bei  Dictyostelium discoideum .“ 

bei  Dictyostelium discoideum .“ 

Dissertation 

zur Erlangung des akademischen Grades  des Doktors der Naturwissenschaften 

an der Universität Konstanz Mathematisch­ 

Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich  Biologie, vorgelegt von Sandra Thal. 

Tag der mündlichen Prüfung:  23.02.2005  Referent: Prof. M. Groettrup 

Referentin: Privatdozentin C. Schlatterer

1.  Einleitung 

1.1. 

1.2  Differenzierungszyklus 

1.3.  Chemotaxis: Orientierung der Zellen in einem Gradienten,  Ausbildung einer stabilen Zellpolarität und Adaptation 

4 

1.4  Chemotaktische Signalkaskaden 

1.4.1.  Die cAMP regulierten Signalwege 

1.5.  Rolle des Calcium bei der Chemotaxis 

1.6.  Plasmamembran Calcium ATPase 

1.7.  Zellbewegung 

1.7.1.  Pseudopodienbildung 

1.7.2.  Ablauf der Zellbewegung 

1.7.3.  Zytoskelettproteine 

2.  Ziel der Dissertation 

3.  Material und Methoden 

3.1.  Allgemeine Liste 

3.1.1.  Chemikalienliste 

3.1.2.  Geräteliste 

3.1.3.  Verbrauchsmaterialien 

3.2.  Physiologische Lösungen und Medien 

3.2.1.   Dictyostelium ­Medium und Differenzierungspuffer 

3.2.2.   Dictyostelium  Differenzierungsplatten 

3.2.3.  Immunohistochemische­Lösungen 

3.2.4.  cAMP induzierte F­Aktinakkumulation 

3.2.5.  Pinozytose­Lösung 

3.2.6.  Phagozytoste­Lösung 

3.2.7.   D. discoideum  Stämme 

3.2.8.   E. coli  Stämme 

3.3.  Molekularbiologische Puffer, Medien und Reagenzien 

3.3.1.  Luria Broth­ Medium 

3.3.2.  LB­Platten 

3.3.3.  Puffer 

3.3.4.  Southern Blot­Lösungen 

3.4.  Physiologische Methoden 

3.4.1.  Zellanzucht von  D. discoideum  

3.4.2.  Einleitung des Differenzierungszyklus 

3.4.3.  Sporengewinnung 

3.4.4.  Einfrieren vegetativer Zellen 

3.4.5.  Simultane Untersuchung des Differenzierungsverhalten  von „Enigma“ und „Ganko“ im Vergleich zum Wildtyp 

25 

3.4.6.  Detailuntersuchung des Aggregationsverhaltens von 

„Enigma“ und Wildtyp 

25 

3.4.7.  Selektionsverfahren zur Anreicherung von 

Zellpolaritätsmutanten 

26 

3.4.8.  Bestimmung des Wachstumsverhaltens in 

Suspensionskultur 

29 

3.4.9.  Pinozytose­Experiment 

3.4.10.  Phagozytose­Experiment 

3.4.11.  cAMP induzierte F­Aktinakkumulation 

3.4.12.  Untersuchung der Lichtstreuungsoszillation 

3.4.13.  Untersuchung von Dunkelfeldwellen 

3.4.14.  Chemotaxis mit einer cAMP gefüllten Glaskapillare 

3.4.15.  Immunohistochemische Nachweis der F­Aktinlokalisation 

3.4.16.  Immunohistochemische Kernfärbung 

3.5.  Molekularbiologische Methoden 

3.5.1.  PCR­Ansätze 

3.5.2.  PCR­Programme 

3.5.3.  Primer für Sonden und PCR­Produkte 

3.5.4.  Primer für Sequenzierungen 

3.5.5.  DANN­Präparation von  D.discoideum  

3.5.6.  RNA­Präparation von  D. discoideum  

3.5.7.  cDNA­Synthese 

3.5.8.  RT­PCR 

3.5.9.  REMI­Mutangenese 

3.5.10.  “REMI­Rescue” 

3.5.11.  Homologe Rekombination von “Ganko” und “Enigma” 

3.6.  Allgemeine molekularbiologische Methoden 

3.6.1.  Southern Blot 

3.6.2.  Standardtechniken 

4.  Ergebnisse 

4.1.2.  Zellvolumen und Differenzierung 

4.1.3.  Chemotaktisches Verhalten 

4.1.4.  Änderung der Zellgestalt bei autonomer cAMP­ 

Segregation: Lichtstreuungsoszillation und  Dunkelfeldwellen 

51 

4.1.5.  Zytoskelettuntersuchungen 

4.1.6.  Kernzahl, Zellteilung und Endozytose 

4.1.7.  Molekularbiologische Analyse der REMI­Mutante 

4.1.8.  Homologe Rekombinante: „ Wildtyp/“Ganko 

“ 

4.2.  Untersuchung der REMI­Mutante: „Enigma“ 

4.2.1.  Selektion der Zellpolaritätsmutante 

4.2.2.  Zellvolumen und Differenzierung 

4.2.3.  Änderung der Zellgestalt bei autonomer cAMP­ 

Segregation: Dunkelfeldwellen und  Lichtstreuungsoszillation 

67 

4.2.4.  Zytoskelettuntersuchungen 

4.2.5.  Chemotaktisches Verhalten 

4.2.6.  Kernanzahl, Zellteilung und Endozytose 

4.2.7.  Molekularbiologische Analyse 

4.2.8.  Homologe Rekombinante: Wildtyp/“Enigma 

“ 

4.3.  Identifizierung und Klonierung einer möglichen  

Plasmamembran Calcium ATPase  aus  D. discoideum  

79 

4.3.1.  Identifizierung und Lokalisierung 

4.3.2.  Proteinanalyse der möglichen dPMCA 

4.3.3.  Molekularbiologische Analyse 

5.  Diskussion 

5.1.  Die REMI­Mutante: „ Ganko“ 

5.2.  Die REMI­Mutante: „ Enigma“ 

5.3.  Die mögliche  dPMCA  

6.  Danksagung 

7.  Inhalt der CD´s­ Filmlegenden 

98

Diese Arbeit beschreibt zum einem die Isolation von zwei REMI­ 

Zellpolaritätsmutanten („Ganko“, „Enigma“) sowie die Charakterisierung ihrer  Phänotypen und die molekularbiologischen Analysen der REMI­Integrationen. 

Zum anderen beschreibt die Arbeit die Isolierung eines Gens für eine möglichen  Plasmamembran Calcium ATPase aus Dictyostelium und seine molekularbiologische  Charakterisierung. 

Bei der ersten REMI­Mutante „Ganko“ konnte erstmalig für Dictyostelium gezeigt  werden, dass der 3´UTR Bereich von Aktin 8 für die Bildung eines normalen F­ 

Aktinzytoskeletts in den Pseudopodien benötigt wird. Dabei beeinflusst die 

Integration des REMI­Vektors 293 bp nach dem Stopkodon und 283 bp bzw. 277 bp  nach den beiden Polyadenylierungssignalen nicht die Expression von Aktin 8 in der  Mutante. Dennoch konnte „Ganko“ aufgrund dieser Integration sich im 

Selektionsassay durch 1.2 µm große Filterporen entlang eines niedrigen cAMP­ 

Gradienten bewegen und bewies auch im Chemotaxisassay mit einer 10 µM cAMP  gefüllten Glaskapillare, dass er sensitiver auf cAMP als der Wildtyp reagierte. Bei den  cAMP stimulierten F­Aktin Anreicherungsassays wurde unter Standardbedingung  (10 µM cAMP) wie bei Stimulation mit 1 µM cAMP  bei „Ganko“ weniger F­Aktin, als  bei dem Wildtyp akkumuliert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass F­Aktin in  der Mutante genauso wie im Wildtyp in den Pseudopodien lokalisiert war, allerdings  mit einer anderen Verteilung. Bei „Ganko“ bildet das F­Aktinnetzwerk kein schmales  Band wie beim Wildtyp, sondern verteilte sich diffus in den Pseudopodien. Anhand  gleicher Belichtungszeiten bei den Bildern der F­Aktinfärbung konnte gezeigt werden,  dass die Intensität der F­Aktinfärbung bei „Ganko“ deutlich niedriger war als beim  Wildtyp. Veränderungen in der Differenzierung, des Zellvolumens, der 

Wachstumsrate, der Endozytose oder die Änderung der Zellgestalt bei autonomer  cAMP­Segregation in Suspensionskultur bzw. auf Festmedium konnten gegenüber  dem Wildtyp nicht festgestellt werden. 

Die Untersuchungen der Homologen Rekombinante Wildtyp/ „Ganko ⁺ “ zeigte, dass  nur die Integration des REMI­Vektors für den Phänotyp verantwortlich war. 

Anhand dieser Ergebnisse wird vermutet, dass der 3´UTR Bereich für die Regulation  der posttranskriptionelle Prozessierung benötigt wird. Die Integration des REMI­

Modell, dass auf den Daten des Phänotyps basiert, diskutiert. 

Bei der zweiten REMI­Zellpolaritätsmutante „Enigma“ konnte auch über Homologe  Rekombination gezeigt werden, dass die Integration des REMI­Vektors 

verantwortlich war, für den beschrieben Phänotyp der Mutante. Die Integration des  Vektors erlaubte „Enigma“ sich im Selektionsassay in sehr kurzer Zeit chemotaktisch  durch 1.2 µm große Filterporen entlang eines cAMP­Gradienten zu bewegen. Auch  besaß diese Mutante wie „Ganko“ eine Veränderung im F­Aktinzytoskelett, wobei der  relative Gehalt der F­Aktin Anreicherung nach cAMP Stimulation genauso hoch war  wie beim Wildtyp. Diese Veränderung im F­Aktinzytoskelett resultierte bei „Enigma“ 

in der Ausbildung von Filopodien statt Pseudopodien. Des Weitern besaß „Enigma“ 

eine flacher Zellgestalt als der Wildtyp und Veränderung in der Differenzierung. 

„Enigma“ entwickelte sich genauso wie der Wildtyp bis zum Übergang zwischen dem  multizellulären Aggregat und dem „mound“­Stadium. Bei diesem Übergang kam es  bei der Mutante zu einer veränderten Regulation der Zell­Zellkontakte. Dies führte zu  einem Auseinanderbrechen des multizelluläre Aggregat  in unterschiedliche große  Einzelstücke. Diese Einzelstücke differenzieren sich dann zeitverzögert über Bildung  der „slug“­ und „mexican­hat“­Stadien zu Fruchtkörpern. Insgesamt  benötigte 

„Enigma“  30 Stunden und der Wildtyp 24 Stunden bis zur Kulmination. 

Bei der chemotaktischen Bewegung unter Standardbedingung wurden bei „Enigma“ 

mehr laterale Pseudo­ bzw. Filopodien ausgebildet als beim Wildtyp, doch konnte  kein Unterschied bei der chemotaktischen Geschwindigkeit zwischen den beiden  Zelllinien ermittelt werden. Diese Mutante besaß gegenüber dem Wildtyp noch eine  gesteigerte Pinozytose. 

Effekte auf die Wachstumsrate oder Änderung auf der Zellgestalt bei autonomer  cAMP­Segregation in Suspensionskultur bzw. auf Festmedium konnten nicht  festgestellt werden. 

Die Genetische Grundlage für diesen Phänotyp konnte nicht analysiert werden, da  die genomische Sequenz aus dem religierten und sequenzierten REMI­Plasmid  keinem bekannten Gen oder intergenischen Sequenz zugeordnet werden konnte. 

Vermutet wird, dass die veränderte Regulation eines Gens aus der Rho­Familie 

Dictyostelium discoideum  identfiziert werden. Die Analyse der Proteindomänen lässt  vermuten, dass es sich um eine PMCA handelt. Die Sequenz der mögliche dPMCA  konnte über Sequenzierung von PCR­Amplifikate und eines cDNA Klons aus einer  cDNA­Bank (Tsukuba)  fast vollständig isoliert werden. Des Weiteren konnte gezeigt  werden, dass die mögliche dPMCA nur als einzelne Kopie im Genom enthalten ist. 

Über eine Expressionsstudie wurde gezeigt, dass die mögliche dPMCA in allen  Entwicklungsstadien gleichbleibend exprimiert wird. Die Daten des Dictyostelium­ 

genomprojekts erlaubten die Lokalisation der möglichen dPMCA auf dem  Chromosom 5.

Hiermit erkläre ich, Sandra Thal, dass die vorliegende Dissertationsarbeit mit dem  Titel: „ Untersuchung zur chemotaktischen Signalkaskade bei Dictyostelium 

discoideum“ von mir selbständig verfasst wurde. Bei der Erarbeitung und Verfassung  der Dissertationsarbeit wurden keine Quellen oder Hilfsmittel, als die angegeben  benutzt. 

Sandra Thal

Indische Sprichwort

1. Einleitung 

1.1. Dictyostelium discoideum 

Dictyostelium discoideum gehört zu der Familie der Dictyostelidea und wurde  anfänglich zu der Ordnung der Ascrasiomycetes  klassifiziert. 

Aufgrund ribosomaler RNA­ und Aminosäure­Analyse des Elongationsfaktors EF­1α  (Baldauf 1997) kam es zu einer neuen Positionierung der Dictyostelidea zwischen  den Pilzen und Pflanzen als eigene Gruppe der Mycetozoa. 

Die erste Spezies aus der Familie der Dictyostelidea wurde 1869 von Brefeld (Brefeld  1869) aus Pferdemist isoliert und als Dictyostelium mucoroides klassifiziert. Er prägte  den Begriff Dictyostelium der sich aus Dicty (Netzartig) und stelium (Turmartig) 

zusammensetzt. Die Auswahl dieser beiden Wörter basierte auf der Beobachtung  des netzförmigen Aggregationsstadiums und turmförmigen Fruchtkörpers. Erst 1930  war es möglich Mitglieder der Dictyostelidea labortechnisch zu kultivieren. Der  anfängliche LaborstammDictyostelium discoideum (NC 4) wurde 1935 in North  Carolina aus Waldboden isoliert. Der in dieser Arbeit verwendete Laborstamm Ax­ 2  ist eine Derivat  von Ax­1. Beide können aufgrund zweier Punktmutationen in 

axenischem Medium kultiviert werden. 

Was macht die Verwendung von Dictyostelium discoideum so interessant für die  Grundlagenforschung ? 

Zum einen die gute Kultivierbarkeit, das haploide Genom mit 40 Mbp und der 

ungewöhnliche Differenzierungszyklus: dabei differenzieren sich einzelne Amöben zu  einem multizellulären  Fruchtkörper (Abb. 1). Aufgrund dieses Differenzierungszyklus  ist es möglich an einem Organismus das Zellverhalten von Einzelzellen bei der Pino­,  Phagozytose, Zellteilung, Zell­Zellkommunikation, Zellpolarität und Chemotaxis zu  untersuchen. In den multizellulären Stadien kann die Differenzierung des 

multizellulären Aggregats zu einem Fruchtkörper, die Apoptose von Zellen, Zell­ 

Zellkommunikation, Zellsortierung, Phototaxis und Chemotaxis untersucht werden.

1.2. Differenzierungszyklus 

Der Entzug der Nahrungsquelle, z.B. der Bakterien oder des Nährmediums induziert  den Differenzierungszyklus (Abb.1). Nachdem die einzelnen Amöben ungefähr 4  Stunden gehungert haben, beginnen einzelne Zellen mit der Ausschüttung von 3´­ 

5´zyklischen Adenosinmonophosphat (Watson, Westwick et al.), welches andere  Amöben chemotaktisch stimuliert. cAMP dient den Zellen nicht nur als 

chemotaktischer Lockstoff, sondern führt auch zur Synchronisation der Zellen  basierend auf Änderungen der Genexpression (Oyama and Blumberg 1986). 

Nicht nur die Zellen im Inneren des späteren Aggregationszentrums schütten cAMP  (6 Minuten Intervall) (Otto and Kessin 2001) aus, sondern auch Zellen die auf das  Zentrum zuströmen, was zu einer Verstärkung des Anfangssignals führt. 

Nachdem das multizelluläre Aggregat (10 ⁵ Zellen) (Otto and Kessin 2001) gebildet  wurde, kommt es über das „mound“­Stadium zur Weiterdifferenzierung zum 

Pseudoplasmodium. Das Pseudoplasmodium ist ca. 1­2 mm groß und bewegt sich in  einer Schleimhülle auf dem Substrat fort. Aufgrund seiner morphologischen 

Ähnlichkeit mit einer Nacktschenke wird dieses Stadium auch als „slug“­Stadium  bezeichnet (Raper 1952). Im „slug“ ist eine morphologische Heterogenität erkennbar,  wobei die Sortierung der unterschiedlichen Zelltypen bereits im „mound“­Stadium  cAMP­abhängig stattgefunden hat (Dormann, Vasiev et al. 2000). Im anterioren Ende  des „slug´s“ sind die Prästielzellen (20 %) lokalisiert und im posterioren Ende 

befinden sich die Präsporenzellen (80%) (Raper 1940) mit den sogenannten anterior  like cells (ALC) (Sternfeld 1982). Die ALC´s sind in der Lage bei einem Ausfall der  Prästielzellen deren Aufgaben zu übernehmen. Sie sorgen dann auch für die 

Aufrechterhaltung des 1:4 Verhältnisses von Prästiel­zu­Präsporenzellen (Abe, Early  et al. 1994). 

Bevor der „slug“ sich weiterdifferenziert kann er auf dem Substrat wandern, wobei er  sich phototaktisch und thermotaktisch orientiert (Bonner, Clarke et al. 1950) oder sich  direkt zum „mexican hat“ differenziert. Nach dem „mexican Hat“­ Stadium kommt es  zur Kulmination, wobei der Fruchtkörper gebildet wird. Dieser besteht aus einem  Sporenkopf, einem Sporenträger und einer Zellscheibe, die als Basis dient. 

Unter natürlichen Bedingungen erfolgt die Verbreitung der Sporen durch Wasser­, 

Luftfeuchtigkeit und besserem Nahrungsangebot kommt es zur Keimung der Sporen  und damit zu einem Neubeginn des Lebenszyklus . 

Abb. 1:  Differenzierungszyklus von Dictyostelium discoideum.  Sporenkeimung 

Vegetative  Zellen 

Aggregations­ 

stadium 

Mound­ 

stadium  Slugstadium

anterior 

posterior 

Kulminations­ 

stadium 

Fruchtkörper

1.3. Chemotaxis: Orientierung der Zellen in einem Gradienten, Ausbildung  einer stabilen Zellpolarität und Adaptation 

Grundlage für die Bildung des multizellulären Organismus ist das chemotaktische  Zusammenströmen der Amöben. Bevor es zur chemotaktischen Zellbewegung  kommt orientieren sich die Zellen entlang des asymmetrischen Lockstoffgradienten  und bilden nachfolgend eine stabile Zellpolarität aus. 

Die Orientierung der Zelle innerhalb eines externen asymmetrischen 

Lockstoffgradienten wird durch die Stimulation der Lockstoffrezeptoren vermittelt,  wobei die Lockstoffrezeptoren uniform über die Zelloberfläche verteilt sind und auch  bleiben. Die Transduktion der Rezeptorbesetzung am Ort der höchsten 

Lockstoffexponierung führt zu einer lokalen Anreicherung von Signalmolekülen an  der Zellmembran am Ort der höchste Rezeptorbesetzung. Diese Anreicherung führt  zu lokalen Aktivierungen von nachgeschalteten Signalwegen (s.u.) die zu einer  Polarisierung führen kann. 

Die Polarisierung von Zellen äußert sich in einer asymmetrischen Veränderung der  Zellgestalt mit einem erkennbaren anterior­ und posterior­ Bereich. Der anterioren  Bereich oder „leading egde“ wird gebildet durch Anreicherung von filamentösem  Aktin sowie den Aktinbindeproteine. Im posterioren Bereich kommt es zu 

Anreicherung von Myosion II, Cortexillin und deren Bindeproteinen (Devreotes and  Zigmond 1988; Manahan, Iglesias et al. 2004). 

Doch nicht nur über die anteriore Anreichung von F­Aktin und posteriore 

Anreicherung von Myosin wird eine Zellpolarität etabliert sondern z.B. auch über  einen PIP3­Gradienten und einen Calcium­Gradienten innerhalb der Zelle (s.u.). 

Bei einer Positionsveränderung der Lockstoffquelle wird die asymmetrische  Zellgestalt aufrechterhalten, indem sich der anteriore Zellbereich zur höchsten  Lockstoffkonzentration bewegt. Dieses Verhalten basiert auf einer erhöhten 

Sensitivität und einer erhöhten Aktin­Zytoskelettaktivität in diesem Bereich der Zelle. 

Beide Faktoren ermöglichen eine schneller Bewegung in Richtung der  Lockstoffquelle. 

Bei einer Positionsveränderung der Lockstoffquelle mit einem sehr steilen 

aufgehoben werden, wobei es zur Ausbildung einer neuen anterior­posterior Achse  kommt (Devreotes and Janetopoulos 2003). 

Neben der Zellorientierung und Etablierung einer stabilen Zellpolarität ist auch die  Adaptation der Zellen essentiell für die Chemotaxis. Die Zellen reagieren auf die  Veränderung der Rezeptorbesetzung und adaptieren daran, wenn die Besetzung  konstant gehalten wird. Wenn die Rezeptorbesetzung erhöht wird kommt es zu einer  erneuten Zellreaktion in Richtung der Stimulation und die Zellen bewegen sich auf  die Lockstoffquelle zu. Unabhängig  davon, ob sie sehr weit oder sehr nah von der  Quelle entfernt sind. Die Abnahme des Lockstoffstimulus führt zu einer 

Desensibilisierung und erlaubt eine Neuorientierung der Zellen. So ist es möglich,  dass sich die Zellen innerhalb eines 2%igen Gradienten orientieren können. 

1.4. Chemotaktische Signalkaskaden 

Welche Komponenten sind für die Ausbildung einer chemotaktischen Bewegung  verantwortlich bei Dictyostelium discoideum ? 

Die Induktion des Rezeptor­Zytosol­Signalwegs durch cAMP­Bindung an den  heterotrimer gekoppelten G­Protein­Rezeptor führt zu Aktivierung multipler 

Signalkaskaden (Abb. 2) die für die Zellorientierung, die Etablierung der Zellpolarität,  den Adaptationsprozeß, Zellbewegung und Verstärkung des cAMP­Signals 

verantwortlich sind. Diese Signalkaskaden setzten sich aus PI3K­abhängigen­,  MAPK­ und ACA­abhängigen Signalwegen zusammen. Hinzu kommen Signalwege,  die durch sekundäre Botenstoffe wie IP3 (Inositol­1,4,5­trisphosphat), cGMP 

(zyklisches Guanosinmonophosphat) und Calcium gesteuert werden. 

1.4.1. Die cAMP regulierten Signalwege 

Dictyostelium verfügt insgesamt über 4 spezifische cAMP­Rezeptoren (cAR1, cAr2,  cAR3,cAR 4), die zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten expremiert  werden: cAR1 in der Aggregationsphase, cAR3 bei der „Mound“­Bildung, cAR2 im  Übergang vom „Slug“ zum Kulminationsstadium und cAR4 in der späten 

Kulminationsphase (Parent and Devreotes 1996).

Die Bindung von cAMP an cAR1 zu Beginn der Aggregationsphase induziert die  chemotaktische Bewegung der Einzelzellen, die mit der Bildung des multizellulären  Aggregats endet. 

An cAR 1 können mindestens 2 unterschiedliche heterotrimer G­Proteine binden,  zum einen Gα2βγ zum anderen Gα9βγ. Die Induktion der multiplen Signalkaskaden  erfolgt nach heutigem Wissenstand über die Gβγ  ­ Untereinheit von α2. 

PIP3­Kaskade 

Die Gβγ­Untereinheit aktiviert die PI3­Kinase, diese wandelt Posphatidylinositol­4,5­ 

Bisphosphat (PIP2) in Posphatidylinositol­3,4,5­ Triphosphat (PIP3) um, dabei wird  bei PIP3 die Bindestelle für die PH­Domän (Pleckstring­Homology) tragenden  Proteine (Crac, AktB/PKB, PhdA, PTEN)  zugänglich gemacht. 

Diese regulatorischen Proteine translozieren sekundenschnell durch Bindung der  PH­Domäne an unterschiedliche Bereiche der Zellmembran, was anhand von GFP­ 

Markierung nachgewiesen werden konnte (Meili, Ellsworth et al. 1999; Dormann,  Weijer et al. 2002; Iijima and Devreotes 2002). Beispielsweise Crac (cytosol regulator  of adenylyl cyclase) oder PhDA (PH­Domän tragendes Protein A) welche beide nach  der Stimulation an das Vorderende der Zelle (Parent, Blacklock et al. 1998) 

translozieren. Crac wird benötigt für die Aktivierung der Adenylylzyklase (ACA),  welche hauptsächlich für die Synthese von cAMP verantwortlich ist (s.u.). PhDA wird  für die F­Aktin­Organisation am sogenannten „leading egde“ benötigt. Im Gegensatz  dazu führt die Fusion der Akt/PKB (Protein Kinase B) PH­Domänen zur direkten  Stimulation und Translokalisation der PKAa (Protein Kinase A alpha) an das  Hinterende der Zelle. Dort inhibiert die PKAa die MHCKA (Myosin schwere Kette  Kinase A) und führt dort zur Anreicherung von Myosin (Chung and Firtel 1999). 

Gegenspieler der PI3Kinase ist die PI3­Phosphatase (PTEN) (Iijima and Devreotes  2002), die nach  cAR 1­Induktion vom Zytosol an das Hinterende der Zelle 

transloziert und sich dort in die Plasmamembran anlagert. Dort dephosphorylisiert  PTEN PIP3 und der PIP3­Gardient wird ausgebildet (Comer and Parent 2002).

MAP­Kaskade 

Bei der MAP­Kaskade kommt es nach Phosphorylierung von cAR 1 zu einem  Zusammenspiel der MAP­Kinase ERK1 und einer Vielzahl von interagierenden 

Proteinen wie z.B. der MHCK, der PKA, der Guanylyzyklasen, Mitgliedern der kleinen  G­Proteinfamilie wie Ras­ und Rac­GTPasen und letztlich den Proteinen des 

Zyktoskeletts. Beispielsweise führt die transiente Aktivierung der Guanylyzyklasen  (GCase) zur Bildung von cGMP, welches wiederum  bei der Regulation der MLKK  (Myosin leichte Kette Kinase) beteiligt ist (Yumura 1993; Liu and Newell 1994). Die  Phosphorylierung der leichten Myosinkette äußert sich in einer Translokalisierung der  Myosinkette innerhalb des Zytoskeletts zu den sog. „foci“. Dort kommt es zur 

Phosphorylierung der schweren Myosinkette und somit zur Dissoziation des Myosins  vom Zytoskelett (Berlot, Spudich et al. 1985). 

Adenylylzyklase (ACA) und die Phosphodiesterasen (PDE) 

cAMP wird nicht nur als chemischer Lockstoff für die Bildung des multizellulären  Aggregats benötigt, sondern dient auch zur Zell­Zellkommunikation. Dafür muß zum  einen cAMP  ausgeschüttet und zum anderen cAMP extra­ wie intrazellulär abgebaut  werden. 

Für die Segregation von cAMP ist eine Adenylylzyklase (ACA) verantwortlich die bei  der Aggregation von der spontane cAMP­Segregation aktiviert wird. Die ACA 

regulierte Ausschüttung von cAMP zu benachbarten Zellen und der ursprüngliche  cAMP­Puls wandert dann als spiralförmige oder konzentrischen cAMP­Welle durch  die Zellpopulation (Siegert 1991). 

An der positiven Regulation der ACA sind neben Crac, „Aimless“, Erk2 , das 

zytosolische Protein  „Pianissimo“ und möglicherweise RasC beteiligt (Chen, Insall et  al. 1996; Insall, Borleis et al. 1996) . 

Für den cAMP Adaptationsprozess wird eine negative Regulation der ACA benötigt,  wobei die einzelnen Komponenten dieses Regulationsweges noch nicht bekannt  sind. Es wird vermutete, dass die Gα9­Untereinheit daran beteiligt ist (Abb. 2)  (Brzostowski, Parent et al. 2004). 

Die intrazelluläre wie extrazelluläre Degradation von cAMP wird von 

Phosphodiesterasen übernommen, die in drei funktionelle Gruppen aufgeteilt sind.

Die erste Gruppe (Pde 1, Pde 4) baut das extrazelluläre cAMP ab. Mitglieder der  zweiten (Pde2/RegA, Pde6/GbpB/PdeE) und dritten Gruppe 

(Pde3,Pde5/GbpA/PdeD, Pde6/GbpB) bauen intrazelluläres cAMP und cGMP ab  (Manahan, Iglesias et al. 2004). 

Abb. 2: Zusammenfassung unterschiedlicher Signalkaskaden in Anlehnung an  (Chung, Funamoto et al. 2001; Kimmel and Parent 2003; Brzostowski, Parent et al. 

2004). Abkürzungen und Erklärung siehe Text bzw.  = bestätige Signalwege, 

= vermutete Signalwege,         = Inhibierung des Signalwegs.

1.5. Rolle des Calcium bei der Chemotaxis 

Es ist bekannt das Calcium in unterschiedlichen Zellsystemen als „second 

messenger“ dient  und bei der Chemotaxis von Dictyostelium ein Calciumgradient in  den Zellen aufgebaut wird (Schlatterer, Gollnick et al. 1994; Yumura, Furuya et al. 

1996). Des Weiteren wird Calcium für den Auf­ und Abbau des Zytoskeletts benötigt  (Taylor, Condeelis et al. 1977; Europe­Finner and Newell 1986; Newell, Malchow et  al. 1995), dennoch ist die Rolle von Calcium bei der Chemotaxis sehr kontrovers  diskutiert. Beispielsweise können sich menschliche Neutrophile polarisieren und  chemotaktisch bewegen ohne, dass es zu einer messbaren Änderung des  zytosolisch freien Calciums kommt (AL­Mohanna 1990; Elsner 1996). Bei 

Dictyostelium wurde von Traynor et al.(Traynor, Milne et al. 2000) der iplA­Rezeptor  (IP3­Receptor­like) über homologer Rekombination von IP3­Rezeptorsequenzen  deletiert. Anhand seiner Studien mit dieser Mutante postulierte Traynor, dass  Calcium keine Rolle spielt bei der Etablierung von Zellpolarität und der 

chemotaktischen Bewegung. Gestützt wird diese These durch Untersuchung einer  Mutante bei der eine Plasmamembran Calciumpumpe (PMCA) aus menschlichen  Erythrozyten in Dictyosteliumzellen überexpremiert wurden (Cubitt, Reddy et al. 

1998). Trotz einer veränderten Calcium­Homeostase bewegten sich die Zellen mit  gleicher Geschwindigkeit, wie die Kontrollzellen auf die cAMP­Quelle zu. Allerdings  entwickelte sich diese Mutante nur bis zum „Mound“­Stadium. 

Anderseits ist bekannt, dass viele zytoskeletale Prozesse durch Calcium reguliert  werden so z.B. wird ein 34 kd­Protein, welches Calciumreguliert ist, für die 

Vernetzung der F­Aktinfilamente benötigt (Furukawa, Maselli et al. 2003). Ein  anderes Beispiel ist die Tatsache, dass Zellen die mit dem Calciumchelator EGTA  über eine „scrape loading“­Technik beladen wurden und nur noch eine verminderte  chemotaktische Reaktion zeigen (Unterweger and Schlatterer 1995). 

Calcium und IP3 

Die Regulation der Calciumhomeostase wird durch die Bildung von IP3 induziert,  nachdem der cAR1­Rezptor cAMP gebunden hat und es zur Aktivierung der Gα2­  Unterheit gekommen ist. Dies aktiviert die PhospholipaseC, welche die Spaltung von  PIP2 zu IP3 und Diacylglycerol (DG) veranlasst. Die Bindung von IP3 an IP3­Rezeptor

Kanäle führt zur Freisetzung von Calcium aus internen Speichern (Europe­Finner  and Newell 1986; Jayaraman, Ondriasova et al. 1995; Nebl, Kotsifas et al. 2002). 

In Dictyostelium findet sich neben den IP3 sensitiven Speicher auch ein sog. 

acidosomaler Calciumspeicher, welcher durch Bindung von Arachidonsäure aktiviert  wird (Flaadt, Jaworski et al. 1993; Schaloske, Sonnemann et al. 1998). 

Die Freisetzung von Calcium aus internen Speichern führt im Gegenzug zu einem  Einstrom von Calcium über die Plasmamembran, der als Kapazitativer 

Calciumeinstrom bezeichnet wird. Für das Absenken der Calciumkonzentration auf  die basale Calciumkonzentration stehen der Zelle die Calciumpumpen in den 

internen Speichern und in der Plasmamembran zur Verfügung. Wie Schlatterer et.al  (Schlatterer, Happle et al. 2004) zeigen konnte, scheinen die Plasma­ 

membranpumpen für die Calciumregulation sehr wichtig sein. So wird z.B. bei 

Induktion des kapazitativen Calciumeinstroms gleichzeitig der Ausstrom von Calcium  über die Plasmamembran­ Calciumpumpen inhibiert  und nicht der Einstrom von  Calcium über die Plasmamembran hochreguliert. 

1.6. PMCA 

Plasmamembran­Ca ²⁺ ­ ATPasen (PMCA´s) gehören zu der P2 (Subtyp 2B) 

Unterfamilie der P­Typ Ionen transportierenden ATPasen.  Das ubiqitäre Vorkommen  der PMCA´s innerhalb der Eukaryoten führte zu der Modellvorstellung, dass sich die  PMCA´s aus 10 Transmembransegmenten zusammensetzen (Abb. 3), wobei die  NH2 ­ und COOH­ Enden der PMCA im Zytosol lokalisiert sind. 

Der größte Teil der Proteinmasse befindet sich im Zytosol und wird in 3 Segmente  untereilt: Einer intrazellulären Schleife zwischen dem Transmembransegement 2 und  3 (Transduktionsdomäne); der großen katalytischen Domäne mit der ATP­ 

Bindungstelle zwischen den Transmembrandomänen 4 und 5; einem langen  Schwanzteil nach der letzten Transmembrandomäne (regulatorische Domäne)  (Strehler and Zacharias 2001) (Abb. 3).

Abb. 3:  Schematische Darstellung der eukaryotischen Modell­PMCA und ihrer  Transmembranregionen (TM) mit den einzelnen Domänen. In Anlehnung an  (Strehler and Zacharias 2001). 

1.7. Zellbewegung 

1.7.1. Pseudopodienbildung 

Die Bewegungsentstehung bei Dictyostelium wird anhand von mehreren  unterschiedlichen Modellen diskutiert. Beispielsweise gibt es Befürworter des  frontalen Kontraktionsmodells (Rubino, Fighetti et al. 1984)( Abb. 4, A), wobei die  Vorwärtsbewegung der Zelle auf einer Interaktion von F­Aktin mit dem 

unkonventionellen Myosin beruht. Gestützt wird diese These durch das  Vorhandensein einer Myosin I­ Isoform in frisch gebildeten Pseudopodien. 

Abb. 4: Bewegungsmodelle (A) frontales Kontraktionsmodell und (B) kortikales  Expansionsmodell. 

A  B 

Myosin I 

Verankerte Aktinfilamente 

Verankerte Aktinfilamente

Oder das kortikale Expansionsmodell (Condeelis, Jones et al. 1992; Stites, Wessels  et al. 1998) (Abb. 4, B) welches auf der Verbindung zwischen F­Aktin und Membran  verankerten Aktinfilamenten basiert, ohne Beteiligung von Myosin I. 

1.7.2. Ablauf der Zellbewegung 

Nachdem die Zelle die Richtung des chemotaktischen Lockstoffs lokalisiert hat  kommt es zur Ausbildung eines Pseudopodiums. Dieses sendet ein Adhäsionssignal  in die Zellen und es kommt zum Aufbau der Kontraktionskraft, welche der Zelle die  Bewegung zur Pseudopodienspitze ermöglicht. Mit dieser Bewegung kommt es zum  Ablösen des Uropods vom Substrat und einer Verkürzung der Zelle (Condeelis  1998). 

Die Geschwindigkeit der chemotaktischen Zellbewegung liegt bei D. discoideum  zwischen 10­ 15 µm/min (Varnum and Soll 1984). 

1.7.3. Zytoskelettproteine 

Das Zytoskelett von Dictyostelium setzt sich aus den beiden Hauptkomponenten  Aktin und Myosin und deren Regulatoren so wie aus Monomeren Bindeproteinen  (Cofilin, Cap, Profilin I, Profilin II) und F­Aktin Auf­ und Abbauproteine (Severin,  Protovlin,Cap 32/34) zusammen (Ludwig 1999). 

1. Signal         2. Pseudopodienbildung  3. Adhäsion 

4. Kontraktion       5. Ablösung 

Abb. 5: Wichtige Schritte bei der Pseudopodienbildung. 

Erklärung siehe Text, erstellt in Anlehnung an (Condeelis 1998)

Aktin 

Der Gesamtgehalt von Aktin beträgt ca. 8 % der gesamten zellulären Proteinmasse  und besteht in unstimulierten Zellen aus einem Gleichgewicht von G­ und F­Aktin. 

Der Aktinpool wird nicht durch ein einziges Gen gespeist,  sondern von einer Aktin­ 

Superfamilie. Diese setzt sich aus  17­20 unterschiedlichen Genen zusammen  (McKeown 1978; Patricia Romans 1985), ähnlich der Aktin­Superfamilie der  Mammalia (Vandekerckove 1979; Buckingham, Alonso et al. 1986). 

Die Unterscheidung der einzelnen Isoformen in beiden Aktin­Superfamilien erfolgt  nur über die 5´­ wie 3´untranslatierten Sequenzen, da aufgrund der hohen 

Sequenzkonservierung keine Unterscheidung im kodierenden Bereich möglich ist. 

Nach cAMP­Stimulation kommt es innerhalb von 3­5 Sekunden zu einer Erhöhung  um 50­ 60 % des F­Aktingehalts in den Zellen (McRobbie 1985a). Nicht nur die  Anreicherung von F­Aktin  nach einer Stimulation und die Ausbildung der stabilen  asymmetrischen Polarisierung ist entscheidend für die Zellbewegung, sondern auch  der Aufbau eines stabilen 3­dimensionalen Aktinnetzwerkes. Dabei werden die 

gebildeten Aktinfilmante über sog. Vernetzungs­ und Bündelungs­Proteine (α­Aktinin,  Interaptin, Fimbrin etc.) stabilisiert und über Membranankerproteine (Ponticulin, Talin,  Comitin, Interaptin und Hisactophilin) mit der Zellmembran verbunden (Noegel and  Luna 1995). 

Myosine 

Dictyostelium besitzt neben diversen unkonventionellen Myosinen (Myosin I­ 

Isoformen) ein konventionelles Myosin, Myosin II. 

Myosin II ähnelt in seiner Struktur sehr dem Mammalia Myosin und setzt sich aus  einer paarigen Myosin Schweren Kette (Schwanzregion) und zwei regulatorischen  Leichten Ketten (Kopfregion) zusammen (Warrick 1987). Wie in der Skelett­ 

muskulatur wird die Schwanzregion für die Zusammenlagerung der Myosionketten  benötigt. Die Zusammenlagerung der Myosionketten ist von der Phosphorylierung  der Schweren Ketten durch eine spezifische Schweren Kette Kinase abhängig. 

Diese Phosphorylierung wird benötig für die Stabilisierung der Zellpolarität und  unterdrückt gleichzeitig die Bildung von lateralen Pseudopodien im posterioren  Bereich der Zellen. Dies ermöglicht den Zellen direkt entlang des Gradienten zu  wandern (Stites, Wessels et al. 1998).

Nach cAMP­Stimulation konzentriert sich Myosin entlang des gesamten Zellkortex  und führt zu einer Änderung der Zellgestalt bei der sich die Zelle abrundet. Mit  Ausbildung von Pseudopodien wird die Myosinkonzentration im Kortex aufgehoben  und es kommt zur Anreicherung von Myosin im posterioren Bereich. Die Deletion von  Myosin II führt  zu einem Wachstumsdefekt, der verhindert dass die Zellen in 

Supensionskultur wachsen können (De Lozanne and Spudich 1987). 

Aufgrund ihrer Struktur wird vermutet, dass die unkonventionellen Myosine als  Motorportein agieren, was aber noch nicht eindeutig bestätigt werden konnte. 

Lokalisiert ist Myosin I im „leading egde“ von chemotaktisch aktiven Zellen,  Filopodien und dem Zellkortex. Die Deletion der unkonventionellen Myosin I­ 

Isoformen myoA und myoB  führt z. B. zu einer Reduktion der chemotaktischen  Geschwindigkeit, wobei myoB­Nullzellen mehr laterale Pseudopodien bilden, als die  Wildtypzellen (Titus, Wessels et al. 1993; Jung 1996). 

2. Ziel der Dissertation 

Obwohl in den letzten Jahrzehnten viel über die Komponenten wie PTEN (Comer  and Parent 2002; Iijima and Devreotes 2002) oder Crac (Segall 1999) und deren  Signalwege bekannt wurde, gibt es immer noch unbekannte Komponenten in den  einzelnen Signalkaskaden. So ist z.B. wenig bekannt über den genauen Ablauf der  zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Chemotaxis (Iijima, Huang et al. 2002) oder  wie die einzelnen Signalwege untereinander reguliert werden. 

In dieser Dissertation sollten unbekannte Komponenten der chemotaktischen  Signalkaskaden isoliert und ihre Bedeutung für die Chemotaxis untersucht werden. 

Dafür sollten REMI­Mutanten mit einer veränderten Zellpolarität über einen  Selektionsassay isoliert und der Phänotyp dieser Mutanten, in Bezug auf die  Chemotaxis charakterisiert werden. Die veränderte genetische Struktur dieser  Mutanten sollte über REMI­Rescue identifiziert und molekularbiologisch analysiert  werden. 

Ein weiterer Teil der Dissertation sollte sich mit der Identifizierung von PMCA´s aus  dem Dictyosteliumgenom beschäftigen. Dafür sollte zuerst geklärt werden wie viele  PMCA´s vorhanden sind und ihre Proteinstruktur analysieren. Des weitern sollten  diese PMCA´s molekularbiologisch isoliert, kloniert, sequenziert und charakterisiert.

3. Material und Methoden 

3.1. Allgemeine­Listen 

3.1.1. Chemikalienliste  Agar­Agar [Invitrogen] 

Ampicillin [Roth] 

Koffein [Fluka] 

KCl [Riedel­de Haën] 

Blasticidin S [ICN]  Maleinsäure  [Merck] 

CaCl2 [Riedel­de Haën]  NaCl [Roth] 

Camp [Boehringer]  NaOH [Riedel­de Haën] 

DEPC [Sigma]  Natriumacetat [Merck] 

DMSO [Merck]  Natriumcitrat­tribasisch [Riedel­de Haën] 

EDTA [Roth]  Paraformaldeyhd [Riedel­de Haën] 

Essigsäure [Roth]  Pikrinsäurelösung [Fluka] 

Formaldehyd [Riedel­de Haën]  Pipes [Sigma] 

Formamiddeionisiert [Sigma]  Proteinase K [Sigma] 

Fötales Kälberserum [Gibco]  RNAseZap[Sigma] 

Glycin [Sigma]  Streptomycin [Roth] 

HCl [Riedel­de Haën] 

EGTA [Fluka] 

Trizmabase [Sigma] 

Trizol [Sigma] 

Hefe Typ II [Sigma]  Zitronensäure [Merck] 

HEPES [Sigma] 

Hoechst 33285 [Fluka] 

KH2CO4 [Riedel­de Haën] 

KHCO2 [Riedel­de Haën]

3.1.2. Geräteliste 

8­Kanal­Dichtemeßgerät [Uni. Konstanz] 

Brutschrank 37 º C  [Heraeus] 

DNA­Meßgerät: Ultrospec 3000 [Pharmacia, Biotech] 

Chemotaxiskammer [Uni. Konstanz] 

Elektroporator [Biorad] 

Eppendorfschüttler I: Mixer 5432 [Eppendorf] 

Eppendorfschüttler II: MSD Minishaker [IKA] 

Feinwaage: HM­202 [AND] 

Filmentwickler: Konica SRX­2001 

Fluorimeter­Wasserbad: Paratherm Ft1­electronic [Julabo] 

Fluorimeter: Fluorescence Spectrophotometer 650­10 S [Perkin­Elmer] 

Fluorimeterlampe: Xenon­Power­Supply 150 [Perkin­Elmer] 

Fluorimeterschreiber: BBC Goerz 

Folienschweissgerät: Vacupack 2 Plus [Krups] 

Kamera I: M35 [Zeiss] 

Kamera II: JC II [Zeiss] 

Kapillarengerät: Micropipette Puller Model P­87 [Saffer Instrumente Co. ]  Magnetrührer MR 3001 [Heidolph] 

Mikroskop I: Zeiss IM [Zeiss] 

Mikroskop II: Axiovert 100 TV [Zeiss] 

Mikrotitermeßgerät: Anthos Labtec HT2  PCR­Gerät: iCycler [Bio­Rad] 

pH­Meter: Präzisions pH­Meter E510 [Metrohm Herisau] 

Power Supply 2197 [LKG Bromma] 

Reinraumbank I: Lamin Air HBB2448 [Holten] 

Reinraumbank II: Laflow [Dicto Bosch] 

Stereolupe: Stemi 2000 [Zeiss] 

Turboblotter [Schleicher & Schuell] 

Videokamera  Stereolupe: CCD Kamera [AVT Horn] 

Videokamera II: CCD  [Panasonic] 

Waage: PE 3600 [Mettler] 

Wasserbad I:  Köttermann 

Wasserbad II: 1420 Thermomix [B.Braun] 

Wasserbad II: E52t [Haake] 

Wasserbad III: K4 Electronic [mgw Louche] 

Zählkammer [Neubauer] 

Zentrifuge I: Kühlzentrifuge [Sorvall] 

Zentrifuge II: Minispin [Eppendorf] 

Zentrifuge III: RC­5 Superspeed [Sorvall] 

Zentrifuge IV: Minifuge 2 [Heraeus] 

3.1.3. Verbrauchsmaterialien  Blotpapiere [Schleicher & Schuell] 

Borosilikat Glas Kapillaren [Kwik­Fil] 

Deckgläser ( 18 x18 mm ) [Knittel­Gläser] 

Eppendorfgefäßesteril (1.5 und 2 ml)  [Eppendorf] 

Nitrocellulosefilter (0.45 µm, 25 mm Black­HAPB [Millipore, Mostein, Frankreich])  Nitrocellulosefilter (1.2 µm, 25 mm Black­HAPB [Millipore, Mostein, Frankreich])  Nylon Membran positiv geladen [Roche] 

Objektträger (18 x 100 mm) [ Menzel­Gläser] 

PCR­Gefäßesteril [Peske] 

Petrischalen ( 5.4 cm, 9 cm , 14 cm) [Greiner] 

Pipettenspitzen ( 0.1­10 µl, 2­200 µl, 100­1000 µl) [Peske] 

RNAsefreie Pipettenspitzen ( 0.1­10 µl, 2­200 µl, 100­1000 µl)  [Eppendorf] 

Sterilfilter ( 0.45 µm, 0.25 µm )  Zentrifugenröhrchen  (50 ml) [TPP ]

3.2. Physiologische Lösungen und Medien 

3.2.1. Dictyostelium­Medium und Differenzierungspuffer  Axenisches Medium 

28.6 g  Bacto Pepton No. 3 [Becton & Dickinson] 

12.2 g  Bacto Hefe Extrakt [Becton & Dickinson] 

2.56 g  Na2HPO4 x 2 H2O [Riedel­de Haën] 

0.97 g  KH2PO4 [Riedel­de Haën] 

36 g  Maltose [Acros, Organics] 

ad. 2 l H2Obidest  pH 6.7 

Sørensenphosphat­Puffer (SP­Puffer)  13 mM KH2PO4 

4 mM Na2HPO4 x 12 H2O 

Mit KH2PO4 auf pH 6.0 ad. 1 l H2Obidest 

3.2.2. Differenzierungsplatten 

Sørensenphosphat­Agar Platten  1.5 mM Koffein Platten  500 ml SP­Puffer mit 1.5 % (w/v) 

Agar­Agar; autoklaviert bei 120 ºC 

100 ml SP­Puffer, 1.5 mM Koffein  mit 1.5 % (w/v) Agar­Agar; 

autoklaviert bei 120 ºC 

3.2.3. Immunohistochemie­Lösungen 

10 % Paraformaldehydlösung  Fixierlösung 

0.4 g Paraformaldehyd  2 ml Paraformaldehydlösung (10 %) 

6 ml H2O  5 ml 20 mM Pipes pH 6.0 

10 µl 2 M NaOH­Lösung  1.5 ml gesättigte Pikrinsäurelösung  Lösen bei 50 ºC, pH 6.0  180 µl 0.4 M NaOH 

1320 µl H2O

PBS  PBS/Glycin 

137 mM NaCl  1x PBS 

2.7 mM KCl  50 mM Glycin 

10 mM Na2HPO4 

2 mM KH2PO4 

ad. 1l  H2O pH 7.4 

PBG  Phalloidin­Färbelösung 

10 ml BSA (5%) [Sigma ] 

1 ml Fischgelatine (10 %) [Sigma] 

ad. 100 ml PBS 

100 µg/ml TRITC­Phalloidin [Sigma] 

gelöst in MeOH 1: 200 in PBG  verdünnt. 

3.2.4. cAMP induzierte F­Aktinakkumulation 

FITC­Stammlösung  Stoplösung 

100 µg/ml FITC­Phalloidin [Sigma] in 1  ml MeOH gelöst, gelagert bei –20 ºC. 

0.1 % Triton x­100  20 mM KH2PO4  10 mM Pipes  5 mM EGTA  2 mM MgCl2 

3.7 % Formaldeyhd 

pH 6.8 gelagert bei –20 ºC  0.25 µM FITC­Phalloidin 

3.2.5. Pinozytose­Lösungen  FITC­Dextran­ 

Lösung 

Phosphat­Puffer I  Phosphat­Puffer II 

50 mg/ml FITC­ 

Dextran [Sigma] 

in 1 ml SP­Puffer 

50 mM Na2HPO4 

ad. 1 l pH 9.3 

Phosphat­Puffer I  0.1 % Triton x­100

3.2.6. Phagozytose­Lösungen 

TRITC­Hefen  Trypanblau­Lösung 

5 g Hefe (Typ II)  2 mg/ ml Trypanblau 

PBS­Puffer  20 mM Citrat 

SP­Puffer  150 ml NaCl 

50 mM Na2HPO4 pH 9. 2  ad. 50 ml  pH 4.5  2 mg TRITC [Sigma] 

3.2.7. D. discoideum­Stämme  Wildtypstamm Ax­2 Klon 214 

REMI­Stämme Derivate Ax 2 Klon 214 (siehe Diplomarbeit: Katja Drews) 

3.2.8. E.coli­Stamm  DH5α [Invitrogen] 

3.3. Molekularbiologische Puffer, Medien und Reagenzien  3.3.1. Luria Broth (LB)­Medium 

10 g  Trypton [ Gibco BRL] 

5 g  Hefeextrakt [Gibco BRL] 

5 g  NaCl 

pH 7.5; ad. 500 ml H2Obidest 

3.3.2. LB­Platten 

500 ml LB­Medium und 1.5 % Agar­Agar (w/v).

3.3.3. Puffer 

50x TAE­Puffer  Gelelektrophorese­Puffer 

242 g Tris­Base  1x TAE   1l 

57.1 ml Essigsäure  10 µl  Ethidiumbromid (25 mg/ ml)  100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 

ad. 1 l H2Odeionisiert 

TE­Puffer  SOC­Puffer 

10 mM Tris­Hcl pH 7.4  1mM EDTA pH 8.0 

20 g Trypton  5 g Hefeextrakt  ad. 250 ml H2Obidest  0.5 g NaCl 

10 ml 0.25 M KCl  5 ml 2 M MgCl2 

20 ml 1 M Glukose  pH 7.0 ; ad. 1 l H2Obidest 

3.3.4. Southern Blot­Lösungen 

Depurinierungslösung  Denaturierungslösung 

250 mM HCl  0.5 N NaOH 

ad. 1 l H2Obidest, steril  1. 5 mM NaCl 

ad. 1 l H2Obidest autoklaviert bei 120 ºC 

Neutralisierungslösung  20x SSC 

0.5 M Tris­ HCl pH 7.5  3 M NaCl 

3 M NaCl  300 mM Na­Citrat 

ad. 1 l H2Obidest autoklaviert bei 120 ºC  pH 7.0 

ad. 1 l H2Obidest , autoklaviert bei 120 ºC  Prähybridisierungslösung  Hybridisierungslösung 

10  ml  DIG Easy Hyb [Roche]  10 ml DIG Easy Hyp [Roche] 

Denaturierte Sonde (10 Minuten  kochendes Wasserbad, danach +4 Cº  für 10 Minuten)

Waschlösung I  Waschlösung II 

2x SSC  0.5x SSC 

0.1 % SDS (10%)  0.1 % SDS (10 %) 

Waschlösung III  Block­Lösung I 

100 mM Maleinsäure  5 ml Blockingreagenz (10 x) [Roche] 

150 mM NaCl  ad. 50 ml Waschlösung III 

pH 7.5 ad. 1 l H2Obidest autoklaviert 

Block­Lösung II  Detektionspuffer I 

15 ml Block­Lösung I 

1:30000 DIG FAB­Antikörper [Roche] 

100 mM Tris­HCl pH 7.5  100 mM NaCl 

pH 9.5; ad. 1 l H2Obidest autoklaviert bei  120 ºC 

Detektionspuffer II  500 µl Detektionspuffer I  4 Tropfen CDP­Star [Roche] 

3.3.5. Kits 

PCR­Kits  RT­PCR­Kit  DNAse­Kit 

Proof­PCR Kit [Qiagen] 

Hot­Start PCR­Kit [Qiagen] 

Omniscript RT­PCR  [Qiagen] 

DNAsefree [Ambion] 

ExTaq­Kit [Takara] 

Plasmidaufreinigungs­Kits  Klonierungs­Kits  Sonden­Markierungs­ Kits  [Roche] 

Fast­Plasmid Purification Kit  [Qiagen] 

Topo­TA cloning Kit  [Invitrogen] 

DNA­Labeling­Kit [Roche] 

Fast­Plasmid [Eppendorf]  Topo­cloning Blunt­ 

End Kit [Invitrogen] 

PCR­Labeling­ Kit [Roche]

3.3.6. Restriktionsenzyme  Cla I [Roche] 

Bcl I [Roche] 

Bam H I [Roche] 

Nde I [Roche] 

Bcl I [Roche] 

3.3.7. DNA­Präparation von D. discoideum: Lysepuffer  10 mM Mg­Acetat 

10 mM NaCl  2 % NP­40 

10 % Saccharose  30 mM Tris­HCl pH 8.5 

ad. 1 l H2Odeionisiert ; autoklaviert, Lagerung bei+ 4 ºC 

3.4. Physiologische Methoden 

3.4.1. Zellanzucht von Dictyostelium discoideum 

Sporen von Dictyostelium discoideum und der REMI­Mutanten wurden in 30 ml  axenischem Medium bzw. in BAS­Medium ( Blasticidin S 10 µg/ml, Ampicillin 100  µg/ml, Streptomycin 40 µg/ml) inokuliert und bei 23 ºC, 150 rpm im abgedunkelten  Kulturraum kultiviert, bis eine Zelldichte von 0.5 – 1.5 x 10 ⁷ Zellen/ml erreicht war. 

Diese Kultur wurde als Vorkultur zum Animpfen der Hauptkulturen (30 oder 300 ml)  verwendet und bei 4 º C, 100 rpm bis zum Gebrauch aufbewahrt. Es wurde für jede  Versuchswoche eine eigene Vorkultur angelegt und verwendet. 

3.4.2. Einleitung des Differenzierungszyklus 

Für die Einleitung der Differenzierung wurden die Zellen in der exponentiellen 

Wachstumsphase (0.5­1.2 x 10 ⁷ Zellen/ml) abzentrifugiert (2 Minuten, 2000 rpm) und  danach vom axenischen Medium abgetrennt. Das Zellpellet wurde in 100 bzw. 20 ml  kaltem SP­Puffer, abhängig vom Ausgangsvolumen, resuspendiert  und

abzentrifugiert. Das Waschen des Zellpellets erfolgte 3mal,  bevor die Zelldichte auf  2 x 10 ⁷ Zellen/ml  in SP­Puffer eingestellt wurde. Die Ausgangszelldichte wurde über  eine mikroskopische Bestimmung anhand einer Neubauer­Zählkammer ermittelt. 

Der Zeitpunkt nach Abtrennung des axenischen Mediums wurde als t0 (t = Zeitpunkt, 

x = Stunde) definiert. Alle Medien­ , Wasch­ und Zellüberstände von genetisch  veränderten Dictyosteliumzellen wurden entsprechend der geltenden Richtlinien  autoklaviert und entsorgt. Für die Differenzierung in Suspensionskultur wurden die  Zellen bei 23 ºC, 150 rpm im abgedunkelten Kulturraum inkubiert. 

Für die Differenzierung auf Festmedium (SP­Platten; Nitrocellulosefilter) wurden  300 µl gewaschene Zellsuspension (Ø 5.4 cm, 25 mm) oder 1 ml (Ø 9 cm) auf­ 

getragen. Nach 10minütiger Sedimentation der Zellen wurde der Pufferüberstand  entfernt. Die Festmedien wurden anschließend 20 Minuten bei geöffnetem Deckel,  für die Trocknung der Oberfläche bei RT inkubiert. Anschließend wurden diese bei  23 ºC im abgedunkelten Kulturraum  inkubiert. 

3.4.3. Sporengewinnung 

Für die Sporengewinnung wurden die Zellen unter sterilen Bedingungen vom  axenischen Medium abgetrennt, gewaschen und auf eine Zelldichte von 2 x 10 ⁷  Zellen/ml eingestellt. Jeweils 1 ml der Zellsuspension wurde auf eine SP­Agarplatte  (Ø 9 cm) aufgetragen. Die Sedimentation der Zellen und Trocknung der Oberfläche  erfolgte, wie oben beschrieben. Die Platten wurden 1 Woche bei 23 ºC abgedunkelt  im Kulturraum inkubiert. Die Sporen wurden mit einer sterilen Impföse abgetragen  und in einem Eppendorfgefäßsteril in 1 ml SP­Puffer aufgenommen. Diese 

Sporengefäße wurden bei –70 ºC bis zum Gebrauch eingefroren. 

3.4.4. Einfrieren vegetativer Zellen 

Die Zellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase vom axenischem Medium,  wie oben beschrieben, unter sterilen Bedingungen abgetrennt und gewaschen. Das  Pellet wurde im letzten Schritt in der Lösung Ikalt, bestehend aus 75 % Medium und  25 % fötalem Kälberserum auf Eis resuspendiert und dabei wurde Zelldichte von

4 x 10 ⁷ Zellen/ml eingestellt. Im gleichen Volumen wurde die Lösung IIkalt (55 %  Medium, 25 % fötales Kälberserum, 20 % DMSO) zugegeben und vorsichtig  gemischt. Je 1 ml dieser Mischung wurde in 2 ml Eppendorfgefäßensteril aliquotiert  und bei –20 ºC für 24 Stunden gelagert. Die Endlagerung erfolgte bei –70 ºC bis zum  Gebrauch. 

3.4.5. Simultane Untersuchung des Differenzierungsverhalten von „Enigma“ und 

„Ganko“ im Vergleich zum Wildtyp 

Bei Erreichen einer Zelldichte von 0.5­1.0 x 10 ⁷ Zellen/ml wurden die Zellen, 

Mutanten­ wie Wildtypzellen, zeitgleich gewaschen (s.o.) und auf eine Zelldichte von  2 x 10 ⁷ Zellen/ml eingestellt. Für eine simultane Beobachtung der Differenzierung  wurde eine Agarplatte (Ø 5.4 cm) mit einer Trennscheibe halbiert. Auf jede Hälfte der  Platte wurden 6 x 10 ⁶ Zellen aufgetragen. Die Trennscheibe wurde erst entfernt,  nachdem die zwei Zellpopulationen sedimentiert und die Oberflächen der Platten  getrocknet waren. Die Platte wurde umgekehrt auf einem Durchlichttisch des  Stereomikroskops platziert und von einer Kaltlichtquelle beleuchtet. Die 

Differenzierung wurde videotechnisch alle 30 Minuten über eine CCD Kamera mittels  AxionVision­Software [Zeiss] aufgezeichnet. Der Film Enigma 1 wurde mit dem  Quick­Time Programm (Vers. 6.0) erzeugt (siehe Filmlegenden). 

3.4.6. Detailuntersuchung des Aggregationsverhalten von „Engima“ und Wildtyp  Nach Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase wurden die Zellen gewaschen  und auf eine Zelldichte von 2 x 10 ⁷ Zellen/ml eingestellt (s.o.). Nachdem 1 ml 

Zellsuspension auf einer SP­Agarplatte sedimentiert und getrocknet war, wurden die  Platten bis zur Bildung von Aggregationsströmen im Dunkeln bei 23 ºC inkubiert. Ab  diesem Zeitpunkt wurden die Platten umgekehrt auf dem Durchlichttisch der 

Stereolupe platziert und die Differenzierung der Zellen bis zur Bildung von  Pseudoplasmodien videotechnisch mit einer CCD­Kamera mittels AxionVison­ 

Software [Zeiss] alle 15 Minuten dokumentiert. Die Filme Wildtyp 4, Enigma 2 und  Enigma 3 wurde mit dem Quick­Time Programm (Vers. 6.0) erzeugt (siehe 

Filmlegenden).

3.4.7. Selektionsverfahren zur Anreicherung von Zellpolaritätsmutanten 

Die grundlegende Methode für die Selektion von Zellpolaritätsmutanten beruht auf  der Verwendung einer Chemotaxiskammer (Abb. 6), wie sie von Segall (Segall,  Fisher et al. 1987) beschrieben wurde. Im Gegensatz zur Originalapplikation wurden  Zellen selektiert die bereits 4 Stunden differenziert hatten, die Filteranzahl (5­7 Filter,  Filterdicke 150 µm) verändert, die Porengröße (1.2 µm) reduziert und die 

Experimentdauer (45­90 Minuten) verändert. Als chemischer Lockstoff wurde cAMP  verwendet, statt der beschriebenen Folsäure. 

Die Selektion der Zellpolaritätsmutanten gliederte sich in unterschiedliche 

Selektionsstufen (Abb. 7, Übersicht ). Die Selektionsstufe 1 diente der Anreicherung  von Zellpolaritätsmutanten. Die beiden nachfolgenden Stufen dienten der 

spezifischen Selektion von Zellpolaritätsmutanten, wobei die Schwerpunkte der  Selektionsstufe 2A auf cAMP sensitiveren Zellen und die Selektionsstufe 2 B auf  Zellen mit einer gesteigerten Motilität lagen. 

Abb. 6: Übersicht über den Aufbau der Chemotaxiskammer und der Bestimmung der  Zellzahl. 

16 Stunden 

Magnetfisch  Netz 

Dichtungsring  F5 + 

F4 + 

F3+ 

F2 + 

F1 + 

F0 

F1 ­ 

F2 ­ 

F3 ­ 

Magnetic fish  Modul 1 

Modul 2 

Modul 3 

Zellzahl ­  bestimmung

Abb. 7: Schematische Übersicht über den Aufbau der Selektion und den einzelnen  Selektionsstufen. Gezeigt ist der Ablauf der Selektion die für die Isolierung der  Zellpolaritätsmutanten „Ganko“ und „Enigma“ benötigt wurden. ( x ^a ) Zahl der  Anreicherungsselektionen, (x ^b ) unabhängige Selektionswiederholungen. 

Die Chemotaxiskammer setzte sich aus drei Komponenten, bestehend aus einer  unteren wie oberen Pufferkammer und einer Überwurfmutter, zusammen (Abb. 6). 

Die untere Pufferkammer wurde mit SP­Puffer gefüllt und ein Dichtungsring auf der  Traverse platziert. Jeweils 3 befeuchtete Nitrocellulosefilter (F1—3­) wurden auf die  Traverse der Pufferkammer gesetzt. Auf den nachfolgenden Filter wurden 5 x 10 ⁶  Zellen pipettiert (Fo), die bis t4 differenziert waren. Dieser Zellfilter wurde in der ersten  Selektionsstufe mit fünf befeuchteten Filtern (F1­5+) überschichtet. Auf den letzen  Filter wurde wiederum ein Dichtungsring platziert und die obere Pufferkammer  aufgesetzt. Die Verbindung der beiden Pufferkammern erfolgte mit der dritten  Komponente, mit der die beiden Kammern fest miteinander verschraubt wurden. 

Selektionsstufe 2A (3x ^a )       Selektionsstufe 2B (3x ^a )  Selektionsstufe 1 (2x ^a ) 

22 Klone der Selektionsstufe 2A (1x ^b )      18 Klone der Selektionsstufe 2B (1x ^b ) 

„REMI­Rescue „   „ REMI­Rescue“  

„ Ganko „  (3x ^b )       „ Enigma“  (3x ^b)

Selektionsstufe 1: Anreicherung von REMI­Zellpolaritätsmutanten 

Insgesamt wurden in der ersten Selektionsstufe 6 separat hergestellte REMI­ 

Zellpopulationen (ungefähr 5000 Klonen) selektiert. 

Die obere Kammer wurde in der ersten Selektionsstufe mit 50 µM cAMP gefüllt. Für  die Ausbildung eines stationären cAMP­Gradientens wurden in die Pufferkammern  jeweils ein Magnetfisch gegeben. Die Chemotaxiskammer wurde für 90 Minuten bei  ständiger Durchmischung  (Magnetrührer 200 rpm) bei RT für 90 Minuten inkubiert. 

Nachdem der Pufferüberstand aus der oberen Kammer entfernt war, wurden die  oberen 3 Filter (450µm, 600 µm, 750 µm Distanz) in separate Medienschalen (Ø  5.4 cm, 5 ml Medium) überführt. Für den Wildtyp wurde axenisches, für die REMI­ 

Mutanten (REMI­Zellpopulation, REMI­Klone) wurde axenisches Medium mit 

Antibiotikazusatz (BAS, s.o.) verwendet. Die Medienschalen wurden 16 Stunden bei  23 ºC in Dunkelheit inkubiert, danach wurde die Zellzahl mikroskopisch bestimmt. 

REMI­Mutanten des obersten Filters wurden in Medienvolumina von 10 ml, 20 ml und  30 ml kultiviert. Anschließend wurde für eine Anreicherung von REMI­Zellpolaritäts­ 

mutanten eine erneute Selektion durchgeführt, insgesamt 2mal (Abb. 7, Übersicht). 

Selektionsstufe 2: Selektion von sensitiven (2A) und hochmotilen REMI­ 

Zellpolaritätsmutanten (2B) aus der Selektionsstufe 1 

Mutanten die sensitiver auf einen geringeren cAMP­Gradienten reagieren sollten als  der Wildtyp wurden selektiert, indem die cAMP­Konzentration auf 25 µM verringert  wurde (Selektionsstufe 2A). 

Mutanten mit einer höhere Motilität (Selektionsstufe 2B) als der Wildtyp wurden  selektiert, indem die Selektionszeit auf 45 Minuten reduziert wurde und gleichzeitig  die Distanz d.h. die Filteranzahl auf 7 erhöht wurde, was einer Distanz von 1050 µm  von F0 ausgehend entsprach. 

Bei beiden Selektionsansätzen wurde die Zellzahl der oberen 3 Filter bestimmt,  indem  die Filter in axenischem Medium (Ø 5.4 cm, 5 ml Medium)  inokuliert und die  Zellzahl nach 16 Stunden mikroskopisch ermittelt wurde. 

Für eine Anreicherung von REMI­Zellpolaritätsmutanten wurden die Zellen des  obersten Filters weiterkultiviert (siehe Selektionsstufe 1) und 3mal selektiert.

Als Kontrolle wurden alle Selektionsansätze mit Wildtypzellen 3mal unabhängig  durchgeführt. 

Klonierung der REMI­Zellpolaritätsmutanten „Enigma“ und „Ganko“ aus den  Selektionsstufen 2A und 2B 

Die REMI­Populationen aus den angereicherten Selektionsstufen 2A und 2B  wurden  in 30 ml BAS­Medium inokuliert und bis zu einer Zelldichte von 5 x 10 ⁶ Zellen/ml bei  23 ºC, 150 rpm im Kulturraum kultiviert. 1 ml Zellsuspension wurde anschließend auf  eine Zelldichte von 2­3 Zellen/ml verdünnt und jeweils 150 µl in eine Mikrotiter­ 

vertiefung (96er Mikrotiterwellplatte) pipettiert und diese  Platten bei 23 ºC im 

Kulturraum kultiviert. Alle drei Tage wurde das Wachstum kontrolliert und nach ca. 3  Wochen einzelne Klone in eine 24­Mikrotiterwellplatte (2 ml BAS­Medium) überführt. 

Die einzelnen Klone (Selektionsstufe 2A: 22 Klone, Selektionsstufe 2B: 18 Klone)  konnten nach ca. 2 Wochen in Petrischalen (Ø 9.4, 10 ml, 30 ml BAS­Medium ) und  nachfolgend in 30 ml BAS­Medium (100 ml Kolben) inokuliert werden (23 ºC, 150  rpm).  Jeder Klon wurde 1mal unabhängig in seiner Selektionsstufe selektioniert und  das Zellanreicherungsprofil der 3 oberen Filter bestimmt. Nur Klone mit einer 

aufsteigende Zellzahl z. B. Selektionsstufe 2 A F5<F6<F7, wurden für das „REMI­ 

Rescue“ (Selektionsstufe 2A: 3 Klone, Selektionsstufe 2B: 8 Klone) kultiviert. 

3.4.8. Bestimmung des Wachstumsverhaltes in Suspensionskultur 

Eine Hauptkultur (30 ml bzw. 300 ml) wurde mit einer bestimmten Zellzahl 

(5 x 10 ⁵ Zellen/ml) inokuliert und bei 23 ºC, 150 rpm im abgedunkelten Kulturraum  kultiviert. In regelmäßigen Zeitintervallen wurde die Zellzahl der einzelnen Kulturen  bestimmt und die Verdopplungszeit in der exponentiellen Wachstumsphase 

berechnet. Insgesamt wurden von den einzelnen Zelllinien (Wildtyp, „Ganko“, 

„Enigma“) mindestens 3 unabhängige Wachstumskurven aufgezeichnet und die  Verdopplungszeit ermittelt.

3.4.9. Pinozytose­Experiment 

Für die Untersuchung zur Flüssigkeitsaufnahme wurden Wildtyp­ wie Mutantenzellen  mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der an Dextran gekoppelt war, inkubiert. Die  Methode des Pinozytose­Experiments beruht auf den Experimenten von Schreiner  et.al (Schreiner, Mohrs et al. 2002)  . 

Die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 1­ 5 x 10 ⁶ Zellen/ml abzentrifugiert und  mit SP­Puffer gewaschen (s.o.). Die Zelldichte wurde nach dem letzten Waschschritt  auf eine Dichte von 5 x 10 ⁶ Zellen/ml  in 5.5 ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde  15 Minuten bei 23º C, 150 rpm im abgedunkelten Kulturraum inkubiert, bevor die  Nullprobe (500 µl) entnommen wurde. Die 500 µl wurden 1:10 mit kaltem SP­Puffer  (4. 5 ml) verdünnt und abzentrifugiert (5 Minuten, 2000 rpm). Nach Abnahme des  Überstandes wurde das Zellpellet in 1 ml kaltem SP­Puffer resuspendiert und erneut  abzentrifugiert (60 Sekunden, 13000 rpm). Nach Abnahme des Überstands wurde  das Pellet in 1 ml 50 mM Na2HPO4 gelöst und anschließend sedimentiert (60 

Sekunden, 13000 rpm). Die Zellen wurde nach Abnahme des Überstands in 2 ml 50  mM Na2HPO4 mit 0.1 % Triton lysiert. 

Die lysierten Zellen wurden bis zur fluorimetrischen Messung in Dunkelheit bei RT  inkubiert. 

Nach Abnahme der Nullprobe wurden 200 µl FITC­Dextran (2 mg/ ml) zugegeben  und alle 15­20 Minuten über einen Zeitraum von 120 Minuten eine Probe 

entnommen. 

Die Menge des aufgenommen Fluoreszenzfarbstoffes, wurde mit 1 ml der  aufgearbeiteten Proben bei Extinktion 480 nm und Emission 520 nm an einem  Fluorimeter bestimmt. Für eine Quantifizierung des aufgenommen 

Fluoreszenzfarbstoffes in Bezug auf die Proteinmenge wurde von den 

aufgearbeiteten Proben eine Proteinbestimmung nach Bradford (Sambrook 2001)  durchgeführt. Für die Normierung wurde die Fluoreszenzintensität von 1 µg Protein  des Wildtyps nach 120 Minuten als 100 % definiert.