Tierärztliche Hochschule Hannover
Plättchengebundene Antikörper und Neutrophilen-Plättchen-Interaktionen bei verschiedenen Erkrankungen des Hundes
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Brigitte Dircks
Münster
Hannover 2011
Apl.-Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie
1. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Mischke
Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
2. Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter
Klinik für kleine Klauentiere
Tag der mündlichen Prüfung: 20. Mai 2011
In Erinnerung
an meinen Vater
(J Am Vet Med Assoc 2009;235:960-966) American Journal of Veterinary Research
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form von Postern oder Vorträgen auf folgenden Fachtagungen präsentiert:
17. Jahreskongress des European College of Veterinary Internal Medicine (ECVIM-CA) in Budapest, Ungarn 2007:
Clinical and laboratory features of thrombocytopenic dogs with and without platelet-bound antibodies: a retrospective study of 83 dogs.
16. Fachtagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG (Innlab) in Giessen 2008:
Underlying diseases and laboratory features of thrombocytopenic dogs with and without platelet-bound antibodies detected by a flow cytometric assay.
19. Fachtagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG (Innlab) in Leipzig 2011:
Detection of platelet-neutrophil aggregates in blood of dogs with systemic inflammatory disorders.
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung ... 1
II. Underlying diseases and clinicopathologic variables of thrombocytopenic dogs with and without platelet-bound antibodies detected by use of a flow cytometric assay: 83 cases (2004–2006) ... 5
Abstract ... 6
III. Detection of platelet-neutrophil aggregates in blood of dogs with systemic inflammatory disorders ... 7
Abstract ... 8
Introduction ... 9
Materials and Methods ... 10
Results ... 12
Discussion ... 13
References ... 18
Tables and Figures ... 22
IV. Übergreifende Diskussion ... 26
V. Zusammenfassung ... 37
VI. Summary ... 41
VII.Literaturverzeichnis ... 45
VIII.Anhang ... 51
Bezugsquellen ... 51
Publikationsliste ... 53
Danksagung... 55
Abkürzungsverzeichnis
AA Arachidonic acid / Arachidonsäure
ADP Adenosine diphosphate / Adenosindiphosphat bzw. beziehungsweise
C Celsius
CBC Complete blood count / Blutbild
CD Cluster of differentiation / „Unterscheidungsgruppen“
COL Collagen / Kollagen
DIC Disseminated intravascular coagulation / Disseminierte intravasale Gerinnung
d.h. das heißt
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid / Ethylendiamintetraessigsäure EPI Epinephrine / Epinephrin
et al. et alii (lat.: “and others” / „und andere“)
F Fahrenheit
fL Femtoliter
FSC Forward-angle light scatter / Vorwärtsstreulicht g Gravitational acceleration / Erdbeschleunigung GP Glycoprotein / Glykoprotein
ie id est (lat.: “that is“/ „das heißt”) Ig Immunoglobulin / Immunglobulin
IMT Immune-mediated thrombocytopenia / Immunvermittelte Thrombozytopenie
L Liter
LPS Lipopolysaccharide / Lipopolysaccharid
MFI Mean flourescence intensity / Mittlere Fluoreszenzintensität
mL Milliliter
mmol Millimole / Millimol
MPV Mean platelet volume / Mittleres Plättchenvolumen n Number (of dogs) / Anzahl (der Hunde)
nIMT Non-immune-mediated thrombocytopenia / Nicht immunvermittelte Thrombozytopenie
PBA Platelet-bound antibody /Plättchengebundene Antikörper PBS Phosphate buffered saline / Phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerase chain reaction /Polymerase-Kettenreaktion
PE Phycoerythrin
pIMT Primary immune-mediated thrombocytopenia / Primäre immunvermittelte Thrombozytopenie
PMA Phorbol-myristate-acetate / Phorbol-myristat-azetat PMN Polymorphonuclear cells / Polymorphkernige Zellen
PNA Platelet-neutrophil aggregate / Plättchen-Neutrophilen-Aggregat RBC Red blood cells / Rote Blutzellen
SD Standard deviation / Standardabweichung
sIMT Secondary immune-mediated thrombocytopenia / sekundäre immunvermittelte Thrombozytopenie
SIRS Systemic inflammatory response syndrome / Systemisches inflammatorisches Response-Syndrom
SLE Systemic lupus erythematosus / Systemischer Lupus erythematosus spp. Species / Spezies
SSC Side-angle light scatter / Seitwärtsstreulicht
µg Microgram / Mikrogramm
μL Microliter / Mikroliter μmol Micromole / Mikromol
I. Einleitung
Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Hämostase und Thromboseentstehung und sind maßgeblich an einer Vielzahl anderer physiologischer und pathophysiologischer Prozesse wie Entzündungsreaktionen, Immunabwehr, Wundheilung und Tumormetas- tasierung beteiligt (Jurk und Kehrel 2005). Eine Thrombozytopenie wird als verminderte Anzahl zirkulierender Thrombozyten definiert und gilt als häufigste erworbene Erkrankung der Hämostase beim Hund (Russell 2010). Sie kann durch verminderte Produktion im Knochenmark, vermehrte Zerstörung, erhöhten Verbrauch, Umverteilung oder massive Blutverluste verursacht werden (Grindem 2000). Bei der immunvermittelten Thrombozytopenie (immune-mediated thrombocytopenia, IMT) führen Antikörper, zumeist vom Isotyp Immunglobulin G (IgG), auf der Plättchenoberfläche zu einer vermehrten Zerstörung von Plättchen durch das mononukleäre Phagozytensystem (Lewis und Meyers 1996a). Bei der primären IMT (pIMT) sind dies Autoantikörper, die sich gegen Glykoproteine (GP) richten. Glykoprotein IIIa und IIb, die am häufigsten vorhandenen GP auf der Plättchenoberfläche, wurden beim Hund als Zielantigene identifiziert (Lewis und Meyers 1996b). Im Gegensatz dazu richten sich die Antikörper bei der sekundären IMT (sIMT) gegen fremdes oder modifiziertes Antigen auf der Plättchenoberfläche oder binden als Immunkomplexe auf Thrombozyten (Lewis et al., 1995). Eine Vielzahl zugrunde liegender Erkrankungen, vor allem Infektions- und Tumorerkrankungen können zu einer sIMT führen (Kohn et al., 2000).
Unterschiedliche Tests weisen plättchengebundene Antikörper (direktes Testverfahren) oder plättchenbindene Antikörper im Serum (indirektes Testverfahren) nach, jedoch kann nicht zwischen einer pIMT oder sIMT unterschieden werden (Lewis et al., 1995, Lewis und Meyers 1996a) Die Diagnose einer pIMT erfordert neben einem positiven Antikörpernachweis den Ausschluss anderer Ursachen einer IMT und gestaltet sich oft als schwierig.
Epidemiologische Übersichtsarbeiten zur Thrombozytopenie (Grindem et al., 1991, Botsch et al., 2009) sowie retrospektive Studien zur pIMT beim Hund (Kohn et al., 2000, Putsche und Kohn 2008) liegen bereits vor, jedoch beinhaltet keine dieser Arbeiten den Vergleich zwischen IMT und nicht immunologisch vermittelter Thrombozytopenie, noch werden Parameter wie das mittlere Plättchenvolumen (MPV) oder die Megakaryopoeseaktivität systematisch mit einbezogen.
Daher sollten im ersten Teil dieser Arbeit zugrundeliegende Erkrankungen sowie klinische und labordiagnostische Parameter bei thrombozytopenischen Hunden mit und ohne plättchengebundene Antikörper sowie bei Hunden mit einer pIMT charakterisiert werden.
Der zweite prospektive Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit Plättchen-Neutrophilen- Aggregaten (PNA) beim Hund. Die Interaktion zwischen neutrophilen Graunolzyten und Blutplättchen wird initial durch P-Selektin auf der Oberfläche aktivierter Thrombozyten vermittelt. P-Selektin bindet über den P-Selektin glycoprotein ligand-1 (CD163) an neutrophile Granulozyten (Evangelista et al., 1999, 2007). Wechselwirkungen zwischen neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten führen u.a. zur gegenseitigen Zellfunktionssteigerung und fördern die Anreicherung und Emigration von neutrophilen Granulozyten in entzündlichem Gewebe (Diacovo et al., 1996, Zarbock et al., 2007).
Plättchen-Neutrophilen-Aggregate spielen daher möglicherweise in der Pathogenese unterschiedlicher Erkrankungen eine Rolle. In der Humanmedizin wurden vermehrt PNA bei Patienten mit myeloproliferativen Erkrankungen (Jensen et al., 2001), koronaren Herzerkrankungen (Nijm et al., 2005), Diabetes mellitus (Hu et al., 2004) und Sepsis (Kirschenbaum et al., 2000, Russwurm et al., 2002) nachgewiesen. Zwar wurde kürzlich die Bildung von PNA beim Hund nach Inkubation mit verschiedenen Plättchenagonisten mit Hilfe eines Vollbluttestes beschrieben (Tarnow et al., 2008), jedoch gibt es bisher keine Daten zum Vorkommen von PNA bei Hunden mit systemisch-entzündlichen Erkrankungen. Dieses wie auch für den Menschen beschriebene Testverfahren zur Messung von PNA bergen das Risiko einer übermäßigen Aktivierung von Blutplättchen während der Probenaufarbeitung, durch die es zu einer artifiziellen Bildung von PNA kommen könnte.
Ziel der eigenen Arbeit war es daher, einen Test zur Bestimmung von PNA unter weitgehender Vermeidung einer in vitro PNA-Formation zu entwickeln. Mittels dieses Testverfahrens sollte die Aggregatbildung zwischen Thrombozyten und neutrophilen Granulozyten bei Hunden mit verschiedenen systemisch-entzündlichen Erkrankungen gemessen werden. Zur Erarbeitung pathophysiologischer Grundlagen sollte der Einfluss verschiedener Plättchen- und Neutrophilenagonisten (Phorbol-myristat-azetat PMA , Kollagen Collagen, COL , ADP, Epinephrin EPI , Lipopolysaccharid LPS , und Arachidonsäure Arachidonic acid, AA ) auf die Bildung von PNA in vitro untersucht werden. Weiterhin sollte eine Untersuchung der Formveränderungen der neutrophilen
Granulozyten als Indikator für deren Aktivierung bei systemisch-entzündlichen Erkrankungen sowie nach Stimulation mit den unterschiedlichen Agonisten erfolgen.
II. Underlying diseases and clinicopathologic variables of thrombocytopenic dogs with and without platelet-bound antibodies detected by use of a flow cytometric assay: 83 cases (2004–2006)
Brigitte Hedwig Dircks, DVM; Hans-Joachim Schuberth, Prof Dr med vet; Reinhard Mischke, Prof Dr med vet
Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, 30173 Hannover, Germany. (Dircks, Mischke); Institute for Immunology, University of Veterinary Medicine Hannover, 30173 Hannover, Germany. (Schuberth)
Journal of the American Veterinary Medical Association October 15, 2009, Vol. 235, No. 8, Pages 960-966
Abstract
Objective – To characterize underlying diseases and clinical and clinicopathologic variables of thrombocytopenic dogs with and without platelet-bound antibodies (PBAs) and to evaluate clinicopathologic variables of dogs with primary immune-mediated thrombocytopenia (IMT).
Design – Retrospective case series.
Animals – 38 thrombocytopenic dogs.
Procedures – Medical records were reviewed to identify dogs in which PBA tests were performed between 2004 and 2006; PBAs were measured via flow cytometry.
Results – PBAs were detected in 37 of 83 (45%) dogs. Thirteen dogs were suspected of having primary IMT. Median platelet counts were significantly lower in dogs with PBAs, compared with counts in dogs without PBAs. Dogs suspected of having primary IMT had significantly lower median platelet counts, compared with counts for those with secondary IMT. Mean platelet volume (MPV) was increased (> 14.3 fL) significantly more often in dogs without PBAs (19/33 [58%]) than in dogs with PBAs (7/26 [27%]). No dogs suspected of having primary IMT had an increase in MPV. Examination of bone marrow aspirates revealed an increase in megakaryopoiesis in a higher percentage of dogs with PBAs (14/21 [67%]) than in dogs without PBAs (7/18 [39%]). An increase in megakaryopoiesis was detected in all dogs suspected of having primary IMT that had a bone marrow analysis.
Conclusions and Clinical Relevance – Platelet counts, results of bone marrow analysis, and MPV may be helpful in dogs for the differentiation between primary IMT and thrombocytopenia resulting from other diseases. An MPV within or less than the reference range did not rule out an increase in megakaryopoietic activity.
III. Detection of platelet-neutrophil aggregates in blood of dogs with systemic inflammatory disorders
Brigitte Hedwig Dircks, DVM; Reinhard Mischke, Prof Dr med vet; Hans-Joachim Schuberth, Prof Dr med vet
Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, 30173 Hannover, Germany. (Dircks, Mischke); Institute for Immunology, University of Veterinary Medicine Hannover, 30173 Hannover, Germany. (Schuberth)
Presented in part at the 19th Annual Meeting of the InnLab DVG, Leipzig, Germany, February 2011.
Address correspondence to B. Dircks (b.dircks@gmx.de).
Abstract
Objective – Evaluation of platelet-neutrophil aggregate (PNA) formation and neutrophil shape characteristics as indicator of neutrophil activation in dogs with systemic inflammatory diseases and after stimulation with various platelet and neutrophil agonists.
Animals – 20 dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) of which 6 had sepsis and 12 had disseminated intravascular coagulation (DIC), 10 healthy beagle dogs.
Procedures – Isolation of neutrophils by use of a Ficoll density gradient directly after blood sampling or after incubation of blood with phorbol myristate acetate (PMA), collagen, adenosine diphosphate, epinephrine (EPI), and with different concentrations of lipopolysaccharide (LPS), and arachidonic acid (AA); Evaluation of CD61 expression on neutrophils as an indicator of PNA formation as well as alterations in neutrophil size and granularity by flow cytometry.
Results – Dogs with SIRS were shown to have significantly increased PNA formation, increased neutrophil size and decreased granularity in comparison to healthy control dogs, but no differences were seen with regard to these parameters when dogs with and without sepsis or DIC were compared.
Significantly increased PNA formation of variable degree was observed after stimulation with all tested agonists with PMA being the strongest agonist. Neutrophil shape changes (increased neutrophil size and decreased granularity) were seen after incubation with all agonists except EPI. Incubation with LPS or AA at different concentrations resulted in a dose-dependent effect on PNA formation and neutrophil shape change.
Conclusions and Clinical Relevance – Increased PNA numbers and neutrophil shape changes were found in dogs with systemic inflammatory diseases. Similar changes after incubation with platelet agonists indicate the role of platelet activation in PNA formation. Further studies are necessary to predict the significance and diagnostic value of PNA in SIRS and sepsis.
Introduction
Apart from their role in haemostasis, platelets are capable for initiation and propagation of inflammatory and immune processes via secretion of cytokines and interaction with other cells.1,2,3 Platelet activation leads to expression of adhesion molecules on their surface mediating platelet aggregation and interaction with other cells e.g. endothelial cells and leukocytes.4,5,6 Upon activation, platelets release and express P-selectin (CD62P), which allows binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 (CD163) expressed on the surface of all leukocytes, thus promoting the initial adhesion between cells.7,8
Neutrophils are the most numerous leukocyte population which also accumulate in inflamed tissue.9 Interaction with platelets seems to mediate neutrophil accumulation and emigration into inflammatory tissue.10,11 The interaction between platelets and neutrophils may also increase the function of both cell types. Therefore, they provide an important link between thrombosis and inflammation.
Increased numbers of platelet-neutrophil aggregates (PNA) have been demonstrated in human patients with myeloproliferative disorders,12 coronary artery disease,13 diabetes mellitus,14 and sepsis15,16 of human patients. For dogs, a whole blood assay for the detection of platelets binding to monocytes and neutrophils has been described recently and the cellular response to various agonists has been investigated.17 But to our knowledge, no data exist regarding the clinical significance of PNA in dogs with systemic inflammatory diseases.
Measurement of PNA possesses the high likelihood of in vitro stimulation of platelets with subsequent artificial formation of PNA. In order to minimize ex vivo PNA formation, we developed for the present study a simple and reproducible method, in which platelets are separated from neutrophils immediately after blood sampling. Formation of PNA as well as neutrophil shape characteristics as indicator of neutrophil activation were studied in blood samples from dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS). In order to identify relevant factors for the observed findings, PNA formation and neutrophil shape characteristics were analysed in blood of healthy dogs, stimulated with various platelet- and/or neutrophil agonists (phorbol myristate acetat, collagen COL , adenosine diphosphate
ADP , epinephrine EPI , lipopolysaccharide LPS , and arachidonic acid AA ).
Materials and Methods
Selection of cases – Twenty dogs with SIRS, presented to the Small Animal Clinic between August and December 2010 were prospectively entered into the study and PNA were measured in these dogs. In all dogs, a complete blood count, biochemical analysis, and a coagulation profile were performed. Furthermore, all dogs underwent extensive diagnostic imaging procedures including ultrasound and radiography. SIRS was diagnosed, when 2 or more of the following criteria were present: heart rate > 120/min; respiratory rate > 20/min;
rectal temperature < 38°C or > 39°C; white blood cell count > 18,000 or < 5,000. Twelve of these dogs were suspicious of having disseminated intravascular coagulation (DIC) on base of an abnormal coagulation profile (≥ 2 of the following findings: prolonged prothrombin time, prolonged activated partial thromboplastin time and thrombocytopenia) and the detection of an underlying disease known to be associated with DIC. Furthermore, in 6 of the dogs with SIRS, sepsis was diagnosed. The diagnosis was based on a positive blood culture in one dog, and on the finding of a septic focus in 5 dogs including three dogs with pyoabdomen (due to intestinal wound dehiscence, ruptured pyometra, and abdominal perforating bite wound, respectively), and each one dog with phlegmon (due to esophageal perforation), and septic pyothorax. Ten healthy beagle dogs were used as control dogs. These clinically owned dogs had no signs of illness at the time of the study.
Blood sampling – Free-flowing blood was drawn from the cephalic vein of each dog with loosened tourniquet to minimize platelet activation after discarding the first 2 mL. Blood was collected into sodium-heparin containing tubes (Natrium-Heparin-MonovettenR, Sarstedt, Nümbrecht, Germany) using a 20-gauge needle and processed immediately. Sodium-heparin containing tubes were chosen for this study because preliminary tests (data not shown) have shown the lowest formation of PNA formation in healthy control dogs when sodium-heparin was used as anticoagulants compared to EDTA- and sodium citrate.
Ethical approval – The study design was approached by the animal welfare officer of Hanover School of Veterinary Medicine and by the competent authority (Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety reference number: 09A607 ).
Sample processing – In order to minimize ex vivo PNA formation, a flow cytometric test for the measurement of PNA formation after early separation of platelets from neutrophils was developed:
Two milliliters of phosphate buffered saline (PBS) was added to 2 mL of blood and gently mixed, than layered over 5 ml of Ficoll-Hypaque solution and centrifuged for 30 min at 1100 x g and 4°C without brake. Plasma, interphase, and Ficoll medium were removed. Red blood cell (RBC) lysis was initiated by incubation of the remaining neutrophil-RBC pellet with 4 ml of aqua dest. and stopped after 20 sec by adding 4 ml of 2 x PBS. This lysis procedure was repeated two times and each lysis step was followed by centrifugation for 10 min (4°C) at 300 x g (1. lysis), 250 x g (2. lysis), and 150 x g (3. lysis). Cells were washed twice with PBS and centrifuged subsequently at 100 x g and 80 x g respectively.
Isolated and washed neutrophils were incubated 30 min at 4°C with 25 µL mouse-anti-human phycoerythrin (PE)-conjugated CD61 (1:50 dilution) (AbD Serotec, Kidlington, England).
After two washing steps with staining buffer (PBS, 0.5% bovine serum albumin, 0.01 NaN3), cells were suspended in 300 µL sterile-filtered PBS.
Flow cytometry – Neutrophils were analyzed by flow cytometry (FACScan, Becton Dickinson, New Jersey, USA). At least 10 000 events were acquired. In forward-angle light scatter (FSC) versus side-angle light scatter (SSC) plots neutrophils were identified based on their characteristic FSC/SSC profiles. In FSC/SSC plots the mean FSC (correlating with cell size) and the mean SSC values (correlating with granularity and complexity) were recorded as parameters for the neutrophil shape. After cell staining with a PE-labeled anti-CD61 monoclonal antibody, the mean fluorescence intensity (MFI) of all gated neutrophils was recorded in addition to the percent CD61-positive neutrophils. The threshold for CD61- positivity was based on stained cells of healthy dogs (Fig. 1).
PNA after stimulation with different agonist – Aliquots of 1.8 mL blood from healthy beagle dogs were incubated at 37°C for 20 min with either 0.2 mL of PBS (control) or 0.2 mL of agonist solutions (final concentrations): PMA (5 µmol/L), COL (20 µg/mL), ADP (20 µmol/L), EPI (20 µmol/L), COL (20 µg/mL) + ADP (20 µmol/L), EPI (20 µmol/L) + ADP (20 µmol/L), LPS (1, 2, 5, and 10 µg/mL), AA (0.5, 1, and 2 mmol/L). After the incubation, 2 mL of PBS was added to each vial and the blood was gently mixed. Sample processing and flow cytometric analysis was performed as described above.
Statistics – Data were analysed and expressed as means ± standard deviation (SD) and compared using unpaired (comparison of patient groups) or paired (influence of addition of agonists) Student`s t-tests. Analysis was performed using Microsoft Excel 2007 software. A P value of < 0.05 was considered statistically significant.
Results
PNA formation and neutrophil shape characteristics in dogs with systemic inflammatory diseases
The MFI and the percentage of CD61-positive neutrophils were significantly higher in 20 dogs with SIRS compared to healthy control dogs (P=0.003 both) (table 1). Furthermore, the mean FSC of neutrophils was significantly higher (P<0.001) and the mean SSC of neutrophils was significantly lower (P=0.013). Comparison of each subgroup (DIC, non-DIC, sepsis, non- sepsis) with healthy control dogs revealed a significantly increased MFI, percentage of CD61- positive neutrophils, and mean FSC. The mean SSC of healthy control dogs was significantly lower compared to septic, DIC, non-DIC dogs, but not significantly different compared to non-septic dogs.
In vitro stimulation of blood with different agonists – A significant increase in MFI and the percentage of CD61-positive neutrophils was seen after incubation of blood with almost all agonists used in the current study (Figure 2).
Most marked increases in MFI (62.4 29.2 versus 4.2 0.5; mean SD) (P<0.001), and percentage of CD61-positive neutrophils (89.4% 9.8 versus 4.7% 0.6) (P<0.001) were observed after stimulation with PMA in comparison with unstimulated samples.
Incubation with a combination of COL and ADP showed no further increase in MFI and the percentage of CD61-positive neutrophils when compared to incubation with COL alone, whereas a combination of ADP and EPI led to a nearly cumulative response.
Incubation of blood with LPS and AA at different dosages resulted in a dose-dependent increase in MFI as well as percentage of CD61-positive cells compared to unstimulated samples.
Incubation with all tested agonists except EPI resulted in a higher mean FSC and a lower mean SSC of the neutrophils with PMA having the most prominent effect (figure 3).
Combinations of ADP and COL or EPI and ADP showed no additive effect. LPS and AA both resulted in a dose-dependent FSC increase and SSC decrease.
Discussion
Based on the flow cytometric measurement of CD61 associated with neutrophils in the present study, increased values of circulating PNA in dogs with septic and non-septic systemic inflammatory diseases with and without accompanied DIC were detected. This finding is in concordance with an increased formation of PNA in human patients developing SIRS and uncomplicated sepsis16 and in patients with other inflammatory conditions,13,18 however, we are not aware of previous studies investigating the in vivo formation of PNA in dogs with systemic inflammatory diseases. Measurement of platelet adhesion to leukocytes is suggested to be a very sensitive and reliable tool for evaluation of in vivo platelet activation,19 and moreover, it could also be of pathophysiologic significance. Adhesion of activated platelets to neutrophils promotes activation, accumulation and emigration of neutrophils at sites of vascular injury and inflammation.10 Thus, PNA possibly provide an important link between haemostasis and inflammation and may be crucial for initiation and progression of the local and systemic inflammatory response.
No significant difference in PNA formation was seen between SIRS dogs with and without sepsis in the present study, whereas in the study performed by Russwurm et al.16 human patients with uncomplicated sepsis had the highest degree of PNA and very low values were seen in septic shock. Furthermore a negative correlation was found between severity of sepsis and formation of PNA. In contrast, our results indicate that a significant PNA formation does not seem to allow conclusions about the existence of sepsis in dogs with SIRS. However, due
to the small number of dogs with sepsis, we have not differentiated between dogs with sepsis and septic shock nor evaluated the severity of sepsis which could explain the lack of difference between dogs with SIRS and sepsis in the present study and the discrepancy to the literature. The tendency of PNA to migrate into inflamed tissue is probably more pronounced in dogs with sepsis; therefore disappearing of PNA from peripheral blood could have also led to the observed lack in difference between the disease groups.
In the present study dogs with DIC had increased PNA numbers compared to control dogs, but no difference was found between SIRS dogs with and without DIC. As DIC is a clinical syndrome characterized by systemic activation of the haemostatic system leading to fibrin and microthrombus formation throughout the microcirculation,20 one would suspect a higher degree of PNA formation subsequent to systemic activation of platelets. Possible explanations for this lack of difference are the depletion of platelets as well as the increased integration of activated platelets and PNA into formed microthrombi in dogs suffering from DIC.
In contrast to microscopic evaluation, which was not performed for the present study, flow cytometry appears to be a reliable and straightforward tool for the identification and quantification of PNA.21 We measured PNA flow cytometrically after early separation of platelets from neutrophils, immediately after blood sampling, in order to minimize ex vivo formation of PNA. In fact, healthy control dogs had a mean percentage of PNA of 2.3%, which is comparable to other studies using the whole blood assay.17,22,23,24
In this study, additionally to the percentages of neutrophils bearing platelet-specific antibodies, quantification of PNA formation was done by calculating the MFI of all gated neutrophils, i.e. this approach also includes CD61-negative neutrophils. The MFI can be considered as a semiquantitative value reflecting the relative number of platelets bound per leukocyte.21 The value itself depends very much on the specific settings of the flow cytometer and varies according to the expression density of CD61 on platelets.21 We have detected more pronounced differences between groups when the percentage of CD61-positive neutrophils was measured, and moreover, stimulation with the weak platelet agonist EPI resulted in significant differences in the percentage of positive cells but not in MFI. Thus, the percentage of positive neutrophils could be the more sensitive parameter for the quantification of in vivo PNA formation.
Most of the agonists used in this study are reported to cause platelet aggregation in dogs.25,26 Activated platelets release and express P-selectin (CD62P) which promotes adhesion to each other and, via binding to the P-selectin glycoprotein ligand-1 (CD163), to neutrophils.7,8 The observed increase in PNA formation after stimulation with different agonists in the present study is probably the result of activation of platelets as some of the agonists are exclusively platelet agonists and not known to have direct effects on neutrophils. This might be true also for the dogs with SIRS. Activated platelets have been described in dogs with systemic inflammatory disorders by means of flow cytometric analysis including platelet aggregation, P-Selectin surface expression, and microparticle formation as well as automated methods including mean platelet component concentration and mean platelet component distribution width.27,28
In concordance with Tarnow et al.17, the most potent agonist for PNA formation turned out to be the phorbol ester PMA, an exogenous synthetic activator of protein kinase C. While in the mentioned study no significant increases in PNA formation after incubation of blood with ADP, EPI, or COL were observed, the present study, however, showed a mild, but significant increased PNA formation after ADP and EPI and a moderate increase in PNA after COL incubation, when comparable concentrations were used. In the present study only Beagle dogs were included; in contrast, the study by Tarnow et al.17 consisted of various breeds, mainly Retrievers. Thus, besides different sample preparation and methodology, interindividual and breed-related variations in platelet reactivity29 might be reasons for the difference in PNA formation. Control samples in the current study showed low percentages of PNA, which makes the formation of aggregates due to sample handling and technique as a cause for the discrepancy between our study and the study by Tarnow et al.17 less likely.
EPI is considered to be only a weak platelet agonist in dogs,25 which is in concordance with only minor PNA formation after incubation with EPI reported here. However, regardless of this weak platelet reactivity in response to EPI, neutrophils are known to express adrenergic receptors and to produce enhanced levels of proinflammatory cytokines in response to catecholamines,30 which may have contributed to neutrophil activation with subsequent interaction with platelets.
During sepsis or infection with gram-negative bacteria, LPS can be present in the circulation.31 The LPS concentrations which induced PNA formation in vitro in this study
were comparable to those measured in human patients with severe sepsis.31 LPS is capable of inducing platelet P-selectin expression,32 which plays an important role in platelet-neutrophil interaction.33 Furthermore, it has been shown that also neutrophils express the signaling receptor for LPS, Toll-like receptor 4.34 Thus, LPS seems to induce platelet and neutrophil activation thereby contributing to coagulation and inflammation during sepsis. Similar to our findings, LPS has been demonstrated to initiate interactions between platelets and neutrophils in human blood.35
During inflammatory processes the AA metabolism is enhanced36 and AA is released by activated platelets and neutrophils from membrane phospholipids.37,38 AA induces generation of the potent platelet agonist thromboxane A2 as well as platelet granule release in human platelets39 and in fact, is well known to cause platelet activation and aggregation in canine blood.40 In neutrophils, the major pathway of AA metabolism involves 5-lipoxygenation, leading to formation of leukotriene B4 among others, which is a potent chemotatic and chemokinetic agent and stimulates neutrophil activation and aggregation.38 Thus, besides platelet activation, incubation with LPS and AA in the present study may have contributed to increased PNA formation by inducing direct neutrophil activation.
Indeed, after stimulation with different agonists, we detected an increased size and decreased granularity of neutrophils, both of which are probably indicators of neutrophil activation.
Besides functional changes as integrin expression density, inflammatory cytokine production, and enhanced oxygen radical production, structural changes are described as being characteristic for activated neutrophils.9,41,42 Increased cell size is possibly the result of cell swelling43 or the presence of band neutrophils which tend to be larger compared to segmented neutrophils.44 However, we did not investigate whether the neutrophil shape changes, thought to be indicators of neutrophil activation, were induced directly or indirectly, e.g. via platelet activation, as blood samples were not stimulated with isolated neutrophil agonists.
We detected a significantly increased size and decreased granularity of neutrophils also in dogs with SIRS, with and without sepsis. A greater percentage of neutrophils with increased size in dogs with septic and non-septic inflammation was previously demonstrated by Weiss et al..42 However, the mentioned study showed a higher percentage of neutrophils with decreased granularity only for dogs with sepsis, but not for dogs with non-septic inflammation. As SIRS is only a syndrome and includes a wide variety of different clinical
settings, this discrepancy may be explained by the lack of standardized patient populations in both studies. Furthermore, the possibility of an undetected septic focus cannot be completely ruled out despite the extensive clinical investigations in all dogs with SIRS included in this study.
Increased PNA formation and neutrophil shape changes were found in dogs with systemic inflammatory diseases. Similar changes could also be induced by different agonists known as platelet activating substances, which suggests that PNA formation at least partly reflect platelet activation. The method described here provides a simple and reproducible way of assessing platelet interaction with neutrophils. Further studies are necessary to assess its significance in the pathogenesis in SIRS and sepsis and, whether the detection of PNA might provide a clinically sensible tool for identification and therapeutic intervention of prothrombotic conditions in dogs.
References
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Tables and Figures
Table 1: CD61-positive neutrophils and neutrophil shape parameters of healthy dogs and dogs with systemic inflammatory diseases
CD61-staining1 Cell shape2
MFI % positive FSC SSC
Controls (n=10) 3.3 ± 0.1 a 2.3 ± 0.2 a 480 ± 10 a 481 ± 10 a SIRS (n=20) 5.1 ± 1.6 b 10.5 ± 7.9 b 568 ± 66 b 404 ± 89 b
DIC (n=12) Non-DIC (n=8)
5.5 ± 1.9 b 4.4 ± 0.9 b
10.8 ± 8.9 b 10.1 ± 6.7 b
577 ± 83 b 555 ± 29 b
395 ± 100 b 417 ± 73 b Sepsis (n=6)
Non-sepsis (n=14)
5.0 ± 1.0 b 5.1 ± 1.8 b
8.3 ± 3.5 b 11.5 ± 9.1 b
534 ± 31 b 583 ± 73 b
394 ± 43 b 408 ± 104 a,b After staining of blood leukocytes with a PE-labeled CD61-specific antibody, cells were analyzed by flow cytometry. 1) The mean fluorescence intensity (MFI) of gated neutrophils and the percentage of CD61-positive neutrophils was recorded (see Fig. 1). 2) The cell shape was defined as the mean forward angle light scatter (FSC) and mean side angle light scatter (SSC) of gated neutrophils.
Values are presented as means ± standard deviation, SIRS: systemic inflammatory response syndrome, DIC: disseminated intravascular coagulation.
Different small letters indicate significant differences (P < 0.05, unpaired Student´s t-test) between values of controls and disease groups, DIC and non- DIC or sepsis and non-sepsis in the same column.
Figure 1: Representative scattergrams of canine polymorphonuclear cells (PMN) after flow cytometric acquisition. Left dotplots: PMN were identified based on their characteristic forward and side scatter characteristics (circles). The cells were stained with a PE-labeled antibody specific for the platelet surface molecule CD61. Right dotplots: CD61 versus side scatter of unstimulated cells (A) and cells stimulated with 1 mmol/l arachidonic acid for 20 minutes (B). For all gated PMN, the mean fluorescence intensity (MFI) is shown in the dotplots as well as the percentage of CD61-positive PMN (squares).
Figure 2: Mean fluorescence intensity (MFI) (CD61-PE) of neutrophils and percentage of CD61-positive neutrophils (CD61+polymorphonuclear cells (PMN) (%)) unstimulated (Nil) and after stimulation with various agonists; values are shown in mean standard deviation.
PMA: phorbol myristate acetate, COL: collagen, ADP: adenosine diphosphate, EPI:
epinephrine. Different small letters indicate significant differences (P < 0.05, paired student´s t-test) between values.
Figure 3: Mean forward-angle light scatter and mean side-angle light scatter of neutrophils unstimulated and after stimulation with various agonists; see figure 2 for remainder of key.
IV. Übergreifende Diskussion
Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Charaktisierung von zugrundeliegenden Erkrankungen sowie klinischen und labordiagnostischen Parametern bei thrombozytopenischen Hunden mit und ohne plättchengebundenen Antikörpern sowie bei Hunden mit pIMT. Dafür wurden die Patientendaten von 83 Hunden, bei denen im Zeitraum von Januar 2004 bis Dezember 2006 ein Test zur Bestimmung plättchengebundener Antikörper mittels Durchflusszytometrie durchgeführt wurde, retrospektiv ausgewertet.
Bei 37 der 83 Hunde wurden plättchengebundene Antikörper nachgewiesen. Ein positives Testergebnis impliziert eine immunvermittelte Thrombozytopenie, unterscheidet jedoch nicht zwischen einer pIMT und einer sIMT. Vielmehr war der Nachweis plättchengebundener Antikörper bei der Mehrzahl der Patienten mit verschiedenen Erkrankungen assoziiert. Dies deutet darauf hin, dass adaptive immunologische Reaktionen im Rahmen von Entzündungen, Infektionen und der Tumorabwehr eine Rolle spielen. Jedoch ist zu berücksichtigen, dass das begleitende Vorliegen einer Erkrankung nicht zwingend bedeutet, dass diese für die IMT verantwortlich ist.
Bei den positiv getesteten Hunden lag in der vorliegenden Studie ein höherer Anteil an Patienten mit einer schweren Thrombozytopenie vor. Dies deutet darauf hin, dass der immunvermittelte Abbau von Blutplättchen ein potenter Pathomechanismus für eine Thrombozytopenie ist, unabhängig davon, ob autoimmunbedingt oder assoziiert mit einer anderen Erkrankung.
Infektionskrankheiten sind häufig mit einer Thrombozytopenie vergesellschaftet (Grindem et al., 1991, Jordan et al., 1993). So wurde bei etwa einem Drittel der in dieser Studie eingeschlossenen Hunde eine infektiöse Erkrankung diagnostiziert. Plättchengebundene Antikörper sind bei Infektionen mit Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Leishmania infantum und Leptospira spp. beim Hunden gefunden worden (Bexfield et al., 2005, Waner et al., 2000, Terrazzano et al., 2006). Zudem wurden in der Humanmedizin bei septischen Erkrankungen, hervorgerufen durch grampositive und gramnegative Erreger, erhöhte Thrombozyten-assoziierte IgG-Titer gemessen. In Sepsispatienten wird die Thrombozytopenie sowohl auf eine verminderte Produktion im Knochenmark als auch auf eine vermehrte Zerstörung der Thrombozyten in der Peripherie zurückgeführt. Letztere kann sowohl durch eine disseminierte intravasale Gerinnung (disseminated intravascular
coagulation, DIC) als auch durch immunologische Mechanismen verursacht werden (Stéphan et al., 1999, Stéphan et al., 2000). In dieser Arbeit hatte die Hälfte der Hunde mit einer Infektionserkrankung einen positiven Nachweis plättchengebundener Antikörper. Die Thrombozytopenie scheint bei diesen Hunden zumindest teilweise durch Immunmechanismen hervorgerufen worden zu sein.
Bei nur 4 von 15 thrombozytopenischen Hunden mit entzündlichen Erkrankungen ohne Nachweis von Infektionserregern wurden plättchengebundene Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen. Dies deutete darauf hin, dass die niedrige Plättchenzahl bei entzündlichen Erkrankungen im Wesentlichen durch andere Ursachen als durch Immunmechanismen verursacht wurde. Eine IMT ist bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen beim Hund dokumentiert worden, so z.B. durch den Plättchenfaktor 3-Test bei Hunden mit chronischer Otitis, Gingivitis, Sinusitis und Endometritis (Wilkins et al., 1973).
Der Plättchenfaktor 3-Test ist jedoch ein serologischer Test, der Antikörper gegen Thrombozyten im Serum misst und daher, bedingt durch ein hohes Maß an unspezifischer Bindung, eine geringe Sensitivität besitzt (Jain und Kono 1980, McVey und Shuman 1989).
Bei Menschen mit chronischen und akuten Lebererkrankungen mit und ohne Thrombozytopenien sind Thrombozyten-assoziierte IgG nachgewiesen worden (Landolfi et al., 1980, Graber et al., 1984). Die Existenz von plättchengebundenen Antikörpern in einem von 3 Hunden mit chronischer Hepatitis und einem Hund mit Pankreatitis und begleitender Hepatitis in unserer Studie lässt vermuten, dass Immunmechanismen in der Pathogenese der Thrombozytopenie bei Hunden mit Lebererkrankungen ebenfalls eine Rolle spielen.
In der vorliegenden Arbeit wurden plättchengebundene Antikörper bei Hunden mit Tumor- assoziierten Thrombozytopenien nachgewiesen. Im Einklang damit konnten bei 9 von 24 thrombozytopenischen Hunden mit lymphoproliferativen Erkrankungen und Hämangiosarkomen Antikörper mittels eines indirekten Immunfluoreszenztests erfasst werden (Kristensen et al., 1994b).Weiterhin wurde eine IMT bei 7 Hunden mit verschiedenen soliden Tumoren einschließlich Adenokarzinomen, Mastozytomen und Fibrosarkomen mit einem direkten Immunfluoreszenztest identifiziert (Helfland et al., 1984). In Übereinstimmung damit hatten auch in dieser Studie 3 von 10 Hunden mit Tumorerkrankungen plättchengebundene Antikörper. Unseres Wissens nach gibt es bisher keine Berichte von plättchengebundenen Antikörpern bei Hunden mit einem histiozytären
Sarkom. Als Pathomechanismen für die IMT bei neoplastischen Erkrankungen werden eine Immundysregulation, zirkulierende Immunkomplexe und unspezifische, an die Plättchenoberfläche bindende Antikörper vermutet (Lewis et al., 1995).
Bei einem der beiden thrombozytopenischen Hunde mit systemischem Lupus erythematosus (SLE) wurden plättchengebundene Antikörper gemessen. Dies ist übereinstimmend mit dem Nachweis von antithrombozytären Antikörpern mittels direkten und indirekten Tests bei Hunden mit SLE in der Literatur (Campbell et al., 1984, McVey und Shuman 1989, Kristensen et al., 1994a). Autoantikörper führen zur Bildung von Immunkomplexen und zur Opsonisierung von Zielzellen in der Pathogenese des SLE (Stone 2005). Der negative Test bei dem verbleibenden Hund ist ein Hinweis darauf, dass eine Thrombozytopenie bei dem SLE nicht nur durch eine immunbedingte Zerstörung der Blutplättchen hervorgerufen wird.
Plättchengebundene Antikörper wurden bei 2 Hunden mit vermuteter Glomerulonephritis gefunden. Immunkomplexe, die auch an Thrombozyten binden können, spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Glomerulonephritis (Grauer 2005).In einer humanmedizinischen Studie (Puram et al., 1984) hatten 14 von 26 urämischen Patienten mit und ohne Thrombozytopenien erhöhte plättchengebundene IgG-Konzentrationen und 7 von ihnen wiesen erhöhte Mengen von Immunkomplexen auf.
Der Nachweis von plättchengebundenen Antikörpern bei einem Hund mit Verdacht auf idiopathischer aplastischer Anämie in der vorliegenden Studie ist im Einklang mit dem Nachweis gleich hoher plättchengebundener IgG-Konzentrationen beim Menschen mit aplastischer Anämie und pIMT (Kawaguchi et al., 1992). Die Thrombozytopenie bei der aplastischen Anämie ist nicht nur auf eine immunvermittelte Zerstörung von Thrombozyten in der Peripherie zurückzuführen, sondern möglicherweise auch auf eine Schädigung von Stamm- und Vorläuferzellen im Knochenmark.
Hunde mit einem positiven Testergebnis zum Nachweis plättchengebundener Antikörper hatten niedrigere Thrombozytenzahlen und weniger häufig ein erhöhtes MPV im Vergleich zu Hunden mit einem negativen Testergebnis. Zudem war die Megakaryopoese häufiger gesteigert bei Hunden mit plättchengebundenen Antikörpern. Dies erscheint im Widerspruch zu den Ergebnissen einer anderen retrospektiven Studie (Sullivan et al., 1995),nach der das MPV und die Megakaryopoeseaktivität signifikant assoziiert waren. Allerdings war der
prädiktive Wert eines MPV innerhalb oder unterhalb des Referenzbereiches für eine verminderte Megakaryopoeseaktivität gering.
Die Autoren einer weiteren Studie vermuteten eine vermehrte Bildung größerer Plättchen bei Zuständen erhöhter Thrombopoese (Thompson et al., 1983).Dies ist gleichbedeutend mit der Annahme, dass das Ausmaß der Stimulation der Thrombopoese das MPV bestimmt und dass Letzteres negativ mit der Plättchenzahl korreliert (Levin und Bessmann 1983). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stehen offenbar im Widerspruch dazu, dass größere Thrombozyten ein Indikator für eine erhöhte Thrombopoeseaktivität sind und dass eine negative Korrelation zwischen Thrombozytenzahl und MPV besteht. Ein möglicher Erklärungsansatz für unsere Ergebnisse ist eine vermehrte Entfernung und Zerstörung größerer Plättchen in der Peripherie.
Größere Plättchen sind aktiver, z.B. bei der Thrombozytenadhäsion (Kraytman 1973) und können stärker mit Antikörpern beladen sein (Zucker-Franklin und Karpatkin 1977). Dies führt möglicherweise zu deren bevorzugter Entfernung aus dem Kreislauf bzw. einer vermehrten Zerstörung durch das Immunsystem.
Die Anwesenheit von Mikropartikeln, die in der vorliegenden Studie nicht gemessen wurden, haben möglicherweise zu einem falsch niedrigen MPV geführt. In einer anderen Studie konnten bei 62% der Hunde mit einer pIMT und bei allen Hunden mit einer sIMT Mikropartikel gefunden werden (Wilkerson et al., 2001). Ein artifiziell erniedrigtes MPV durch Mikropartikel ist somit auf der Grundlage dieser Ergebnisse wahrscheinlich nur von untergeordneter Bedeutung in unserer Studie. Anderenfalls würde man ein niedriges MPV besonders ausgeprägt bei Hunden mit einer sIMT erwarten.
Des Weiteren kann eine vermehrte Bildung kleinerer Plättchen im Knochenmark zu einem niedrigeren MPV im peripheren Blut führen. Bei experimentell ausgelöster IMT beim Hund führten Antikörper auf der Megakaryozytenoberfläche zu morphologischen und funktionellen Defekten (Joshi und Jain 1977), wodurch eine Bildung kleinerer Plättchen resultieren könnte.
Elf der 13 Hunde mit vermuteter pIMT in dieser Arbeit hatten eine schwere Thrombozytopenie (≤ 20.000/µl) und keiner dieser Hunde hatte ein MPV über dem Referenzbereich. Zudem hatten alle Hunde mit einer pIMT, bei denen eine Knochenmarkspunktion durchgeführt wurde (n = 9), eine gesteigerte Megakaryopoeseaktivität. Zu dem gleichen Ergebnis kam eine weitere retrospektive Studie (Weiss 2006), die bei 25 von 28 Hunden mit einer pIMT eine megakaryozytäre Hyperplasie
fanden. Eine vermehrte Anzahl sowie ein erhöhtes Volumen von Megakaryozyten im Knochenmark bei Patienten mit einer pIMT wird als Antwort auf eine vermehrte Zerstörung von Thrombozyten in der Peripherie verstanden (Lewis und Meyers 1996a, Garon et al., 1999). Zwar können antithrombozytäre Antikörper an die Oberfläche von Megakaryozyten binden, diese führen aber nur selten zu einer verminderten Anzahl von Megakaryozyten im Knochenmark (Joshi und Jain 1977).
Vergleichbar mit unseren Ergebnissen wurde die Kombination aus schwerer Thrombozytopenie und Mikrothrombozytose bereits zuvor als stark hinweisend auf eine pIMT beschrieben (Nothern und Tvedten 1992). In der erwähnten Studie (Nothern und Tvedten 1992) erfolgte jedoch kein Nachweis antithrombozytärer Antikörper. Somit basierte die Diagnose einer pIMT indirekt auf den Ausschluss anderer Erkrankungen und das Ansprechen auf die Therapie.
Als Einschränkung der vorliegenden Studie ist zu nennen, dass eine mikroskopische Untersuchung eines Blutausstriches auf Thrombozytenaggregate nur dann erfolgte, wenn die Ergebnisse des automatischen Blutzellgerätes einen Hinweis auf Aggregatbildung ergab. Da das von uns genutzte Blutzellgerät, der Advia 120, Plättchenaggregationen vermutlich nur unzuverlässig erkennt (Stokol und Erb 2007), können wir die Möglichkeit falsch niedriger Plättchenzahlen bzw. falsch hoher Plättchenvolumina bei einem Teil der Patienten nicht vollständig ausschließen. Zur Vermeidung solcher Mikroaggregate während der Blutabnahme wurde mittels großvolumiger Kanülen frei fließendes Blut direkt in das Probengefäß gewonnen. Zudem erfolgte eine umgehende Analyse der Proben.
Zusammenfassend wurde im ersten Teil dieser Arbeit deutlich, dass die immunvermittelte Zerstörung von Blutplättchen ein potenter Pathomechanismus für eine Thrombozytopenie bei einer Vielzahl von Erkrankungen ist. Hunde, bei denen plättchengebundene Antikörper nachgewiesen werden und die zusätzlich eine schwere Thrombozytopenie, ein niedriges bis normales MPV und eine gesteigerte Megakaryopoeseaktivität im Knochenmark aufweisen, scheinen höchst verdächtig für eine pIMT zu sein. So könnte das MPV ein diagnostisches Hilfsmittel bei der Aufarbeitung einer Thrombozytopenie sein, ihre Bedeutung im Hinblick auf die megakaryopoetische Aktivität bleibt jedoch unklar.
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war der Nachweis von PNA bei Hunden mit verschiedenen systemisch-entzündlichen Erkrankungen mit und ohne Sepsis oder DIC. Zur
Erarbeitung pathophysiologischer Grundlagen dieser Aggregatbildung sollte der Einfluss verschiedener Plättchen- und Neutrophilenagonisten auf die Bildung von PNA in vitro gemessen werden. Weiterhin sollte eine Untersuchung der Formveränderungen der neutrophilen Granulozyten als Indikator für eine Aktivierung dieser Zellen bei systemisch- entzündlichen Erkrankungen sowie nach Stimulation mit den unterschiedlichen Agonisten erfolgen. Dafür wurde in der vorliegenden Studie ein einfacher und reproduzierbarer durchflusszytometrischer Test entwickelt, bei dem die In-vitro-Formation von PNA, durch Separation der Thrombozyten von den neutrophilen Granulozyten direkt nach der Blutabnahme, weitgehend verhindert werden sollte.
Basierend auf der CD61 Expression auf neutrophilen Granulozyten konnte in der vorliegenden Studie ein erhöhter Anteil zirkulierender PNA im Blut von Hunden mit septischen und nicht-septischen, systemisch-entzündlichen Erkrankungen mit und ohne DIC gefunden werden. Dies ist in Übereinstimmung mit einer vermehrten Bildung von PNA bei Menschen mit einem systemischem inflammatorischen Response-Syndrom (SIRS) und unkomplizierter Sepsis (Russwurm et al., 2002) sowie anderen entzündlichen Erkrankungen (Nijm et al., 2005, Irving et al., 2008); Uns sind jedoch keine Studien zur Untersuchung der PNA-Bildung bei Hunden mit systemisch-entzündlichen Erkrankungen bekannt. Die durchflusszytometrische Messung von PNA wird als zuverlässiger und sensitiver Marker für die In-vivo-Thrombozytenaktivierung beim Hund gewertet (Wills et al., 2006). Diese Aggregate scheinen von pathophysiologischer Bedeutung zu sein, da sie möglicherweise ein Bindeglied zwischen Entzündung und Hämostase darstellen und für die Initiierung und Erhaltung der lokalen sowie der systemisch-entzündlichen Reaktion wichtig sind. So vermittelt die Interaktion aktivierter Plättchen mit neutrophilen Granulozyten die Aktivierung, lokale Ansammlung und Emigration von neutrophilen Granulozyten an Orte mit Gewebe- und Gefäßschädigung (Diacovo et al., 1996).
In der vorliegenden Arbeit bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den an SIRS erkrankten Hunden mit und ohne Sepsis. Dagegen zeigten Russwurm et al. (2002), dass Patienten mit einer unkomplizierten Sepsis den höchsten Anteil an PNA hatten, während niedrige Werte bei Patienten mit septischen Schock gefunden wurden. Weiterhin bestand in der erwähnten Studie eine negative Korrelation zwischen dem Schweregrad der Sepsis und der Bildung von PNA. Dagegen implizieren unsere Ergebnisse, dass die Bildung von PNA
keine Rückschlüsse auf das Vorhandensein einer Sepsis bei Hunden mit systemisch- entzündlichen Erkrankungen zulässt. Allerdings haben wir, aufgrund der niedrigen Tierzahl, weder zwischen einfacher Sepsis und septischem Schock differenziert noch den Schweregrad der Sepsis mit einbezogen, was den fehlenden Unterschied zwischen Hunden mit SIRS und Sepsis und die Diskrepanz zur Literatur erklären könnte. Eine Abwanderung von PNA in entzündliches Gewebe, und damit dem Verschwinden aus der Blutzirkulation, ist möglicherweise verstärkt bei Hunden mit einer Sepsis und könnte ein Erklärungsansatz für das Fehlen eines Unterschiedes zwischen den Gruppen in der vorliegenden Studie darstellen.
Weiterhin hatten Hunde mit einer DIC zwar vermehrt PNA im Vergleich zur Kontrollgruppe, aber ein Unterschied zwischen an SIRS erkrankten Hunden mit und ohne DIC konnte nicht beobachtet werden. DIC ist ein klinisches Syndrom, charakterisiert durch eine systemische Aktivierung der Hämostase mit folgender Fibrin- und Mikrothrombenbildung innerhalb der Mikrozirkulation (Stokol 2010), was eine Assoziation zu einer vermehrten Aggregatbildung plausibel erscheinen lässt. Mögliche Erklärungen für unsere Ergebnisse könnten die erniedrigte Anzahl von Thrombozyten bei einer Verbrauchskoagulopathie sowie der Einbau von Plättchen und PNA in Mikrothromben bei Hunden mit einer DIC sein.
Im Gegensatz zur mikroskopischen Untersuchung (hier nicht durchgeführt) stellt die Durchflusszytometrie ein zuverlässiges und eindeutiges Mittel zum Nachweis und zur Quantifikation von PNA dar. Die Aufbereitung der Blutproben für die Durchflusszytometrie erfolgte in der vorliegenden Studie direkt nach der Blutabnahme, d.h. die Thrombozyten wurden frühzeitig von den neutrophilen Granulozyten getrennt, um eine Bildung von PNA ex vivo zu minimieren. So hatten gesunde Hunde der Kontrollgruppe einen mittleren Anteil an PNA von 2,3%, was vergleichbar mit anderen Studien in der Veterinär- und Humanmedizin ist (Li et al., 1999, Michelson et al., 2001, Tarnow et al., 2008, Ståhl et al., 2009).
Zusätzlich zur Bestimmung des prozentualen Anteils von neutrophilen Granulozyten mit plättchenspezifischen Antikörpern erfolgte in der hier vorgestellten Arbeit die Quantifizierung der PNA durch Bestimmung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der Zellen. Die MFI gibt die relative Anzahl gebundener Plättchen pro Granulozyt wider. Dieser Wert ist abhängig von der Einstellung des Durchflusszytometers sowie der CD61-Expressionsdichte der gebundenen Plättchen und gilt somit als semiquantitativer Ansatz (Barnard et al., 2003). Wir stellten jedoch einen größeren Unterschied zwischen den Gruppen fest, wenn der
