Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) in Dummerstorf
Isolierung und Charakterisierung merkmalsassoziiert exprimierter DNA-Sequenzen mittels 'mRNA-differential display' in ausgewählten
Geweben bei Rind und Schwein
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Ute Dorroch aus Rostock Hannover
2001
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Schierwater
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2001
Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungsverzeichnis iv
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis vii
A. Einleitung 1
B. Literaturübersicht 4
1. Merkmalsausprägung beim Nutztier 4
1.1. Die primäre und sekundäre Genwirkung 5
1.2. Genvarianten und phänotypische Merkmalsausprägung 7
1.3. Umweltfaktoren und Merkmalsausprägung 15
2. Identifizierung merkmalsassoziierter Kandidatengene 18
2.1. Positionelle Kandidatengene 20
2.1.1. Genetische und physische Genkarten 22
2.1.2. Komparative Kartierung 23
2.2. Funktionelle Kandidatengene 26
2.2.1. Die EST-Technologie 27
2.2.2. Die 'mRNA differential display'-Methode 30
C. Eigene Untersuchungen 35
I Aufgabenstellung (experimenteller Ansatz) 35
II Material und Methoden 36
1. Material 36
1.1. Tiermaterial 36
1.1.1. Kühe unterschiedlichen Stoffwechseltyps 36
1.1.2. Schweine 39
2. Methoden 41
2.1. Das Verfahren des 'mRNA differential display' 41
2.1.1. Extraktion zytoplasmatischer RNA 41
2.1.2. Reverse Transkription (RT) 42
2.1.3. Amplifikation durch RT-PCR 43
2.1.4. Polyacrylamidgelelektrophorese 44
2.1.5. Färbung der Polyacrylamidgele mit Silbernitrat 44 2.1.6. Extraktion von cDNA-Banden aus Polyacrylamidgel 45
2.1.7. PCR zur Amplifikation der cDNA 45
Seite 2.2 Klonierung und Sequenzierung different dargestellter cDNA-Banden 47
2.2.1. Herstellen kompetenter Bakterienzellen 47
2.2.2. DNA-Amplifikation durch Plasmidklonierung 48
2.2.3. Plasmidminipräparation 49
2.2.4. DNA- Sequenzanalyse 50
2.3. Methoden zur Auswertung 52
2.3.1. Datenbankhomologiesuche 52
2.3.2. Präparation genomischer DNA 52
2.3.2.1 Präparation genomischer DNA aus Blut 52
2.3.2.2. Präparation genomischer DNA aus Gewebe 53
2.3.3. Ableitung sequenzspezifischer Primer 53
2.3.4. cDNA 'Microarray'-Technik 55
2.3.4.1. Microarraychipdesign 55
2.3.4.1.1.Amplifizierung der cDNAs 55
2.3.4.1.2.Aufbringen der cDNAs auf den Microarrayobjektträger 57
2.3.4.1.3.Präparation von C0t-1-DNA 58
2.3.4.2. Hybridisierung mit fluoreszensmarkierten Sonden 59
2.3.5 Kartierung von ESTs 63
2.3.5.1. Kartierung im Somatischen Zellpanel mittels PCR 63 2.3.5.2. Kartierung im Rind-Hamster-RH-Panel mittels 'two times'-PCR 63
III Ergebnisse 64
1. Kühe unterschiedlichen Stoffwechseltyps 64
1.1. Elektrophoretische Darstellung differenter cDNAs mittels 64 'mRNA-differential display'
1.2. Darstellung differenter ESTs in der Leber und im Dünndarmepithel 69 von Kühen mit unterschiedlichem Stoffwechseltyp
1.2.1. Nachweis von Sequenzhomologien 69
1.2.2. Darstellung der identifizierten ESTs an genomischer boviner DNA 78 und physische Kartierung mittels 'Radiation Hybrid Mapping'
1.2.3. Darstellung differenter Expression der identifizierten ESTs mittels 87 semi-quantitativer RT-PCR
1.2.4. Erstellung von cDNA 'Microarrays' 88
Seite 2. Fütterung unterschiedlicher Proteindiäten beim Schwein 89 2.1. Elektrophoretische Darstellung differenter cDNAs mittels 89
'mRNA-differential display'
2.2. Darstellung differenter ESTs in der Leber bei Schweinen nach 93 Fütterung unterschiedlicher Proteindiäten
2.2.1. Nachweis von Sequenzhomologien 93
2.2.2. Darstellung der identifizierten ESTs anhand genomischer 98 porciner DNA
D. Diskussion 100
1. Darstellung different exprimierter Sequenzen mittels nicht 100 radioaktiver 'mRNA-differential display'-Methode
2. Darstellung differenter cDNAs 103
3. Schlußfolgerungen 108
E. Zusammenfassung 110
F. Summary 112
G. Literaturverzeichnis 114
H. Anhang I
1. Geräte I
2. Biologische Substanzen, Chemikalien, Lösungen und Puffer II
Abkürzungsverzeichnis
A Adenosin
AMP Adenosinmonophosphat
AMPK AMP-aktivierte Proteinkinase
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
BAC bacterial artificial chromosome
BLAD bovine leucocyte adhesion deficiency
bp Basenpaar(e)
BTA Bos taurus-Chromosom
C Cytosin
cDNA copy desoxyribonucleic acid
CGRP calcitonin gene-related peptid
Cha Charolais
Chr Chromosom
CI Chloroform-Isoamylalkohol
COMPASS comparative mapping by annotation and sequence similarity
ddH2O zweifach destilliertes Wasser
ddNTP Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphat
DEPC Diethylpyrocarbonat
DtH Deutsche Holstein
DH Dehydrogenase
dH2O destilliertes Wasser
DNA desoxyribonucleic acid
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Desoxyribonukleosid-5'-triphosphat (A = Adenosin, C
= Cytosin, G = Guanosin, T = Thymidin
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamin-Tetraazetat
EST expressed sequence tag
FBN Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere
FISH Fluoreszens-in situ-Hybridisierung
FSH Follikel stimulierendes Hormon
G Guanosin
I Inosin
IGF-1 insulin-like growth factor 1
kb Kilobase(n)
LB Luria Bertani
LINE long interspersed element
LM Lebendmasse
M C oder A
MAS marker assisted selection
MHS Maligne Hyperthermie-Syndrom
min Minuten
mRNA messenger ribonucleic acid
N A, C, G, T, U oder I
OLA oligoligation assay
PAC P1 artificial chromosome
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PCI Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol
PCR polymerase chain reaction
PRKAG3 AMP-aktivierte Proteinkinase gamma-Untereinheit
PSE pale-soft-exsudate
QTL quantitative trait loci
repeat repetitives Element
RFLP restriction fragment length polymorphism
RH radiation hybrid
RN Rendement Napole
rpm rounds per minute
RT Reverse Transkription
SCP somatic cell panel
SDS Sodiumdodecylsulfat
sec Sekunden
SEGFAM segregierende Familienstruktur des FBN Dummerstorf
SINE short interspersed element
SNP single nucleotide polymorphism
SPI Sojaproteinisolat
SSC Sus scrofa-Chromosom
SSCP single strand conformation polymorphism
TEMED N', N', N', N' Tetramethylethylendiamin
TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
tRNA transfer ribonucleic acid
U Uridin
ÜN über Nacht
UTR untranslatierte Region
WGRH whole genome radiation hybrid
YAC yeast artificial chromosome
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
Tabellen: Seite
Tab. 1: Genvarianten beim Rind und beim Schwein, die im Zusammenhang mit der 9 Merkmalsausprägung Bedeutung haben und für die gendiagnostische Tests zur Verfügung stehen
Tab. 2: Phänotypische Unterscheidung der Deutschen Holstein Kuh vom Umsatztyp 37 (DtHU), der Deutschen Holstein Kuh vom Umsatz-/Ansatztyp (DtHU/A) und
der Charolaiskuh (Cha)
Tab. 3: Informationen zu den Versuchstieren 39
Tab. 4: Rationszusammensetzung 39
Tab. 5: Rationszusammensetzung (chemisch) und Energiegehalt 40 Tab. 6: Häufigkeit elektrophoretisch dargestellter cDNA-Banden zwischen den drei 66
Vergleichstieren: DtHU,DtHU/A,Cha nach Anwendung des 'mRNA-differential display'
Tab. 7: Mittlere Häufigkeit des Auftretens von cDNA-Banden mit der gleichen 'core'- 66 Sequenz innerhalb einer zur RT-PCR angewendeten Primerkombination
Tab. 8: Gesamtanzahl identifizierter ESTs in Leber und Dünndarmepithel 67 Tab. 9: Häufigkeiten aufgetretener EST-flankierender Bereiche 69 Tab. 10: Auflistung boviner hepatischer und intestinaler exprimierter Sequenzen 71
(ESTs): Sequenzhomologien
Tab. 11: Einteilung identifizierter different dargestellter Gene zwischen Rindern 77 unterschiedlichen Stoffwechseltyps entsprechend ihrer physiologischen
Bedeutung in 7 ausgewählte Gruppen
Tab. 12: Auflistung der Primerpaare für die bovinen intestinal und hepatisch 79 exprimierten ESTs
Tab. 13: Zuweisung von 122 bovinen ESTs zum bovinen Genom durch 84 SCP-und WGRH-Kartierung
Tab. 14: Häufigkeit elektrophoretisch dargestellter cDNA-Banden zwischen den 91 jeweils 2 Schweinen, die zum einen mit einer Kaseinproteindiät und zum
anderen mit einer Sojaproteinisolatdiät gefüttert wurden, nach Anwendung des 'mRNA-differential display'
Tab. 15: Mittlere Häufigkeit des Auftretens von cDNA-Banden mit der gleichen 'core'- 92 Sequenz innerhalb einer zur RT-PCR angewendeten Primerkombination
Tab. 16: Gesamtzahl identifizierter ESTs in der Leber 92
Seite Tab. 17: Häufigkeiten aufgetretener EST-flankierender Bereiche 93 Tab. 18: Auflistung porciner hepatischer exprimierter Sequenzen (ESTs): 95
Sequenzhomologien
Tab. 19: Einteilung identifizierter different dargestellter Gene, die nach Fütterung 97 unterschiedlicher Proteindiäten beim Schwein isoliert wurden, entsprechend
ihrer physiologischen Bedeutung in 7 ausgewählte Gruppen
Tab. 20: Auflistung der Primerpaare für die porcinen hepatisch exprimierten ESTs 99
Abbildungen:
Abb. 1: Stufen der primären und sekundären Genwirkung 4
Abb. 2: Darstellung der cDNA-Banden: 1/1, 1/2, 1/3 auf 1,5 % igem Agarosegel 46 nach Isolierung und Eluierung aus dem Acrylamidgel und Amplifikation
mit den Primern der RT-PCR (D1 und U1)
Abb. 3: Beispiel für WGRH5000-Kartierung 63
Abb. 4: Polyacrylamidgelausschnitte der Leber und des Dünndarmepithels 65 Abb. 5: Darstellung eines 'differential display'-Polyacrylamidgels mit den 68
silbergefärbten cDNA-Banden
Abb. 6: Schematische Zuordnung von 119 ESTs in die bovine RH5000 Rahmenkarte 86 Abb. 7: RT-PCR-Experiment nach Amplifikation des Lebertranskriptes von 87
EST fbn-l152 (sequenzspezifischer Primer) von jeweils 10 Tieren der Rasse Deutsche Holstein und Charolais
Abb. 8: Ausschnitt eines signalgebenden Bereiches des mit einer Cy5-markierten 89 Sonde hybridisierten cDNA-'Microarrays'
Abb. 9: Polyacrylamidgelausschnitt der Leber 90
Diagramme:
Diagramm 1: 70 Verteilung der aus Leber und Dünndarmepithel isolierten cDNAs nach
Datenbankhomologievergleich und anschließender Charakterisierung
Diagramm 2A): 87
Messung der individuellen relativen densitometrischen Einheiten des Lebertranskriptes fbn-l152 bei Tier 1 bis 10 der Rasse Deutsche Holstein und bei Tier 1 bis 10 der Rasse Charolais
Seite
Diagramm 2B): 88
Durchschnitt der relativen densitometrischen Einheiten bei beiden Tiergruppen mit Darstellung der Standardabweichung
Diagramm 3: 94
Verteilung der aus Leber von Schweinen nach Fütterung unterschiedlicher Proteindiäten isolierter cDNAs nach Datenbankhomologievergleich und anschließender Charakterisierung
A. Einleitung
In den vergangenen Jahren sind zunehmend moderne Verfahren der Genomanalyse in der Nutztierzucht zur Anwendung gekommen. So konnten sowohl unter Verwendung des Kandidatengenansatzes als auch des Markergenansatzes entscheidende Beiträge für die züchterische Verbesserung der landwirtschaftlichen Nutztiere erreicht werden (SCHWERIN
& KÜHN, 1999, BOVENHUIS, 1999).
Beim Kandidatengenansatz werden Gene, die für an der Merkmalsausprägung beteiligte Schlüsseleiweiße kodieren, mit Hinsicht auf das Auftreten von merkmalsassoziierten Varianten (direkte Marker) analysiert und diese gezielt in der Selektion zum Ausschluß negativer Genvarianten genutzt (SCHWERIN et al., 1995) . Beispiele hierfür sind Varianten im porcinen Ryanodinrezeptorgen bei der malignen Hyperthermie (MICKELSON et al., 1990) oder im bovinen ß2-Integrin bei der Erkrankung BLAD, der Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (KEHRLI et al., 1990). Die entsprechenden Genteste sind entwickelt worden und im Rahmen einer markergestützten Selektion einsetzbar. Beim Markergenansatz oder auch 'umgekehrten genetischen Ansatz' werden anhand der Kosegregation von phänotypischer Merkmalsausprägung mit bereits kartierten genetischen Markern in segregierenden Tierstrukturen merkmalsbeeinflussende Loci (sogenannte 'Quantitative Trait Loci', QTL) identifiziert und mittels gekoppelter Marker (indirekte Marker) angestrebt, positive QTL-Allele in der Population anzureichern (GEORGES et al., 1995) . So konnten bis zum heutigen Zeitpunkt bei den verschiedenen Nutztierarten eine Vielzahl von QTL für Milchleistungs-, Wachstums-, Qualitäts- und Gesundheitsmerkmale kartiert werden (HEYEN et al., 1998; GEORGES et al., 1995; ZHANG et al., 1998; KÜHN et al., 1996;COPPIETERS et al.,1998; MICHAUX et al., 1983; ANDERSSON et al., 1994). Mit diesen Erkenntnissen wurden die Grundlagen für die Anwendung der markergestützten Selektion (MAS) gelegt.
Sowohl direkte Marker (z.B. Genvarianten im Ryanodinrezeptorgen oder Östrogenrezeptor- gen beim Schwein) als auch indirekte Marker, z.B. Marker für Hornlosigkeit (HARLIZIUS et al., 1997; GEORGES et al., 1993) oder den Erbdefekt 'Weaver–Syndrom' beim Rind (GEORGES et al., 1993), werden bereits erfolgreich im Rahmen markergestützter Selektions- programme genutzt.
Eine effektive Nutzung von QTL in Zuchtprogrammen setzt jedoch ihre Feinkartierung bzw.
die Klonierung der genetischen Variation selbst (GEORGES et al., 1998) sowie die ständige
Identifizierung und Kartierung neuer QTL (BOVENHUIS, 1999, SCHWERIN & KÜHN, 1999), aber auch das bessere Verständnis von QTL-Wechselwirkungen voraus (SCHWERIN, 2000).
Eine neue Technik, die im Zusammenhang mit der Identifizierung von merkmalsassoziierten Genen und der Analyse intergener Wechselwirkungen Anwendung finden kann, ist die EST (Expressed Sequence Tag)-Technologie. Sie erlaubt den Nachweis merkmals-, umwelt- oder entwicklungsabhängiger exprimierter Gene einer Zelle oder eines Gewebes (ADAMS et al., 1991, MOU et al., 1994, HILLIER et al., 1996).
Ein Verfahren, das in diesem Zusammenhang Anwendung findet, ist das Verfahren des 'mRNA differential display' (LIANG & PARDEE, 1992), das die vergleichende elektrophoretische Darstellung transkribierter Moleküle nach RNA-Isolierung und cDNA- Synthese umfaßt und die Identifizierung von different exprimierten mRNAs /cDNAs ermöglicht. Dabei wird davon ausgegangen, daß Gene, die in Abhängigkeit von der Leistungsausprägung different exprimiert werden, auch potentielle Kandidatengene darstellen und daß die Identifizierung und die komplexe Analyse ihrer Expression Einblicke in das Netzwerk der merkmalsassoziierten Genexpression eines Gewebes bzw. Tieres erlauben.
Bisher ist dieses Verfahren erfolgreich zur Klonierung solcher Gene eingesetzt worden, die in verschiedenen Geweben oder im gleichen Gewebe unter veränderten Bedingungen Expressionsunterschiede aufweisen (LIANG et al., 1993; AIELLO et al., 1994; LI et al., 1994; NISHIO et al., 1994). Dieses Verfahren wurde in den vorliegenden Untersuchungen genutzt, um different zwischen verschiedenen Stoffwechseltypen beim Rind bzw. nach Fütterung verschiedener Proteindiäten beim Schwein exprimierte Sequenzen zu identifizieren und zu charakterisieren. Anhand dieser identifizierten Sequenzen wurde gezeigt, welche biochemischen Moleküle (u.a. Signalpeptide, Enzyme, Transkriptionsfaktoren) in besonderem Maße die Stoffwechselleistung mitbestimmen und auf welche Art und Weise einige in einem oder mehreren Stoffwechselwegen fungieren. Um weitere Einblicke in die intergenetische Up- und Downregulation dieser different exprimierten cDNAs zu erhalten, sind mit ihnen an ausgewählten Geweben von Rindern und Schweinen einer jeweils neuen Stichprobe Expressionsprofile erstellt worden. Mit der vorliegenden Arbeit sollen die Grundlagen für die Identifizierung potentieller in den differenzierten Stoffumsatz von Tieren involvierter Kandidatengene und eine mögliche Analyse von leistungsassoziierten intergenen Wechsel- wirkungen geschaffen werden.
Die ESTs, die von den Kühen unterschiedlichen Stoffwechseltyps (Milch-, Fleisch-, Milch- /Fleischtyp) identifiziert wurden, ordnen sich in das interdisziplinäre Forschungsprojekt des
FBN Dummerstorf 'Genetische und physiologische Grundlagen der Merkmalsausprägung für Wachstum und Stoffumsatz in segregierenden Familienstrukturen beim Rind' ein. Im Rahmen dieses Projektes sollen in den different exprimierten Sequenzen Einzelbasenpaar- polymorphismen identifiziert und im Rahmen der QTL-Kartierung als potentielle merkmalsassoziierte Marker verwendet werden.
B. Literaturübersicht
1. Merkmalsausprägung beim Nutztier
Die Züchtung hat zur Verbesserung vieler Leistungen der landwirtschaftlichen Nutztiere geführt. Das betrifft insbesondere Produktionsmerkmale wie z.B. die Milchleistung bei Kühen, Schafen und Ziegen oder die Fleischleistung bei Rindern, Schweinen und Schafen.
Bei Merkmalen mit geringer Heretabilität (z.B. Fruchtbarkeit) oder mit negativen Korrelationen zu anderen Merkmalen (z.B. Tiergesundheit - Hochleistung) erwiesen sich die Methoden der klassischen Tierzucht oft als uneffektiv. Die Ursachen dafür sind in der hohen Komplexität der Merkmalsausprägung eines Organismus begründet.
Abb. 1: Stufen der primären und sekundären Genwirkung (SCHWERIN et al., 1999a)
Grundsätzlich sind Organismen 'offene Systeme', die in Stoff- und Energieaustausch mit anderen Systemen (Umwelt) stehen. Dabei ist der Phänotyp das Ergebnis umfassender untereinander verknüpfter Reaktionsketten auf allen Ebenen der Hierarchie des biologischen Systems (siehe Abb.1) und ihrer Wechselwirkung mit der Umwelt. Grundsätzlich sind die Gene, die in ihrer Sequenz die Information für die Proteine und damit für den Bau und den Stoffwechsel von Zellen und Geweben tragen, die Hauptquelle der Merkmalsausprägung.
Dies ist jedoch kein starrer Prozeß. Einerseits unterliegt die DNA selbst ständig sequenz-
verändernden Einflüssen. So können durch Fehler in der Replikation, durch Rekombination oder die Einwirkungen von Noxen Mutationen entstehen, von denen einige in der Lage sind, die Expression oder die Funktion von Proteinen zu verändern. Andererseits können Umweltfaktoren auf das komplexe System des Stoffwechsels Einfluß nehmen und die Wirkung von Enzymen, Hormonen etc. blockieren oder verstärken. Leistungen stellen letztendlich das Ergebnis der Genwirkung und der Wechselwirkung zwischen Genotyp und Umwelt dar, wobei dieser Effekt tierspezifisch sein kann (SCHWERIN et al., 1999a).
Die Stufen der Merkmalsausprägung faßt man in zwei Abschnitten – die primäre und sekundäre Genwirkung - zusammen.
1.1. Die primäre und sekundäre Genwirkung
Die primäre Genwirkung ist die Biosynthese der Proteine, die in zwei Prozessen abläuft. Der erste Prozeß ist die Transkription, in dessen Ergebnis 'messenger' RNA (mRNA) als Transkript der DNA erstellt wird. Als zweiter Prozeß schließt sich die Translation an. Die Information der 'messenger RNA' (Nukleinsäuresequenz) wird in eine Polypeptidkette (Aminosäuresequenz) übersetzt, welche das Genprodukt darstellt (RIEGER et al., 1976;
HESKETH et al.,1998).
Die Gesamtheit aller Gene eines Organismus bezeichnet man als Genom. Das typische haploide Säugergenom ist aus 3x109 Basenpaaren zusammengesetzt. Der Anteil der 'single copy'–Sequenzen, die für Proteine kodieren, beträgt nur etwa 5 % des Gesamtgenoms (GEORGES & MASSEY, 1991). Jedes Individuum trägt eine väterliche und mütterliche Kopie, deren DNA-Gehalt im Normalfall identisch ist, die aber Unterschiede in den Genen (Allele) aufweisen können. Von den bei Säugern angenommenen 40000 bis 50000 Genen (HATTORI et al., 2000) werden etwa 5000 bis 15000 Gene je Zelle gleichzeitig exprimiert (LIANG & PARDEE, 1992). Die kleinstmögliche Einheit des Genoms, bezogen auf Mutation und Rekombination, ist das individuelle Nukleotidpaar der DNA. Diese Nukleotide sind in einer definierten linearen Ordnung zu größeren funktionellen Einheiten wie Genen oder Strukturelementen im Genom angeordnet (RIEGER et al., 1976; SCHWERIN,1992). Die erste Definition des Genbegriffs formulierte 1909 Wilhelm Johannsen. Wesentlich klarer wurde diese Definition durch BEADLE & TATUM (1941): Ein Gen ist eine Sequenz in der genomischen DNA, die für ein Protein kodiert ('die Ein-Gen-Ein-Enzym-Hypothese'). Diese Definition bedarf heute einiger Ergänzungen und sie gilt nicht für alle Gene. So gehören zu einem Gen auch solche Sequenzen, die als 'Signale' seine Transkription (Expression)
regulieren. Diese 'Signale' können weit vom eigentlichen Gen entfernt liegen. Beispielsweise beginnt die Transkription der mRNA schon vor dem Start-Triplett (als Führungssequenz für die Anheftung der Ribosomen an die mRNA) und endet erst hinter dem Stop-Triplett (in Form einer Schwanzsequenz für das 'mRNA-processing'). Diese Bereiche umfassen den Transkriptionsinitiationsort (auch 'cap site' genannt) und den Transkriptionsterminationsort (auch 'poly-A site' genannt) (NICHOLAS, 1996; Portin, 1993). Ein exprimiertes Gen wird als 'aktiv' bezeichnet. Es transkribiert aber nicht selbst. Es wird vielmehr transkribiert (SCHWERIN, 2000). Gene höherer Organismen bestehen mit wenigen Ausnahmen aus einem mosaikartigen Muster von kodierenden und nichtkodierenden Sequenzen, die als Exons ('expressed regions') und Introns ('intragenetic regions') bezeichnet werden. Die primäre Genexpression unterliegt durch diesen Aufbau einer gewissen Variabilität. Diese Variabilität beinhaltet das differentielle Prozessieren von Genen durch die z.B. unterschiedliche Auswahl von Exons in Abhängigkeit vom Entwicklungsstand des Organismus oder wechselnden Umweltbedingungen. Gene können auch infolge von Mutationen in mehreren Varianten auftreten. Bei den Eukaryoten ist das strukturelle Gen länger als die mRNA, die in die Translation eingeht. Die originale primäre mRNA enthält die bereits erwähnten Introns, die herausgespleißt werden, so daß nur die Exons die mRNA bilden, die in das Protein umgeschrieben wird (NICHOLAS, 1996; DIBB,1993; PORTIN, 1993; HESKETH et al.,1998). Dieses Prozessieren kann für das selbe Gen unterschiedlich erfolgen, so daß die endgültigen mRNAs unterschiedlich kodierende Sequenzen enthalten können, die folglich differente Proteine erzeugen. Es können aber auch ineffiziente oder sogar funktionslose mRNAs entstehen (GARRETT et al., 1989). AMARA et al. beschreiben 1982 dieses alternative Prozessieren anhand des Calcitoningens. Dabei entstehen aus einem primären RNA-Transkript des Calcitoningens verschiedene mRNAs, die zum einen für das Hormon Calcitonin kodieren und zum anderen für das 'Calcitonin Gen-Related Peptid' (CGRP). Die Calcitonin-mRNAs dominieren in der Schilddrüse, während die CGRP-spezifischen mRNAs im Hypothalamus zu dominieren scheinen. Diese Beobachtungen führten AMARA et al.
(1982) zur Darstellung eines Modells, in dem die entwicklungsbedingte Regulation des mRNA-Prozessierens genutzt wird, um die Vielfalt der neuroendokrinen Genexpression zu erhöhen.
Vereinfachend zusammengefaßt ist ein Gen der Abschnitt auf dem DNA-Strang, der für die Bildung der primären Transkripteinheit essentiell ist. Dazu gehören der nichttranskribierte 5'- Promotorbereich, die transkribierten, aber nicht translatierten 5'-und 3'-Bereiche (UTR) und
der eigentliche transkribierte Strukturgenbereich, der aus den translatierten Exon- und den nicht-translatierten Intron-Regionen besteht (SCHWERIN, 2000).
Als sekundäre Genwirkung bezeichnet man die Wirkung, die das Protein im Zusammenspiel aller physiologischen Prozesse entfaltet. Sie umfaßt die Stoffwechselprozesse, wie Bildung komplexer Proteinstrukturen aus verschiedenen Untereinheiten, enzymatische Wirkungen von Proteinen, komplexe Wirkung und Wechselwirkung von Metaboliten etc., die nach Synthese der primären Genprodukte die Merkmalsausprägung signifikant beeinflussen. Ihre Analyse ist sehr kompliziert. Das ist bedingt durch den Status des zellulären und entwicklungsbedingten Stoffwechsels, die große Anzahl von Interaktionen der Gene untereinander sowie durch den Einfluß von Umweltfaktoren (RIEGER et al., 1976 ).
1.2. Genvarianten und phänotypische Merkmalsausprägung
Der Phänotyp eines Organismus besteht aus der Gesamtheit seiner sicht- bzw. meßbaren Merkmale, die durch die Wirkung des Genotyps des betreffenden Organismus sowie dessen Wechselwirkung mit der Umwelt, in der sich der Organismus befindet, ergeben. Der Genotyp legt die Reaktionsnorm fest, mit der ein Organismus auf seine Umwelt reagieren kann. Aus diesem Grund können Variationen (Polymorphismen) des genetischen Materials zu unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen bzw. unterschiedlichen Graden der Merkmalsausprägung führen. Verschiedene Zustandsformen des gleichen Gens, die zu unterschiedlicher Merkmalsausprägung führen, heißen Allele. Sie beanspruchen in homologen Chromosomen den gleichen Platz in der Kopplungsgruppe (Genlocus) und unterscheiden sich von anderen Allelen auf diesem Locus durch eine oder mehrere Mutationen. Für DNA-Sequenzpolymorphismen in der gesamten genomischen DNA gibt es experimentell begründete Schätzungen, die auf Häufigkeiten von 0,001 bis 0,002 hinauslaufen (KAZAZIAN et al., 1983; VOSBERG, 1991). GEORGES et al. (1987) schätzten die Polymorphismushäufigkeit beim Rind auf 0,0007.
Der Organismus, der das veränderte Gen trägt, heißt Mutant. Der Organismus, der das normale (unveränderte) Gen enthält, wird als Wildtyp (Z+) bezeichnet (LEWIN,1997;
NICHOLAS,1996; PORTIN, 1993).
Ursache von DNA-Varianten sind Mutationen innerhalb der Nukleotid-Sequenz, die nicht durch DNA-eigene Reparaturmechanismen erkannt oder bereinigt werden konnten. Sie treten mit unterschiedlicher Frequenz innerhalb einer Familie oder Population auf (GEORGES &
MASSEY,1991). Diese auftretenden Veränderungen, meist Einzelbasenpaarpolymorphismen (Punktmutationen: Transition, Transversion) oder Formen von Insertionen, Deletionen oder Duplikationen von einem oder mehreren Nukleotiden, sind in der Lage, Qualität und Menge des Genproduktes zu beeinflussen. Im Strukturgen auftretend, sind sie Ursache vieler Erbkrankheiten oder monogen vererbter Merkmalsvarianten. Durch die veränderte Nukleotidsequenz im kodierenden Bereich kann es zu einer veränderten Aminosäuresequenz und damit zu einem veränderten sterischen Verhalten der Proteine - oft verbunden mit der Änderung der physikalisch chemischen Eigenschaften - kommen.
Durch die enormen Fortschritte in der Genomanalyse, insbesondere beim Menschen, sind auch beim Nutztier eine Vielzahl von merkmalsassoziierten Genvarianten beschrieben worden.
So führt, als gut bekanntes Beispiel beim Rind, eine A/G-Transition an der Aminosäureposition 128 des ß2-Integringens zu der folgenschweren Erkrankung BLAD ('Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency'), die eine Immunabwehrschwäche bei homozygot betroffenen Tieren erzeugt. Diese sind dadurch von chronischen Entzündungen betroffen und bleiben in ihrer Entwicklung zurück (KEHRLI et al., 1990).
Beim Schwein fanden Mickelson et al. 1990 eine Beziehung zwischen dem autosomal rezessiv vererbbaren Maligne Hyperthermiesyndrom (MHS) und dem Ryanodinrezeptor. Sie konnten nachweisen, daß es nach Streßeinwirkung zum unkontrollierten Kalziumionenaustritt aus dem sarkoplasmatischen Retikulum der Muskelzellen kommt. Die Erhöhung der Kalziumionenkonzentration im Zytoplasma löst die Aktivierung der Proteinkinase C aus und die Zelle wird einer Reizung unterworfen. Die Folge dieses übermäßigen Reizes bedingt bei homozygoten Anlageträgern eine erhöhte Sterblichkeit oder führt zur postmortalen Erscheinung des PSE-Fleisches ('pale-soft-exsudate) mit stark geminderter Qualität. FUJII et al. gelang 1991 der Nachweis der kausalen Punktmutation an der Position 1843 (C/T- Transition) des Ryanodinrezeptorgens (RYR1) und damit die Bildung der Basis für die Entwicklung eines gendiagnostischen Tests zur züchterischen Bekämpfung dieses Syndroms.
In der folgenden Tabelle 1 werden die Genvarianten für Rind und Schwein zusammengefaßt, die im Zusammenhang mit der Merkmalsausprägung von besonderer Bedeutung sind und für die gendiagnostische Tests zur Verfügung stehen.
Tab. 1: Genvarianten beim Rind und beim Schwein, die im Zusammenhang mit der Merkmalsausprägung Bedeutung haben und für die gendiagnostische Tests zur Verfügung stehen
(*)siehe Abkürzungsverzeichnis) A) Tierart: Rind
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest *) Referenz
Milch- protein- gehalt,
Milchverar- beitungsei- genschaften:
Gerinnungs- zeit
Bruchfestig- keit
BB>AB>AA
AC>BC>AE
=AA>AB>
BB>BE
BB/BC (fest) AA/AE/BE (weich)
N-Casein, (CSN3)
Allel B/C: Pos.418- C/T-Transition Allel B/C: Pos.454- A/C-Transition
Allel C: Pos.301-A/G- Transition
Allel G/H: Pos.415- T/G-Transition
Allel G: Pos.300-T/C- Transition
Allel F: Pos.40-A/C- Transition
Allel E: Pos.474- G/A-Transition
Southern-RFLP:
Allele A,B PCR-RFLP:
Allele A,B,C PCR-SSCP:
Allele
A,B,C,E,F,G,H
LEVEZIEL et al.
(1988);
MEDRANO &
AGUILLAR- CORDOVA (1990);
SCHLIEBEN (1991);
PRINZENBERG et al. (1999)
Milch- menge
AA<BB<AB Prolaktin- gen
RFLP Allele: A,B
COWAN et al.
(1990) Rotfaktor Braunfärbung
bei Deutschen Holstein, geringere Allergenität
Bovine Melanocyte Stimulating Hormone Receptor- Gen (b-MSHR)
Deletion (BTA18)
SSCP
PCR-RFLP
KLUNGLAND et al.
(1995);
JOERG et al. (1996);
BLAD (Bovine Leukozyten Adhesion Deficiency)
Immun- schwäche- krankheit, Kümmerer, chron. Ent- zündungen
ß2-
Integringen (CD 18 Gen)
A/G-Transition (AS- Pos.128)
PCR-RFLP KEHRLI et al. (1990)
Myophos- phorylase- Defiziens (Charolais)
Dehydra- tation, Elektrolyt- imbalance
Myo- phospho- rylase Gen
Punktmutation (AS- Pos.489)
PCR-RFLP BILSTROM et al.
(1998)
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest Referenz
Muskelhy- pertrophie
Muskel- masse- zunahme um 20 %;
Doppellen- digkeit
Myostatin Gen (mh)
11 bp Deletion (Pos.821[de11]) 10 bp Insertion/17 bp Deletion (Pos.419[de17- ins10])
Pos.610 C/T-Transition Pos.676 G/T-
Transversion
Pos.938 G/A-Transition
Mikrosatelliten PCR-RFLP
FAHRENKRUG et al. (1999);
GROBET et al.
(1998)
DUMPS (Deficiency of Uridine Mono- phosphatat Synthase)
früher embryonaler Tod
Uridin Mono- phosphat- Synthase Gen
C/T-Transition (AS- Pos.405)
PCR-RFLP BARENDSE et al.
(1993);
SCHWENGER et al.
(1993)
D-Manno- sidose
Enzym- mangel, Ataxie, Aggressivität, Paralyse, Tod
D-Mannosi- dase Gen
G/A-Transition (Galloway)
T/C-Transition (Angus, Brangus)
PCR-RFLP BERG et al. (1997);
HEALY (1996)
ß-Manno- sidose
Enzym- mangel
ß-Mannosi- dase Gen
RFLP CHEN et al. (1995)
BSE (Bovine Spongiforme Encephalo- pathie)
ZNS- Symptome, Tod
Prion Protein Gen (PrP)
Mikrosatelliten SCHLÄPFER et al.
(1999)
Citrullin- ämie
Tod spätestens 5 Tage p.p.
Arginin- succinat- synthase Gen
C/T-Transition (AS- Pos.86)
PCR-RFLP DENNIS et al. (1989)
MSUD (Maple Syrup Urine Disease) bei Shorthorn &
Hereford
ZNS- Symptome, Tod in ersten Lebens- wochen
'Brached Chain Keto Acid'- Dehydrogen ase Gen
T/C-Transition (AS-Pos.
6)
PCR-RFLP ZHANG et al. (1990)
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest Referenz
Kongenitale Hypo- thyreose, beim Afrikander
Kropfbil- dung
Thyro- globulingen
C/T-Transition (AS-Pos.
697)
PCR-RFLP RICKETTS et al.
(1987)
Sphero- zytose
Anämie, Wachstums- störungen
Erythro- zyten-Band- 3-Protein Gen
C/T-Transition PCR-RFLP INABA et al. (1996)
Glycogen- speicher- krankheit V
Muskel- glycogen- stoffwechsel- störungen
Glycogen- phospho- rylase Gen
RFLP TSUJINO et al.
(1996)
Roan, White Heifer Disease (Shorthorn
& Weiß- Blaue- Belgier)
weißer Farb- phänotyp, Anomalien des weiblichen Genitaltraktes
Mammary Gland Factor;
STAT5a (MGF Gen)
AS-Austausch von Alanin zu Asparagin
PCR-RFLP SEITZ et al. (1999)
Dermato- sparaxie / Ehlers- Danlos;
ähnlich Ehlers- Danlos (Mensch)
höhere Ver- letzlichkeit der Haut, überstreck- bare Gelenke, Blutungsnei- gung steigt, Netzhaut- ablösungen
Prokollagen I-Proteinase Proteo- glycan
Deletion Transition
PCR-RFLP PCR-RFLP
COLIGE et al.
(1999);
TAJIMA et al. (1999)
B) Tierart: Schwein
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest Referenz
Fleisch- qualität
Variationen des intramus- kulären Fett- gehaltes
'Heart Fatty Acid Bind- ing Protein' (H-FABP)
RFLP GERBENS et al.
(1997)
Fleisch- qualität bei Duroc
Variationen des intramus- kulären Fett- gehaltes
'Adipocyte Fatty Acid Binding Protein'
Mikrosatellit im ersten Intron
GERBENS et al.
(1998)
Maligne Hyper- thermie- Syndrom (MHS)
Stress- anfälligkeit
Ryanodin- rezeptorgen (RYR1)
C/T-Transition (Nukleinsäure-Pos.
1843)
PCR-RFLP, PCR-SSCP
FUJII et al. (1991);
BRENIG et al.
(1992);
NAKAJIMA et al.
(1996) Fleisch-
qualität beim Hampshire
erhöhter Glykogen- gehalt im Fleisch, verminderte Verarbei- tungseignung für Koch- schinken- herstellung
AMP- aktivierte Protein- kinase F3- noncatalytic subunit (PRKAG3 Gen)
Substitution (R200Q) (AS-Pos. 200)
OLA, PCR- RFLP
MILAN et al. (2000)
Frucht- barkeit
Variationen in der Wurfgröße
'Retinoic Acid Receptor J' (RARG)
RFLP MESSER et al.
(1996a);
MESSER et al.
(1996b) Frucht-
barkeit
Variation in der
Wurfgröße, homozygot vorteilhaftes Allel (1,5 mehr Ferkel je Wurf)
'Follicle Stimulating Hormone', ß-
Polypeptid (FSHB)
RFLP ZHAO et al. (1998);
LI et al. (1998)
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest Referenz
Hautfarbe weiße Haut- färbung, Sattel- ausprägung
Mast- stammzell Wachstums -faktor- rezeptor (KIT Gen)
Duplikation des KIT Gen
quantitative PCR JOHANSSON MOLLER et al.
(1996)
. Hautfarbe schwarze
Hautfärbung, ausgeprägte Pigmentation
Melano- cortin Rezeptor1- Gen (MC1R)
PCR-RFLP, SSCP
KIJAS et al. (1998)
Wachstum, Fettansatz, Futterauf- nahme
Variationen bei Merk- malen wie Wachstum, Fettansatz, Futter- aufnahme
Melano- cortin Rezeptor4- Gen (MC4R)
PCR-RFLP KIM et al. (2000)
Schlacht- körperzu- sammen- setzung bei Large White, Piétrien, Wildschwein
Variationen im Muskel- und Fettansatz
Insulin-Like Growth Faktor 2 (IGF2 Gen)
Nukleinsäure-Pos. 241 polymorph
OLA,
Mikrosatelliten
NEZER et al. (1999);
JEON et al. (1999)
Oedem- krankheit und Ferkel- diarrhoe bei Schweizer Landrasse, Edel- schwein, Hampshire, Duroc, Piétrain
Anfälligkeit für
Ödemkrank- heit und Ferkel- diarrhoe F18
Fucosyl- transferase 1
(FUT1- Gen)
G/A-Transition (AS- Pos. 307)
PCR-RFLP VÖGELI et al.
(1996);
MEIJERINK et al.
(1997)
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest Referenz
Frucht- barkeit
Variation der Wurfgröße, homozygot vorteilhaftes Allel 0,5 Ferkel mehr je Wurf bei synthetischer Linie (50 % Meishan- anteil)
Retinol Binding Protein 4 (RBP4)
PCR-RFLP MESSER et al.
(1996c);
ROTHSCHILD et al.
(2000)
Frucht- barkeit
Variation der Wurfgröße, homozygot vorteilhaftes Allel 1,5 Ferkel mehr je Wurf bei synthetischer Linie (50 % Meishan- anteil)
Östrogen- rezeptor Gen (ESR)
PCR-RFLP ROTHSCHILD et al.
(1996)
Frucht- barkeit
Variation der Wurfgröße, homozygot vorteilhaftes Allel 0,66 Ferkel mehr je Wurf (Edelschwein
& Landrasse, synthetische Linie Duroc x Edelschwein, synthetische Linie Meishan x Edelschwein
Prolactin- rezeptor Gen (PRLR)
PCR-RFLP VINCENT et al.
(1998)
Merkmal Phänotyp betroffenes Gen
beschriebene Mutation Gentest Referenz
Hyper- cholesterol- ämie
Cholesterol- überschuß im Blut
Low Density Lipoprotein Receptor (LDL- Rezeptor Gen)
Arginin zu Cystein (AS- Pos. 84)
SSCP HASLER-RAPACZ
et al. (1996);
HASLER-RAPACZ et al. (1998);
GRUNWALD et al.
(1999)
1.3. Umweltfaktoren und Merkmalsausprägung
Die Übersetzung der im Genotyp fixierten genetischen Prädisposition in den Phänotyp wird durch die Interaktionen des Genotyps mit der Umwelt signifikant beeinflußt.
Wie hoch die Anpassungsgrenze bzw. Leistungsfähigkeit eines Tieres ist, wird im wesentlichen durch seinen Genotyp mit den entsprechend vorteilhaften oder nachteiligen Genvarianten (Allelen) geprägt. Ob ein Gen oder eine Genvariante für seinen Träger von Vorteil oder Nachteil ist, hängt von dem Kontext ab, in den es integriert ist. Dazu gehören andere Gene genauso wie die äußere Umgebung (STROHMANN, 1995).
Unter dem Begriff Umwelt versteht man die Summe aller nichterblichen Einflüsse, denen ein Lebewesen ausgesetzt ist. Das Tier steht mit seiner Umwelt in vielfältigen Wechselbeziehungen. Hohe Leistungen in der tierischen Produktion können nur bei optimalen Umwelt-Organismus-Beziehungen und weitgehender Ausschaltung von Überbelastungen und Erkrankungen erzielt werden. Dies zeigt sich insbesondere bei quantitativen Merkmalen (Leistungsmerkmale), wie z.B. Milchmenge, Fettprozentwert in der Milch, Fleischansatz, Futterverwertung aber auch bei den funktionalen Merkmalen wie Tiergesundheit. Diese sind zwar in jedem Individuum mit einem bestimmten genetischen Potential festgelegt, dessen Ausschöpfung aber in der Gestaltung der direkten Umwelt liegt (MOTHES, 1984; SIGUSCH, 1985). Treten Umweltfaktoren als Überbelastungen für den Organismus auf, dann ist ein Leistungsabfall zu erwarten. Die Belastbarkeit ist von der Anpassungsfähigkeit abhängig.
Überbelastung führt zur Überschreitung der Adaptationsmöglichkeiten und damit zur Krankheit (SIGUSCH, 1985). Von besonderer Bedeutung für die Leistungsfähigkeit sind die Faktoren Temperatur, Licht, Luft und Ernährung.
Temperatur: Viele im Tierkörper in vivo ablaufende biochemischen Prozesse sind temperaturabhängig. Im Ergebnis jeglicher tierischer Leistung entsteht wiederum Wärme. Für die Konstanz der Körpertemperatur haben warmblütige Nutztiere einen Temperatur- regelmechanismus. Sie besitzen einen Wärmeschutz (u.a. Haare, Federn, Schweißdrüsen), der der Umgebungstemperatur phylogenetisch angepaßt ist. Die Umgebungstemperatur hat einen entscheidenden Einfluß auf die Futterausnutzung und damit auf die tierische Leistung (EICHEN et al.,1997). Beim Rind führen hohe Umgebungstemperaturen (21°C-24°C) zur Senkung der Milchmengenleistung, des Fettgehaltes und des Eiweißgehaltes der Milch. In dem Bestreben, die Körpertemperatur konstant zu halten, hechelt das Rind (es entsteht Verdunstungskälte), wodurch es zu einer verringerten Futteraufnahme kommt (SIGUSCH, 1985). Bei der Ausbildung des Akromelanismus, beispielsweise beim Russenkaninchen und der Siamkatze, hat die Temperatur einen ursächlichen Einfluß. Es handelt sich hierbei um einen Teilalbinismus, der autosomal rezessiv vererbt wird. Das kupferhaltige Enzym Tyrosinase (Katalysator der Tyrosinoxidation) funktioniert nur bzw. besser bei niedrigen Temperaturen, d.h. bei Temperaturen unterhalb der Körpertemperatur (15°C-25°C). Über 25°C wächst die Affinität des Enzyms zu einem Tyrosinaseinhibitor, folglich besteht bei 37°C eine feste Bindung. Bei niedrigeren Körpertemperaturen (u.a. an Ohren und Gliedmaßenenden) kann die Melaninsynthese erfolgen und führt entsprechend zur Pigmentierung an diesen Körperstellen (KIDSON & FABIAN, 1981).
Licht: Der Lichtfaktor (weißes Licht) hat einen erheblichen Einfluß auf die Fortpflanzung, Milch- und Fleischleistung, die Krankheitsresistenz sowie als Zeitgeber. Über Sinneszellen in der Haut und im Auge wird das Hypothalamus-Hypophysen-System des Organismus aufgrund der Belichtungszeit und Lichtintensität beeinflußt (AVENDANO et al., 1997). Die Körperfunktionen folgen einer zirkadianen Rhythmik und zirkannualen Periodik, auf die durch Änderung der Lichteinwirkungszeit und –intensität Einfluß auf Fortpflanzungs- leistungen und die Stoffwechselaktivität genommen werden kann.
Luft: Die Luftbewegung wirkt, wenn sie in Form von Zugluft (einseitig, niedrig temperiert, hohe Geschwindigkeit) auftritt, gesundheitsmindernt. Gleiches gilt für ungünstige Gasverhältnisse (hohe Konzentration an Schadgasen) in der umgebenden Luft, für deren übermäßigen Gehalt an Staub, zu hohe Schalleinwirkungen und im besonderen für alle biotischen Faktoren mit pathogener Potenz wie bei einer Vielzahl von Bakterien, Viren und Ekto- und Endoparasiten (SIGUSCH, 1985).
Ernährung: Die Ernährung der landwirtschaftlichen Nutztiere beeinflußt deren Gesundheit und Leistungsfähigkeit im funktionellen Zusammenhang mit dem Intermediärstoffwechsel (SIGUSCH, 1985). Besonders deutlich wird der Einfluß der Ernährung im Antagonismus zwischen Gesundheits- und Fruchtbarkeitsdepression bei hoher Milchleistung der Milchkühe.
Dies steht in enger Verbindung mit der Frage nach der physiologisch kritischen Leistungsgrenze vor dem Hintergrund des Futteraufnahmevermögens bzw. der Energie- versorgung bei hoher Milchleistung, insbesondere in den ersten sechs Laktationswochen.
Dabei verweist u.a. LOTTHAMMER (2000) auf den Umstand, daß die Energiekonzentration des Futters für das Rind (hoher Rohfaserbedarf für die Pansenfunktion) im Gegensatz zum Schwein, nicht beliebig erhöht werden kann (Gefahr der Pansenazidose). In diesem Zusammenhang ist die deutlich negative Beziehung zwischen der Jahresleistung in Milch-kg und der Fruchtbarkeit sowie Stoffwechselstörungen zu sehen (NEBEL et al., 1993; MARTI &
FUNK, 1994; EICKER et al., 1996; MARKUSFELD et al., 1997; LOTTHAMMER, 2000).
Aber auch die Ernährungsqualität und die Futterinhaltsstoffe (u.a. Wachstumsfaktoren im Kolostrum) nehmen Einfluß auf die metabolischen und endokrinen Merkmale bei neugebo- renen Kälbern (STEINHARDT et al., 2000; HAMMON & BLUM, 1998a,b; BLUM et al., 1997). So beeinflußt die Proteinqualität der Milch oder des Milchersatzes die Adaptation der Verdauungsorgane, die rhythmisch motorische und sekretorische Aktivität und die Plasmakonzentrationen der die Darmfunktion regulierenden Peptide (NARANJO et al., 1997;
ZABIELSKI et al., 1998; LE HUEROU-LURON et al., 1998; STEINHARDT et al., 2000).
Bei einer weitergehenden Einflußnahme der juvenilen Ernährung auf die physiologische Konstitution der adulten Individuen bis hin zu altersbedingten Stoffwechselstörungen spricht man in der humanen Ernährungsforschung von einem 'Metabolic Programming'. Die konsumierte Nahrung während der ersten Lebenswochen und –monate kann einen permanenten Einfluß auf den Stoffwechsel und die Gesundheit sowie auf die Körper- komposition des Adulten haben. Dabei haben männliche und weibliche Individuen unterschiedliche Empfindlichkeiten auf die ernährungsbedingte Programmierung (KOLETZKO et al.,1998; ROBERTS & MCDONALD, 1998). So werden u.a. die Nervenentwicklung und die Knochenmineralisierung im mittleren Kindesalter nachweislich durch die perinatale Ernährung geprägt (LUCAS, 1998). Auch beim Tier konnte STEINHARDT et al. (2000) an Kälbern zeigen, daß außer den genetischen Faktoren, kausal die Aufnahme einer entsprechenden Milchmenge und die in der Milch enthaltenen Stoffe (Wachstumsfaktoren, Erythropoetin, Hormone) für Entwicklungsdifferenzen in späteren Lebensabschnitten in Betracht zu ziehen sind.
HESKETH et al. fassen 1998 den nachhaltigen Einfluß der Ernährung auf die Genexpression und das Verständnis der Interaktion zwischen Nährstoffen und Genexpression zusammen. So können die Effekte der Ernährung auf vielen Stufen zwischen der Transkription und der Produktion des funktionellen Proteins zum Tragen kommen. Die Nährstoffe selbst können auf die Genexpression durch Kontrolle regulatorischer Signale in untranslatierten Bereichen des Gens oder durch Einfluß auf zur Genexpression führender Signalkaskaden einwirken. Eine adäquate Diät (gleicher Anteil an Hauptnährstoffen und Zusatzstoffen), gefüttert an zwei unterschiedliche Individuen oder das gleiche Individuum unter anderen Umständen, kann zu unterschiedlichen metabolischen oder klinischen Auswirkungen führen (HESKETH et al., 1998).
Eine Voraussetzung für die gezielte Untersuchung von Gen-Gen- oder Gen-Umwelt- Wechselwirkungen ist die Kenntnis der an der Wechselwirkung beteiligten genetischen Variation.
2. Identifizierung merkmalsassoziierter genetischer Variation
Allgemein wird erwartet, daß mit der Kartierung und Identifizierung wirtschaftlich bedeutsamer Merkmalsloci ('quantitative trait loci', QTL) und der Anwendung dieses Wissens im Rahmen der markergestützten Selektion eine weitere Steigerung des Zuchtfortschrittes erreicht werden kann, insbesondere durch eine höhere Selektionsgenauigkeit bzw.
Selektionsintensität oder durch Reduzierung des Generationsintervalls.
Grundsätzlich sind hierzu zwei Schritte notwendig:
- die Lokalisierung bzw. Identifizierung der Loci, welche das interessierende Merkmal beeinflussen (QTL) und
- die züchterische Bearbeitung dieser QTL.
Im Zusammenhang mit der Identifizierung der an der Merkmalsausprägung beteiligten genetischen Variation kommen grundsätzlich zwei Ansätze der Genomanalyse zur Anwendung: der Marker- und der Kandidatengenansatz.
Der Markeransatz wird auch als 'umgekehrter genetischer Ansatz' bezeichnet, da nicht vom Genprodukt als solchem ausgegangen wird, sondern von DNA-Varianten, den sogenannten DNA-Markern. Als DNA-Marker werden Polymorphismen der Erbanlagen mit bisher
unbekannter Funktion, aber bekannter Position auf den Chromosomen bezeichnet, die an die Nachkommen weitervererbt werden und dabei diese Position in der Erbsubstanz, einschließlich aller in diesem Bereich lokalisierten, aber unbekannten merkmalsbeeinflussenden Genorte markieren und im Erbgang verfolgen lassen (NICHOLAS, 1996).
Die sogenannte ‚repetitive DNA' stellt eine wesentliche Quelle genetischer Variation dar und eignet sich dadurch als genetischer Marker. In einer groben Einteilung gibt es zwei Arten dieser repetitiven DNA: 'dispersed-sequence'-Elemente und 'tandem repeats'. 'Dispersed- sequence'-Elemente werden nach ihrer Länge als 'long interspersed elements' (LINEs) - mehr als 1000 Basenpaare lang - und 'short interspersed elements' (SINEs) - kürzer als 500 Basenpaare lang - klassifiziert. Die SINE's des Rindes zeigen keine Ähnlichkeit zu denen des Schweins (LENSTRA et al., 1993). Die Funktion dieser Elemente ist noch weitgehend ungeklärt (SINGER, 1982). 'Tandem repeats' sind Tandemwiederholungen eines definierten Sequenzmotivs in Kopf-zu-Schwanz-Anordnung. Auf Grund des wiederholten Auftretens ein und desselben Sequenzmotivs an einem Genort, werden diese Sequenzen auch als Satelliten bezeichnet. Es existieren große Unterschiede sowohl in der Länge als auch in der Anzahl der Wiederholungen, die eine Einteilung in Makro-, Midi-, Mini- und Mikrosatelliten zulassen (GEORGES & MASSEY, 1991). Die Zahl der Tandem-Kopien innerhalb der Satellitenloci variiert in einem solchen Maße, daß mit Satellitensequenzen als DNA-Sonden stets hochvariable Fragmentmuster erhalten werden, was sie zu einer wertvollen Quelle hochinformativer genetischer Marker auch in der Nutztierzucht macht (SCHWERIN, 1992).
Minisatelliten umfassen eine Motivlänge von 10-60 Basenpaaren (JEFFREYS et al., 1985), während Mikrosatelliten 1-5 Basenpaare als Motiv besitzen (TAUTZ, 1989). HILBERT et al.
(1989) verweisen auf den hohen Informationsgehalt von Minisatelliten. Die Variation der Wiederholungsanzahl ist extrem polymorph und mit einem Heterozygotiegrad von mehr als 90 % charakterisiert. RICHARDSON et al. (1986) stellen fest, daß ungefähr 30 % des bovinen Genoms aus repetetiven Elementen besteht.
Solche genetischen Marker können genutzt werden, um z. B. QTL zu lokalisieren, wenn eine relativ enge Kopplung zwischen dem Marker und dem QTL besteht. Dazu sind neben möglichst vollständigen Markerkarten, d. h. verfügbare genetische Marker, die möglichst dicht das gesamte Genom abdecken, (BARENDSE et al., 1997; BISHOP et al., 1994;
FERRETTI et al., 1997) entsprechende informative Familien notwendig. In solchen Familien wird dann die Vererbung von Markern und QTL analysiert. Bei paralleler Vererbung (Kosegregation) kann gefolgert werden, daß beide Loci eng gekoppelt sind und über die
Weitergabe der Markerallele Informationen über die Vererbung, z. B. der QTL-Allele oder des Erbdefektes, gewonnen werden können.
Der zweite Ansatz, der Kandidatengenansatz, wird in der Regel für monogen bzw. majorgen beeinflußte Merkmale angewendet. Kandidatengene sind Gene, die für Schlüsseleiweiße der Merkmalsausprägung kodieren. Bei diesem Ansatz werden Prozesse analysiert, von denen man vermutet, daß sie in die Merkmalsausprägung involviert sind und auf mögliche Schlüsseleiweiße untersucht. Die entsprechend kodierenden Gene werden als potentielle Kandidatengene auf merkmalsassoziierte Varianten überprüft (SCHWERIN et al., 1995;
BOVENHUIS, 1999).
Kandidatengene erlauben, wenn die Effekte ihrer Varianten bekannt sind, in der markergestützten Selektion (MAS) eine größtmögliche Genauigkeit beim Selektionsentscheid und dadurch eine hohe Selektionsintensität bzw. eine Reduzierung des Generationsintervalls (GEORGES & MASSEY, 1991; SCHWERIN et al., 1995; BOVENHUIS, 1999). Die Identifizierung der Genvarianten erfolgt in den meisten Fällen mittels PCR/RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Testverfahren ( KEHRLI et al., 1990; DENNIS et al., 1989;
SCHWENGER et al., 1993; ZHANG et al., 1990; RICKETTS et al., 1987; INABA et al., 1996; CHEN et al., 1993; GROBET et al., 1997; JOERG et al., 1996; MEDRANO, 1990).
Man unterscheidet funktionelle und positionelle Kandidatengene. Während es sich bei den positionellen Kandidatengenen um Gene handelt, die sich physisch im Bereich kartierter QTL befinden, stellen funktionelle Kandidatengene solche Gene dar, von denen bekannt ist, daß ihre Produkte signifikant an der Merkmalsausprägung beteiligt sind (SCHWERIN, 2000).
2.1. Positionelle Kandidatengene
Voraussetzung für die Identifizierung potentieller positioneller Kandidatengene sind neben der Kenntnis kartierter QTL-Regionen möglichst hochauflösende Genkarten. Im Bereich identifizierter QTL-Regionen beim Nutztier können durch die Erstellung integrierter Genkarten (aus genetischer und physischer Genkarte) Gene identifiziert werden, die in diesem Genombereich lokalisiert sind und aufgrund ihrer Position Kandidatengene für das mit dem entsprechenden QTL beschriebene Merkmal sind.
Der positionelle Kandidatengenansatz führte u.a. zur Entdeckung des 'Muskelhyper- trophiegens' (Myostatin) als Ursache für das Merkmal 'Doppellender' bei Rindern der Rassen Weißblaue Belgier sowie Piemontese (GROBET et al., 1997). Bereits 1995 war von
GEORGES et al. der entsprechende QTL auf BTA 2 kartiert worden. Diese Gruppe nutzte die Informationen der physischen Genkarte des Menschen, um im zum BTA2 homologen Chromosomenbereich HSA2 potentielle Kandidatengene, wie das Myostatingen, zu identifizieren. Sie fanden, daß die Position des Myostatingens der humanen Genkarte exakt mit dem 'Muskelhypertrophiegen' der bovinen Genkarte übereinstimmt. Für das Doppellender-Gen konnte eine inaktivierende Mutation, eine 11-Basenpaardeletion, nachgewiesen werden, die dazu führt, daß das Protein das normale Muskelwachstum nicht mehr einschränken kann (DICKMANN, 1997).
Mit dem gleichen Ansatz erfolgte beispielsweise die Entdeckung des sogenannten 'Kochschinkengens' der Schweinerasse Hampshire (MILAN et al., 2000). Ein großer Anteil dieser Rasse trägt die dominante RN--Mutation. Diese Mutation hat einen positiven Einfluß auf den Muskelansatz, aber einen negativen Effekt bezüglich der Verwendbarkeit des Muskelfleisches in der Kochschinkenherstellung. Diese negativen Verarbeitungseigen- schaften sind auf einen 70 % igen Anstieg des Muskelglycogengehaltes im Muskel bei RN- (RN-/rn+ oder RN-/RN-) –Tieren zurückzuführen. Der verantwortliche RN-Locus konnte bereits 1996 (MILAN et al., 1996) dem SSC 15 zugewiesen werden. Im folgenden wurde eine BAC-Bibliothek untersucht, um ein 'Contig' der RN-Region zu erstellen. Die BAC-Klone wurden zur Erzeugung von Markern (Mikrosatelliten und SNPs) genutzt, mit deren Hilfe eine hochauflösende Karte erstellt wurde. Für die Kartierung nutzte man ein porcines RH- (Radiaton-Hybrid) Panel. Zwei Marker des BAC-Klones 127G6 grenzten schließlich die interessierende RN--Region ein, die durchsequenziert wurde. Eine von drei kodierenden Sequenzen zeigte im Homologievergleich Ähnlichkeit mit der humanen AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) J-Untereinheit (PRKAG3) und der der Hefe (Snf4). Aktivierte AMPK fördert ATP-produzierende Stoffwechselwege und inhibiert ATP-verbrauchende Wege.
AMPK kann außerdem die Glycogensynthase hemmen. Expressionsuntersuchungen der PRKAG3 zeigten eine muskelspezifische Expression. Dieser Fakt bestätigt die Tatsache, daß RN--Tiere einen hohen Glycogengehalt im Muskel, aber nicht in der Leber haben. Es konnten insgesamt sieben SNPs ('single nucleotide polymorphism') in der vollständig untersuchten PRKAG3 entdeckt werden, aber nur die R200Q Substitution war mit dem gesuchten RN-- Bereich vergesellschaftet. Es konnte gezeigt werden, daß die AMPK-Aktivität dreimal höher in normalen rn+-Tieren gegenüber RN--Tieren war. Folglich ist R200Q die Mutation, die die AMP-Aktivierung sowie den Glycogenabbau hemmt. Es bleibt aber noch zu klären, ob die reduzierte AMPK-Aktivität möglicherweise eine Feedbackhemmung infolge des hohen Energiestatus des Muskels widerspiegelt (MILAN et al., 2000).
Dieses erfolgreiche sogenannte 'positional candidate cloning' beim Nutztier wurde erst möglich durch die enormen Fortschritte der Genomanalyse, insbesondere beim Menschen aber auch bei den Nutztieren. Das komparative 'positional candidate cloning' erfordert nicht nur präzise Angaben zur Region mit konservierter Syntänie bei der am besten untersuchten Spezies Mensch, sondern auch möglichst genaue Informationen zur Genanordung bei der Nutztierspezies selbst. Diese Informationen sind von großer Bedeutung innerhalb von Segmenten mit Syntänie (WOMACK et al., 1997). Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung des 'positional candidate cloning' sind deshalb hochauflösende integrierte physische und genetische Genkarten der einzenen Tierarten sowie komparative Genkarten.
2.1.1. Genetische und physische Genkarten
Die genetische Genkarte ist eine Kopplungskarte, die sich aus einer Auflistung gekoppelter Gene/DNA-Sequenzen oder auch Kopplungsgruppen in linearer Ordnung - entsprechend ihrer Rekombinationsfrequenz - gestaltet. Die Rekombinationsrate spiegelt die Häufigkeit des Auftretens einer ungeraden Anzahl von 'Crossing-over'-Ereignissen zwischen zwei Genorten wider. Da die Möglichkeit für einen 'Crossing-over' proportional zum Abstand beider Genorte ist, kann die Rekombinationsrate als Einheit der Chromosomenlänge verwendet werden. Die Längeneinheit ist ein Morgan [M]; ein cM entspricht einer Distanz zweier Genorte, die mit einer Rekombinationsrate von 1% übereinstimmt. Für die Erstellung von Kopplungskarten werden heute hauptsächlich Mikrosatelliten-Marker verwendet. Mikrosatelliten sind die am besten geeigneten polymorphen Marker für diese Anwendung und ermöglichen die Erstellung kompletter Kopplungskarten. Sie sind ebenfalls für die komparative Kartierung für eng verwandte Spezies anwendbar, da nachweislich vom Rind isolierte Mikrosatellitenmarker auch beim Schaf zu verwenden sind und umgekehrt. So kann zumeist die Kartenposition der einen Spezies für die andere vorhergesagt werden (MOORE et al., 1994). Genetische Genkarten des Rindes sind von BARENDSE et al. (1997), BISHOP et al. (1994), FERRETTI et al. (1997) sowie THOMSEN et al. (2000) publiziert worden.
Die physische Karte zeigt die Lokalisation eines Gens oder einer DNA-Sequenz auf seinem Chromosom an (NICHOLAS, 1996). Die physische Kartierung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Als Orientierungskoordinaten dienen zytogenetische Strukturen. Die kartierten DNA-Sequenzen können Chromosomen, Chromosomenregionen oder auch Chromosomenbanden oder -fragmenten zugeordnet werden.
Man nutzt die 'in situ' Hybridisierung, somatische Zellpanels (SCP) oder ‚radiation hybrid‘
(RH)-Panels. Die 'in situ' Hybridisierung ermöglicht die Sichtbarmachung einer Nukleinsäurensonde auf einem Zielgewebe, einer Zielzelle, auf Kernen und Chromosomen, so daß die Lage der Nukleinsäuresequenz festgelegt werden kann. Eine Form dieser Methode ist die Fluoreszens 'in situ' Hybridisierung (FISH), die Fluorochrome zur Sondenmarkierung und –detektierung nutzt (LEITCH et al., 1994).
Somatische Zellpanels sind Zelllinien von meist CHO ('chinese hamster ovary'), die verschiedene Chromosomen einer anderen Art enthalten. Es ist nur die Zuordnung zu einem gesamten Chromosom möglich (SCHULER et al., 1996; KWOK et al., 1996).
RH-Panels enthalten neben den Wirtschromosomen (z. B. vom Hamster) nur einzelne Chromosomenfragmente der zu untersuchenden Spezies, die mittels radioaktiver Strahlung erzeugt wurden. Die RH-Kartierung ist eine statistische Methode, die die Distanz zwischen DNA-Sequenzen in centiRad (cR) sowie deren Anordnung auf dem Chromosom festlegt (COX et al., 1990). Die Entwicklung des 5000 rad Rind-Hamster-RH-Panel (WOMACK et al., 1997) führte zur Möglichkeit der physischen Feinkartierung beim Rind. Die RH-Panels für andere Spezies umfaßten durchschnittlich höhere Auflösungen gegenüber den Rinder-RH- Panels. Es existiert ein 70 kb/cR7000 RH-Panel für Schweine (HAWKEN et al., 1999), ein 100 kb/cR3000 RH-Panel für Mäuse (VAN ETTEN et al., 1999), ein 166 kb/cR5000 RH-Panel für Hunde (PRIAT et al., 1998) und ein 106 kb/cR3000 RH-Panel für Ratten (WATANABE et al., 1999). Von REXROAD et al. (2000) sind die Kartierungsmöglichkeiten weiterhin durch die Erstellung eines 12000 rad Rinder-RH-Panels verbessert worden. Die Publikation von physischen Karten des Rindes erfolgte von EGGEN & FRIES (1995) und BAND et al.
(2000a). Eine wichtige Grundlage der hohen Leistungsfähigkeit der molekularen Genomanalyse ist die Möglichkeit, das Wissen über die Struktur und die Funktion von Genen über die Tierarten hinweg anzuwenden, was man sich u.a. auch bei der komparativen Kartierung zunutze macht (COLLINS et al., 1998).
2.1.2. Komparative Kartierung
Da alle Organismen aufgrund der gemeinsamen Evolution verwandt sind, kann das vergleichende Studium der Genomorganisation eines Organismus zu wertvollen Informationen über einen anderen führen. Die Molekulargenetik profitiert von der Möglichkeit, Gene einer bestimmten Spezies auf der Basis des Wissens über verwandte Gene einer anderen Art zu analysieren und zu verstehen. Der Vergleich weitläufig verwandter
