Interferon
IgE Immunglobulin E
IL Interleukin
i.p. intraperitoneal
JNJ 3975 JNJ 39758979
k.A. keine Angaben in der Literatur
kg Kilogramm
IV
MCP Monocyte chemotactic protein
mg Milligramm
min Minuten
MIP Macrophage inflammatory protein
ml Milliliter
mRNA messenger Ribonukleinsäure
NaCl Natriumchlorid
NGF Nerve growth factor
OVA Ovalbumin
OVA-Modell Ovalbumin-induziertes Mausmodell PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
p.o. per os
RANTES Regulation and activated normal T-cell expressed and secreted
SD Standardabweichung
SE Sensibilisierungswoche
Std. Stunden
TARC Thymus and activation-regulated chemokine
TDI Toluendiisocyanat
TH T-Helferzelle
TNCB Trinitrochlorobenzen TNF Tumor necrosis factors
TSLP Thymic stromal lymphopoietin
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
® Registered Trade Mark
TM Unregistered Trade Mark
± Plus/Minus
% Prozent
1
1 Einleitung
Die atopische Dermatitis ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die mit starkem Juckreiz einhergeht und sowohl beim Menschen als auch unterschiedlichen Tierarten, wie z.B. dem Hund, auftritt.
Beim Menschen sind vor allem Säuglinge und Kleinkinder von der atopischen Dermatitis betroffen, die Prävalenz in den Industriestaaten beträgt 10,2 % (SILVERBERG & HANIFIN 2013).
Die klinischen Symptome unterscheiden sich je nach Krankheitsphase: In der akuten Phase ist die atopische Dermatitis durch starken Juckreiz und erythematöse Haut mit Papeln gekennzeichnet. Es finden sich sowohl Exkorationen sowie Erosionen mit serösem Exsudat.
In der subakuten Phase leiden die Betroffenen unter erythematösen, schuppenden Pappeln mit deutlichen Exkorationen. Die chronische Phase der atopischen Dermatitis ist durch verdickte Haut, Lichenifikation sowie fibrösen Papeln charakterisiert. In diesem Stadium der atopischen Dermatitis können Symptome aller drei Krankheitsphasen parallel auftreten (LEUNG 1999).
Auch beim Hund sind Hautläsionen und starker Juckreiz die klinischen Hauptsymptome. Die Prävalenz beträgt ca. 10 % bis 20 % aller Hunde (NOLI et al. 2014).
Die frühere Annahme, dass die atopische Dermatitis eine klassische Typ 1- Hypersensitivitätsreaktion mit Bildung von allergenspezifischen Immunglobulin E (IgE)- Antikörpern sei, ist mittlerweile revidiert. Die atopische Dermatitis gilt heute als multifaktorielle Erkrankung, bei der komplexe immunologische Vorgänge sowie genetische Faktoren eine Rolle spielen (LEUNG 2000; NOVAK et al. 2003).
So ist die Beteiligung des im Jahr 2000 entdeckten Histamin 4 Rezeptors (H4R) an der Entstehung der atopischen Dermatitis bisher noch nicht gänzlich verstanden. Es wird angenommen, dass dieser vor allem für die Entstehung des Juckreizes eine wichtige Rolle spielt, da erhöhte Histaminspiegel in atopischer Haut nachgewiesen werden können (RUZICKA und GLÜCK 1983), eine Behandlung mit Histamin 1 Rezeptorantagonisten (H1R-Antagonist) jedoch keine zufriedenstellende klinische Besserung hervorruft (HOARE et al. 2001). Daher scheint der H4R ein neuer vielversprechender Ansatz zur Therapie der atopischen Dermatitis sein.
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Das Ziel dieser Arbeit ist es, zunächst ein Tiermodell der atopischen Dermatitis zu etablieren um im Anschluss den Effekt von H1R- und H4R- Antagonisten in diesem Modell zu untersuchen. Als Tiermodell wurde das Ovalbumin-induzierte Mausmodell der atopischen Dermatitis nach SPERGEL et al. (1998) gewählt, da dieses viele Aspekte der humanen atopischen Dermatitis widerspiegelt. Des Weiteren soll untersucht werden, ob die zusätzliche Störung der Hautbarriere dieses Modell optimieren kann. Ebenso sollen die Effekte von unterschiedlichen Wirkstoffgruppen (Glukokortikoid, H1R- und H4R-Antagonist) in diesem Tiermodell untersucht werden. Auch werden unterschiedliche Behandlungszeiträume sowie Applikationsarten miteinander verglichen.
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2 Literaturübersicht
2.1 Tiermodelle der atopischen Dermatitis
Um die pathophysiologischen Vorgänge besser zu verstehen und um neue Wirkstoffe entwickeln und testen zu können, werden Tiermodelle der atopischen Dermatitis (AD) eingesetzt.
Die Maus bietet als Versuchstier einige Vorteile: es sind kleine Tiere, die Haltungskosten sind gering, sie haben eine hohe Anzahl an Nachkommen pro Jahr, die Physiologie und Pathophysiologie der Maus sind bereits sehr gut erforscht. Des Weiteren sind Inzuchtstämme sowie genetisch veränderte Tier erhältlich (z.B. Knockout-Mäuse) (GUTERMUTH et al.
2004).
Die bisher eingesetzten Mausmodelle der AD können zur besseren Übersicht in drei Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe beinhaltet Mäuse, die spontan atopische Dermatitis entwickeln, in der zweiten Gruppe wird die atopische Dermatitis durch eine epikutane Sensibilisierung ausgelöst und in der dritten Gruppe werden genetisch veränderte Mäuse verwendet (JIN et al. 2009).
2.1.1 Spontan atopische Dermatitis entwickelnde Mausmodelle
Die Inzuchtstämme NC/NgA, NOA und DS/Nh entwickeln unter normalen Haltungs- bedingungen spontan AD.
2.1.1.1 NC/NgA-Mäuse
Mäuse des Inzuchtstamms NC/NgA entwickeln bei Kontakt mit Umweltallergenen spontan Hautveränderungen, die in vielen Aspekten der humanen AD ähneln. Ab einem Alter von acht Wochen können erste Läsionen im Gesicht, an den Ohren, im Nacken und auf dem Rücken entstehen. Zu Beginn zeigen die Mäuse Juckreiz, Erytheme und Blutungen, gefolgt von Ödemen, Errosionen, Exkorationen, Schuppen und trockener Haut. Auch bleiben diese Tiere im Wachstum zurück. Histologische Veränderungen sind die Zunahme der Epidermisdicke, Hyper- und Parakeratose sowie interzelluläre Ödeme. Zudem nimmt die Anzahl an Mastzellen in der Haut deutlich zu, ein Teil dieser ist degranuliert. Die Anzahl an Eosinophilen nimmt ebenso zu. Der totale IgE-Gehalt im Serum steigt mit Zunahme des klinischen Schweregrads der AD an (MATSUDA et al. 1997).
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Eine Störung der Hautbarriere konnte in diesem Tiermodell nachgewiesen werden, so sind der Gehalt an Ceramiden in der Haut von NC/NgA Mäusen deutlich reduziert und der Wasser- verlust aus der Haut erhöht (AIOI et al. 2001). Werden die Tiere unter pathogenfreien Bedingungen gehalten, entwickeln sie keinerlei Symptome, daher scheint der Kontakt zu Umweltallergenen als Auslöser notwendig zu sein (MATSUDA et al. 1997).
2.1.1.2 NOA-Mäuse
Ein weiterer Inzucht-Stamm, der spontan AD entwickelt, ist die NOA-Maus. Bei diesen Mäusen entsteht ab einem Alter von zehn Wochen spontan eine ulzerative Dermatitis, die mit Juckreiz, Mastzell-Infiltration und erhöhten IgE-Serumspiegeln einhergeht. Jedoch fehlen die für AD typischen histologischen Veränderungen der Haut (WATANABE et al. 1999).
2.1.1.3 DS/Nh-Mäuse
Auch bei DS/Nh-Mäusen entstehen unter konventionellen Haltungsbedingungen Juckreiz und erythematöse und erosive Hautläsionen. Der erhöhte IgE-Gehalt im Serum korreliert mit dem Schweregrad der Symptome. In der Haut finden sich vermehrt CD4+ T-Zellen, Eosinophile, Mastzellen und CD11b+ Makrophagen. Die Hautläsionen sind mit Staphylococcus aureus (S.
aureus) besiedelt. Eine Beteiligung dieses Keims an der Entstehung der Läsionen gilt als sehr wahrscheinlich (HIKITA et al. 2002).
2.1.2 Epikutane Sensibilisierung als Model der AD
Die epikutane Sensibilisierung zur Auslösung von AD-ähnlichen Hautläsionen kann mit verschiedenen Allergenen erfolgen. Häufig verwendet werden das Hühnereiweiß Ovalbumin (OVA) oder verschiedene Hausstaubmilben-Extrakte (GUTERMUTH et al. 2004).
2.1.2.1 Epikutane Sensibilisierung mit OVA
Die epikutane Sensibilisierung mit OVA ist sowohl für Balb/c- als auch C57BL/6- Mäuse beschrieben (SPERGEL et al. 1999).
Die Sensibilisierung erfolgt über die dreimalige Applikation von OVA über 1 Woche auf die rasierte Haut. Die Pause zwischen den einzelnen Sensibilisierungen beträgt 2 Wochen. Die Mäuse entwickeln AD-ähnliche Hautläsionen, die histologisch durch epidermale Hyperproliferation sowie Infiltration von Neutrophilen, Lymphozyten, Mastzellen und
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Eosinophilen gekennzeichnet sind. Die Expression von mRNA der Zytokine IL-4, IL-5 und IFN-γ in der Haut ist gesteigert. Der Serumgehalt von totalem sowie allergenspezifischem IgE ist erhöht. Die Inhalation von aerolisiertem OVA führt bei epikutan sensibilisierten Mäusen zu asthmaähnlichen Symptomen (SPERGEL et al. 1998; JIN et al. 2009).
2.1.2.2 Epikutane Sensibilisierung mit Hausstaubmilben-Extrakten
Die Sensibilisierung mit Hausstaubmilben-Extrakten ist bisher für zwei verschiedene Mausstämme beschrieben worden. Zum einen wird der Inzuchtstamm NC/NgA verwendet.
Die Mäuse werden unter sterilen, pathogenfreien Bedingungen gehalten und dreimal pro Woche mit einem Extrakt aus der Hausstaubmilbe Dermatophagoides farinae (D. farinae) auf dem Rücken behandelt. In der zweiten Woche entsteht trockene, juckende Haut, ab der vierten Woche lassen sich Hautläsionen (Erosionen mit Blutungen, Schuppen) beobachten.
Der totale sowie D. farinae-spezifische IgE-Gehalt im Serum steigt an. Histologische Ver- änderungen sind die Zunahme der Epidermisdicke sowie eine erhöhte Anzahl an Mastzellen in der Haut (MATSUOKA et al. 2003).
Im zweiten Modell werden Balb/c-Mäuse mit dem rekombinantem Milbenallergen Der p 8 sensibilisiert. Die epikutane Sensibilisierung erfolgt insgesamt dreimal über jeweils vier Tage in einem Abstand von 17 Tagen. Klinisch entsteht eine exkorative Dermatitis mit deutlicher Lichenifikation. Histologisch fallen eine Verdickung der Epidermis, eine Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie von Mastzellen auf. Eine Zunahme von Nervenendigungen in der Nähe der Mastzellen sowie ein Anstieg von Neuropeptiden in der Dermis könnten Hinweise auf eine neurogene Entzündung sein (HUANG et al. 2003).
2.1.3 Genetisch veränderte Mäuse als Model der AD
Zu dieser Gruppe zählen sowohl transgene als auch Knockout-Mäuse. Diese Modelle sind besonders geeignet, um z.B. die Bedeutung einzelner Zytokine für die Pathogenese der AD zu klären (GUTERMUTH et al. 2004).
2.1.3.1 Transgene Mäuse
Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-31 (IL-31), und Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) transgene Mäuse entwickeln AD-ähnliche Läsionen.
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IL-4 transgene Mäuse
Das Zytokin IL-4 ist in der Lage, die Differenzierung von TH0-Zellen zu TH2-Zellen induzieren, als auch B-Zellen zur Produktion von IgE anzuregen.
IL-4 transgene Mäuse exprimieren das murine IL-4 Gen auf basalen Keratinozyten. Dies führt zu einem erhöhten IL-4 Gehalt in der Haut. Ab einem Alter von 4 Monaten zeigen 43% der Tiere trockene Haut, Juckreiz sowie erste Hautläsionen. Die Lokalisation dieser Läsionen ähnelt denen von NC/NgA-Mäusen. Histologisch sind die chronischen Hautläsionen durch Spongiosis, Hyper- und Parakeratose, Akanthose sowie Infiltration von T-Zellen, Eosino- philen und z.T. degranulierten Mastzellen gekennzeichnet. Bei 47% der Mäuse mit Symp- tomen kann eine sekundäre Infektion der Hautläsionen mit S. aureus nachgewiesen werden (CHAN et al. 2001).
IL-31 transgene Mäuse
Das Zytokin IL-31 wird von TH2-Helferzellen produziert und trägt vermutlich zur Entstehung von allergischen Erkrankung bei. IL-31 transgene Mäuse überexprimieren IL-31. Ab einem Alter von vier bis acht Wochen entstehen Alopezie sowie starker Juckreiz, der zu Hautläsionen führen kann. Die Haut am Ohr ist ebenfalls verdickt. 80 bis 100 Prozent der sechs Monate alten transgenen Mäuse zeigen klinische Symptome (Alopezie und Juckreiz).
Die histologische Untersuchung der Hautläsionen zeigt Hyperkeratose, Akanthose, Infiltration von Entzündungszellen und Mastzellen. IL-31 transgene Mäuse zeigen jedoch keinen Anstieg des Serum-IgE-Gehalts (DILLON et al. 2004).
TSLP transgene Mäuse
Das Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) ist ein Zytokin, das von epithelialen Zellen gebildet wird und für die Aktivierung von dendritischen Zellen in der Haut verantwortlich ist.
TSLP transgene Mäuse exprimieren ein keratinozytenspezifisches, durch Tetrazykline induzierbares TSLP-Gen. Unter Gabe von Doxycyclin kommt es nach zwei Wochen zur Ausbildung von Erythemen. Nach drei bis vier wöchiger Doxycyclin-Behandlung entstehen sichtbare AD-ähnliche Hautläsionen sowie Splenomegalie und Lymphadenopathie. Die Histologie zeigt eine Akanthose, Spongiosis, Hyperkeratose und eine Infiltration von Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen und Eosinophilen. Der Serumgehalt an IgE und IgG1 ist erhöht, der Gehalt an IgE2a verringert (YOO et al. 2005).
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2.1.3.2 Knockout-Mäuse
RelB-Knockout-Mäuse sowie Cathepsin E-Knockout Mäuse entwickeln ebenfalls spontan AD-ähnlich Läsionen.
RelB-Knockout-Mäuse
RelB ist ein Protein, das zur Familie des Transkriptionsfaktors NF-κB gehört und vor allem in spezifischen Regionen von lymphoiden Organen expremiert wird.
RelB-Knockout-Mäuse zeigen neben hämatologischen Veränderungen und Entzündungs- anzeichen in verschiedenen Organen auch spontan auftretende Hautläsionen (WEIH et al.
1997; BARTON et al. 2000). Diese treten ab einem Alter von vier bis zehn Wochen auf. Erste Symptome sind eine Verdickung der Haut sowie Haarverlust. Histologisch zeigen sich Hyperkeratose, Akanthose und eine Infiltration von CD4+ T-Zellen, Eosinophilen und einigen Mastzellen in der Haut. Der Serumspiegel an IgE ist erhöht (BARTON et al. 2000).
Cathepsin E-Knockout-Mäuse
Cathepsin E ist ein endolysosomale Protease, die vor allem in Zellen des Immunsystems zu finden ist (YANAGAWA et al. 2007).
Cathepsin E-Knockout-Mäuse entwickeln unter normalen Haltungsbedingungen ab einem Alter von zehn Wochen Juckreiz und Hautläsionen. Diese sind gekennzeichnet durch Alopezie, Erytheme, Krusten, Erosionen sowie eine Verdickung der Haut. Der Schweregrad der Läsionen nimmt mit dem Alter der Tiere zu. Histologisch weisen die Läsionen eine epidermale Hyperproliferation wie auch eine Infiltration von Eosinophilen, Makrophagen, Lymphozyten und Mastzellen in der Dermis auf. Der Gehalt an IgE im Blut ist, ebenso wie der Gehalt an Eosinophilen, gesteigert. In vitro verursacht eine Stimulation von Splenozyten von Cathepsin E-Knockout-Mäusen eine erhöhte Sekretion von IL-4 und IL-5, nicht jedoch von IL-2 und IFN-γ (TSUKUBA et al. 2003).
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Tabelle 1: Übersicht über Befunde der jeweiligen Mausmodelle der atopischen Dermatitis, (k.A. = keine Angaben in der Literatur) (MATSUDA et al. 1997; WEIH et al. 1997; SPERGEL et al. 1998; WATANABE et al. 1999; BARTON et al. 2000; CHAN et al. 2001; HIKITA et al. 2002; HUANG et al. 2003; MATSUOKA et al. 2003; TSUKUBA 2003;
DILLON et al. 2004; YOO et al. 2005).
Mausstamm
AD- ähnliche
Haut- läsionen
Gen.
Defekt der Haut- barriere
Histologie
IgE-
Anstieg Juck- reiz Infiltration von Hyper-/
Para- keratose Lympho-
zyten
Mast-
zellen total spezif.
NC/NgA + + + + + + - +
NOA + k.A. - + - + - +
DS/Nh + k.A. + + + + - +
IL-4
transgen + k.A. + + + + - +
IL-31
transgen + k.A. + + + - - +
TSLP
transgen + k.A. + + + + - k.A.
RelB
Knockout + k.A. + + + + - k.A.
Cathepsin E
Knockout + + + + + + - +
Allergen
OVA + - + + + + + +
D. farinae + + + + + + + +
Der p 8 + - + + + k.A. k.A. k.A.
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2.2 Histamin
Histamin ist ein biogenes Amin, das als Neurotransmitter im Nervensystem und als Gewebshormon im Magen-Darm-Trakt, Immunsystem und in der Haut vorkommt. Die chemische Bezeichnung lautet 2-(4-Imidazolyl)-Ethylamin.
Histamin wurde 1910 von G. Barger und Sir H. Dale als Bestandteil des Getreidepilzes Mutterkorn entdeckt. Sie stellten fest, dass Histamin eine Konstriktion eines isolierten Meerschweinchendarms hervorruft (BARGER und DALE 1910). Im selben Jahr zeigten Sir H. Dale und P. P. Laidlaw in Tierversuchen, dass die Gabe von Histamin bei Säugetieren schockähnliche Zustände verursacht. Symptome waren Bronchokonstriktion, Konstriktion von Herz- und Lungenarterien sowie eine Stimulation der Herzkontraktion (DALE und LAIDLAW 1910). Allerding gelang C. H. Best erst im Jahr 1927 der Nachweis von Histamin im Körpergewebe, v.a. in der Lunge (BEST et al. 1927).
Histamin wird durch oxidative Decarboxylierung aus der Aminosäure L-Histidin gebildet (WEISSBACH et al. 1961). In Mastzellen und basophilen Granulozyten liegt es in Granula vor und ist dort mit Heparin assoziiert. Auch in enterochromaffinen Zellen im Magen, in den Lymphknoten und im Thymus kommt Histamin in hohen Konzentrationen vor. In Leber, Lunge und in Varikositäten von histaminergen Neuronen konnte es in geringen Konzentrationen nachgewiesen werden (ZIMMERMANN et al. 2011).
Histamin hat unterschiedliche physiologische Wirkungen: im Magen fördert es die Säure- produktion, am Herzen wirkt es positiv chronotrop und inotrop. Im zentralen Nervensystem beeinflusst es den Schlaf-Wach-Rhythmus, den Appetit, das Lernverhalten und auch das Gedächtnis. Des Weiteren spielt Histamin eine Rolle als Immunmodulator und als Mediator
Abbildung 1: Strukturformel von Histamin
10
von Entzündungsreaktionen (HAAS und PANULA 2003; MÖSSNER und CACA 2005;
THURMOND et al. 2008).
Auch für pathophysiologische Vorgänge ist Histamin von Bedeutung. So konnten erhöhte Histaminspiegel in der bronchoalveolären Lavage von Asthma-Patienten nachgewiesen werden (BROIDE et al. 1991). In der Haut von Patienten mit AD, Psoriasis oder chronischer Urtikaria wurde ein gesteigerter Gehalt an Histamin festgestellt (JOHNSON et al. 1960;
PETERSEN et al. 1998; KAPLAN et al. 1978). TUOMISTO et al. (1983) konnten im Liquor von Patienten mit Multipler Sklerose einen Anstieg von Histamin nachweisen. Der Gehalt an Histamin im Plasma sowie in der Gelenksflüssigkeit bei Rheumatoider Arthritis ist ebenfalls erhöht (CRISP 1984).
2.3 Histaminrezeptoren
Histamin vermittelt seine Wirkung über vier verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.
Diese sind nach der zeitlichen Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt: Histamin 1-Rezeptor (H1R), Histamin 2-Rezeptor (H2R), Histamin 3-Rezeptor (H3R) und Histamin 4-Rezeptor (H4R).
2.3.1 Histamin 1-Rezeptor
Der H1R wird von vielen Zellen und in vielen Geweben exprimiert, u.a. auf der glatten Muskulatur von Atemwegen und Gefäßen, auf Neuronen, Hepatozyten, Chondrozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, T- und B-Zellen. Die Aktivierung des H1R ruft eine Bronchokonstriktion sowie eine Kontraktion des Darms und eine Erhöhung der Gefäßpermeabilität hervor (JUTEL et al. 2009). H1R-Knockout-Mäuse zeigen Auffälligkeiten im Lernverhalten, der Lokomotion und Nozizeption ebenso wie im Gedächtnis (YANAI et al.
1998). T-Zellen dieser Mäuse produzieren weniger IFN γ bei einer gesteigerten Produktion der TH2 Zytokine IL-4 und IL-13. Histamin scheint daher in der Lage zu sein, über den H1R die T-Zell-vermittelte Immunantwort zu beeinflussen (JUTEL et al. 2001).
11
2.3.1.1 Histamin 1-Rezeptor-Antagonisten
Nach BAKKER et al. (2000) wirken H1R-Antagonisten als inverse Agonisten, d.h. sie haben eine hohe Affinität zur inaktiven Form des H1R und verschieben das Gleichgewicht zur inaktiven Form.
H1R-Antagonisten, auch als Antihistaminika bekannt, werden in zwei Generationen unterschieden. Zu den H1R-Antagonisten der ersten Generation zählen Diphenhydramin, Doxylamin, Mepyramin (auch Pyrilamin genannt) und Dimetinden. Antihistaminika der ersten Generation können leicht die Bluthirnschranke überwinden, so dass als Nebenwirkungen Sedation und anticholinerge Effekte auftreten (HILL 1990; NICHOLSON et al. 1991). Daher wurde eine zweite Generation Antihistaminika entwickelt, die nur in geringen Maßen ins Gehirn gelangt und so weniger sedativ wirkt. Vertreter dieser „neuen“
Generation sind Cetirizin, Levocetirizin, Fexofenadin, Terfenadin, Loratadin und Desloratadin.
In der Humanmedizin sind H1R-Antagonisten der zweiten Generation Therapie der Wahl bei allergischer Rhinitis, allergischer Konjunktivitis und Urtikaria. Viele Studien belegen die Wirksamkeit dieser Medikamente zur Behandlung dieser Krankheiten. H1R-Antagonisten sind jedoch nur gering wirksam bei AD, Asthma, Anaphylaxie, Erkältungen, Otitis media, Sinusitis, unspezifischem Husten sowie nicht allergisch-bedingtem Juckreiz. H1R- Antagonisten der ersten Generation werden auch zur Behandlung von Schlaf- und Angststörungen, Akathisie, Migräne, Schwindel und zur Sedation eingesetzt. Ein großer Nachteil ist jedoch das Auftreten von starken Nebenwirkungen, wie z.B. Sinustachykardie, Mydriasis, trockener Mund und Augen, Gewichtszunahme als auch unerwünschter Sedation (SIMONS und SIMONS 2011).
Die Abbildungen 2 und 3 zeigen die Strukturformeln der erwähnten H1R-Antagonisten.
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Doxylamin Diphenhydramin
Dimetinden Mepyramin (Pyrilamin)
Abbildung 2: Strukturformeln von H1R-Antagonisten der ersten Generation.
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2.3.2 Histamin 4-Rezeptor
Der H4R wurde im Jahr 2000 zunächst von ODA et al. (2000) beschrieben. In den folgenden Jahren gelang die Klonierung des H4R von Mensch, Ratte, Maus, Meerschweinchen, Schwein, Affe und Hund (NAKAMURA et al. 2000; LIU et al. 2001; LIU et al. 2001;
MORSE et al. 2001; Zhu et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; ODA et al. 2002; ODA et al.
2005; JIANG et al. 2008). Der H4R wurde bisher auf hämatopoetischen Zellen nachgewiesen, u.a. auf dendritischen Zellen, Eosinophilen, Mastzellen, Monozyten, Neutrophilen sowie T- und B-Zellen (ODA et al. 2000; MORSE et al. 2001; ZHU et al. 2001; O’REILLY et al.
2002; HOFSTRA et al. 2003; LING et al. 2004; GUTZMER et al. 2005; GUTZMER et al.
2009). H4R-mRNA konnte auch im Knochenmark, im Gewebe von Milz, Lymphknoten, Thymus, Skelettmuskel, Hoden, Prostata, Dünndarm, Leber, Pankreas, Lunge, Herz und
Abbildung 3: Strukturformeln von H1R-Antagonisten der zweiten Generation.
Fexofenadin Levocetirizin
Terfenadin Loratadin Desloratadin
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Niere nachgewiesen werden (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; MORSE et al.
2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). Eine tatsächliche Expression des H4R in diesen Geweben wird jedoch noch diskutiert, eine mögliche Ursache für den Nachweis von H4R-mRNA in diesen Geweben könnten eine Verunreinigung mit hämatopoetischen Zellen sein (ZHANG et al. 2007).
Der H4R hat eine bedeutende Funktion bei der Regulation der Immunantwort. Er hat Einfluss auf die Chemotaxis von verschiedenen Zellen und die Zytokinfreisetzung aus diesen. So verursacht Histamin über den H4R die Migration von Mastzellen ohne jedoch die Degranulation dieser zu beeinflussen. Eine Aktivierung des H4R auf Mastzellen führt zu einer Calciumfreisetzung aus intrazellulären Speichern (HOFSTRA et al. 2003).
Bei Eosinophilen ruft die Bindung von Histamin an den H4R eine Änderung der Zellform, die Polymerisation von Aktin und eine gesteigerte Expression von Oberflächenmolekülen wie z.B. CD11b und CD54 hervor. Auch ist die Chemotaxis in Richtung des Chemokins Eotaxin erhöht (BUCKLAND et al. 2003; LING et al. 2004). O’REILLY et al. (2002) zeigten, dass auch Histamin selbst über den H4R chemotaktisch auf Eosinophile wirkt. Bereits 1992 publizierten RAIBLE et al. (1992), dass Histamin einen Calciumanstieg in Eosinophilen verursacht und dieser über den H3R/H4R-Antagonisten Thioperamid zu blocken ist. Da LING et al. (2004) nachweisen konnten, dass Eosinophile keinen H3R exprimieren, scheint der Calciumanstieg allein über den H4R vermittelt zu werden.
Dendritische Zellen (DC) werden über den H1R und den H4R zur Migration angeregt. Dies kann durch den H1R-Antagonisten Diphenhydramin oder den H4R-Antagonisten JNJ 7777120 geblockt werden (BÄUMER et al. 2008). GUTZMER et al. (2005) zeigten, dass die Stimulation des H4R auf DC zu Chemotaxis und Aktinpolymerisation sowie einer verringerten Produktion des TH1-Zytokins IL-12p70 führt. Des Weiteren sind DC in der Lage, selbst Histamin zu produzieren, welches dann autokrin wirken kann. DC, deren H4R stimuliert wurde, fördern die TH2-Antwort von T-Zellen, so dass die TH2-Zytokine IL-4 und IL-5 sowie die inflammatorisch wirkenden Zytokine IL-6 und IL-17 vermehrt produziert werden (DUNFORD et al. 2006).
Inflammatorische dendritische epidermale Zellen (IDEC) exprimieren ebenfalls den H4R. Das Zytokin IFN-γ führt zu einer erhöhten Expression des H4R auf IDEC. Eine Stimulation des
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H4R vermindert die Produktion des TH2-Chemokins CCL2 und des TH1-Zytokins IL-12 (DIJKSTRA et al. 2008).
Langerhans-Zellen exprimieren ebenfalls den H4R. GSCHWANDTNER et al. (2010) zeigten, dass die Migration von Langerhans-Zellen über den H4R vermittelt wird. Ebenso führt die Stimulation des H4R zu einer Abnahme der Sekretion des Chemokins CCL2.
GLATZER et al. (2013) zeigten, dass der H4R auf humanen Keratinozyten nachweisbar ist.
Eine Aktivierung mit Histamin oder dem H4R-Antagonisten 4-Methylhistamin induziert die Proliferation der Keratinozyten. Dies lässt sich durch den H4R-Antagonisten JNJ 7777120 blocken. Auf Keratinozyten von gesunden Mäusen konnte erst nach einer Stimulation mit Lipopolysaccharid und Peptidoglykan mRNA des H4R nachgewiesen werden. H4R- Knockout-Mäuse haben eine geringere Epidermisdicke. In vitro zeigen neonatale Keratinozyten dieser Mäuse eine geringere Proliferation als bei Wildtyp-Mäusen.
Keratinozyten von Wildtyp- oder H4R-Knockout-Mäusen zeigten keinen Unterschied in der Proliferation nach der Stimulation mit Histamin.
CD8+ T-Zellen werden sowohl über den H4R als auch über den H2R zur Produktion von IL- 16 angeregt. IL-16 wirkt chemotaktisch auf CD4+ T-Zellen und führt zur Migration dieser (GANTNER et al. 2002).
GUTZMER et al. (2009) publizierten, dass der H4R auch auf CD4+ T-Zellen vorhanden ist und durch das TH2-Zytokin IL-4 hochreguliert werden kann. TH2-Zellen zeigen eine höhere Expression des H4R als TH1- oder naive T-Zellen. Eine Stimulation des H4R auf TH2-Zellen führt zu einem gesteigerten Gehalt an IL-31-mRNA in diesen. Auch auf TH17-Zellen ist der H4R vorhanden. Wird dieser mit Histamin oder dem H4R-Antagonisten 4-Methylhistamin stimuliert, kommt es zu einer vermehrten Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL- 17. Dies lässt sich durch den H4R-Antagonisten JNJ 7777120 blocken (MOMMERT et al.
2012). ROSSBACH et al. (2011) zeigten zudem, dass sensorische Neurone in der Haut sowohl den H1R, den H3R als auch den H4R exprimieren. Eine kombinierte Behandlung mit H1R- und H4R-Antagonisten ist in der Lage H3R-induzierten Juckreiz zu hemmen.
2.3.2.1 Histamin 4-Rezeptor-Antagonisten
Seit der Entdeckung des vierten Histamin-Rezeptors und der Annahme, dass er eine Rolle in der Regulation des Immunsystems spielt, sind einige Antagonisten entwickelt worden. Der in
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der Forschung bisher am häufigsten verwendete, erste selektive H4R-Antagonist ist das Carboxamid JNJ 7777120. Dies hat eine sehr hohe Affinität zum humanen sowie murinen H4R und eine tausendfache Selektivität gegenüber dem H1R und dem H3R. Da JNJ 7777120 bei oraler Gabe in der Maus eine maximale Plasmakonzentration von 0,8 ± 0,2 µmol/l sowie eine kurze Halbwertszeit von 1,0 ± 0,04 Stunden hat, ist die Verwendbarkeit für In-vivo- Versuche jedoch eingeschränkt. In In-vitro-Versuchen hat sich JNJ 7777120 jedoch als sehr nützliches Hilfsmittel erwiesen (THURMOND et al. 2004; LIM et al. 2010).
Das Benzimidazolyl-Piperazin VUF 6002 (auch als JNJ 10191584 bezeichnet) ist ein Analogon des Carboxamids JNJ 7777120 und hat eine zehnfach geringere Affinität für den H4R im Vergleich zu diesem (TERZIOGLU et al. 2004; LIM et al. 2010).
Ein weiterer H4R-Antagonist, welcher für In-vivo-Studien benutzt wird, ist das Benzimidazol JNJ 28307474. Dieses zeigt ebenfalls eine hohe Affinität zum humanen H4R, jedoch nur eine geringere Affinität zum murinen H4R (COWDEN et al. 2010).
Der H4R-Antagonist JNJ 40279486 wurde von SAVALL et al. (2011) beschrieben. Chemisch zählt dieser zu der Gruppe der trizyklischen Aminopyrimidinen. Bisher sind jedoch keine weiteren Daten über den Einsatz dieses Antagonisten vorhanden.
Der 2014 zum ersten Mal beschriebene H4R Antagonist JNJ 39758979, ein 6-Alkyl-2,4- Diaminopyrimidin, hat eine sehr hohe Affinität für den murinen H4R mit einer geringen Affinität für den H3R. Dieser Antagonist wurde bereits in Phase-II klinischen Studien als Wirkstoff gegen Asthma sowie AD getestet. Da jedoch bei zwei Studienteilnehmern eine Agranulozytose auftrat, wurden die Studien abgebrochen. Jedoch zeigte sich, dass JNJ 39758979 in der Lage ist, Juckreiz bei Patienten mit AD zu lindern (KOLLMEIER et al.
2014; SAVALL et al. 2014; THURMOND et al. 2014; MURATA et al. 2015).
In Tabelle 2 sind die Affinitäten der H4R-Antagonisten zum humanen, murinen und caninen H4R aufgeführt. Abbildung 4 zeigt die Strukturformeln der genannten H4R-Antagonisten.
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VUF 6002
Abbildung 4: Strukturformeln von H4R-Antagonisten
Tabelle 2: Affinitäten verschiedener H4R-Antagonisten für den humanen, den murinen und den caninen H4R (k.A. = keine Angaben in der Literatur)
Antagonist pKi H4R (nmol/l, Mittelwert ± Standardfehler)
Mensch Maus Hund
JNJ 7777120 8,3 ± 0,1 8,4 ± 0,1 7,1 ± 0,1
VUF 6002 7,5 ± 0,1 6,9 ± 0,1 6,2 ± 0,1
JNJ 28307474 4,9 ± 1,1 109 ± 8 62 ± 31
JNJ 40279486 9,4 k.A. k.A.
JNJ 39758979 12,5 ± 02,6 5,3 ± 0,4 > 10.000
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2.4 H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen Dermatitis und Kontaktallergie
H4R-exprimierende Zellen spielen eine Rolle in der Entstehung von allergischen Reaktionen.
Der H4R stellt daher eine mögliche neue Zielstruktur zur Behandlung allergisch bedingter Erkrankungen. Aus diesem Grund sind bereits verschiedene H4R-Antagonisten in Tiermodellen getestet worden. Abbildung 5 zeigt mögliche Angriffspunkte dieser Antagonisten an Zellen, die in der Pathogenese von allergischen Reaktionen eine Rolle spielen.
Abbildung 5: Rolle von H4R-exprimierenden Zellen bei allergischen Reaktionen, modifiziert nach ZHANG et al.
(2007).
A: Sensibilisierunsphase: Dendritische Zellen prägen und polarisieren naive CD4+ T-Zellen unter Mitwirkung von Mastzellen.
B: Provokationsphase: Aktivierte T-Zellen produzieren unterschiedliche Zytokine, die zum einen Mastzellen und Eosinophile zur Migration in das entzündliche Gewebe anregen als auch B-Zellen zur Produktion von IgE.
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Die Wirkung von H1R- und H4R-Antagonisten wurde in unterschiedlichen Mausmodellen der Kontaktallergie sowie einem Mausmodell der AD untersucht.
MATSUSHITA et al. (2012) zeigten, dass die Gabe des H1R-Antagonisten Olopatadin (10 mg/kg p.o.) als auch des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (100 mg/kg p.o.) die klinischen Symptome (Ekzem-ähnliche Läsionen auf der dorsalen Haut) in einem Mausmodell der chronischen Kontaktallergie, hervorgerufen durch das Hapten Trinitrochlorobenzen (TNCB), verbessert. Auch die Kombination der beiden Antagonisten konnte eine Linderung hervorrufen. Die histologische Untersuchung der betroffenen Hautstellen zeigte eine geringere Epidermisdicke bei Tieren, die mit JNJ 7777120 oder der Kombination behandelt worden waren. Die Migration von Eosinophilen in die Haut wurde durch alle drei Behandlungen verringert. Die Kombination der zwei Antagonisten zeigte jedoch keinen zusätzlichen Nutzen im Vergleich zu einer Monotherapie mit JNJ 7777120. Die Infiltration der Haut mit Mastzellen wurde durch JNJ 7777120 gehemmt. Auch hier zeigte die Kombination des H1R-Antagonisten mit dem H4R-Antagonisten keinen weiteren Effekt. Alle Behandlungen senkten den IgE-Gehalt im Serum, die Kombination war dabei am effektivsten.
MATSUSHITA et al. (2012) bestimmten auch den Gehalt verschiedener Zytokine in der Haut: JNJ 7777120 sowie die Kombination senkten die TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-6, während Olopatadin nur den Gehalt an IL-5 reduzierte. Die TH1-Zytokine IFN-γ und IL-12 wurden bei Tieren, die mit JNJ 7777120 behandelt worden waren, vermehrt in der Haut nachgewiesen. Eine Behandlung mit Olopatadin senkte hingegen den Gehalt dieser Zytokine.
Die Kombination der beiden Wirkstoffe konnte die Einzeleffekte gegeneinander aufheben.
SUWA et al. (2011) untersuchten ebenfalls im TNCB-induzierten Modell der chronischen Dermatitis die Wirkung eines H1R- und eines H4R-Antagonisten sowie eines Glukokortikoids. Der H4R-Antagonist JNJ 7777120 (10 mg/kg p.o.; 30 mg/kg p.o.) zeigte eine dosisabhängige Reduzierung der Hautläsionen auf dem Rücken, während der H1R- Antagonist Fexofenadin (60 mg/kg p.o.) und das Glukokortikoid Dexamethason (3 mg/kg p.o.) keine Besserung hervorriefen. Alle drei Wirkstoffe verringerten den IgE-Serumspiegel.
Die Anzahl an Mastzellen in der Haut konnte nur durch JNJ 7777120 gesenkt werden. Der mRNA-Gehalt des Zytokins IL-4 wurde sowohl durch JNJ 7777120 als auch Dexamethason gesenkt.
20
Auch SEIKE et al. (2010) zeigten, dass der H4R-Antagonist JNJ 7777120 (10 mg/kg) die klinischen Symptome (Hautläsionen auf dem Rücken) im TNCB-vermittelten Modell der chronischen Kontaktdermatitis lindert. Ebenso reduzierte er die Migration von Mastzellen und Eosinophilen in die Haut sowie den IgE-Serumspiegel. Der Gehalt an den TH2-Zytokinen IL- 4, IL-5 und IL-6 in der Haut wurde durch JNJ 7777120 verringert. Die TH1-Zytokine IFN-γ und IL-12 waren hingegen erhöht.
In einem weiteren TH2-abhängigen Mausmodell der Dermatitis wurden Effekte des H1R- Antagonisten Mepyramin (2 mg/kg s.c.; 10 mg/kg s.c.; 20 mg/kg s.c.), des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (2 mg/kg s.c.; 10 mg/kg s.c.; 20 mg/kg s.c.) sowie deren Kombination bestimmt.
Eine Bewertung der klinischen Symptome in diesem Modell erfolgte nicht. Die histologische Untersuchung ergab, dass keine der Behandlung einen Effekt auf die Infiltration der Haut mit Mastzellen hat. Die Ex-vivo-Restimulation der aus den drainierenden Lymphknoten gewonnenen Zellpopulation mit dem zuvor benutzten Antigen zeigte keine Unterschiede in der Produktion von Zytokinen durch die Monotherapie. Die kombinierte Behandlung reduzierte die Produktion der Zytokine IL-4 und IL-13, die Produktion von IFN-γ wurde nicht beeinflusst (MAHAPATRA et al. 2014).
ROSSBACH et al. (2009) untersuchten den Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (15 mg/kg i.p.) und des Glukokortikoids Dexamethason (5 mg/kg i.p.) in zwei unterschiedlichen Mausmodellen der Kontaktallergie. Im TH1-vermittelten Allergiemodell wurde das Hapten Dinitrochlorobenzen (DNCB) benutzt, im TH2-vermittelten Allergiemodell das Hapten Toluendiisocyanat (TDI). In beiden Modellen zeigte JNJ 7777120 keine Verringerung der Ohrschwellung; Dexamethason reduzierte diese hingegen signifikant. Dies spiegelte sich auch in der histologischen Untersuchung des Zellinfluxes in die Haut sowie der Ödematisierung dieser wider. Die Behandlung der Tiere mit dem H4R-Antagonisten bereits während der Sensibilisierungsphase gegen DNCB konnte ebenfalls keine Linderung der Symptome bringen. Auch die Blockade aller vier Histaminrezeptoren mit den Antagonisten Diphenhydramin, Ranitidin und Thioperamid brachte keine Verbesserung.
Die H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) und JNJ 28307474 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) wurden von COWDEN et al. (2010) in einem TH2-vermittelten Kontaktallergiemodell, ausgelöst durch Fluoresceinisothiocyanat (FITC), untersucht. Beide Antagonisten konnten die Ohrdicke als klinisches Anzeichen einer Entzündung reduzieren.
21
Histologisch waren sowohl der Gesamtzellinflux als auch die Anzahl an Mastzellen und Eosinophilen in der Haut verringert. Die Untersuchung des Homogenisats aus den betroffenen Hautstellen auf den Gehalt verschiedener Zytokine ergab eine Reduktion von MIP-1α, RANTES, IL-4, MCP-1, IL-1ß, IL-6, GM-CSF ebenso wie TNF-α. Die Ex-vivo- Restimulation der aus den drainierenden Lymphknoten gewonnenen Zellpopulation führte zu einer verringerten Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-17.
Im gleichen Model wurde auch der Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ 39758979 (20 m/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) auf die Entstehung von klinischen Symptomen bestimmt. Auch dieser konnte die Ohrdicke verringern (THURMOND et al. 2014).
OHSAWA und HIRASAWA (2012) untersuchten die Wirkung des H4R-Antagonist JNJ 7777120 (30 mg/kg p.o.) sowie dessen Kombination mit dem H1R-Antagonisten Olopatadin (3 mg/kg p.o.) in einem Mausmodell, das durch die Verwendung von NC/NgA-Mäusen und dem Hapten Picrylchlorid, sowohl Teilaspekte der AD sowie einer Kontaktallergie widerspiegelt. Die klinischen Symptome (Hautläsionen auf dem Rücken sowie an den Ohren) konnten durch beide Behandlungen reduziert werden. Olopatadin als Monotherapie hingegen zeigte keinen Effekt. Die Kombination der beiden Antagonisten war genauso effektiv wie das Glukokortikoid Prednisolon (3 mg/kg p.o.). Die kombinierte Behandlung reduzierte die Epidermisdicke, die Einzelbehandlung mit JNJ 7777120 verringerte die Anzahl an Mastzellen in der Haut. Der IgE-Gehalt im Plasma wurde nur durch die Kombination der Antagonisten signifikant gesenkt. Die Bestimmung der Zytokine in der Haut zeigte eine Abnahme von NGF, IL-4, IL-5, TSLP und TARC durch JNJ 7777120 sowie durch die Kombination mit Olopatadin.
Der Effekt von H4R-Antagonisten in einem Mausmodell der AD wurde bisher nur von KAMO et al. (2014) getestet. Dazu wurden die H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (10 mg/kg i.p.; 30 mg/kg i.p.) und JNJ 28307474 (10 mg/kg i.p.; 30 mg/kg i.p.) in NC/NgA-Mäusen, die zusätzlich gegen Hausstaubmilben (Dfb) sensibilisiert wurden, auf ihre Wirksamkeit untersucht. Es konnten jedoch keine Linderung der klinischen Symptome beobachtet werden (KAMO et al. 2014).
In einigen dieser Modelle wurde auch der Einfluss von H1R- und H4R-Antagonisten auf den allergisch bedingten Juckreiz bestimmt. So publizierten ROSSBACH et al. (2009), COWDEN et al. (2010), SUWA et al. (2011) als auch OHSAWA und HIRASAWA (2012), dass der
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H4R-Antagonist JNJ 7777120 in der Lage ist, den Juckreiz in den jeweiligen Tiermodellen zu hemmen. Lediglich KAMO et al. (2014) stellten fest, dass JNJ 7777120 keinen Einfluss auf den allergiebedingten Juckreiz hat. Die Kombination eines H4R-Antagonisten mit einem H1R-Antagonisten scheint zur Linderung des Juckreizes am effektivsten zu sein (ROSSBACH et al. 2009; OHSAWA und HIRASAWA 2012).
Tabelle 3 gibt einen Überblick über die beschriebenen Modelle und den Effekt von H4R- Antagonisten in diesen.
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Tabelle 3: Übersicht über die Effekte von H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen Dermatitis und Kontaktallergie (↓ = Reduktion, - = kein Einfluss, k.A. = keine Angaben)
Antagonist Maus- stamm
Hapten/
Allergen
Klinische Symptome
Mast- zellen
IgE- Gehalt
TH2-
Zytokine Autor
JNJ 7777120
C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Matsushita et
al. (2012)
HR-1 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Suwa et al.
(2011)
C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Seike et al.
(2010)
Balb/c OVA k.A. - k.A. - Mahapatra et
al. (2014)
NMRI DNCB - k.A. k.A. k.A. Rossbach et
al. (2009)
NMRI TDI - k.A. k.A. k.A. Rossbach et
al. (2009)
Balb/c FITC ↓ ↓ k.A. ↓ Cowden et al.
(2010)
NC/Nga Picryl-
chlorid ↓ ↓ - ↓ Ohsawa und
Hirasawa (2012)
NC/Nga Dfb - k.A. k.A. k.A. Kamo et al.
(2014)
JNJ 28307474
Balb/c FITC ↓ ↓ k.A. ↓ Cowden et al.
(2010)
NC/Nga Dfb - k.A. k.A. k.A. Kamo et al.
(2014) JNJ
39758979 Balb/c FITC ↓ k.A. k.A. k.A. Thurmond et
al. (2014)
Kombination H1R- Antagonist
+ H4R- Antagonist
C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Matsushita et
al. (2012)
Balb/c OVA k.A. - k.A. ↓ Mahapatra et
al. (2014)
NC/Nga Picryl-
chlorid ↓ - ↓ ↓ Ohsawa und
Hirasawa (2012)
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3 Material und Methoden 3.1 Material
3.1.1 Material für In-vivo-Versuche
Baumwollgaze 20 x 20 cm Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied
BlendermTM 3M Medica, Neuss
Combifix Adapter Luer B. Braun Melsungen AG, Melsungen Einmalspritzen 1 ml Henry Schein, Hamburg
Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg Eppendorfgefäße 2 ml Eppendorf, Hamburg
Isotone Kochsalz-Lösung 0,9% B. Braun Melsungen AG, Melsungen Kanülen 26G Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen
Knopfkanüle WDT, Garbsen
Peha Haft Color Paul Hartmann AG, Heidenheim
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Polypropylen-Röhrchen 15 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Schermaschine Moser Elektrogeräte GmbH, Unterkirnach Serum-Gel Röhrchen Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Tesafilm Beiersdorf, Hamburg
Videokamera Legria HF S21 Canon Deutschland GmbH, Krefeld
Aceton Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Aqua ad inj. B. Braun Melsungen AG, Melsungen ß-Cyclodextrin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Betamethason-17-valerat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Celestan ® MSD Sharp & Dohme GmbH, Haar
JNJ 39758979 Janssen PRD, USA
Mepyraminmaleat Abcam, Cambridge, UK
Methylcellulose Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
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Ovalbumin Grade V Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Veet®-Enthaarungscreme Reckitt Benckiser Deutschland GmbH, Mannheim 4-Methylhistamindihydrochlorid Tocris Bioscience, UK
3.1.2 Material für Zellkultur-Versuche
Brutschrank Thermo Fisher Scientific, Braunschweig Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
Eppendorfgefäße 2 ml Eppendorf, Hamburg Homogenisator DUALL® 1 ml Omnilab, Gehrden Mikroskop Axiovert 25 Carl Zeiss AG, Jena
Neubauer-Zählkammer VWR International GmbH, Darmstadt
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Polypropylen-Röhrchen 15 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Polypropylen-Röhrchen 50 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Sterilbank Heraeus Lamin Air H. Jürgens GmbH & Co. KG, Bremen Sterilfilter Minisart Sartorius, Göttingen
Wasserbad Memmert, Schwabach
Zentrifuge Thermo Fisher Scientific, Braunschweig 6-,12-,24-,24,48-Well-Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Ethanol CG Chemikalien, Laatzen
Fetales Kälberserum 10 % Biochrom, Berlin
Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe
RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin
Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Trypan-Blau Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
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3.1.3 Material für ELISA
Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
Multipipette Eppendorf, Hamburg
Nunc-Immuno-Platten Thermo Fisher Scientific, Braunschweig
Photometer Dynatech, Denkendorf
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Rundschüttler Reax 2000 Heidolph, Kelheim
Waschpipette Eppendorf, Hamburg
LEGEND MAX™ Mouse BioLegend, San Diego, USA OVA Specific IgE ELISA Kit
Mouse IL-4 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA Mouse IL-6 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA Mouse IL-10 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA Mouse IFN-γ ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA
TMB Liquid-Substrat-System Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
3.1.1 Material für Histologie
Deckgläser 24x50 mm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe Einbettkassetten Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe Färbeküvetten Glas Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Heiztisch Vogel GmbH, Giesen
Mikrotom 2035 Reichert-Jung, Nusstoch
Objektträger Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe Paraffin-Streckbad TFB45 Medite, Burgdorf
Schwämme für Einbettkassetten Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Paraffin-Einbettsystem MEDITE, Burgdorf
Wasserbad GFL, Burgwedel
Ethanol 70, 80, 96, 100 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Entellan Merck KGaA, Darmstadt
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Eosin Merck KGaA, Darmstadt
Essigsäure AppliChem GmbH, Darmstadt
Giemsa-Lösung Merck KGaA, Darmstadt
Hämalaun Merck KGaA, Darmstadt
Isopropanol Otto-Fischer GmbH, Saarbrücken
Paraffin Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe
Pikrinsäure VWR International GmbH, Darmstadt
Xylol Otto-Fischer GmbH, Saarbrücken
3.1.2 Material für FACS
FACS-Gerät BD Biosciences, Belgien
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge Thermo Fisher Scientific, Braunschweig 96-Well-Platten, round-bottom Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Bovines Serum Albumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim APC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend, San Diego, USA
FITC anti-mouse CD3ε BioLegend, San Diego, USA PE anti-mouse CD11c Antibody BioLegend, San Diego, USA PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend, San Diego, USA PE/Cy7 anti-mouse CD19 BioLegend, San Diego, USA Antibody
Pacific Blue anti-mouse CD8a BioLegend, San Diego, USA Antibody
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3.1.3 Puffer und Lösungen PBS Puffer
NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2PO4 1,44 g KH2PO4 0,2 g Aqua bidest ad 1000 ml
Einstellung von pH 7,2 (1 mol/l HCl)
Trypanblau-Lösung
Trypanblau 4 mg PBS 1 ml
RPMI++-Medium
RPMI 500 ml
FKS 10 %
Penicillin/Streptomycin 1 %
Hämolyse-Puffer
NH4Cl 8,29 g Na2EDTA 0,037 g NaHCO3 0,839 g Aqua bidest ad 1000 ml
Einstellung von pH 7,3 (1 mol/l HCl)
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3.1.4 Versuchstiere und Tierhaltung
Für die Versuche wurden weibliche Balb/c Mäuse in einem Alter von 4 bis 8 Wochen von der Firma Charles River (Sulzfeld) bezogen.
Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ III mit „Häuschen“ bei 22°C und einem Licht/
Dunkel-Rhythmus von je 12 Stunden gehalten. Die Einstreu bestand aus Weichholzgranulat (Altromin, Lage/Lippe). Wasser und Pelletfutter (Altromin 1324, Lage/Lippe) standen ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden jeweils 14 Tage vor Versuchsbeginn eingestallt und zweimal täglich an den Umgang gewöhnt.
30
3.2 Versuchsübersicht
Ziel dieser Arbeit war die Optimierung des OVA-induzierten Mausmodell der atopischen Dermatitis nach SPERGEL et al. (1998) sowie die Beurteilung verschiedener Wirkstoffe in diesem Modell. Zunächst wurde untersucht, ob eine Störung der Hautbarriere die Ausprägung AD- ähnlicher Hautläsionen im OVA-Modell beeinflussen kann. Dazu wurden drei Varianten des Protokolls miteinander verglichen (s. Tabelle 4). Es wurden jeweils folgende Parameter erfasst: die Ausprägung der Hautläsionen (Hautscore), die Epidermisdicke, die Anzahl an Entzündungs- und Mastzellen in der Haut, der Allergen-spezifische IgE-Gehalt im Serum, das Gewicht und die Zellzahl der Lnn. axillares sowie die Milzzellzahl.
Im Anschluss wurde die Wirkung eines H1R-Antagonisten, eines H4R-Antagonisten sowie eines Glukokortikoids und deren Kombinationen im OVA-Modell untersucht. Um den Behandlungserfolg beurteilen zu können, wurden zusätzlich zu den bereits genannten Parametern das Zellprofil der Lnn. axillares sowie die OVA-induzierte Zytokinproduktion (IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10) der aus der Milz isolierten Zellen bestimmt. Als Kriterium für allergischen Juckreiz wurde das Kratzverhalten bewertet.
31
3.3 Methoden
3.3.1 Protokoll des OVA-Modells
Das OVA-Standardprotokoll (modifiziert nach SPERGEL et al. (1998)) besteht aus insgesamt drei epikutanen Sensibilisierungswochen (SE) sowie zwei Wochen Provokationsphase (Challenge; C). Zwischen diesen Phasen liegen jeweils 14 Tage Pause.
An Tag 1 wurden je Gruppe sieben Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen mittels Veet®- Enthaarungscreme im Brustbereich enthaart. Nach 1 Std. Ruhezeit wurde den Mäusen ein Patch mit OVA Grade V (100 µg/100 µl PBS) auf die enthaarte Brust gelegt. Das Patch bestand aus drei Lagen Baumwollgaze (1,5 cm x 1,5 cm) und wurde mittels einer selbst- haftenden Bandage (Peha Haft Color®) und chirurgischem, okklusivem Klebeband (Blenderm®) fixiert. An Tag 4 wurde der Verband entfernt und nach 4 Stunden Wartezeit wurden die Mäuse mit frisch angesetzter OVA Grade V-Lösung neu verbunden. Die erste Sensibilisierungswoche endete an Tag 8 mit dem Entfernen des Verbandes. An Tag 22 begann Sensibilisierungswoche 2, diese verlief identisch zur Sensibilisierungswoche 1. Nach dem gleichen Schema wurde Sensibilisierungswoche 3 ab Tag 43 durchgeführt. Im Rahmen der ersten Challenge wurden die Mäuse an Tag 64 erneut mit Veet®-Enthaarungscreme enthaart und nach einer Stunde wurde ein Patch mit OVA Grade VI (100 µg/100 µl PBS) auf die gleiche Art und Weise wie in den Sensibilisierungswochen auf der Brust fixiert. An Tag 67 wurden der Verband und das OVA-Patch erneuert, dazu wurde frische OVA Grade VI- Lösung benutzt. Der Verband wurde an Tag 71 morgens entfernt.
Abbildung 6: Zeitachse OVA-Standardprotokoll
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Eine weitere Challenge wurde ab Tag 85 durchgeführt. An Tag 93 erfolgte die Tötung der Mäuse mit anschließender Probenentnahme für weitere Untersuchungen. Die Tötung erfolgte unter Inhalation von 5 % Isofluran und nachfolgendem Entbluten unter Narkose durch Punktion des Herzens zur Blutentnahme.
3.3.2 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-induzierten Modells der atopischen Dermatitis
Es wurden drei Protokolle sowie eine Kontrolle miteinander verglichen (siehe Tabelle 4).
Tabelle 4: Übersicht über die miteinander verglichenen OVA-Protokolle
Protokoll Angewandtes Protokoll 1 PBS-Kontrolle
2 OVA-Standardprotokoll
3 OVA-Standardprotokoll + Aceton 4 OVA-Standardprotokoll + Tesa-Strippen
3.3.2.1 PBS-Kontrolle
Als Kontrolle wurden die Mäuse gemäß dem OVA-Standardprotokoll behandelt, allerdings wurde auf die Patches keine OVA-Lösung sondern lediglich PBS (100 µl) gegeben.
3.3.2.2 OVA-Standardprotokoll
Das bereits beschriebene OVA-Protokoll wurde in diesem Durchgang als OVA- Standardprotokoll bezeichnet und unverändert angewandt.
3.3.2.3 OVA-Protokoll mit Aceton
Auch dieses Protokoll basiert auf dem OVA-Standardprotokoll, die Haut an der Brust wurde zusätzlich vor jedem Auflegen des OVA-Patches dreimal mit einem in Aceton getränktem Tuch abgewischt. Ziel war es, die Hautbarriere zu stören (RISSMANN et al. 2009).
3.3.2.4 OVA-Protokoll mit Tesa-Strippen
Dieses Protokoll basiert ebenso auf dem OVA-Standardprotokoll, jedoch wurde vor dem Auflegen des OVA-Patches ein Tesafilmstreifen zehnmal auf die enthaarte Brust geklebt und schnell abgerissen. Dies erfolgte bei jeder Erneuerung des Verbandes um eine Störung der Hautbarriere zu verursachen (RISSMANN et al. 2009).
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Abweichend vom eigentlichen OVA-Standardprotokoll hatte dieser Versuch nur eine Provokationswoche. Daher wurden die Mäuse bereits an Tag 72 getötet und Proben entnommen. Es wurden folgende Parameter untersucht: der klinische Hautscore, Gewicht und Zellzahl der Lnn. axillares, Milzzellzahl, OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum, Epidermisdicke sowie die Anzahl der Entzündungs- und Mastzellen in der Haut.
3.3.3 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell
Es wurden mehrere Durchgänge des OVA-Standardprotokolls mit unterschiedlichen Behandlungen durchgeführt (s. Tabelle 5). Je Durchgang wurde immer eine Kontrollgruppe mit einem Vehikel (Lösungsmittel der Testsubstanzen) behandelt.
Es wurden folgende Parameter untersucht: Klinischer Hautscore, Kratzverhalten, Lymphknotengewicht und –zellzahl, Zellprofil der drainierenden Lymphknoten, Milzzellzahl, OVA-induzierte Zytokinproduktion der Splenozyten, OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum, epidermale Hyperproliferation, Anzahl der Entzündungs- und Mastzellen in der Haut.
Tabelle 5: Verwendete Wirkstoffe und Dosierungen im OVA-Modell
Wirkstoff Dosierung
Mepyramin
(H1R-Antagonist) 20 mg/kg i.p.
JNJ 39758979 (H4R-Antagonist)
20 mg/kg p.o.
50 mg/kg p.o.
20 mg/kg i.p.
Betamethason (Glukokortikoid)
1 mg/kg p.o.
2 mg/kg i.p.
Mepyramin + JNJ 39758979 20 mg/kg i.p. + 20 mg/kg i.p.
JNJ 39758979 + Betamethason 20 mg/kg i.p. + 2 mg/kg i.p.
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3.3.3.1 H4R-Antagonist JNJ 39758979
Der H4R-Antagonist JNJ 39758979, im folgenden JNJ 3975 genannt, wurde in zwei unterschiedlichen Dosierungen und zwei Applikationsarten verabreicht. Zur oralen Gabe wurde JNJ in 20% ß-Cyclodextrin gelöst und mittels einer Knopfsonde zwei- bzw. dreimal täglich verabreicht (THURMOND et al. 2014). Für die i.p. Behandlung wurde JNJ in Aqua ad inj. gelöst.
Die jeweiligen Zeitpunkte der Behandlungen sowie die Dosierungen sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6: Behandlungsschema JNJ 39758979
Sensibilisierung (SE) Challenge (C)
Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
20 mg/kg p.o. - - - 2 x tgl. 3 x tgl.
50 mg/kg p.o. - - - 2 x tgl. 3 x tgl.
20 mg/kg i.p. - - - 2 x tgl. 2 x tgl.
3.3.3.2 H1R-Antagonist Mepyramin
Die Behandlung mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin erfolgte zweimal täglich in einer Dosierung von 20 mg/kg i.p.. Dafür wurde Mepyramin in Aqua ad inj. gelöst. Zeitpunkt sowie Dosierung sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7: Behandlungsschema Mepyramin
Sensibilisierung (SE) Challenge (C)
Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
20 mg/kg i.p. - - - 2 x tgl. 2 x tgl.
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3.3.3.3 Glukokortikoid Betamethason
Betamethason wurde sowohl als Betamethasonvalerat (oral) als auch als Betamethason- phosphat (i.p.) einmal täglich morgens verabreicht. Für die orale Gabe wurde Betamethason in 0,5% Methylcellulose, für die i.p. Gabe in Aqua ad inj. gelöst (MAEKAWA et al. 2006).
Tabelle 8 zeigt das Behandlungsschema.
Tabelle 8: Behandlungsschema Betamethason
Sensibilisierung (SE) Challenge (C)
Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
1 mg/kg p.o. - - - 1 x tgl. 1 x tgl.
2 mg/kg i.p. - - - 1 x tgl. 1 x tgl.
3.3.3.4 Kombination Mepyramin und JNJ 39758979
Beide Substanzen wurden in Aqua ad inj. gelöst und i.p. injiziert. Zeitpunkt sowie Dosierung sind in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9: Behandlungsschema Kombination Mepyramin und JNJ 39758979
Sensibilisierung (SE) Challenge (C)
Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
Mepyramin 20 mg/kg i.p.
+ JNJ 39758979
20 mg/kg i.p.
- - -
2 x tgl.
+ 2 x tgl.
2 x tgl.
+ 2 x tgl.
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3.3.3.5 Kombination JNJ 39758979 und Betamethason
Beide Substanzen wurden in Aqua ad inj. gelöst und i.p. injiziert. Betamethasonphosphat wurde einmal täglich verabreicht, JNJ 3975 zweimal täglich (s. Tabelle 10).
Tabelle 10: Behandlungsschema Kombination JNJ 39758979 und Betamethason
Sensibilisierung (SE) Challenge (C)
Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C
JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.
+ Betamethason
2 mg/kg i.p.
- - -
2 x tgl.
+ 1 x tgl.
2 x tgl.
+ 1 x tgl.
3.3.4 Untersuchte Parameter im OVA-Modell 3.3.4.1 Bewertung der Hautläsionen
An Tag 91 erfolgte die Bewertung der Hautläsionen verblindet 8 Stunden nach Entfernung des Verbandes. Es wurde ein Score-System benutzt. Bewertet wurden drei Parameter:
Schuppung, Erosion/Exkoration und Erythem. Dafür wurde die in Tabelle 11 beschriebene Skala benutzt:
Tabelle 11: Einteilung Hautscore (Schuppung, Erosion/Exkoration und Erythem)
Score Definition Schweregrad 0 Keine Veränderungen 1 Leichte Veränderungen 2 Moderate Veränderungen 3 Schwere Veränderungen 4 Sehr schwere Veränderungen
Aus der Summe der Einzelparameter ergab sich der Gesamtscore (0-12).
