Universität Konstanz Fakultät für Biologie
Diversität und Tiefenverteilung methanotropher Bakterien im Sediment des Bodensees
Durchführung der Arbeit an der Fakultät für Biologie, Lehrstuhl für Limnologie / Mikrobielle Ökologie, Prof. Dr. B. Schink, Universität Konstanz, 78475 Konstanz
Diplomarbeit
vorgelegt von Michael Pester
Konstanz, Dezember 2002
Frisch gestochener Sedimentkern. Im Hintergrund ist der Bodensee zu sehen. (Foto von Simone Gerhardt, Universität Konstanz)
INHALT
Erklärung:
„Hiermit erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig angefertigt habe und dass alle Stellen, die dem Wortlaut oder dem Sinn nach anderen Werken entnommen sind, durch Angabe der Quellen als Entlehnung kenntlich gemacht worden sind.“
Konstanz, den 20. Dezember 2002
Michael Pester
Mein Dank gilt:
meiner Familie für die Ermöglichung dieses Studiums und ihre stete Unterstützung.
PD Dr. Andreas Brune für die Überlassung des Themas und die stete Hilfsbereitschaft bei Fragen.
Prof. Dr. B. Schink für die Möglichkeit diese Arbeit an seinem Lehrstuhl durchzuführen.
Dr. Ingeborg Bussmann für die Bereitstellung der DNS-Extrakte der MOB-Isolate und Anreicherungskulturen sowie die stete Hilfsbereitschaft bei Fragen.
allen Mitgliedern der „Termitengruppe“ und „Sedimentgruppe“ für ihre Hilfsbereitschaft und die angenehme Arbeitsatmosphäre, besonderer Dank gilt Dirk, Uli und Simone.
der Arbeitsgruppe von PD Dr. Michael Friedrich für die Hilfe bei der phylogenetischen Analyse mit ARB und Anregungen/Hilfeleistungen bei der T-RFLP-Analyse.
allen Mitgliedern des Lehrstuhls Schink für die angenehme Zeit.
INHALT
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III 1 EINLEITUNG 4
1.1 Methan – seine Bedeutung und Entstehung 4 1.2 Die Bodenseesedimente als Modellsystem für Methanproduktion und Methanabbau 5
1.3 Aerobe, methanotrophe Bakterien (MOB) 6
2 ZIELE DIESER ARBEIT 8 3 MATERIAL UND METHODEN 9
3.1 Das Untersuchungsobjekt Bodensee 9
3.2 Probennahme 10
3.3 DNS-Extraktion und Aufreinigung 11
3.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 13
3.5 Klonbibliothek 14
3.6 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) 15
3.7 Sequenzieren 15
3.8 Phylogenetische Analyse 16
3.9 Rarefaction-Analyse 16
3.10 Terminaler Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (T-RFLP) 17
3.10.1 Modifikation der PCR-Bedingungen 18
3.10.2 Modifikation der PCR-Produkt-Aufreinigung 18
3.10.3 Modifikationen des Restriktionsverdaus 18
3.10.4 Verdau überhängender, einzelsträngiger PCR-Produkte mit Mung Bean Nuclease 19 3.10.5 T-RFLP-Analyse von Klonen und Klongemischen 19
3.10.6 T-RFLP-Analyse der Sedimente 19
3.11 Anreicherungskulturen und Reinkulturen 20 4 ERGEBNISSE 21 4.1 Diversität der pmoA-Gene im Litoralsediment des Bodensees 21
4.1.1 Klonbibliothek 21
4.1.2 RFLP-Analyse und Sequenzierung 21
4.1.3 Phylogenetische Analyse 23
4.2 Evaluation der T-RFLP-Methode 27
4.2.1 PCR 28
II
4.2.2 Aufreinigung des PCR-Produktes 31
4.2.3 Restriktionsverdau 31
4.2.4 Verdau überhängender, einzelsträngiger PCR-Produkte mit Mung Bean Nuclease 33 4.2.5 Zusammenfassung der T-RFLP-Evaluation und weiteres Vorgehen 34 4.3 T-RFLP-Analyse von einzelnen Klonen und Klongemischen 35 4.4 T-RFLP-Analyse der Bodensee-Sedimente 39
4.4.1 Das Litoralsediment 39
4.4.2 Das Profundalsediment 41
4.4.3 Vergleich zwischen Litoral- und Profundalsediment 42 4.5 T-RFLP-Analyse von Anreicherungskulturen 42
4.5.1 Anreicherungen in Mikrotiterplatten 43
4.5.2 Anreicherungen in einem Gradientensystem 46
5 DISKUSSION 48 5.1 Diversität der pmoA-Gene im Litoralsediment 48 5.2 T-RFLP-Analyse des Litoral- und Profundalsediments 49 5.3 Zusammensetzung von MOB-Anreicherungen aus dem Litoralsediment 53
5.4 Evaluation der verwendeten Methoden 54
5.5 Ausblick 60
6 ZUSAMMENFASSUNG 62 7 LITERATURVERZEICHNIS 63
III
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AMO Ammonium-Monooxygenase
amoA Gen, das für eine Untereinheit der AMO kodiert AOB Ammonium oxidierende Bakterien
bp Basenpaar
DNS Desoxyribonukleinsäure
EMBL European Molecular Biology Laboratory FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung MOB Aerobe, methanoxidierende Bakterien MPN Most Propable Number
NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction
pMMO Partikuläre (membranständige) Methan-Monooxygenase pmoA Gen, das für eine Untereinheit der pMMO kodiert PVPP Polyvinyl-Polypyrrolidon
RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus SDS Sodium-Dodecyl-Sulfat
sMMO Lösliche (zytoplasmatische) Methan-Monooxygenase TPmix Totaler Phosphorgehalt nach der Vollzirkulation eines Sees T-RFLP Terminaler Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
1 EINLEITUNG
1.1 Methan – seine Bedeutung und Entstehung
Methan ist ein wichtiger Bestandteil des globalen Kohlenstoffkreislaufes und spielt eine entscheidende Rolle für das globale Klima. Schätzungen zufolge werden jährlich etwa 500 Tg Methan in die Atmosphäre abgegeben (Cicerone und Oremland, 1988; Wuebbles und Hayhoe, 2002). Damit ist Methan nach CO2 und Wasserdampf das drittwichtigste Treibhausgas (Wuebbles und Hayhoe, 2002).
Zur Zeit sind zwei Quellen der Methanbildung bekannt: a) biologische Prozesse und b) geologische, thermisch katalysierte Prozesse, wie z.B. die Bildung von Erdöl. Eine dritte Quelle des Methans, der Erdmantel, wird postuliert, konnte aber noch nicht nachgewiesen werden (Cicerone und Oremland, 1988).
Etwa 70−90 % des in die Atmosphäre abgegebenen Methans ist biologischen Ursprungs (Cicerone und Oremland, 1988) und wird von methanogenen Archaea produziert. Die Methanogenese steht am Ende des anaeroben Abbaunetzwerkes organischer Substanzen, wenn alternative anorganische Elektronenakzeptoren wie Nitrat oder Sulfat nicht in ausreichenden Mengen zur Verfügung stehen (Zehnder und Stumm, 1988) bzw. der Abbau organischer Substanzen mit anorganischen Elektronenakzeptoren aufgrund unterschiedlicher Substratnutzung/Substrataffinität nicht mit der Methanogenese konkurriert (Thebrath et al., 1993).
Eine bedeutender Ort der Methanogenese sind Süßwassersedimente. Von diesen Habitaten wird angenommen, dass in ihnen eine Methanmenge äquivalent zu ca. 45 % des in die Atmosphäre entweichenden Methans produziert wird (Costello und Lidstrom, 1999).
Aufgrund hoher Methanoxidationsraten aerober, methanotropher Bakterien (MOB) wird das in Süßwassersedimenten gebildete Methan jedoch zum großen Teil bereits innerhalb der Sedimente wieder abgebaut und gelangt nicht in die Atmosphäre (Costello und Lidstrom, 1999). Diese hohen Methanumsatzraten machen Süßwassersedimente zu einem interessanten Forschungsobjekt.
EINLEITUNG 5
1.2 Die Bodenseesedimente als Modellsystem für Methanproduktion und Methanabbau
Der Bodensee ist ein oligotropher bis mesotropher, voralpiner See dessen gesamte Wassersäule bis zum Grund durchoxidiert ist. Die Sedimente des Bodensees wurden eingehend auf die mikrobiellen Prozesse der Methanproduktion und des Methanabbaus untersucht. Die Methanproduktion in den Bodenseesedimenten ist abhängig von der Temperatur (Thebrath et al., 1993) und der Verfügbarkeit von abbaubarem organischen Material (Schulz and Conrad, 1995). Dabei spielt für das konstant kalte Profundalsediment (ca. 4 °C) nur das sedimentierende organische Material eine Rolle (Schulz and Conrad, 1995).
Für das Litoralsediment konnte eine Temperaturabhhängigkeit nachgewiesen werden (Thebrath et al., 1993); eine Abhängigkeit vom sedimentierenden organischen Material wurde nicht untersucht, ist aber sehr wahrscheinlich.
Der Methanabbau im Bodensee erfolgt fast ausschließlich aerob (Bosse et al., 1993). Im Profundalsediment des Bodensees werden mehr als 90 % des Methans aerob abgebaut. Das restliche Methan diffundiert in die Wassersäule (Frenzel et al., 1990). Das im Vergleich zum Profundalsediment (< 1 mmol CH4 m−2 d−1) wesentlich produktivere Litoralsediment (Dezember: 5 mmol CH4 m−2 d−1, September: 95 mmol CH4 m−2 d−1) verliert den Großteil des Methans über aufsteigende Gasblasen direkt an die Wassersäule (Thebrath et al., 1993).
Allerdings werden auch hier ca. 80 % des diffusiv entweichenden Methans aerob abgebaut (Bosse et al., 1993).
Die Zone des aeroben Methanabbaus im Bodensee befindet sich in den obersten Millimetern des Sediments. Hier überlappen sich die gegenläufigen Gradienten von Sauerstoff und Methan. Der Sauerstoff dringt aufgrund der aeroben Respiration von benthischen Mikroorganismen und der benthischen Infauna nur wenige Millimeter in das Sediment ein.
Das Methan wird in einer Tiefe von 1–7 cm gebildet und diffundiert in Richtung der Sedimentoberfläche. Stellenweise wurde auf einer Tiefe von 11 cm eine zweite Zone der Methanproduktion gefunden (Frenzel et al., 1990; Thebrath et al., 1993).
Der Methanabbau im Sediment basiert auf biologischen Prozessen (Bosse et al., 1993), von denen zur Zeit drei Arten bekannt sind: i) die aerobe Methanoxidation durch aerobe, methanotrophe Bakterien (MOB), ii) die aerobe Methanoxidation durch Ammonium oxidierende Bakterien (AOB) und iii) die anaerobe Methanoxidation. Für den Bodensee
EINLEITUNG 6
konnte gezeigt werden, dass der überwiegende Anteil des Methanabbaus im Sediment den MOB zuzuschreiben ist. Ammonium oxidierenden Bakterien und die anaerobe Methanoxidation spielen keine entscheidende Rolle (Frenzel et al., 1990; Bosse et al., 1993).
1.3 Aerobe, methanotrophe Bakterien (MOB)
MOB besitzen die bemerkenswerte Eigenschaft Methan als ihre einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen. Sie wurden bereits in vielen verschiedenen Ökosystemen, z. B.
in limnischen und marinen Gewässern und Sedimenten, in verschiedenen Böden, sowie in Tundren und Reisfelder gefunden und können als ubiquitär vorkommend angesehen werden (Henckel et al., 2000; Horz et al., 2001; Heyer et al., 2002; Pacheco-Oliver et al., 2002).
Anhand von phylogenetischen, physiologischen, morphologischen und biochemischen Eigenschaften werden die MOB in zwei Gruppen/Typen unterteilt. Die Typ I-MOB gehören zu den γ-Proteobakterien und umfassen die Gattungen Methylomonas, Methylocaldum, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylosarcina, Methylosphaera, und Methylococcus.
Die Typ II-MOB gehören zu den α-Proteobakterien und umfassen die Gattungen Methylocystis, Methylosinus, Methylocella und Methylocapsa (Horz et al., 2001).
Ein weiteres wichtiges Unterscheidungsmerkmal dieser beiden Bakteriengruppen ist ihr Kohlenstoff-Assimilationsweg. Beide Gruppen von Bakterien oxidieren das Methan bis zum Formaldehyd. Die Typ I-MOB assimilieren Formaldehyd über den Ribulosemonophosphat- Weg, wohingegen die Typ II-MOB Formaldehyd über den Serin-Zyklus assimilieren (Hanson und Hanson, 1996).
Die Dissimilation des Methans ist bei allen bekannten MOB sehr ähnlich. Ein Unterschied liegt im ersten Schritt der Dissimilation, der Oxidation von Methan zu Methanol.
Der erste Schritt der Dissimilation kann entweder durch die membranständige, partikuläre Methanmonooxygenase (pMMO) oder die lösliche, zytoplasmatische Methanmonooxygenase (sMMO) katalysiert werden. Beide Enzyme sind bis heute nur in MOB gefunden worden. Die pMMO ist in allen soweit bekannten MOB enthalten, mit einer möglichen Ausnahme - Methylocella palustris (Dedysh et al., 2000). Das Enzym sMMO ist dagegen nicht in allen MOB enthalten (Hanson und Hanson, 1996). Das Gen der vermutlich aktiven Untereinheit der pMMO (pmoA) kann dazu benutzt werden MOB phylogenetisch zu unterscheiden.
Stammbäume, die auf der Basis von pmoA-Genen erstellt wurden, korrelieren gut mit
EINLEITUNG 7
entsprechenden Stammbäumen auf der Basis von 16S rRNA Genen (Costello und Lidstrom, 1999; Horz et al., 2001).
Aufgrund der Bedeutung von MOB im globalen Kohlenstoffkreislauf, sowie der hohen Methanproduktions- und Methanoxidationsraten in Süßwassersedimenten, ist es von Interesse die Bakteriengruppe der MOB in den unterschiedlichen Sedimenten des Bodensees (Litoral- vs. Profundalsediment) zu studieren. Die Sedimente des Bodensees, im Besonderen das Litoralsediment, unterliegen häufig Störungen, die einen zeitlich begrenzten Sauerstoffeintrag in tiefere, anoxische Sedimentschichten ermöglichen. Die Eindringtiefe des Sauerstoffs während solcher Ereignisse kann die Eindringtiefe der reinen Diffusion bei weitem übertreffen. Solche Ereignisse können sowohl physikalischer Natur sein, wie Strömungen, Wellenschlag und Stürme, als auch biologische Ursachen haben, wie das Fraßverhalten von benthischen Fischen (Shormann und Cotner, 1997) und die Aktivitäten der bentischen Infauna (Frenzel, 1990; Kajan und Frenzel, 1999; Wetzel, 2001). Aus diesem Grund ist es von Interesse zu erfahren bis zu welchen Sedimenttiefen MOB zu detektieren sind und ob sich die Zusammensetzung ihrer Populationen über die Tiefe hinweg verändert.
2 ZIELE DIESER ARBEIT
Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel die Diversität der MOB im Litoralsediment des Bodensees zu untersuchen. Dazu sind zwei Ansätze möglich: a) ein molekularbiologischer Ansatz und b) die Isolierung und Kultivierung von MOB. Diese Arbeit befasste sich mit dem molekularbiologischen Ansatz. Dafür sollte eine pmoA-Klonbibliothek erstellt und damit Rückschlüsse auf die Diversität der MOB gezogen werden. MOB-Isolate aus dem Sediment des Bodenseelitorals sollten ebenfalls auf ihre pmoA-Gene untersucht werden, um sie mit der Klonbibliothek zu vergleichen und gleichzeitig charakterisieren zu können.
Daran anschließend sollte am Lehrstuhl für Mikrobielle Ökologie/Limnologie die Fingerprint-Methode Terminaler Restriktionfragment-Längenpolymorphismus (T-RFLP) etabliert werden. Mit Hilfe einer T-RFLP-Analyse von pmoA-Genen sollten folgende Aspekte untersucht werden: i) Zusammensetzung von MOB-Populationen im Litoral- und Profundalsediment, ii) die Tiefenverteilung von MOB im Litoral- und Profundalsediment und iii) die Zusammensetzung von Anreicherungskulturen in Mikrotiterplatten vs.
Anreicherungskulturen in einem gegenläufigen Gradienten aus Methan und Sauerstoff.
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Das Untersuchungsobjekt Bodensee
Der Bodensee ist der zweitgrößte See Zentraleuropas (siehe Abb. 1) und befindet sich am nördlichen Rand der Alpen. Morphologisch unterteilt er sich in zwei Becken, den Obersee und den kleineren, flacheren und eutropheren Untersee. Der Obersee hat eine durchschnittliche und maximale Tiefe von 101 bzw. 252 m. Er besteht aus einem Hauptbecken, in das der Hauptzufluss Alpenrhein einfließt, und eine nord-westliche, fjordähnliche Verlängerung, den Überlinger See. Der Obersee wird generell als warm-monomiktisch eingestuft und ist bis zum Grund durchoxidiert.
L P
Abbildung 1. Beckenmorphologie des Bodensees mit 50 m Tiefenlinien. Schattierte Flächen stellen Wassertiefen kleiner als 10 m dar (Bäurle und Gaedke, 1998). Die Probennahme-Stellen des Litoralsediments (L) und Profundalsediments (P) sind rot gekennzeichnet.
Während des letzten Jahrhunderts durchlief der Bodensee eine Phase der Eutrophierung mit einem Maximum um das Jahr 1980 (TPmix = 80 µg l−1). Seitdem befindet er sich in einem
MATERIAL UND METHODEN 10
stetigen Reoligotrophierungsprozess (1997 war TPmix = 18 µg l−1e) (Bäuerle and Gaedke, 1998). Die geologischen Eigenschaften des Bodensee-Sediments sind in den Artikeln von G.
Müller nachzulesen (Müller, 1966; Müller, 1967).
3.2 Probennahme
In dieser Arbeit wurde das Litoral- und das Profundalsediment des Überlinger Sees untersucht. Das Litoralsediment stammte aus der Oberen Güll, einer Bucht vor der Insel Mainau. Die Proben wurden immer in dem Gebiet zwischen der Insel Mainau und dem gegenüberliegenden Naturschutzgebiet in ca. 2 m Tiefe entnommen. Das Profundalsediment stammte aus einer Tiefe von 80−100 m (nördliches Ufer, zwischen Birnau und Nussdorf) (siehe Abb. 1). Probenentnahmen fanden für das Litoralsediment im Winter am 03.12.2001 (Probe für eine Klonbibliothek, Ansatz A und B) und im Sommer am 30.08./05.09.2002 (Proben für die T-RFLP, Ansatz C und D) statt. Sediment aus dem Profundal (Probe für die T- RFLP, Ansatz E) wurde im Sommer am 12.09.2002 vom Forschungsschiff MS Lauterborn aus beprobt.
Um die natürliche Tiefenschichtung des Sediments bei der Probennahme zu erhalten, wurden mit einem Sedimentstecher Sedimentkerne gestochen. Der Sedimentstecher für das Litoral besteht aus: i) einem auswechselbaren Plastikrohr (8 cm × 37 cm) mit angeschärfter Kante, ii) einen Verschlussmechanismus der beim Senken des Sedimentstechers einen Wasserdurchfluss erlaubt, iii) einem Verbindungsstück zur Stechstange und iv) einer Stechstange (2 m) (siehe Abb. 2). Der Sedimentstecher für das Profundal ist ähnlich aufgebaut. Er besteht aus vier parallel angebrachten Plastikröhren mit aufgeschraubten Verschlussmechanismen, die über ein Metallgehäuse miteinander verbunden waren. Der Profundalsedimentstecher wird durch die Schwerkraft des Metallgehäuses in das Sediment gerammt und über eine Seilwinde geborgen. Eine detailliertere Beschreibung der Sedimentstecher befindet sich im Artikel von Frenzel et al. (1990). Das untere Ende der Sedimentkerne wurde direkt nach der Probennahme mit einem Stopfen und Ton abgedichtet.
