Evaluierung eines Modells der chirurgischen intestinalen Manipulation zur Darstellung der postoperativen Immunsuppression

1 Aus der Klinik für Chirurgie,

Abteilung für Allgemeine Chirurgie,

Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie (Direktor: Univ.- Prof. Dr. Heidecke) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Evaluierung eines Modells der chirurgischen intestinalen Manipulation zur Darstellung der postoperativen Immunsuppression

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der Universitätsmedizin

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 2012

vorgelegt von: Mathias Feuerherd:

geb. am: 04.09.1983

in: Berlin

2 Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar

1. Gutachter: Herr Prof. Dr. med. Stefan Maier 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. med. Otto Kollmar

Ort, Raum: Seminarraum Innere Medizin A, Neubau O, Sauerbruchstr., Raum 0.65 Tag der Disputation: 03.Dezember 2012

3 Für meine Eltern

4 1 Einleitung 7

1.1 Sepsis – ein anhaltendes klinisches und ökonomisches Problem ... 7

1.2 Sepsis Typ A und Sepsis Typ B ... 8

1.3 Das SIRS-CARS-Modell ... 8

1.3.1 Serumzytokine – Biomarker und Effektoren von SIRS und CARS ... 10

1.3.2 Die zellvermittelte Abwehr ... 12

1.3.3 Unterschiede in Abhängigkeit vom Insult ... 13

1.4 Tiermodelle zur Klärung der zugrundeliegenden Mechanismen ... 14

1.4.1 Trauma-Hämorrhagie und Laparotomie – Simulation klinischer Verläufe . ... 14

1.5 IMM ... 15

2 Fragestellung ... 16

3 Material ... 17

3.1 Laborgeräte ... 17

3.2 Verbrauchsmaterialien ... 18

3.3 3.3 Reagenzien und Chemikalien ... 19

3.4 Bakterien ... 21

3.5 Puffer und Lösungen ... 21

3.5.1 Arbeitslösung Myeloperoxidase – Färbung ... 21

3.5.2 Arbeitslösung RNAse (Propidiumiodid-Zellzyklus-Assay) ... 21

3.5.3 Arbeitslösung Propidiumiodid... 21

3.5.4 Avertin® - Stammlösung: ... 21

3.5.5 Avertin® - Gebrauchslösung (2,5%): ... 21

3.5.6 Erythrozyten – Lysepuffer: ... 22

3.5.7 Glycerinlösung (Bakterienstocklösung): ... 22

3.5.8 LPS - Stammlösung (1mg/ ml): ... 22

3.5.9 LPS - Gebrauchslösung: ... 22

3.5.10 Puffer für Propidiumiodid Zellzyklus-Assay: ... 22

3.5.11 TE – Puffer: ... 22

3.5.12 Waschpuffer für Splenozytenisolation: ... 22

3.5.13 Zellkulturmedium: ... 23

4 Abkürzungsverzeichnis ... 24

5 Methoden ... 26

5.1 In vivo Versuche ... 26

5.1.1 Mäuse ... 26

5.1.2 Rahmenbedingungen der Tierversuche ... 26

5.2 Tierexperimentelle Arbeiten ... 26

5

5.2.1 Intraperitoneale (i. p.) Injektion ... 26

5.2.2 Anästhesie und Operationsvorbereitung ... 26

5.2.3 Laparotomie (LAP) ... 27

5.2.4 Intestinales Manipulations-Modell (IMM ) ... 28

5.2.5 Intestinales Manipulationsmodell mit mehrfacher Manipulation (IMM⁺) 28 5.2.6 Caecal Ligation and Puncture (CLP) ... 28

5.2.7 Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) ... 29

5.2.8 Escherichia-coli-Infektion ... 30

5.2.9 Überlebenskinetiken ... 30

5.2.10 Gewinnung von Vollblut und Serum... 31

5.2.11 Euthanasie/ Tötung der Versuchstiere ... 31

5.2.12 Organentnahme ... 31

5.3 Ex vivo Versuche ... 32

5.3.1 Histologische Arbeiten ... 32

5.3.2 Mikrobiologische Arbeiten ... 33

5.3.3 Zellbiologische Arbeiten ... 33

5.4 Statistische Auswertung ... 37

6 Ergebnisse ... 38

6.1 Einfluss des IMM auf verschiedene Parameter der Immunantwort... 38

6.1.1 Vorübergehende Lymphozytopenie ... 38

6.1.2 Unveränderte Apoptoserate im Thymus ... 40

6.1.3 Erhöhte IL6-Konzentration im Serum ... 42

6.1.4 Vorübergehende Suppression der Zytokinsekretion ... 44

6.1.5 Protrahierte Störung der Zytokinsekretion durch Steigerung des Traumagrades ... 47

6.1.6 Überlebensvorteil intestinal manipulierter Mäuse im Vergleich zu nicht operierten in verschiedenen Sepsismodellen ... 51

7 Diskussion ... 56

7.1 Vorübergehende Lymphozytopenie als Zeichen einer gestörten zellulären Abwehr nach IMM ... 56

7.2 Normale Apoptoserate nach IMM – Hinweis für ein moderates Trauma ... 58

7.3 IMM führt zu einem anderen Serum-Zytokinprofil als Trauma-Hämorrhagie- Modelle ... 59

7.4 IMM führt zu einer verminderten Th1-Zytokinsekretion ... 60

7.5 IMM führt zu einem Überlebensvorteil in verschiedenen Sepsis-Modellen .. 61

8 Zusammenfassung ... 64

9 Abbildungsverzeichnis ... 66

6 10 Literaturverzeichnis ... 67 11 Eidesstattliche Erklärung ... 73 12 Lebenslauf ... 74

7

1 Einleitung

1.1 Sepsis – ein anhaltendes klinisches und ökonomisches Prob- lem

Trotz jahrzehntelanger Forschung und einiger Erfolge in der Therapie der Sepsis ist dieses Krankheitsbild noch immer eine medizinische und ökonomische Herausforde- rung. Die Sepsis rangiert unter den ersten zehn Todesursachen in der entwickelten Welt. Die Inzidenz lag im letzten Jahrzehnt in den USA bei 300.000 bis 750.000 Pati- enten und verursachte 200.000 Tote pro Jahr. Dies ist vergleichbar mit der Anzahl Toter durch einen akuten Myokardinfarkt.¹ In Deutschland schätzt man zwischen 4500 und 9500 neu erkrankte Patienten jährlich.² Die Mortalität einer Sepsis oder einer schweren Sepsis liegt, abhängig von den in den epidemiologischen Studien verwendeten Einschlusskriterien, zwischen 10% und 70%.^3-6 Die ökonomische Di- mension wird deutlich, betrachtet man die Kosten der in Deutschland intensivmedizi- nisch betreuten Sepsispatienten. Die Ausgaben liegen bei 20-40% der intensivmedi- zinischen Gesamtkosten.²

Es fällt auf, dass die Gruppe der an Sepsis erkrankten Patienten hinsichtlich der Mor- talität sehr heterogen ist. Eine besonders hohe Mortalität weisen Patienten auf, die vor der Infektion einen „Insult“ erlitten⁷. Dieser kann ischämisch-hämorrhagischer, oder traumatisch-chirurgischer Natur sein. Die bei weitem höchste Mortalitätsrate weisen Patienten auf, die im Rahmen einer nicht-elektiven Hospitalisierung, wie z. B.

durch Polytraumata, operiert werden mussten. Aber auch der Erwerb einer Sepsis als Komplikation elektiver chirurgischer Eingriffe ist mit einer erhöhten Mortalität as- soziiert.⁸ So ist das Risiko an einer Sepsis nach Perforation eines Divertikels zu ver- sterben deutlich geringer als an einer Sepsis in der Folge eines elektiven viszeralchirurgischen Eingriffes.⁹ In aktuellen epidemiologischen Studien aus den Vereinigten Staaten über postoperative Sepsis wird beschrieben, dass in den letzten zwanzig Jahren deren Inzidenz im Allgemeinen anstieg. Je nach Studie verzeichne- ten die Autoren bei Elektiveingriffen eine Zunahme um den Faktor zwei⁸ bzw. drei.⁷

8 In dem betrachteten Zeitraum kam es zudem zu einer höheren Anzahl schwerer Sepsisverläufe. Dies galt im Besonderen für die schwere Sepsis nach Elektiveingrif- fen, wo sich das Verhältnis um den Faktor zwei zugunsten der schweren Sepsis von 34,2% auf 64,6% verschob.⁸ Die Mortalität hingegen sank von 44,4% auf 34,0%⁷ respektive von 52,2% auf 34,4%⁸. Bei steigenden Zahlen von Elektiveingriffen und steigender Inzidenz erhöhte sich somit die absolute Zahl derer, die im Rahmen elek- tiver chirurgischer Eingriffe an einer Sepsis verstarben.

1.2 Sepsis Typ A und Sepsis Typ B

Maier et al. schlugen eine differenziertere Einteilung der Sepsis vor. Es solle unter- schieden werden zwischen Sepsis Typ A oder SAAS (spontaneously acquired ab- dominal sepsis, einer spontan erworbenen, gutartigeren Form) und Sepsis Typ B oder PAAS (postoperatively acquired abdominal sepsis, einer postoperativ erworbe- nen, ungünstiger verlaufenden Form der Sepsis.) ⁹

Diese Einteilung berücksichtigt die unterschiedlichen Voraussetzungen bzw. Ereig- nisse, unter denen die Sepsis erworben wurde, das heißt entweder spontan, ohne vorangegangene Operation, wie infolge einer Divertikelperforation, oder als Kompli- kation in der Folge eines chirurgischen Eingriffs.

Gemeinsam ist den der Sepsis Typ B vorausgehenden Ereignissen, dass sie zu ei- nem veränderten Immunstatus führen, welcher mit einer erhöhten Anfälligkeit für In- fektionen assoziiert ist.¹⁰ Dieser Zustand wird mit Begriffen wie Immunparalyse, Anergie und Immundepression bzw. CARS (compensatory antiinflammatory respon- se syndrome) beschrieben.¹¹

1.3 Das SIRS-CARS-Modell

Der Begriff CARS stammt aus der Beschreibung der Sepsis-Pathophysiologie und wurde in den 1990er Jahren von RC Bone eingeführt.¹² Er umfasst nach heutigem Verständnis alle auto-immunsuppressiven Vorgänge als Folge einer Sepsis, großflächiger Verbrennungen und Gewebeverletzungen.¹³ Auf Bones Modell aufbau- end, entwickelte sich das aktuelle SIRS-CARS-Konzept (Abb. 1).

9

Abbildung 1¹⁴ Modell des SIRS-CARS-Konzepts

Nach einem initialen Insult, d. h. nach einer Infektion mit Bakteriämie bzw. einem hin- reichend großen Trauma reagiert der Organismus mit einer systemischen Inflamma- tion (SIRS). Diese ist gekennzeichnet durch (pro)inflammatorische, nicht nur für das Pathogen, sondern auch für den Organismus potentiell schädigende Vorgänge. Es kommt deshalb, dem Prinzip der Homöostase entsprechend, zur Aktivierung kom- pensatorischer, antiinflammatorischer Mechanismen (CARS). Sind diese Vorgänge in der Balance, kann ein Pathogen erfolgreich abgewehrt werden, ohne dass vital be- drohende Kollateralschäden entstehen. Der Organismus regeneriert. Eine Dysbalan- ce zu Gunsten der Proinflammation führt zur hyperinflammatorischen Autodestrukti- on, eine Dysbalance zu Gunsten der Antiinflammation zur Immunparalyse.

So verursacht eine nur unzureichend regulierte Inflammation vaskuläre Schäden (capillary leak), disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) und letztlich Multiorgan- versagen (MOF).

Aber auch eine prolongierte oder dominante Wirkung der Kompensationsmechanis- men macht Patienten anfällig für sekundäre Infektionen mit oftmals fatalem Verlauf.

Das Immunsystem ist bei eingeschränkter Proinflammation nicht mehr in der Lage, die Ausbreitung der Erreger suffizient einzudämmen.

10 Zu den pathologischen Merkmalen des CARS gehören sowohl klinische als auch zel- luläre Parameter. Klinische Elemente umfassen neben der erhöhten Vulnerabilität für Infektionen auch eine kutane Anergie, Lymphozytopenie und Hypothermie. Auf Zell- bzw. Molekülebene werden eine eingeschränkte Proliferation und die Apoptose von Lymphozyten, dysfunktionale Antigen-präsentierende Zellen und die Dominanz anti- inflammatorischer bzw. immunsuppressiver Mediatoren wie IL10 und Prostaglandin E2 beschrieben.¹³

1.3.1 Serumzytokine – Biomarker und Effektoren von SIRS und CARS

Maßgeblich beteiligt an der ablaufenden Immunreaktion sind Zytokine. Diese low- molecular-weight-Proteine (8 - 50.000 Da) können von jeder kernhaltigen Zelle pro- duziert werden und dienen als Mediatoren des Immunsystems. Sie können dogma- tisch in pro- und anti-inflammatorisch eingeteilt werden, wobei diese Einteilung den sowohl pro- als auch anti-inflammatorischen Effekt einiger Zytokine nicht berücksich- tigt.¹⁵

1.3.1.1 TNF und IL1 – die Akute Phase-Reaktion

Initial wichtige Mediatoren der Proinflammation sind die Akute-Phase-Zytokine der TNF- und IL1-Familie. Diese werden von aktivierten Makrophagen oder Monozyten sezerniert und sind verantwortlich für die Initiation der lokalen und systemischen In- flammation. Durch die Wirkung auf Stromazellen werden chemotaktische Zytokine wie MCP und IL8 ausgeschüttet, welche zirkulierende Leukozyten anlocken. Ferner exprimieren Endothelzellen unter dem Einfluss von TNFα verstärkt Adhäsionsmole- küle. Zudem ist TNFα ein Induktor mikrozirkulatorischer Veränderungen wie der Va- sodilatation und der Permeabilitätssteigerung. Auch die Induktion von Fieber und Hypotension sind Folgen einer erhöhten Konzentration von TNF und IL1.¹⁶ Bei Pati- enten mit Sepsis konnte gezeigt werden, dass erhöhte Plasmakonzentrationen von TNFα mit einer erhöhten Mortalität assoziiert waren.^17-18

1.3.1.2 IL6 – zwischen Inflammation und Antiinflammation

Ein weiteres an der systemischen Inflammation beteiligtes Zytokin ist IL6. Dessen Produktion kann durch thermische, mecha-nische Gewebeverletzungen und Sepsis ausgelöst werden¹⁹ und wird unter anderem durch TNFα und IL1β induziert.^20-21 Es gilt als Zytokin mit sowohl pro- als auch anti-inflammatorischen Eigenschaften.¹⁹

11 IL6 induziert in der Leber Akute- Phase- Proteine wie CRP und Fibrinogen.¹⁶ Zudem ist es an der Stimulation polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten beteiligt.¹⁹ Andererseits hemmt es die Wirkung von TNFα und IL1β²² direkt²³ und indirekt, indem es Makrophagen zur Sekretion von deren löslichen Rezeptoren IL1-ra und TNF-sr stimuliert.²⁴ Neben der Funktion von IL6 als Mediator von SIRS und CARS konnte in klinischen und tierexperimentellen Studien gezeigt werden, dass IL6 ein potenter Biomarker sein kann. Nach einem chirurgischen bzw. einem mechanischen Trauma wird die jeweils höchste Plasmakonzentration 4-48 Stunden später beobachtet.^25-26 Dabei ist die Konzentration abhängig von der Dauer des chirurgischen Eingriffs²⁷ und dem Ausmaß des Gewebeschadens²⁸ bzw. sind hohe IL6-Plasmakonzentrationen assoziiert mit schwereren Verletzungen.^{18, 29} Weiter konnten Miyaoka et al. beim Vergleich zweier Patientengruppen, die eine mit, die andere ohne die klinischen Merkmale eines SIRS, signifikant erhöhte IL6-Konzentrationen in der mit dem SIRS diagnostizierten Gruppe beobachten.³⁰ Sowohl hinsichtlich des Auftretens einer pos- toperativen Sepsis ³¹ als auch bezüglich deren Verlaufs gilt IL6 als bedeutender prognostischer Faktor.^32-33

1.3.1.3 IL10 – das Zytokin der Antiinflammation

Das wohl wichtigste Zytokin des CARS ist IL10. Es wird von Monozyten, Makropha- gen, B-Lymphozyten und CD4+-T-Zellen gebildet. Es kann durch Endotoxin, Viren, Prostaglandin E234

und durch die Aktivierung des Sympathikus³⁵ auch von proinf- lammatorischen Zytokinen wie TNF induziert werden.³⁶ Dieser Feedback- Mechanismus zeigt die enge Regulation von Inflammation und Antiinflammation. So wurde beschrieben, dass die exogene Gabe von TNFα zu einem Anstieg der Plas- makonzentration von IL10 führte. Umgekehrt führte die passive Immunisierung mit anti-TNF neben einem Ausbleiben der TNF-Antwort auf einen Endotoxin-Stimulus hin zu einer signifikant abgeschwächten IL-10-Antwort.³⁶ Seine antiinflammatorische Wirkung entfaltet IL10 vor allem über die Reduktion der Gentranskription inflammato- rischer Mediatoren und deren Inhibition. So induziert IL10 die Freisetzung von TNF- Rezeptoren von Zelloberflächen („Shedding“).²² Außerdem beeinflusst es die Interak- tion von Antigen-präsentierenden-Zellen (APC) und CD4+T-Lymphozyten, sodass die Sekretion proinflammatorischer Zytokine blockiert wird.³⁷ Wie schon für IL6 be- schrieben, ist auch IL10 ein wichtiger Mediator der gestörten Abwehrfunktion bzw.

der Immunparalyse³⁸ dessen erhöhte Plasmakonzentration mit der Schwere und dem Verlauf von Sepsis und Trauma assoziiert waren.^39-40

12

1.3.2 Die zellvermittelte Abwehr

Neben der Balance von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen ist eine intakte zellvermittelte Abwehr unabdinglich für die erfolgreiche Abwehr von Pathogenen. Das bedeutet eine adäquate Funktion und Interaktion von T-Lymphozyten und professio- nellen Antigen-präsentierenden-Zellen (APC). Diese sind im Rahmen des CARS nachhaltig gestört.

1.3.2.1 Lymphozytopenie und verminderte HLA-DR-Expression

Ein wesentliches Charakteristikum des CARS ist die Reduktion zirkulierender Lym- phozyten^41-42. Diese Lymphozytopenie wird gleichsam als ein Grund für die gestei- gerte Anfälligkeit für Infektionen dargestellt und ist assoziiert mit einem schlechteren Verlauf.⁴³ Die zugrunde liegenden Mechanismen werden teilweise kontrovers disku- tiert. Als ein Hauptmechanismus wird die gesteigerte Apoptoserate benannt.^44-46 Ebenso bedeutende wie gut dokumentierte Veränderungen Antigen-präsentierender Zellen (APC) während einer Sepsis und nicht-infektiöser SIRS sind die verringerte Expression von HLA-DR auf Monozyten und folglich deren reduzierte Fähigkeit zur Antigen-Präsentation.^47-50 So konnte gezeigt werden, dass die HLA-DR-Expression mit der Schwere einer Sepsis und dem klinischen Outcome assoziiert ist.^51-52

1.3.2.2 Veränderung der Zytokinsekretion

Bereits in den 1980er Jahren zeigten Wood et al., dass Lymphozyten von Patienten mit schweren Verbrennungen auf einen Stimulus hin (Phytohämagglutinin bzw. LPS) eine reduzierte Zytokinproduktion aufweisen, insbesondere Lymphozyten von Patien- ten, die nach dem Verbrennungstrauma eine Sepsis entwickelt hatten.⁵³

13 Dieses Phänomen konnte bei Patienten mit einem SIRS oder einer Sepsis ebenfalls beobachtet werden.^54-55 Auch andere in vitro aktivierte Leukozyten wie neutrophile Granulozyten und Monozyten zeigen posttraumatisch^56-57, postoperativ^58-59 bzw.

während einer Sepsis^{58, 60} eine verminderte Zytokinsekretion. Kimura et al.⁶¹ be- schreiben, die Beobachtungen der oben zitierten Arbeiten zusammenfassend, dass es weniger zu einer vollständigen Suppression der Produktion aller Zytokine komme.

Es würden vielmehr Zytokine wie IL2, IFNγ und TNFα vermindert sezerniert. Diese Mediatoren würden dem Th1-Phänotyp der Lymphozyten zugeordnet. Die Sekretion von Zytokinen wie IL4 und IL10, dem Th2-Phänotyp der Lymphozyten zugeordnete Mediatoren, sei hingegen gesteigert oder nicht verändert. Diese Th1/Th2-Dysbalance zugunsten der Th2-Immunantwort werde ebenfalls als eine Ursache für die erhöhte Anfälligkeit für Infektionen dargestellt.

1.3.3 Unterschiede in Abhängigkeit vom Insult

Diverse in den letzen Jahren publizierte Übersichtsarbeiten der Literatur legen nahe, dass u. a. das die Immunreaktion (SIRS/ CARS) auslösende Ereignis, der „Insult“, für die beobachteten Phänomene eine wichtige Rolle spielt.11, 13, 62-63

Ein Kreislaufschock oder ein Verbrennungstrauma, ja auch eine Sepsis zeitigen andere Effekte als ein kontrollierter chirurgischer Eingriff. Dies betrifft den Verlauf der Reaktion des Immun- systems sowie das „Verhalten“ unterschiedlicher Zellen oder Zytokine^{49, 63}. Ein Poly- trauma mit Blutverlust bzw. eine Sepsis scheinen eine starke proinflammatorische Immunreaktion auszulösen, wie in klinischen Studien erstellte Zytokinprofile zeigen.⁶³ Das SIRS dominiert also, beschrieben als „Zytokinsturm“ oder inflammatorische Au- todestruktion, die Immunreaktion des Organismus.¹⁵ Dem gegenüber kommt es im Rahmen kontrollierter chirurgischer Eingriffe auch zu einer Akute-Phase-Reaktion.

Diese führt ebenfalls zu den oben beschriebenen TNF- und IL1-vermittelten Verände- rungen der Mikrozirkulation sowie der Aktivierung Neutrophiler und Makrophagen.

Systemisch aber konnten keine oder nur moderate Konzentrationserhöhungen von IL1- und TNF-Konzentrationen gemessen werden während antiinflammatorische Me- diatoren deutlich erhöht waren⁶⁴. So scheint die systemische Immunsuppression im Rahmen elektiver chirurgischer Eingriffe die wichtigere Rolle zu spielen.⁶³

14 Auch hinsichtlich der Phase der Immunsuppression oder CARS unterscheiden sich die Verläufe abhängig vom primären Ereignis. Makrophagen und PBMC von Patien- ten nach einem Polytrauma weisen bis zu zehn Tage eine supprimierte Zytokinsyn- these auf.^56-57 Bei Verbrennungsopfern konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Zytokinen gar bis zu 60 Tage unterdrückt war.⁵³ Nach einem chirurgischen Ein- griff aber konnte die supprimierte Zytokinsynthese nur bis zu 48 Stunden beobachtet werden.^{49, 59}

1.4 Tiermodelle zur Klärung der zugrundeliegenden Mechanismen

1.4.1 Trauma-Hämorrhagie und Laparotomie – Simulation klinischer Ver- läufe

Die dargestellte Komplexität und vor allem die Dynamik der Immunreaktion kann man an Patientenblut unmöglich hinreichend untersuchen. Deswegen wurden Tiermodelle entwickelt, die zu ähnlichen Verläufen mit ähnlichen Merkmalen führen, wie sie in der klinischen Realität beobachtet werden. Dahinter steht die Idee, durch ein umfassen- deres Wissen um die ablaufenden Vorgänge eine adäquate, zielgerichtete und prä- ventive Therapie beginnen zu können. Diese zielt im Idealfall auf eine Prävention der die Sepsis begünstigenden Vorgänge ab.

Etablierte Modelle sind vor allem solche, die ein Gewebetrauma beinhalten bzw. ei- nen Blutverlust herbeiführen und die Kombination eines Gewebetraumas mit einem Blutverlust. Die Tiermodelle sind per se nicht letal, führen jedoch zu den typischen Phänomenen eines dysbalancierten Immunsystems. So wurden auch in den Tiermo- dellen erhöhte Plasma-Konzentrationen von TNFα und IL6 ^65-66, eine reduzierte ex- vivo-Zytokinsekretion von Splenozyten^67-68, eine reduzierte Lymphozytenzahl im pe- ripheren Blut ⁶⁹ bei einer erhöhten Apoptoserate⁷⁰ sowie eine herabgesetzte Lymphozytenproliferation auf einen mitogenen Stimulus⁷¹ beobachtet. Weiter konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Funktion antigenpräsentierender Zellen gestört^72-

73 war. Einhergehend mit dieser Immundysfunktion konnte auch eine gesteigerte An- fälligkeit für eine Infektion und Mortalität einer in dieser Phase induzierten Sepsis ge- zeigt werden⁶⁸.

15 Es ist gut belegt, dass eine durch Hämorrhagie induzierte vorübergehende Hypoten- sion („Hemorrhage“) am Versuchstier endokrine und die oben beschriebenen im- munsuppressiven Effekte auslöst⁷⁴. Wird die Hämorrhagie mit einem Weichteiltrauma kombiniert, wie z.B. durch eine Mittellinien-Laparotomie (“Trauma-Hemorrhage“), kann die Dauer der Immunsuppression gesteigert werden.^{67, 75}

Aber auch das Weichteiltrauma per se führt zu einer Immunsuppression. Seit den 1970er Jahren wurde der immunsuppressive Effekt durch chirurgischen Stress eben- falls am Tiermodell untersucht¹³. Auch hier konnten eine Lymphozytopenie^76-77, eine verminderte ex-vivo-Zytokinsekretion^78-79 sowie eine gesteigerte Infektionsanfällig- keit^80-81 gezeigt werden. Wie in klinischen Studien (s. o.)^{49, 63}, gibt es auch im Tier- modell Hinweise für Unterschiede der Immunantwort zwischen einem Weichteiltrau- ma und Hämorrhagie („Trauma-Hemorrhage-Modell“) wie nach einem Polytrauma einerseits und andererseits chirurgischem Stress ohne signifikanten Blutverlust wie nach einer elektiven Operation. So konnte gezeigt werden, dass das Trauma- Hemorrhage-Modell zu einem signifikanten Anstieg von IL6 und TNFα im Serum führte. Eine Laparotomie allein löste aber lediglich einen signifikanten Anstieg von Serum-IL6 aus, nicht aber von Serum-TNFα.⁶⁵

1.5 IMM

Das in dieser Arbeit untersuchte Intestinale Manipulationsmodell (IMM) wurde bislang zur Erforschung des paralytischen Ileus genutzt. IMM simuliert einen häufig durchge- führten chirurgischen Eingriff ohne chirurgische Komplikationen, d. h. ohne Blutun- gen, Peritonitis oder Perforation.⁸² Es besteht im Wesentlichen aus einer Mittellinien- laparotomie und der Manipulation des Dünndarms (weitere Einzelheiten siehe 5.2.4).

Es wurde gezeigt, dass es in der Folge des Eingriffs zu einer panenterischen Inflam- mation kommt. Das bedeutet, dass auch Musculariszellen nicht manipulierter Darm- abschnitte wenige Stunden nach der Manipulation beginnen, inflammatorische Zyto- kine wie TNF und IL6 zu produzieren⁸³. Hierbei spielen autochthone Makrophagen der Tunica muscularis des Darms eine bedeutende Rolle.⁸⁴ Sie sind die Initiatoren einer inflammatorischen Kaskade, die über die Attraktion zirkulierender Leukozyten letztlich zur Kontraktilitätsstörung der glatten Muskulatur führt.

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2 Fragestellung

Jedes Trauma und somit auch jeder chirurgische Eingriff bewirkt neben einer lokalen auch eine systemische Reaktion des Immunsystems. Diese ist abhängig von der Art und dem Ausmaß des Traumas. Ein chirurgischer Eingriff stört das physiologische Gleichgewicht proinflammatorischer und antiinflammatorischer Mechanismen. Wir sprechen daher von postoperativer Immundysfunktion. Diese wird dann hochgradig problematisch, wenn postoperativ die gefürchtete, therapeutisch schwer zu beherr- schende und häufig letale Sepsis auftritt. Existierende Therapieansätze zur Behand- lung einer postoperativ erworbenen Sepsis sind nur bedingt wirksam, weil die Me- chanismen der postoperativen Immundysfunktion nicht vollständig geklärt sind. Des- halb sind Tiermodelle erforderlich, die es ermöglichen, die Mechanismen zu charak- terisieren.

Das in dieser Arbeit verwendete Intestinale Manipulationsmodell (IMM) simuliert den klinischen Vorgang eines abdominal-chirurgischen Eingriffs an der Maus. Es soll nun geklärt werden, inwiefern IMM in der Lage ist, neben der lokalen Reaktion eine sys- temische Immundysfunktion auszulösen und somit, ob sich das IMM als postoperati- ves Immundysfunktionsmodell eignet. Zu diesem Zweck werden unterschiedliche Schweregrade des Eingriffs miteinander verglichen.

Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der jeweiligen Behandlung werden wichtige Pa- rameter der systemischen Immunantwort analysiert, welche bereits in klinischen Ar- beiten und in Tier-Modellen von SIRS („systemic inflammatory response syndrome) respektive CARS (compensatory anti-inflammatory syndrome) im Sinne einer Im- mundysfunktion verändert und mit einer erhöhten Sepsismortalität assoziiert waren.

Diese beinhalten: die Anzahl der in der Zirkulation befindlichen Lymphozyten, die Serumkonzentration von IL6 und TNFα, die Zytokin-Sekretionsleistung stimulierter Splenozyten und die Apoptoserate von Thymozyten. Weiter soll der Einfluss der je- weiligen Operation auf das Überleben einer postoperativ induzierten Sepsis unter- sucht werden.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, zu untersuchen, ob IMM die nötigen Voraussetzungen für ein Modell der postoperativen Immundysfunktion erfüllt und ob durch die Kombi- nation mit Sepsismodellen, das klinische Problem der postoperativ erworbenen Sepsis simuliert werden kann.

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3 Material

3.1 Laborgeräte

ABI Prism® 7000 Detection System Applied Biosystems, Foster City, USA

Analysenwaage Sartorius Göttingen

Begasungsbrutschrank B 5060 EK/CO2 Heraeus, Hanau Mikrobiologischer Inkubator Binder, Tuttlingen

Chirurgisches Besteck:

Pinzette, Asanus, Neuhausen ob Eck

Nadelhalter, Mikronadelhalter Asanus, Neuhausen ob Eck

Schere, Mikroschere Asanus, Neuhausen ob Eck

Digitalwaage BL 150 S Sartorius AG, Göttingen

Drigalskispatel Carl Roth, Karlsruhe

Durchflusszytometer FACScan Becton Dickinson, San Jose, USA

Durchflusszytometer FACSCalibur Becton Dickinson, San Jose, USA

Fluoreszenzmikroskop Leica DM IL Leica Microsystems, Wetzlar

Handstückzähler Carl Roth, Karlsruhe

Homogenisator Ultraturrax T25 Janke & Kunkel, Staufen im Incubator Shaker innova 4000 New Brunswick Scientific, USA

Neubauer-Zählkammer OptikLabor, Friedrichsdorf

pH-Meter inoLab WtW, Weilheim

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Reagenzglasschüttler Merck Eurolab N.V., Leuven,

Belgien

Sterilwerkbank Herasafe Heraeus, Hanau

Sysmex Hämatologischer Analysator Sysmex, Norderstedt

Thermocycler Biometra, Göttingen

18 Ultraschallbad Sonorex TK 52 Bandelin, Berlin

Zentrifugen:

Centrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg

Megafuge 1.0 R Heraeus, Hanau

3.2 Verbrauchsmaterialien

Agarplatten:

Blutagarplatte Columbia 5% SB BD Bioscience, Heidelberg

Chirurgisches Nahtmaterial:

Mariderm schwarz 7/0 USP Catgut GmbH, Markneukirchen

Polyester weiß 4/0 USP Catgut GmbH, Markneukirchen

Deckgläser Superior, Marienfeld

EDTA-Vacutainer Becton Dickinson, Heidelberg

Einbettschälchen Cryomold® Sakura Finetek Europe B.V.,

Zoeterwoude, Niederlande

Einmal-Impföse (1µl) nerbe plus GmbH, Win-

sen/Luhe

Einmalkanülen Neoject® 20G, 26G, 30G Dispomed, Gelnhausen

Einmalskalpelle Ansell Medical, Cergy Pontoise,

Frankreich

Einmalspritzen (1ml) Dispomed, Gelnhausen

Einmalspritzen Omnican® F (1 ml) Braun, Melsungen

Einmalspritze 5 ml Injekt Braun, Melsungen

Hämatokritkapillaren Brand, Wertheim

Kryoröhrchen Nunc, Roskilde, Dänemark

Leukoplast BSN Medical GmbH, Hamburg

Objektträger Superfrost® Plus Menzel Gläser, Braunschweig

PCR 96-well Platte SuperArray Bioscience Corpo-

ration, USA

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg

19 Pipettenspitzen (Aerosol – resistant, RNAse, Biozym, Hess. Oldendorf DNAse, pyrogenfrei)

Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße Biozym, Hess. Oldendorf

(RNAse, DNAse, pyrogenfrei)

Röhrchen für FACS - Analyse Becton Dickinson, Heidelberg Spritzenvorsatzfilter 0,2 µm und 0,45 µm Merck, Bruchsal

Venenverweilkanülen 16G und 18G BD Vialon Biomaterial, Heidel- berg

Wattestäbchen care&serve

Zellkulturplatten 96 well, u-shape Greiner Bio-One, Frickenhausen

Zellschaber 25 cm Carl Roth, Karlsruhe

Zellsiebe 70 µm BD Pharmingen, Heidelberg

Zentrifugenröhrchen:

Spitzboden 15 ml und 50 ml Becton Dickinson, Heidelberg

3.3 3.3 Reagenzien und Chemikalien

Aqua dest. RNAse, DNAse, pyrogenfrei Invitrogen, Carlsbad, USA Avertin® (2,2,2 - Tribromethanol) Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir-

chen

Kaisers Glyceringelatine Merck KGaA, Darmstadt

Aceton Merck, Darmstadt

Ammoniumchlorid (NH4Cl) Merck, Darmstadt

Avertin® (2,2,2 - Tribromethanol) Sigma-Aldrich Chemie Taufkirchen

Bovines Serumalbumin 22% ortho-clinical diagnostics, Neckargemünd

D-Glucose Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir-

chen

Di-Natrium-Hydrogenphosphat VWR, Darmstadt

DNAse Qiagen, Hilden

EDTA Merck, Darmstadt

20 Einbettmedium Tissue - Tek® Sakura Finetek Europe B.V.,

Zoeterwoude, Niederlande

Ethanol Carl Roth, Karlsruhe

FACS - Puffer Becton Dickinson, Heidelberg

Fötales Kälberserum, inaktiviert Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir- chen

Gentamycin Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir-

chen

Glycerin Merck, Darmstadt

Hydroxylamin Merck, Darmstadt

Isotonische Natriumchlorid-Lösung Delta Select, Pfullingen Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3) Merck, Darmstadt

LB-Broth EZMix™ Powder Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir-

chen

Lipopolysaccharid Salmonella abortus equi Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir- chen

Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir-

chen

N - Acetyl - L - alanyl - L - Glutamin Biochrom AG, Berlin

Natrium-Citrat VWR, Darmstadt

Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt

Natriumpyruvat Biochrom AG, Berlin

PBS Dulbecco w/o Ca2+, Mg2+ PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Penicillin/Streptomycin GIBCOTM Invitrogen, Carlsbad, USA

Propidiumiodid 1mg/ml Sigma-Aldrich Chemie, Taufkir-

chen

RNAse Promega, USA

RPMI 1640 PAA Laboratories, Pasching,

Österreich

Salzsäure VWR, Darmstadt

Türck`s Lösung Merck, Darmstadt

Wasserstoffperoxid (30%) Merck, DarmstadtKits

CBA Mouse Inflammation Kit BD Biosciences, Heidelberg

21

3.4 Bakterien

E.coli ATCC 25922 zur Verfügung gestellt von Dr. med. K. Breitbach Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universität Greifswald

3.5 Puffer und Lösungen

3.5.1 Arbeitslösung Myeloperoxidase – Färbung

10 ml PBS

10 mg Hanker Yates Reagenz 100 µl H₂O₂ (3%)

3.5.2 Arbeitslösung RNAse (Propidiumiodid-Zellzyklus-Assay)

RNAse-Solution (4mg/ml) 1:4 verdünnen in PBS (1 mg/ml)

3.5.3 Arbeitslösung Propidiumiodid

Propidiumiodid (1 mg/ml) 1:40 verdünnen (25 µg/ml)

3.5.4 Avertin® - Stammlösung:

1 g 2, 2, 2 - Tribromethanol 1 ml 2 - Methyl - 2 - butanol bei 50° C im Wasserbad lösen

3.5.5 Avertin® - Gebrauchslösung (2,5%):

1 ml Stammlösung 39 ml erwärmtes PBS pH = 7,0 – 7,4

steril filtrieren (0,2 µm)

22

3.5.6 Erythrozyten – Lysepuffer:

Aqua bidest 155 mM NH4Cl 10 mM KHCO3 0,1 mM EDTA

3.5.7 Glycerinlösung (Bakterienstocklösung):

70% Glycerin In Aqua bidest.

3.5.8 LPS - Stammlösung (1mg/ ml):

1 mg LPS (S. abortus equi) 1 ml PBS

pro 1 ml LPS 5 µl Hydroxylamin (0,1%)

3.5.9 LPS - Gebrauchslösung:

10 ml für in - vitro - Stimulation (1 µg/ml):

10 µl LPS - Stammlösung ad 10 ml Medium

3.5.10 Puffer für Propidiumiodid Zellzyklus-Assay:

2,94 g 0,1M Natriumcitrat in 100ml Aqua bidest gelöst

1,42 g 0,1M Di-Natrium-Hydrogen-Phosphat in 100ml Aqua bidest gelöst Mit HCl 25% pH auf 7,8 titrieren

3.5.11 TE – Puffer:

A. bidest 10 mM Tris 1 mM EDTA pH 8,0 mit HCl

3.5.12 Waschpuffer für Splenozytenisolation:

PBS 2% FCS

23

3.5.13 Zellkulturmedium:

RPMI 1640 (500ml)

5ml 2% Penicillin/ Streptomycin

10ml 4mM N - Acetyl - L - alanyl - L - Glutamin 5ml Gentamycin 10mg/ml

2ml 2% D-Glucose 5ml 2mM Natriumpyruvat 10% FCS

24

4 Abkürzungsverzeichnis

± Standardabweichung vom Mittelwert

∅ Mittelwert

dest. destilliert

C57BL/6 hier verwendeter Mausstamm

CASP Colon Ascendens Stent Peritonitis

CBA Cytometric Bead Array

cDNA copy-Deoxyribonucleic acid

CLP Caecum ligation and puncture

COL Kolonmanipulation

ddH₂O double distilled water

DEPC Diethypyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FACS Flourescent-Activated Cell Sorting

FCS Fetal calf serum

G Gauge

HCl Salzsäure

i. p intraperitoneal

IFNγ Interferon gamma

IL Interleukin

IMM Intestinales Manipulations Modell IMM⁺ IMM mit dreifacher Manpulation

KBE Koloniebildende Einheiten

KG Körpergewicht

LAP Laparotomie

LB lysogeny broth

LPS Lipopolysaccharid

MCP-1 Monocyte chemotactic protein 1

NaCl Natrium-Chlorid

OD260 Optical density bei 260 nm

OD280 Optical density bei 290 nm

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

25

PE Phycoerythrin

PI Propidium Iodide

RNA ribonucleic acid

Rpm rounds per minute

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Reverse Transkriptase

S. abortus equi Salmonella abortus equi

S2 Sicherheitsstufe 2

TLR toll-like receptor

TNFα Tumor necrosis factor alpha

Tris Trishydroxymethylaminomethan

26

5 Methoden

5.1 In vivo Versuche

5.1.1 Mäuse

Für die Experimente wurden weibliche, 8-12 Wochen alte C57Bl/6-Mäuse, bezogen von Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland), verwendet.

5.1.2 Rahmenbedingungen der Tierversuche

Zwischen Ankunft der Mäuse und Versuchsbeginn lagen mindestens zwei Wochen Akklimatisationszeit. Die Mäuse wurden im Tierstall des Biotechnikum Greifswald in Polycarbonatkäfigen Typ III mit je fünf bzw. zehn Mäusen auf Einstreu bei Pressfutter beides ad libitum und einem 12-stündigen Tag- Nachtrhythmus gehalten. Alle Versu- che wurden unter Einhaltung der deutschen Tierversuchsordnung und nach vorheri- ger Genehmigung durch das Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern durchgeführt.

5.2 Tierexperimentelle Arbeiten

5.2.1 Intraperitoneale (i. p.) Injektion

Die Applikation von Substanzen i. p. wurde mit 1 ml Einmalspritzen durchgeführt. Bei der Applikation erfolgte die Punktion median in den unteren Bauchquadranten. Es wurde darauf geachtet, dass das applizierte Volumen 300 µl nicht überstieg.

5.2.2 Anästhesie und Operationsvorbereitung

Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion Tribromethanol von 240 mg/kg Körpergewicht vollständig betäubt. Die jeweilige Operation fand erst nach dem Erreichen einer adäquaten Narkosetiefe statt. Diese wurde durch das Fehlen von Palpebral- und Schwanzreflex überprüft. Die Mäuse wurden dann mit Leukoplast an Hinter- und Vorderläufen auf Styroporplatten fixiert. Allen Operationen ging die Desinfektion des Abdomens voraus. Sämtliche Eingriffe wurden mit sterilem Operati- onsbesteck durchgeführt.

27

5.2.3 Laparotomie (LAP)

Das desinfizierte Abdomen wurde hierzu einen bis zwei Zentimeter inzidiert, wobei die Haut median und die Muskelschicht und das Peritoneum entlang der Linea alba nacheinander und unter weitgehender Schonung von Gefäßen eröffnet wurden (Abb. 2a¹).

Alle Laparotomien, wurden zeitlich parallel zur Operation der Versuchstiere durchge- führt. Der Flüssigkeitsverlust wurde durch intraperitoneale Gabe von 300 µl isotoner Kochsalzlösung kompensiert. Der Verschluss von Haut und Peritoneum (Abb. 2b) erfolgten mittels fortlaufender Nähte (Polyester weiß 4/0).

1 Alle auf den Abbildungen 2,3 verwandten Bilder mit freundlicher Genehmigung von H. Mehmcke

a b

Abbildung 2 Chirurgische Eröffnung und Verschluss des Abdomens

28

5.2.4 Intestinales Manipulations-Modell (IMM )

Wie bei der Laparotomie wurden zunächst Haut und anschließend Muskelschicht und Peritoneum median eröffnet. Nach der Inzision des Bauches erfolgte die Verlagerung der Dünndarmschlingen auf befeuchtete sterile Tupfer. Mittels zweier Wattestäbchen wurde nun das gesamte Dünndarmkonvolut am Jejunum beginnend bis zum Caecum unter Bewegung des Darminhalts antegrad ausgestrichen. Hiernach wurden die Darmschlingen in die Bauchhöhle reponiert, die Flüssigkeit substituiert und wie oben beschrieben die Wunde verschlossen.⁸²

5.2.5 Intestinales Manipulationsmodell mit mehrfacher Manipulation (IMM

⁺

)

Die Operationsschritte entsprachen denen von IMM (siehe obiger Abschnitt). Ledig- lich die Anzahl der Manipulationen unterschied sich. Das heißt der Darm wurde drei- fach statt einfach ausgestrichen.

5.2.6 Caecal Ligation and Puncture (CLP)

Nach der wie oben beschriebenen Eröffnung des Bauches wurde das Caecum nach außen verlagert und 1,5 cm proximal des Caecalpols mit 4/0 Polyester zu 70% abge- bunden, ohne jedoch die Ileocaecalklappe zu beeinträchtigen. Hiernach erfolgte die einfache Punktion des abgebundenen Caecums mit einer 18 G Kanüle. Daraufhin wurde das Caecum leicht ausgestrichen bis ein kleiner Stuhltropfen erschien. Nach- folgend wurde wieder das Caecum reponiert, Flüssigkeit substituiert und die Wunde verschlossen.⁸⁵

29

5.2.7 Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP)

Die Operation wurde wie von Zantl et al. beschrieben durchgeführt.⁸⁶ Nach der Eröff- nung des Abdomens wurde das Caecum nach außen verlagert und hiervon ausge- hend das Colon ascendens exponiert (Abb. 3a). Es folgte das Vorlegen einer Naht, die mit doppeltem Knoten streng antimesenterial geknüpft wurde. Dann erfolgte die Punktion der Darmwand ungefähr 1,5cm aboral der Ileocaecalklappe durch eine 16G-Verweilkanüle (Abb.3b). Diese wurde anschließend vermittels vorgelegter Naht mit zwei Stichen an der Darmwand fixiert und mit chirurgischem Knoten gesichert (Abb.3c). Anschließend erfolgte der Rückzug der Punktionsnadel. Die Kunststoffka- nüle verblieb im Darmlumen. Durch leichte Kompression des Caecum wurde die so eingebrachte Kanüle („Stent“) mit Faeces gefüllt (Abb. 3d) und sämtliche ausgelager- ten Darmanteile in die Bauchhöhle zurück verlagert. Es folgten die Flüssigkeitssubsti- tution und der oben beschriebene Wundverschluss.

Die Operation verlief ohne nennenswerte Blutungen oder nicht intendierte Perforatio- nen der Darmwand. Im Falle einer akzidentellen Blutung durch Verletzung eines Mesenterialgefäßes oder Perforation wurden die Tiere aus dem jeweiligen Versuch ausgeschlossen.

a b

c d

Abbildung 3 CASP, Darstellung des Caecum, Einbringen und Fixieren des Stent

30

5.2.8 Escherichia-coli-Infektion

Für dieses Toxämiemodell wurden die Bakterien aus einem kryokonservierten Glycerinstock in LB-Medium zunächst angeschüttelt (16h, 37˚C, 200rpm) und an- schließend fraktioniert ausgestrichen. Nach einer Bebrütungszeit von 16h bei 5%

Kohlenstoffdioxid und 37˚C wurden die Keime erneut für 16h angeschüttelt. Nachfol- gend wurden photometrisch die Konzentration bestimmt und die Bakterien auf 1x10exp7 KBE/ml mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnt.

Die Versuchstiere erhielten eine Dosis von 5x10exp6 KBE in 200 µl. Diese wurde intraperitoneal verabreicht.

5.2.9 Überlebenskinetiken

Jede Überlebenskinetik wurde nach folgendem Schema durchgeführt.

Bei den jeweiligen Kontrollgruppen entfiel die Operation. Keine der Operationen (La- parotomie, IMM, IMM+) waren letal. Die Sepsis wurde entweder durch die oben be- schriebenen operativen Verfahren wie CLP und CASP oder durch Applikation einer letalen Dosis von Escherichia coli induziert. Anschließend wurden die Mäuse im Rhythmus von sechs Stunden beobachtet und das Überleben dokumentiert. Bei den operativen Modellen der Sepsis wurden die Mäuse über einen Zeitraum von 240 Stunden, im Sepsismodell mit Escherichia coli unter S2 Bedingungen über 72h beo- bachtet. Alle überlebenden Tiere wurden am Ende des Versuchs schmerzlos getötet.

Operation Induktion der Sepsis

Zeit Monitoring alle 6h

Abbildung 4 Versuchsablauf der Überlebenskinetiken

31

5.2.10 Gewinnung von Vollblut und Serum

Bei narkotisierten Tieren wurde der Retroorbitalplexus mit einer Hämatokritkapillare punktiert und für die Vollblutgewinnung das Blut in EDTA-Röhrchen und für die Se- rumgewinnung in Reagenzgefäßen ohne Antikoagulanz gesammelt. Zur Abtrennung des Serums wurde das Blut bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Gerinnung belassen und dann bei 16000 g für 10 min zentrifugiert. Das Serum wurde abge- nommen und in ein neues Reagenzgefäß überführt. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Serumproben bei -20° C gelagert. Die Vol lblutproben lagerten bis zur weiteren Verwendung auf Eis.

5.2.11 Euthanasie/ Tötung der Versuchstiere

Die Versuchstiere wurden unter Narkose durch zervikale Dislokation schmerzlos ge- tötet.

5.2.12 Organentnahme

Die getöteten Tiere wurden auf dem Rücken liegend auf einer Styroporplatte mit Na- deln an den Vorder- und Hinterläufen fixiert. Nach sorgfältiger Desinfektion mit 70%igem Ethanol wurde die Bauchhaut abpräpariert und das Peritoneum freigelegt.

Nach Eröffnung der Peritoneal - und Pleurahöhle wurden je nach Fragestellung Milz, Thymus oder der Dünndarm präpariert und entnommen. Die entnommenen Milzen wurden anschließend maximal 3 Stunden in 1ml Nährmedium auf Eis bis zur weite- ren Bearbeitung gelagert. Thymi wurden ebenfalls auf Eis in 1 ml PBS (2% FCS) für maximal 3 Stunden aufbewahrt. Explantierte Dünndarmabschnitte zur Herstellung von Lamina muscularis intestinalis Stücken wurden wie unter 5.3.1.1 behandelt.

32

5.3 Ex vivo Versuche

5.3.1 Histologische Arbeiten

5.3.1.1 Anfertigung von Muscularisstücken für die Myeloperoxidasefärbung Die wie oben beschrieben explantierten Dünndarmabschnitte wurden in PBS gespült und anschließend am Mesenterialansatz längs aufgeschnitten. Reste des Speise- breis wurden entfernt. Die so vorbereiteten Abschnitte wurden auf einer mit Sylgard®

beschichteten Petrischale mit Insektennadeln aufgespannt und anschließend für 5 Minuten mit 100% Ethanol fixiert. Die Abschnitte wurden dann mit PBS gewaschen.

Nachfolgend wurden die Mucosa und Submucosa unter dem Mikroskop abpräpariert und die Muscularisstücke für die Myeloperoxidasefärbung weiterverwendet.

5.3.1.2 Färbung von Granulozyten in der Muscularis mit der Myeloperoxidasefärbung

Zum Zweck der Qualitätskontrolle der Intestinalen Manipulation wurden Muscularisstücke operierter und nicht operierter C57BL/6 Weibchen hinsichtlich der Einwanderung neutrophiler Granulozyten verglichen. Zur Darstellung von neutrophi- len Granulozyten in der Muscularis intestinalis wurde eine Myeloperoxidasefärbung (Hanker-Yates) verwendet. Das Reagenz interagiert dabei mit der den Granulozyten eigenen Peroxidase.

Hierfür wurden die wie unter 5.3.1.1 präparierten Muscularisstücke mit der Arbeitslö- sung (siehe 3.5.1) für 10 Minuten inkubiert. Nach dem Aufbringen der Schnitte auf Objektträger wurden die Muscularisproben in 10-, 20- und 40-facher Vergrößerung hinsichtlich der Einwanderung neutrophiler Granulozyten beurteilt.

Para-Phenylendiamin

Myeloperoxidase

schwarz-bräunliches, unlösliches Reaktionsprodukt

+ Katechol + H2O2

33

5.3.2 Mikrobiologische Arbeiten

5.3.2.1 Ansetzen eines Glycerinstocks von E.coli ATCC 25922

Die Ausgangskultur wurde auf Columbia Blutagar vom Institut für Medizinische Mik- robiologie zur Verfügung gestellt. Von dieser wurden zum Anlegen des Glycerinstocks sechs Kolonien mittels Impföse entfernt und 50 ml LB-Medium damit angeimpft. Die Kultur wurde daraufhin 16 Stunden bei 37C˚ und 140 rpm über Nacht angeschüttelt. Anschließend wurde die Bakterienkultur mit 20%iger Glycerinlösung in Reaktionsgefäßen zu je 50 µl aliquotiert und bei -70˚C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

5.3.2.2 Anzucht der E.coli aus dem Glycerinstock

Aus der aufgetauten Glycerin-Bakterien-Suspension wurden vermittels Impföse 1 µl entnommen und erneut 50 ml LB-Medium damit angeimpft. Dieses wurde bri 37˚C und 200rpm maximal 16 Stunden angeschüttelt. Aus der dann gelblich trüben Sus- pension wurde ein fraktionierter Ausstrich auf Columbia Blutagar angefertigt. Dieser wurde bei 37˚C und 5% CO₂ maximal 16h bebrütet. Anschließend wurde per Impföse (1µl) eine Einzelkolonie in 50 ml LB-Medium überführt, das dann erneut angeschüttelt wurde. Die so gewonnenen Bakterienkulturen wurden für das E.coli Infektionsmodell genutzt. Alle Arbeiten mit dem E.coli Stamm fanden unter S2- Bedingungen statt.

5.3.3 Zellbiologische Arbeiten

5.3.3.1 Herstellung einer Einzelzellsuspension aus explantierten Milzen

Nach Entnahme der Milz und Lagerung auf Eis wurde diese steril mit dem Stempel einer 5 ml Spritze unter Spülung mit PBS 2% FCS durch ein Zellsieb mit 70 µm Ma- schenweite in ein 50 ml Reaktionsgefäß gedrückt. Die Zellsuspension wurde auf 45 ml mit PBS 2% FCS aufgefüllt und für 10 min bei 300 g und 4° C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das gewonnene Pellet in 1 ml Medium resuspendiert. 9 ml Erythrozyten - Lysepuffer wurden hinzugegeben und der Ansatz für 7 min bei Raumtemperatur inkubiert.

34 Anschließend wurde der Ansatz mit PBS 2% FCS aufgefüllt und für 10 min bei 300 g und 4° C zentrifugiert. Ein Waschschritt mit Medium und gleichen Zentrifugationsparametern wurde angeschlossen. Das erythrozytenfreie Pellet wurde in 1 ml Medium aufgenommen und die Zellzahl bestimmt.

5.3.3.2 Herstellung einer Einzelzellsuspension aus explantierten Thymi

Die Schritte der Thymozytenpräparation entsprechen denen der Splenozytenpräparation (4.2.3.1). Allerdings wird das Erythrozyten-freie Pellet nicht in Medium, sondern in PBS 2% FCS aufgenommen und die Zellzahl bestimmt.

5.3.3.3 Zellzählung

5.3.3.3.1 In der Neubauer Zählkammer

Die Zellzählung wurde hierfür mit Türck`s Lösung, einem essigsauren Färbereagenz, durchgeführt. 10 µl Zellsuspension wurden in 90 µl Türck`s Lösung überführt und gut vermischt. 10 µl des Ansatzes wurden in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert. Unter dem Lichtmikroskop wurde bei 200-facher Vergrößerung ein Großquadrat in Drei- fachbestimmung ausgezählt. Da ein Großquadrat eine Fläche von 1 mm² und eine Tiefe von 0,1 mm aufweist, ergibt sich für das Volumen 0,1 mm³, also 10-4 ml. Mit Hilfe der Kammerformel (Zellzahl/ ml Suspension = Zellen/ Großquadrat x 10⁴ x Ver- dünnungsfaktor) errechnete sich die Zellzahl pro Milliliter.

5.3.3.3.2 Mit dem Hämatologischen Analysator

100 µl der Einzellzellsuspension wurden in FACS- Röhrchen überführt und im Analy- sator gemessen. Grundlage der Berechnung zur Verdünnung war die Anzahl der Leukozyten. Die Zellzählungen im Analysator und in der Neubauer Zählkammer un- terschieden sich nur marginal.

5.3.3.4 Propidiumiodid-Zellzyklus-Assay

Die Verwendung von Propidiumiodid (PI) zur durchflusszytometrischen Darstellung des Zellzyklus leitet sich von dessen Eigenschaft ab, mit Nukleinsäuren zu interkali- eren. Apoptotische Zellen haben infolge von Fragmentierungsprozessen der DNA eine geringere Fluoreszenz als nicht apoptotische. Somit stellt sich diese PI- gefärbten DNA Fragmente im Histogramm als peak im unteren Fluoreszensnivau dar:

35 Die wie unter 5.3.2.2 beschrieben aufbereiteten und gezählten Thymozyten wurden auf 10⁶ Zellen eingestellt, in 500 µl PBS gegeben und zur Permeabilisierung der Zellmembran mit 5 ml Ethanol versetzt. Diese Lösung wurde anschließend für min- destens 14 Stunden bei -20 ˚C gelagert.

Nach der Inkubationszeit folgten weitere Vorbereitungsschritte, der RNA-Verdau und letztlich die Färbung nach folgendem Protokoll:

- Zentrifugation (1200 rpm, 10 Minuten) - Abnahme und Verwerfen des Überstandes

- Resuspension des Pellets in 2 ml des Natrium-Citrat-Dinatrium-Hydrogenphosphat- Puffers (siehe 3.5.10)

- 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur - 1 ml BSA (5%) dazugeben

- Zentrifugation (1200 rpm, 10 Minuten) - Abnehmen und Verwerfen des Überstandes

- Resuspension des Pellets in 30 µl RNAse Arbeitslösung (siehe 3.6) - Inkubation im Wasserbad (37 ˚C, 5 Minuten)

- Zugabe von 200 µl Propidiumiodid-Arbeitslösung - FACS-Analyse

Abbildung 5 Histogramm einer PI-gefärbten Zellsuspension

Typisches Histogramm einer PI-gefärbten Zell- suspension mit apoptotischen Zellen. M₁: G₀/G₁-Phase; M₂: S und G₂-Phase; M₃: Apop- totische Zellen. G₁- und G₂-Dupletten wurden zuvor aus dem Gate ausgeschlossen.

36 5.3.3.5 Induktion von Zytokinen in der Milzzellkultur

Milz-Einzelzellsuspensionen wurden hierfür, wie unter 5.3.3.1 beschrieben, herge- stellt und auf 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Die Stimulation der Zellen fand in der 96well Platte mit LPS aus Salmonella abortus equi statt, das doppelt konzentriert angelegt wurde, da die Endkonzentration im well bei 1 µg/ml liegen sollte. D.h.:

100 µl Zellsuspension der jeweiligen Probe (≙ 10⁶ Zellen je well) 100 µl Medium (c = 2 µg/ml LPS)

200 µl Gesamtvolumen mit cLPS = 1µg/ml.

Die Platten wurden anschließend im Begasungsbrutschrank 24 Stunden bei 37˚C und 5% CO₂ inkubiert.

5.3.3.6 Gewinnung von Kulturüberständen

Nach der Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die 96-well Platten bei 1200 rpm zentrifugiert. Nachfolgend wurden 100µl des Überstandes in Reaktionsgefäße über- führt. Die Splenozyten blieben als Pellet am Boden der wells zurück. Die Überstände wurden bei -20˚C bis zu ihrer weiteren Verwendung gelagert.

5.3.3.7 Quantitativer Nachweis induzierter Zytokine im Kulturüberstand muriner Splenozyten

Der Nachweis von Zytokinen im Kulturüberstand erfolgte durchflusszytometrisch mit dem Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Inflammation Kit von BD Bioscience. Bei dieser Methode können IL-12, TNF-α, IFN-γ, IL - 6, MCP-1 und IL-10 gleichzeitig in einer Probe mit 25 µl Probenvolumen gemessen werden. Es wird ein Gemisch aus sog. Capture -Beads eingesetzt, die jeweils mit zytokinspezifischen Antikörpern ge- koppelt sind und derart zur Bindung von in der Probe befindlichen Zytokinen fähig sind. Jeder im Gemisch befindlicher Bead ist doppelt Fluoreszenz – markiert, einmal zur qualitativen Differenzierung der Zytokine und einmal zu deren quantitativer Be- stimmung.

37 Die zytokinspezifische Fluoreszenz wird in Kanal 3 detektiert, während die quantitati- ve Messung über einen PE markierten Antikörper in Kanal 2 erfolgt. Nicht gebundene Beads können von der gebundenen Beadpopulation abgegrenzt werden, da sie nur in Kanal 2 ein positives Signal erzeugen.

Die Durchführung erfolgte entsprechend den Angaben des Herstellers.

Die Konzentration der in der Probe befindlichen Zytokine wurde anhand einer Stan- dardkurve mit der produktspezifischen Software berechnet.

5.3.3.8 Bestimmung der Leuko- und Lymphozytenzahlen im murinen Vollblut Vollblutproben von C57BL/6 Mäusen wurden, wie unter 5.2.10 dargestellt, gewon- nen. Anschließend wurden mit dem Hämatologischen Analysator Leuko- und Lymphozytenzahlen bestimmt.

5.4 Statistische Auswertung

Die statistischen Auswertungen erfolgten mit der Software GraphPad Prism 5. Dabei wurde bei den Überlebenskinetiken der Log-Rank-Test nach der Kaplan-Meier- Schätzung verwendet. Für die ex-vivo-Daten wurde aufgrund der fehlenden Normal- verteilung und der kleinen Gruppengröße der Mann-Whitney-Rangsummentest mit einem zweiseitigen P-Wert gewählt. Es wurde ein Signifikanzniveau von 5% festge- legt. Dabei wurden die Unterschiede, die einen P-Wert von 0.05 ergaben mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.

38

6 Ergebnisse

6.1 Einfluss des IMM auf verschiedene Parameter der Immunant- wort

6.1.1 Vorübergehende Lymphozytopenie

Um den Effekt der Traumatisierung des Darms von dem der medianen Laparotomie allein abzugrenzen, fungierten lediglich laparotomierte Mäuse als Kontrolle. Daneben dienten nicht operierte Tiere als native Kontrollgruppe. Hierzu wurde zu zwei Zeit- punkten (6 Stunden und 3 Tage) nach einer intestinalen Manipulation oder Laparo- tomie die Gesamtzahl der Leukozyten und der prozentuale Anteil der Lymphozyten im Vollblut bestimmt.

Abbildung 6a zeigt, dass sechs Stunden nach IMM (Ø1,90 · 10⁶/mL) die zirkulieren- den Leukozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe (Ø4,96 · 10⁶/mL) signifikant vermin- dert waren. Auch bei laparotomierten Tieren (Ø 1,96 · 10⁶/mL) war die Anzahl zirku- lierender Leukozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe reduziert. Zwischen den beiden operierten Gruppen hingegen wurden keine Unterschiede gemessen. Der prozentua- le Anteil der Lymphozyten (Abb. 6c) war sowohl sechs Stunden nach IMM (Ø 50%) als auch nach Laparotomie (Ø54%) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Ø90%) ernied- rigt. Differenzen zwischen den beiden operierten Gruppen konnten wir nicht feststel- len. Dieser Effekt war nur vorübergehend messbar, wie die in Abbildung 6b und 6d dargestellten Ergebnisse zeigen. Drei Tage nach IMM bzw. Laparotomie fanden sich keine Unterschiede hinsichtlich der Anzahl zirkulierender Leukozyten (Abb. 6b) und Lymphozyten (Abb. 6 d) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Somit führten beide Eingrif- fe, unabhängig von der Traumatisierung des Darms zu einer vorübergehenden Lym- phozytopenie.

39

Abbildung 6 Vorübergehende Reduktion zirkulierender Lymphozyten

Leukozytenkonzentration 6 Stunden postoperativ

Kontrolle

Laparotomie IMM 0

2 4 6

** **

x106 Zellen/mL

Leukozytenkonzentration 3 Tage postoperativ

Kontro lle

Laparotomie IMM 0

2 4 6

x106 Zellen/mL

Lymphozyten 6 Stunden postoperativ

Kontrolle Laparotomie

IMM 0.00

0.25 0.50 0.75 1.00

** **

Lymphozyten [%Leukozyten]

Lymphozyten 3 Tage postoperativ

Kontrolle Laparotomie

IMM 0.00

0.25 0.50 0.75 1.00

Lymphozyten [%Leukozyten]

Vorübergehende Lymphozytopenie Weiblichen C57BL/6 Mäuse wurde 6 Stunden oder 3 Tage nach intestinaler Manipulation (IMM) oder Laparotomie Blut entnommen.

Nicht operierte Mäuse dienten als Kontrolle. Die Anzahl Leukozyten (a, b) und der prozentuale Anteil der Lymphozyten als Anteil der Leukozyten (c, d) wurden im Voll- blut bestimmt. Die Gruppengröße betrug n ≥ 4. Statistische Signifikanzen sind mit **:

p = 0,01 dargestellt.

a

c d

b

40

6.1.2 Unveränderte Apoptoserate im Thymus

Sechs Stunden nach IMM wurde eine Lymphozytopenie beobachtet (siehe 6.1.1) Ob und inwiefern diese mit einer erhöhten Apoptoserate im Thymus korreliert, sollte mit- tels Propidiumiodid-Zellzyklus-Assay (PI-Assay) durchflusszytometrisch untersucht werden. Die Apoptoseraten der unoperierten Kontrollgruppe als auch der beiden operierten Gruppen lagen sechs Stunden nach dem jeweiligen Eingriff im PI-Assay unter 1% (Abb. 7a). Auch drei Tage nach IMM oder Laparotomie(Abb.7b) konnten keine Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden werden.

41

Abbildung 7 Apoptoserate im Thymus-PI-Assay nach IMM oder Laparotomie

Kontrolle

Laparotomie

IMM 0

1 2 3

Apoptoserate [%]

Kontrolle

Laparotomie

IMM 0

1 2 3

Apoptoserate [%]

a b

Keine erhöhte Apoptoserate im Thymus nach IMM Weiblichen C57BL/6 Mäusen wur- de 6 Stunden (a) oder 3 Tage (b) nach Interstinaler Manipulation (IMM) oder Laparotomie der Thymus explantiert und mittels Propidium-Iodid-Zellzyklus-Assay auf Apoptosen un- tersucht. Thymi unoperierter Mäuse dienten als Kontrolle. Die Gruppengröße betrug n = 3.

Es sind exemplarisch Assay-Histogramme eines Kontrolltieres (c) und eines intestinal manipulierten Tieres (d) dargestellt. Die Ereignisse unter der Markierung (M₁) repräsentie- ren das Fluoreszensignal der Apoptosen in Prozent bezogen auf die Gesamtzahl der Sig- nale im Gate.

Kontrolle IMM

d

c

42

6.1.3 Erhöhte IL6-Konzentration im Serum

Um zu untersuchen, welche systemische Reaktion eine Intestinale Manipulation aus- löst, wurden die Spiegel der Serumzytokine TNFα und IL6 zu verschiedenen Zeit- punkten nach der Manipulation durchflusszytometrisch bestimmt. Als Kontrollen dien- ten, wie auch in den folgenden Versuchen, laparotomierte Mäuse sowie nicht operier- te Tiere. Sechs bis 72 Stunden nach dem Eingriff waren im Vergleich zur Kontrolle erhöhte IL6-Konzentratíon der intestinal manipulierten Tiere zu beobachten (Abb.

8a). Auch laparotomierte Mäuse entwickelten, verglichen mit der Kontrolle, erhöhte IL6-Serumkonzentrationen. Vergleicht man die beiden operierten Gruppen unterei- nander, so war lediglich zum Zeitpunkt sechs Stunden postoperativ ein signifikanter Unterschied messbar. Für TNFα konnten zu keinem Zeitpunkt signifikante Unter- schiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Serumkonzentrationen gemessen werden (Abb. 8b).

Ein operatives Trauma, wie hier herbeigeführt durch IMM oder Laparotomie, resultier- te in erhöhten IL6-Spiegeln, die über einen Zeitraum von 72 Stunden postoperativ erhöht blieben. Die Serumkonzentration von TNFα blieb durch die Operation jedoch unbeeinflusst.

43 IL6

6h 12h

24h

72h 0

500 1000

1500 Kontrolle

Laparotomie IMM

Zeit [h]

Konzentration [pg/ml]

*

*

*

*

*

*

TNFα

6h 12h

24h

72h 0

20 40 60

80 Kontrolle

Laparotomie IMM

Zeit [h]

Konzentration [pg/ml]

Erhöhte IL6-Konzentration im Serum nach IMM und Laparotomie Verschiede- nen Gruppen von C57BL/6 Weibchen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Laparotomie bzw. IMM (6h, 12h, 24h, 72h) Blut entnommen. Als Kontrollen dien- ten nicht operierte Mäuse. In gewonnenen Serumproben wurden die Zytokinkonzentrationen von IL6 und TNFα durchflusszytometrisch bestimmt. Ab- bildung (a) zeigt die zu den jeweiligen Zeitpunkten gemessenen IL6 Konzentratio- nen. In Abbildung (b) sind die entsprechenden TNF-Konzentrationen aufgetragen.

Die Gruppengröße betrug n ≥ 3. Statistische Signifikanzen sind mit (*): p ≤ 0,05 dargestellt.

a

b

Abbildung 8 IL6- und TNFα-Konzentration im Serum nach IMM und Laparotomie

44

6.1.4 Vorübergehende Suppression der Zytokinsekretion

Um zu untersuchen, ob und inwiefern IMM die Zytokin-Sekretionsleistung isolierter Milzzellen beeinflusst, wurden die Zytokinkonzentrationen in Organüberständen LPS- stimulierter Splenozyten durchflusszytometrisch bestimmt.

Milzen weiblicher C57BL/6 Mäuse wurden zu einem frühen Zeitpunkt (6 Stunden) und zu einem späteren Zeitpunkt (3 Tage) nach einer intestinalen Manipulation ent- nommen und aufbereitet. Als Kontrollgruppen dienten laparotomierte und nicht ope- rierte Mäuse.

Abb. 9 zeigt, dass Splenozyten intestinal manipulierter Mäuse weniger TNFα, IFNγ und IL6 auf einen inflammatorischen Stimulus hin sezernierten als die der nicht ope- rierten Kontrolle. Ein Gleiches galt für die Sekretionsleistung der Splenozyten laparo- tomierter Tiere. Zwischen der IMM-Gruppe und der Laparotomiegruppe wurden keine Differenzen gefunden. Hinsichtlich der Sekretion von IL10 konnten keine Unterschie- de festgestellt werden.

In Abb. 10 ist die Zytokinsekretion 3 Tage nach dem jeweiligen Eingriff dargestellt. Zu diesem Zeitpunkt fanden sich zwischen allen Gruppen keine Unterschiede.

45

Abbildung 9 Einfluss des IMM auf die ex-vivo-Induktion von Zytokinen, 6h postoperativ

TNFα

Kontrolle Laparotomie

IMM 0

200 400 600

* *

Konzentration im Kulturberstand [pg/mL]

IFNγ

Kontrolle Laparotomie

IMM 0

200 400 600

* *

Konzentration im Kulturberstand [pg/mL]

IL6

Kontrolle Laparotomie

IMM 0

100 200 300 400

* *

Konzentration im Kulturberstand [pg/mL]

IL10

Kontrolle Laparotomie

IMM 0

100 200

Konzentration im Kulturberstand [pg/mL]