Funktionelle Charakterisierung des 19S regulatorischen Komplexes des 20S Proteasoms sowie
Analyse der Biogenese des 20S Proteasoms
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der Mathematische-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin
von Diplom-Biochemikerin Beate Braun geboren am 17.05.1974 in Berlin
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Bernhard Ronacher
Gutachter: 1. Prof. Dr. W. Lockau 2. Prof. Dr. P.-M. Kloetzel 3. Prof. Dr. W. Dubiel
eingereicht: 5. September 2001
Datum der Promotion: 18. Dezember 2001
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abstrakt ... IV Abstract... V Abkürzungsverzeichnis ... VI
1 Einleitung ... 1
1.1 Das 20S Proteasom ... 1
1.1.1 Aufbau und Struktur des 20S Proteasoms... 1
1.1.2 Katalytische Aktivitäten des Proteasoms ... 3
1.1.3 Assemblierung und Reifung des 20S Proteasoms... 5
1.2 Regulatorische Komplexe des 20S Proteasoms ... 8
1.2.1 Der regulatorische 19S Komplex ... 8
1.2.1.1 Der Aufbau des regulatorischen 19S Komplexes... 8
1.2.1.2 Die Funktionen des 19S Komplexes und seiner Untereinheiten ... 9
1.2.2 Der 11S Regulator ...11
1.3 Zelluläre Funktion der proteasomalen Komplexe...11
1.4 Intrazelluläre Lokalisation des Proteasoms...12
1.5 Zielsetzung...12
2 Materialien und Methoden... 14
2.1 Chemikalien ...14
2.2 Oligonukleotide, Vektoren, Stämme und Zellinien...14
2.2.1 Oligonukleotide ...14
2.2.2 Vektoren ...16
2.2.3 E. coli-Stämme ...17
2.2.4 S. cerevisiae-Stämme ...17
2.2.5 Humane Zellinien...18
2.3 Kultur von Mikroorganismen...18
2.3.1 Medien für E. coli-Kulturen...18
2.3.2 Medien für S. Cerevisiae-Kulturen ...18
2.3.3 Kultur von E. coli-Stämmen...19
2.3.4 Kultur von Hefezellen ...19
2.3.5 Kryokonservierung...19
2.4 Zellkultur...19
2.4.1 Medien für humane Zellinien ...19
2.4.2 Kultur von humanen Zellinien (Suspensionszellen)...20
2.4.3 Anlegen von Dauerkulturen (Kryokonservierung)...20
2.5 Molekularbiologische Methoden...20
2.5.1 Allgemeine Methoden...20
2.5.2 DNA-Fällung ...20
Inhaltsverzeichnis
2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese...21
2.5.4 PCR (polymerase chain reaction) ...21
2.5.5 Annealing von Oligonukleotiden ...21
2.5.6 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen (vom DH5α-Typ)...21
2.5.7 Transformation von Bakterienzellen ...22
2.5.8 Transformation von Hefe-Zellen...22
2.5.8.1 Integration von DNA in das Hefe-Genom...22
2.5.8.2 Plasmid shuffling ...23
2.5.9 Transfektion von T2-Zellen...23
2.5.10 Northern Blot...23
2.5.10.1 RNA-Isolierung ...23
2.5.10.2 Herstellung der Sonden ...24
2.5.10.3 Northern Blot ...24
2.6 Proteinbiochemische Methoden...25
2.6.1 Proteinfällungen...25
2.6.1.1 TCA-Fällung ...25
2.6.1.2 NaDoc-Fällung ...25
2.6.1.3 Kombinierte TCA/NaDoc-Fällung ...26
2.6.2 Elektrophoretische Methoden...26
2.6.2.1 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) nach Lämmli ...26
2.6.2.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese...26
2.6.3 Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung...27
2.6.4 Western Blot Analyse...28
2.6.5 Proteinsequenzierung...28
2.6.6 Proteinbestimmung ...29
2.6.7 Zellaufschlüsse ...29
2.6.7.1 Hefeschnellaufschluß...29
2.6.7.2 Zellaufschluß mittels French Press...29
2.6.7.3 Zellaufschluß mit flüssigem Stickstoff ...29
2.6.7.4 Zellaufschluß humaner Zellen für die analytische PCR ...30
2.6.7.5 Zellaufschluß humaner Zellen für die Western Blot Analyse...30
2.6.8 Test auf proteolytische Ativität des Proteasoms...30
2.6.9 Dichtegradientenzentrifugation...30
2.6.10 Aufreinigung proteasomaler Komplexe...31
2.6.10.1 Aufreinigung von Proteasomkomplexen aus Hefe über einen ProteinA-Tag...31
2.6.10.2 Aufreinigung von 26S Proteasom aus humanen Erythrocyten ...31
2.6.10.3 Reininigung von 20S Proteasom aus kultivierten Zellen...33
2.6.11 Nachweis der Interaktion von Citratsynthase mit proteasomalen Komplexen35 2.6.11.1 Citratsynthase-Aktivitätstest ...35
2.6.11.2 Rückfaltungsassay der Citratsynthase...35
2.6.11.3 Hitzedenaturierung von Citratsynthase...35
2.6.11.4 Nachweis der Interaktion von Proteasomkomplexen mit der Citrat- synthase über Dichtegradientenzentrifugation...36
2.6.11.5 Aggregationsassays ...36
Inhaltsverzeichnis
3 Ergebnisse ... 37
3.1 Chaperonähnliche Eigenschaften des 19S regulatorischen Komplexes des 20S Proteasoms...37
3.1.1 Der Einfluß von 26S Proteasom auf die Reaktivierung und Stabilität der Citratsynthase ...37
3.1.2 Die Verhinderung der Aggregation von Citratsynthase durch die Interaktion mit 26S Proteasom ...39
3.1.3 Die Identifizierung des mit Citratsynthase interagierenden 19S Regulator- Subkomplexes ...40
3.2 Beteiligung des 19S regulatorischen Komplexes an der Biogenese des 20S Proteasoms...43
3.2.1 Der Einfluß von Mutationen im WalkerA-Motif der 19S-ATPasen auf die Reifung des 20S Proteasoms...43
3.2.2 Der Einfluß von Deletionen und Mutationen in der C-terminalen Region der 19S ATPasen auf die Reifung des 20S Proteasoms ...44
3.2.3 Die Stabilität der Proteasomkomplexe aus den ATPase-Mutanten-Stämmen.47 3.2.4 Der Einfluß der Mutationen in den 19S ATPasen auf die Transkription proteasomaler Untereinheiten ...49
3.2.5 Analyse des Ump1-haltigen 20S Proteasomvorläuferkomplexes ...50
3.3 Funktionsanalyse der proteasomalen beta2i-Untereinheit...51
4 Diskussion ... 56
4.1 Die chaperonähnlichen Eigenschaften des 19S Regulators ...56
4.2 Der Einfluß der ATPasen des regulatorischen 19S Komplexes auf die Reifung des 20S Proteasomkomplexes...58
4.3 Der Ablauf der Assemblierung im eukaryotischen 20S Proteasom ...61
4.4 Der Einfluß der proteasomalen beta-Untereinheiten auf ihre Prozessierung ...64
Literaturverzeichnis... 66
Danksagung ... 74
Erklärung... 75
Abstrakt
Abstrakt
Das 20S Proteasom spielt zusammen mit seinem 19S Regulator als 26S Proteasomkomplex eine zentrale Rolle beim Abbau von Proteinen in eukaryotischen Zellen. Dem 19S Regulator wird dabei die Funktion der Substraterkennung und -entfaltung sowie die Beteiligung an der Translokation der entfalteten Substrate zum katalytischen Zentrum zugeordnet.
In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß der 19S Regulator chaperonähnliche Eigenschaften besitzt, dadurch also durchaus die Entfaltung der Proteinsubstrate bewirken kann. Durch den 19S Regulator war das 26S Proteasom in der Lage, einen Teil denaturierter Citratsynthase, eines Modellsubstrats für die Untersuchung von Chaperonaktivitäten, ATP- abhängig zum nativen Zustand zurückzufalten. Desweiteren führte die Anwesenheit des 19S Regulators bzw. des 26S Proteasoms in Abwesenheit von ATP zu einer Aggregationshem- mung denaturierter Citratsynthase. Auch konnte die direkte Interaktion zwischen der Citrat- synthase und dem 26S Proteasom bzw. dem 19S Regulator durch Glyceroldichtegradienten- zentrifugation gezeigt werden. Diese chaperonähnlichen Eigenschaften des 19S Regulators konnten dem aus sechs ATPasen und zwei nicht-ATPasen bestehenden Base-Subkomplex zugeordnet werden.
Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem 19S Regulator und dem 20S Proteasom und damit möglicherweise verbundenen Konformationsänderungen in den Komplexen, wurde postuliert, daß der 19S Regulator auch auf die Biogenese, also die Assemblierung und Reifung des 20S Proteasoms einen Einfluß haben könnte. Es konnte gezeigt werden, daß Mutationen in den 19S ATPasen zu einer Anreicherung der unprozessierten proteasomalen 20S Unterein- heit beta5 bei erhöhter Temperatur führen. Die Ursache dieses Anreicherungseffektes konnte nicht aufgeklärt werden. Der Effekt läßt sich nicht auf eine Hochregulation der m-RNA- Synthese der beta5-Untereinheit zurückführen. Die Beteiligung des 19S Regulators an frühen Assemblierungsstadien des 20S Proteasoms ist aufgrund der Analyse der mit dem Maturie- rungsfaktor Ump1 im Komplex vorliegenden Proteine ebenfalls unwahrscheinlich. Eine Be- teiligung des 19S Regulators an einem der letzten Schritte der 20S Proteasomenbiogenese, beispielsweise an der Katalyse der Prozessierung der beta-Untereinheiten, ist eher vorstellbar, konnte aber nicht eindeutig gezeigt werden.
Auf die Prozessierung der beta-Untereinheiten hat aber auch die katalytische Aktivität der beta-Untereinheiten einen nicht unwesentlichen Einfluß. So werden die katalytisch aktiven Untereinheiten durch Autokatalyse zu ihrer aktiven Form prozessiert und bewirken die Pro- zessierung der katalytisch inaktiven Untereinheiten beta6 und beta7. Dies konnte so auch durch Inaktivierung der beta2i-Untereinheit bestätigt werden. Die Expression der inaktiven Maus-beta1iT1A-Untereinheit in humanen T2-Zellinien verhinderte ihre eigene vollständige Prozessierung, hatte aber auch Einfluß auf die Prozessierung von beta7 und von inaktiv expri- mierten beta1i (Maus-beta1iT1A).
Schlagwörter:
Proteasom Chaperonaktivität 19S Regulator Proteasombiogenese
Abstract
Abstract
In eukaryotic cells the protein degrading proteasome/ubiquitin system is involved in a wide variety of regulatory processes. The 26S proteasome is composed of two subcomplexes, a proteolytic core (20S) and a regulatory complex (19S). It is proposed that the proteins of the 19S regulatory complex can recognize and unfold the substrates. Furthermore the RC parti- cipates in translocation of the substrates into the proteasomes inner chamber were peptide bond hydrolysis occurs.
This work shows that the proteasome exhibits an ATPdependent chaperon-like activity on citrate synthase, a model substrat for chaperones. Human and yeast proteasomes stimulated the recovery of the native structure of citrate synthase in an ATPdependent manner. Further- more the 19S complex was able to supress the aggregation of denatured citrate synthase. Gly- cerol gradient analysis indicated that proteasome facilitates the refolding of citrate synthase through the formation of citrate synthase-proteasome complexes as expected for a chaperon- like mechanism. The chaperonlike activity was mapped to the base of the 19S regulatory com- plex. The RC could be able to unfold protein substrates in the 26S proteasome by this activity.
The crystal structure of S. cerevisiae 20S proteasome shows a closed gate to the proteasome interiors. The 19S regulatory complex may induce conformational changes not only to open the protease cavity but also to assit in beta-subunit processing during 20S proteasome
biogenesis. To test this hypothesis some S. cerevisiae 19S ATPase mutant strains were analyzed for defective 20S proteasome maturation by following the processing of beta5-subunit. This work has shown that some mutations in these ATPases led to an accumulation of the unprocessed proteasomal beta5-subunit at restricted temperature. This effect was not due to the upregulation of beta5 mRNA transcription. It is not very likely that proteins of the RC participate in early steps of proteasome biogenesis, since they could not be found in precurser intermediates containing the maturation factor Ump1p. However, they might be important for later assembly steps.
During biogenesis five prosequence containing beta subunits have to be processed. This proceeds via a two-step mechanism involving autocatalytic or transcatalytic processing by neighbouring subunits. The proposed mechanism could be confirmed by inactivation of the beta2i subunit via substitution of the active site Threonin1 against Alanin (beta2iT1A). The inactivation blocked the autocatalysis of beta2i and influenced the processing of beta7 and that of inactivated beta1i (beta1iT1A).
Keywords:
Proteasome
Chaperone-like activity 19S regulatory complex Proteasome biogenesis
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Å Ångström
Abb. Abbildung
Ala Alanin
AMC 7-Amido-4-Methylcumarin
AS Aminosäure(n)
Asp Aspartat
BCA Bicinchoninsäure
bp Basenpaar
BSA Rinderserumalbumin DEAE Diethylaminoethan
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) DTT Dithiothreitol
ECL enhanced chemiluminiscence EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure ER Endoplasmatisches Retikulum et al. et alii (und andere)
EtOH Ethanol
FKS fetales Kälberserum
FPLC fast protein liquid chromatography g Gramm/relative Erdbeschleunigung
Gly Glycin
h Stunde(n)
HSP Heat Shock Protein (Hitzeschockprotein)
kDa Kilodalton
LB Luria-Bertani-(Medium)
Lys Lysin
M molar
mA Milliampere
MCS multi copy region
MHC major histocompatibility complex
min Minute(n)
mM Millimolar
MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure
nM Nanomolar
NP40 Nonidet P40
OD Optische Dichte
ODC Ornithindecarboxylase
ORF open reading frame (offener Leserahmen)
Abkürzungsverzeichnis PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) PMSF Phenylmethylsulfonfluorid
PVDF Polyvinyldenfluorid
rcf relative centrifugal force (relative Zentrifugalkraft) RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
RT Raumtemperatur
SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Natriumdodecylsulfat)
sec Sekunden
TCA Trichloressigsäure
TEMED N, N, N’, N’-Tetramethyl-p-phenylendiamin
Thr Threonin
Tris Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan U Unit (Einheit der Enzymaktivität)
UE Untereinheit
ü.N. über Nacht UV Ultra Violett
V Volt
Vol Volumen
v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen
2D zweidimensional
1. Einleitung
1 Einleitung
1.1 Das 20S Proteasom
Das 20S Proteasom ist ein zellulärer, nichtlysosomaler Proteinkomplex, der eine bedeutende Rolle bei der Degradation von endogenen Proteinen spielt. Zum ersten Mal wurden 1968 mikroskopische Aufnahmen vom 20S Proteasom aus humanem Erythrozytenlysat in der Li- teratur veröffentlicht. Der Komplex, dessen Funktion zu diesem Zeitpunkt noch unbekannt war, wurde damals aufgrund seiner zylinderförmigen Struktur noch „Cylindrin“ genannt (Harris, 1968).
Anfang der 80er Jahre wurden durch unabhängige Gruppen hochmolekulare Komplexe aus verschiedenen Organismen isoliert, für die eine proteolytische Aktivität nachgewiesen werden konnte. So fand man beispielsweise eine hochmolekulare multikatalytische Protease in Rinder- hypophysen (Wilk et al., 1983) und in Rattenskelettmuskeln (Dahlmann et al., 1985) sowie eine 600 kDa große zylinderförmige alkalische Protease in Karpfenmuskeln (Hase et al. 1980). Des- weiteren wurde, ubiquitär in Eukaryonten vorkommend, ein Partikel namens „Prosom“ oder 19S Ribonucleoprotein (RNP) nachgewiesen, welches in Größe und Zusammensetzung der multikatalytischen Protease ähnelte und scheinbar mit RNA assoziert war (Schmid et al., 1984). Erst 1988 konnte bewiesen werden, daß es sich bei dem „Prosom“ und der multikata- lytische Protease um identische Komplexe handelte. Der Komplex wurde ab diesem Zeit- punkt von den meisten Arbeitsgruppen (20S) Proteasom genannt (Arrigo et al., 1988; Falken- burg et al., 1988). Der Name sollte die proteolytische Aktivität sowie die komplexe Struktur verdeutlichen (Arrigo et al., 1988). Aus Archaebakterien wurde ein dem eukaryotischen Pro- teasom ähnelnder prokaryotischer Proteasomkomplex isoliert (Dahlmann et al., 1989). Bei den Eubakterien dagegen scheint die Verbreitung von Proteasom auf Actinomyceten beschränkt zu sein. In Bakterien existieren dafür andere, dem 20S Proteasom mit assoziiertem 19S Regu- lator ähnelnde, Mehrkomponentenproteasen, die sogenannten Clp-Proteasen. Im Gegensatz zu eukaryotischen Zellen, ist das Proteasom in Prokaryonten nicht essentiell für deren Lebens- fähigkeit (Maupin-Furlow et al., 2000).
1.1.1 Aufbau und Struktur des 20S Proteasoms
Das 20S Proteasom von Pro- und Eukaryoten besteht aus 28 Untereinheiten. Allen 20S Pro- teasomkomplexen ist der Aufbau aus sogenannten alpha(α)- und beta(β)-Untereinheiten ge- meinsam. Der Komplex wird aus zwei übereinanderliegenden Ringen aus je sieben β-Unter- einheiten, die von zwei Ringen aus je sieben α-Untereinheiten beidseitig umschlossen werden, gebildet. Daraus ergibt sich eine sogenannte α7β7β7α7-Anordnung (Kopp et al., 1993, 1995), siehe Abbildung 1.1.
Die meisten untersuchten Archaebakterien enthalten je ein Gen für die α- und β-Untereinheit, wie beispielsweise Thermoplasma acidophilum und Archeoglobus fulgidus (Dahlmann et al., 1989;
Klenk et al., 1997), andere Archaebakterien besitzen zwei oder mehr Gene für die β-Unterein- heit (Maupin-Furlow et al., 1998), wobei aber noch nicht bekannt ist, ob beide β-Untereinhei- ten zugleich in den Komplex eingebaut werden. 20S Proteasomkomplexe aus Actinomyceten, der einzigen Eubakteriengruppe, bei der bis jetzt 20S Proteasom nachgewiesen wurde, beste- hen aus je vierzehn identischen α- und β-Untereinheiten (Cole et al., 1998). Eine Ausnahme bei den Actinomyceten scheint Rhodococcus erythropolis zu sein, in dessen 20S Proteasom je zwei verschiedene α- und β -Untereinheiten eingebaut werden (Tamura et al., 1995).
1. Einleitung In einzelligen Eukaryonten, wie zum Beispiel in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, setzt sich das 20S Proteasom aus je sieben verschiedenen α- bzw. β-Untereinheiten zusammen (Abb. 1.1 a).
Nur drei der sieben β-Untereinheiten, β1, β2 und β5, zeigen katalytische Aktivität (Seemüller et al., 1995; Groll et al., 1997). In Mammalia kommt es durch Interferon-γ Einfluß zu einer Stimulierung der Expression von drei weiteren β-Untereinheiten (β1i, β2i, β5i; i für „indu- zierbar“), welche gegen homologe konstitutiv exprimierte β-Untereinheiten (β1, β2, β5) aus- getauscht werden können (Monaco et al., 1995). Mehr als vierzehn proteasomale Gene wur- den in Drosophila melanogaster sowie Arabidopsis thalania gefunden. Es gibt in diesen Organismen für bestimmte proteasomale Untereinheiten mehrere Gene, die für gewebsspezifische Isofor- men der Untereinheiten kodieren. Über die physiologische Funktion dieser Isoformen ist aber noch nichts bekannt (Yuan et al., 1996; Fu et al., 1998). Einen Überblick über die verschiede- nen Bezeichnungen der eukaryotischen 20S Proteasom-Untereinheiten gibt Abbildung 1.2.
α- β- β- α-Ring
↓ ↓ ↓ ↓
a b
geöffneter Zugang in T. acidophilum
←
geschlossener Zugang in S. cerevisiae
←
Abb. 1.1: a) Räumliches Modell des 20S Proteasoms aus T. acidophilum (oben) bzw. S. cerevisiae (unten). Das 20S Proteasom hat eine 4-Ring-Struktur mit siebenfacher bzw. pseudosiebenfacher Symmetrie. Nur eine der sieben C2-Achsen aus T. acidophilum ist in Hefeproteasom konserviert und wurde markiert. b) Graphische Repräsen- tation und Analyse von Oberflächeneigenschaften (GRASP) des 20S Proteasoms aus T. acidophilum (oben) bzw.
S. cerevisiae (unten). Die Komplexe wurden entlang der Zylinderachse aufgeschnitten, wodurch die dem Lösungs- mittel nicht zugänglichen Atome (weiß) sichtbar werden. Die molekulare Oberfläche ist grau markiert. Das 20S Proteasom ist im Inneren in drei Kammern geteilt. In der mittleren Kammer finden sich die extra hervorge- hobenen katalytischen Seitenketten. Beide Abbildungen wurden freundlicherweise von M. Groll (MPI für Bio- chemie, Martinsried) zu Verfügung gestellt und entsprechen in Teilen den Abbildungen Fig. 3.1. und Fig. 3.2. aus Bochtler et al. (2000).
Elektronenmikroskopische Aufnahmen (Dahlmann et al., 1989; Pühler et al., 1992) sowie Kristallstrukturanalysen von 20S Proteasom aus T. acidophilum (Löwe et al., 1995) und S. cere- visiae (Groll et al., 1997) zeigen, daß das 20S Proteasom, aus Archaebakterien und Eukaryonten gleichermaßen, ein ca. 15 nm hohes zylinderförmiges Partikel mit einem Durchmesser von ca.
11 nm ist. Die Anordnung der Untereinheiten ergibt eine C2- sowie eine pseudo-siebenfache Symmetrie. In Komplexen mit je sieben verschiedenen α- und β-Untereinheiten ordnen sich diese in streng festgelegter Reihenfolge an, welche in den Abbildungen 1.1 a und 1.3 zu sehen ist. Diese Anordnung wurde auch in anderen Spezies so gefunden.
1. Einleitung Nomenklatur der 20S Proteasom-Untereinheiten
Name Alternative Bezeichnung in Alternative Bezeichnung Genname
Saccharomyces cerevisiae in Säugern in Säugern
alpha1 C7, PRS2, SclI iota, PROS27 PSMA6
alpha2 Y7, PRE8 C3 PSMA2
alpha3 Y13, PRE9 C9 PSMA4
alpha4 PRE6 C6, XAPC7 PSMA7
alpha5 PUP2, DOA5 Zeta PSMA5
alpha6 PRE5 C2, PROS30 PSMA1
alpha7 C1, PRE10, PRS1 C8 PSMA3
beta1 PRE3 Y, LMPY, Delta PSMB6
beta1i LMP2, RING12 PSMB9
beta2 PUP1 Z, MC14 PSMB7
beta2i MECL1 PSMB10
beta3 PUP3 C10-II, Theta PSMB3
beta4 C11, PRE1 C7-I PSMB2
beta5 PRE2, DOA3 X, LMPX, MB1, Epsilon PSMB5
beta5i LMP7, RING10, Y2, C13 PSMB8
beta6 C5, PRE7, PRS3 C5 PSMB1
beta7 PRE4 N3, Beta PSMB4
Abb. 1.2: Nomenklatur der 20S Proteasom-Untereinheiten in Eukaryonten. Die Darstellung beruht auf Daten aus Coux et al. (1996), Tanaka et al. (1997a) und Bochtler et al. (1999). Das „i“ steht für induzierbar durch γ- Interferon. Die Nummerierung (αi βi) erfolgte nach Groll et al. (1997).
Sowohl die α- als auch die β-Untereinheiten bestehen aus je zwei fünfsträngigen antiparallelen β-Faltblättern, welche auf einer Seite von den α-Helices H3, H4 und H5 und auf der anderen Seite von den α-Helices H1 und H2 flankiert werden. Unterschiede zwischen den Unterein- heiten scheint es in den loops und in den langen Insertionen, welche die sekundären Struktur- elemente verbinden, sowie in den N- und C-terminalen Regionen zu geben (Groll et al., 1997).
Die α-Untereinheiten haben N-terminale Extensionen, welche sich abschnittsweise zu einer weiteren α-Helix formieren (H0), die eine Furche im β-Faltblatt ausfüllt; diese Furche ist in den β-Untereinheiten nicht bedeckt (Löwe et al., 1995). Das 20S Proteasom hat im Inneren des Zylinders einen Kanal, der sich zu drei Kammern erweitert (Abb. 1.1 b). Die zwei äußeren Kammern werden jeweils durch einen α- und einen β-Ring, die zentral liegende Kammer durch die zwei β-Ringe gebildet. In der Hauptkammer befinden sich die katalytisch aktiven Zentren der β-Untereinheiten.
In der Strukturanalyse von 20S Proteasom aus T. acidophilum wurde gezeigt, daß der Zugang zu den Kammern vermutlich eine Öffnung an den Endringen ist (Löwe et al., 1995). Bei der Strukturanalyse von 20S Proteasom aus S. cerevisiae war dieser Zugang geschlossen (Groll et al., 1997), siehe auch Abb. 1.1 b.
1.1.2 Katalytische Aktivitäten des Proteasoms
In Archaebakterien sind alle β-Untereinheiten für die katalytische Aktivität des Komplexes verantwortlich. Bei den Eukaryonten besitzen nur drei der sieben β-Untereinheiten kataly-
1. Einleitung tische Aktivität (β1, β2, β5). Diese Anzahl ändert sich auch nicht durch den Austausch der durch Interferon-γ induzierbaren Pendants einiger konstitutiv exprimierter Untereinheiten.
Dadurch gibt es in eukaryotischen Proteasomen nur sechs aktive Zentren (Heinemeyer et al., 1997; Dick et al., 1998).
α3 α4 α5 α6 α7 α1 α2 β4 β5 β6 β7 β1 β2 β3
β4 β3 β2 β1 β7 β6 β5 α3 α2 α1 α7 α6 α5 α4
Abb. 1.3: Anordnung der Untereinheiten im humanen 20S Proteasom, abgeleitet vom Homolog in Hefe. Die aktiven β-Untereinheiten wurden grau unterlegt. Die Darstellung wurde mit leichten Änderungen aus Kopp et al.
(1997) entnommen.
Die drei katalytischen Untereinheiten (β1, β2, β5 bzw. β1i, β2i, β5i) sowie beta6 und beta7 werden als Vorläuferproteine mit einer bis zu 80 Aminosäuren langen N-terminalen Prose- quenz (siehe Abb. 1.5) exprimiert und erst im Laufe der Biogenese des 20S Proteasoms zu ihrer reifen, im Falle der katalytischen Untereinheiten damit auch aktiven, Form prozessiert (siehe 1.1.3).
1995 wurde publiziert, daß das nach autokatalytischer Prozessierung am N-Terminus der Aminosäureketten von β1(i), β2(i) und β5(i) stehende Threonin1 für den Katalysemechanis- mus des 20S Proteasoms essentiell ist (Löwe et al., 1995; Seemüller et al., 1995). Dies führte zu der Zuordnung des Proteasoms zu den sogenannten N-terminalen nucleophilen (Ntn)-Hydro- lasen (Branningan et al., 1995). Desweiteren sind für die Katalyse die Aminosäuren Gluta- mat17 und Lysin33 der katalytischen Untereinheiten wichtig. Nach Deprotonierung der Thr1- Hydroxylseitenkette steht diese für den nucleophilen Angriff zur Verfügung. Dabei fungieren entweder Lys33 oder die N-terminale Aminogruppe von Thr1 als Protonendonor/-akzeptor.
Glu17 stabilisiert vermutlich die protonierte Form des Protonenakzeptors (Schmidtke et al., 1996). Die Bedeutung dieser Aminosäuren wurde durch Mutationsanalysen bestätigt. Bei Mutation des Thr1 zu Ala1 in β1, β1i, β2 und β5i oder des Lys33 zu Ala33 in β1i und β5 (Schmidtke et al., 1996; Heinemeyer et al., 1997; Dick et al., 1998; Witt et al., 2000) nimmt das gegen Thr1 ausgetauschte Ala1 in den T1A-Mutanten bzw. das Thr1 in den K33A-Mutanten nicht mehr die erste Position in der Peptidkette ein, da diese Untereinheiten durch die Muta- tionen nur unvollständig prozessiert werden (siehe 1.1.3). Gleichzeitig geht die jeweilige pro- teolytische Aktivität verloren oder wird abgeschwächt. Der T1A-Austausch in beta5 in S. cere- visiae ist für die Zellen letal (Heinemeyer et al., 1997).
Durch die oben erwähnten Mutationsanalysen, konnten die verschiedenen katalytischen Ak- tivitäten den einzelnen β-Untereinheiten zugeordnet werden. So findet man im eukaryotischen Proteasom eine chymotrypsinähnliche, eine trypsinähnliche und eine petidyl-glutamyl-peptid- spaltende (PGPH) Aktivität. Letztere Aktivität wird nach ihrer Spaltungsspezifität auch kaspa- seähnliche Aktivität genannt (Kisselev et al., 1999). Ursprünglich wurden die Aktivitäten durch die Spaltung von fluorogenen Peptidsubstraten charakterisiert (Orlowski et al., 1990, 1993).
Das Proteasom aus T. acidophilum, das nur einen Typ an β-Untereinheit enthält, zeigt vorwie- gend chymotrypsinähnliche Aktivität (Akopian et al., 1997). Einen Überblick über die ver- schiedenen Aktivitäten sowie deren Zuordnung zu den katalytischen β-Untereinheiten gibt Abbildung 1.4.
1. Einleitung Katalytische Aktivitäten der beta-Untereinheiten
• Chymotrypsinähnliche Aktivität (ChT-L) = Spaltung der Peptidbindung nach hydro- phoben Aminossäuren
• Petidyl-glutamyl-peptid Hydrolase Aktivität (PGPH) = Spaltung der Peptidbindung nach sauren Aminosäuren
• Trypsinähnliche Aktivität (T-L) = Spaltung der Peptidbindung nach basischen Amino- säuren
• Branched chain aminoacid prefering (BrAAP) = Spaltung der Peptidbindung nach Aminosäuren mit verzweigten Seitenketten
in Thermoplasma: ChT-L in Eukaryonten:
beta1: PGPH, BrAAP, (ChT-L) beta2: T-L, (ChT-L) beta5: ChT-L
beta1i: ChT-L beta2i: T-L beta5i: ChT-L
Abb. 1.4 : Übersicht der verschiedenen katalytischen Aktivitäten des Proteasoms und ihre Zuordnung zu den einzelnen β-Untereinheiten. Die Hauptaktivitäten der eukaryotischen Untereinheiten sind unterstrichen. Die Dar- stellung beruht auf Daten aus Heinemeyer et al. (1997), Dick et al. (1998) und Orlowski et al. (1993, 2000).
1.1.3 Assemblierung und Reifung des 20S Proteasoms
Die Assemblierung der 20S Untereinheiten zum Komplex scheint in Archaebakterien und Actinomyceten im Vergleich zu den eukaryotischen Komplexen einfach abzulaufen. Die rekombinant exprimierten α-Untereinheiten von T. acidophilum sind in der Lage, zu einem heptameren Ring zu assemblieren (Zwickl et al., 1994). Auch die humane α7-(= C8) Unter- einheit kann eine doppelte Ringstruktur bilden (Gerards et al., 1997). Die α-Untereinheiten von Rhodococcus sind dazu jedoch nicht fähig.
Rekombinant exprimierte β-Untereinheiten ohne eine gleichzeitige Expression von α-Unter- einheiten sind nicht in der Lage, eine geordnete Struktur zu bilden. Das wurde so für die β- Untereinheiten aus T. acidophilum gezeigt, die sowohl mit als auch ohne Prosequenz exprimiert wurden (Zwickl et al., 1994). In T. acidophilum kommt es bei gleichzeitiger Expression von α- und β-Untereinheiten zu einer Assemblierung von proteolytisch aktivem Proteasom. Diese Assemblierung findet auch in Abwesenheit der beta-Propeptide statt (Zwickl et al., 1992, 1994). Die rekombinant exprimierten α- und β-Untereinheiten aus Rhodococcus bilden, wenn sie in vitro zueinander gegeben werden, α/β-precursor-Heterodimere, aus denen schnell „halbe Proteasomen“ entstehen (je ein α- und ein β-Ring). Die „halben Proteasomen“ sind proteo- lytisch inaktiv. Erst durch die Zusammenlagerung von zwei derartigen Teilkomplexen wird der entstehende Gesamtkomplex aktiv. Die Prosequenzen der β-Untereinheiten unterstützen hier die korrekte Assemblierung, sind aber nicht essentiell (Zühl et al., 1997).
In Eukaryonten scheint die Assemblierung komplizierter zu sein, da bisher verschiedene Vor- läuferkomplexe des 20S Proteasoms (Proteasomprecursorkomplexe) beobachtet wurden. Die erste Vorform, der sogenannte 13S Komplex, enthält alle α-Untereinheiten sowie einige β- Untereinheiten (wahrscheinlich β2, β3 und β4) (Frentzel et al., 1994; Nandi et al., 1997;
Schmidtke et al., 1997). Der Begriff „13S“ sowie auch die späteren Begriffe „16S“, „19S“ usw.
1. Einleitung wurden von den für diese Komplexe gefundenen Sedimentationkoeffizienten abgeleitet. Bei dem nächstgrößeren Komplex handelt es sich um den sogenannten 16S Komplex (Frentzel et al., 1994), in dem weitere β-Untereinheiten zu finden sind.
Der 16S Komplex ist hinsichtlich der Anzahl der vorhandenen β-Untereinheiten vermutlich ein heterogener Komplex (Nandi et al., 1997). So wird beschrieben, daß β6, β5i und β1 erst spät eingebaut werden. Nandi et al. (1997) konnten β5 im 16S Komplex nicht nachweisen. In den isolierten Komplexen anderer Gruppen waren ebenfalls nicht alle β-Untereinheiten in den 2D-Gelen der 16S Komplexe zu sehen (Schmidtke et al., 1997). In den 13S Vorläuferkom- plexen liegen die β-Untereinheiten in ihrer unprozessierten Form vor (Schmidtke et al., 1997;
Nandi et al., 1997). Auf den 16S Komplex trifft dies grundsätzlich ebenfalls zu. Es konnte aber die Prozessierungsmöglichkeit von β5i, β1i und β1 im isolierten 16S Komplex nachge- wiesen werden (Frentzel et al., 1994; Schmidtke et al., 1997). Allerdings ist die Bildung eines aktiven 20S Komplexes aus den isolierten 16S Vorläuferkomplexen nicht möglich (Schmidtke et al., 1997). Die Prozessierung der meisten β-Untereinheiten findet möglicherweise erst wäh- rend oder kurz nach der Assemblierung zweier solcher Komplexe statt (Nandi et al., 1997;
Heinemeyer et al., 1997; Chen et al., 1996). Funktionell könnte die Anwesenheit der Prose- quenzen in den Vorläuferkomplexen einen Schutz der aktiven Seitenketten bewirken und eine katalytische Aktivität außerhalb des dafür vorgesehen Reaktionsraumes, der inneren Kammer, verhindern.
In dem 16S Komplex wurden neben Untereinheiten des 20S Proteasoms auch Hsc73 (Schmidtke et al., 1997) und in Saccharomyces cerevisiae ein niedermolekulares Protein namens Ump1 (Ramos et al., 1998) nachgewiesen. Die Existenz eines zu Ump1 homologen Proteins (POMP) wurde auch in Säuger-Zellinien nachgewiesen (Frentzel et al., 1994; Witt et al., 2000).
Möglicherweise liegt POMP auch schon im 13S Komplex vor. In anderen eukaryotischen Spe- zies wurden ebenfalls homologe Gensequenzen zu Ump1 gefunden (Witt et al., 2000). Die Deletion des UMP1-Gens in S. cerevisiae führt zu einer Anreicherung von unprozessierten β- Untereinheiten sowie von beta5-Prozessierungsintermediaten, die in Wildtyp-Stämmen auf- grund ihrer Kurzlebigkeit nicht nachgewiesen werden können (Ramos et al., 1998). Dies deu- tet auf eine entscheidende Rolle des Ump1-Proteins bei der Reifung des 20S Proteasoms hin.
In reifen 20S Proteasomkomplexen ist Ump1 bzw. POMP nicht mehr nachweisbar. Es wird vermutet, daß das Protein im reifen 20S Proteasom abgebaut wird (Ramos et al., 1998; Witt et al., 2000).
Eine wichtige Rolle für die 20S Proteasom Reifung spielt die Prozessierung der Propeptide der katalytisch aktiven Untereinheiten beta1, beta2 und beta5 sowie von beta6 und beta7 (beta3 und beta4 werden nicht als Proform synthetisiert). Im Gegensatz zu den Propeptiden bei den β-Untereinheiten der Archaebakterien, die 8–10 AS lang sind (Zwickl et al., 1992), haben die Propeptide von Eukaryonten eine Länge von bis zu 80 AS. Abbildung 1.5 zeigt einen Ver- gleich Prosequenzen von β-Untereinheiten mehrerer Spezies.
Für die Reifung der katalytischen Untereinheiten wird ein Zwei-Schritt Mechanismus vorge- schlagen. Der erste Schritt der Prozessierung scheint notwendig zu sein, um die Prosequenzen zu verkürzen und diese dadurch möglicherweise auf eine einheitliche Länge zu bringen. Durch mehrere Arbeitsgruppen (Schmidtke et al., 1996; Heinemeyer et al., 1997; Schmidt et al., 1999) wurde nachgewiesen, daß es sowohl bei einem Austausch des Threonin1 (Position 1 der pro- zessierten Untereinheit) als auch des Lysin33 zu Alanin zur unvollständigen Abspaltung der Prosequenz der entsprechenden katalytischen β-Untereinheiten kommt. Es verbleiben 8–10 AS als Prosequenz. Es wird angenommen, daß an diesem Prozessierungsschritt auch kataly- tisch aktive Nachbaruntereinheiten beteiligt sein könnten, weshalb dieser Prozess als „trans- Autokatalyse“ bezeichnet werden kann (Schmidtke et al., 1996; Heinemeyer et al., 1997; Jäger et al., 1999; Groll et al., 1999). Dieser Prozessierungsmodus greift vermutlich auch für die
1. Einleitung Untereinheiten beta6 und beta7, die in einem Schritt durch katalytische aktive Untereinheiten prozessiert werden. Ein katalytisch aktives Threonin wird in diesen Untereinheiten dadurch allerdings nicht freigelegt.
Der zweite Schritt der Prozessierung der katalytischen Untereinheiten ist besser charakteri- siert. Die unvollständige Prozessierung in den oben erwähnten Mutanten läßt auf eine Auto- katalyse als zweiten Prozessierungsschritt schließen. Von großer Bedeutung sind dabei die Aminosäuren Thr1 und Lys33 der jeweiligen zu prozessierenden Untereinheit (Löwe et al., 1995; Schmidtke et al., 1996) (siehe auch 1.1.2).
Ta-beta MNQTLETG↔TTIVGITLK
Rs-beta1 MTADRPALRTGDRDTRLSFGSNLSSFTDYLRGHAPELLPENRIGHRSHSTRGGDGMESGDLAPHG↔TTIVALTYK
Rs-beta2 MTVDRAPRITDGDTRLSFGSNLSSFSEYLRVHAPEHLPQNRFADTGGVVMGGGDVAPHG↔TTIVAISYA
Sc-beta1 MNGIQVDINRLKKGEVSLG↔TTIMAVQFD
Hs-beta1 MAATLLAARGAGPAPAWGPERFTPDESREVSTG↔TTIMAVQFD
Hs-beta1i MLRAGAPTGDLPRAGEVHTG↔TTIMAVEFD
M-beta1i MLRAGAPTAGSFRTEEVHTG↔TTIMAVEFD
Sc-beta2 MAGLSFDNYQRNNFLAENSHTQPKATSTG↔TTIVGVKFN
Hs-beta2 MAAVSVYAPPVGGFSFDNCRRNAVLEADFAKRGYKLPKVRKTG↔TTIAGVVYK
Hs-beta2i MLKPALEPRGGFSFENCQRNASLERVLPGLKVPHARKTG↔TTIAGLVFQ
M-beta2i MLKQAVEPTGGFSFENCQRNASLEHVLPGLRVPHARKTG↔TTIAGLVFR
Sc-beta3 MSDPSSINGGIVVAMTGK
Hs-beta3 MSIMSYNGGAVMAMKGK
Sc-beta4 MDIILGIRVQ
Hs-beta4 MEYLIGIQGP
Sc-beta5 MEAIADSFSVPNRLVKELQYDNEQNLESDFVTGASQFQRLAPSLTVPPIASPQQFLRAHTDDSRNPDCKIKIAHG↔TTTLAFRTQ
Hs-beta5 MALASVLERPLPVNQRGFFGLGGRADLLDLGPGSLSGDLSLAAPGWGVPEEPGIMLHG↔TTTLAFKFR
Hs-beta5i MALLDVCGAPRGQRPESALPVAGSGRRSDPGHYSFSMRSPELALPRGMQPTEFFQSLGGDGERNVQIEMAHG↔TTTLAFKFQ M-beta5i MALLDLCGAARGQRPEWAALDAGSGGRSDPGHYSFSAQAPELALPRGMQPTAFLRSFGGDQERNVQIEMAHG↔TTTLAFKFQ
Sc-beta6 MATIASEYSSEASNTPIEH↔QFNPYGDNGGTILGIAGE
Hs-beta6 MLSSTAMYSAPGRDLGMEPHRAAGPLQL↔RFSPYUFNGGTILAIAGE
Sc-beta7 MNKDPFSWGRPADSTYGAYNTQIANAGASPMVN↔TQQPIVTGTSVISMKYD
Hs-beta7 MEAFLGSRSGLWAGGPAPGQFYRIPSTPDSFMDPASALYRGPITR↔TQNPMVTGTSVLGVKFD
Abb. 1.5: Sequenzvergleich der Prosequenzen der proteasomalen β-Untereinheiten. Dargestellt sind die Prose- quenzen aus Thermoplasma acidophilum (Ta), Rhodococcus Spec. (Rs), Saccharomyces cerevisiae (Sc), Mensch (Hs) sowie einiger Maus-Untereinheiten (M). Die in Wildtyp-Zellen vorkommenden Spaltstellen sind durch einen Doppel- pfeil markiert. Die Darstellung erfolgte in starker Anlehnung an Fig.1 aus Schmidtke et al. (1996) und basiert desweiteren auf Daten aus Schmidt et al. (1999).
Die Bedeutung der Prosequenzen für die Assemblierung ist unterschiedlich. Die Anwesenheit der Prosequenz in Archaebakterien hat keinen Einfluß auf den Einbau der β-Untereinheiten in den 20S Komplex (Zwickl et al., 1992). In Eukaryonten wurden die prozessierbaren Unter- einheiten auch dann eingebaut, wenn der letzte Autokatalyseschritt infolge einer Mutation nicht möglich war (Ausnahme ist die T1A-Mutation in β5 von S. cerevisiae), die Prosequenz von β1i deletiert wurde oder die Untereinheiten mit einer Prosequenz einer anderen Unter- einheit versehen wurden (Schmidt et al., 1999; Witt et al., 2000). Letzteres beeinflußte auch nicht die Position der Untereinheit im Komplex. In S. cerevisiae ist die Präsenz der beta5- Prosequenz für den Einbau dieser Untereinheit in das 20S Proteasom und demzufolge für die Lebensfähigkeit der Zellen essentiell. Dabei kann die Sequenz auch in trans, das heißt, wenn sie unabhängig vom restlichen Protein exprimiert wird, wirken (Chen et al., 1996; Heinemeyer et al., 1997; Jäger et al., 1999). Die Deletion der Prosequenz von β5 in Hefe war nicht letal, wenn gleichzeitig Ump1 deletiert wurde. Dies spiegelt die funktionelle Bedeutung der Prosequenz von β5 im Zusammenspiel mit Ump1 für den Assemblierungsprozess wieder. Eine Bedeutung der Prosequenz von beta5 für die korrekte Positionierung dieser Untereinheit im 20S Kom- plex ist daraus aber nicht abzuleiten (Ramos et al., 1998). Weiterhin wurde festgestellt, daß trotz Abwesenheit der Prosequenz von β5i in humanen Zellinien (bei gleichzeitig exprimier- tem beta5) β5i schwach in den 20S Proteasomkomplex eingebaut wurde. In diesen Zellen kam es zur Anreicherung von Ump1 und Proteasomvorläuferkomplexen, außerdem wuchsen die
1. Einleitung Zellen vergleichsweise schlecht. Schon durch die Fusionierung der Prosequenz der β1i-Unter- einheit an β5i, wurde die β5i-Untereinheit besser in das 20S Proteasom eingebaut. Die Unter- einheit war im 20S Proteasom einerseits als prozessiertes β5i andererseits auch als β5i mit β1i- Prosequenz nachweisbar (Witt et al., 2000). Die Deletion der Prosequenz von β2, aber nicht der von β1, führte in S. cerevisiae zu einem schlechteren Wachstum der Hefezellen (Jäger et al., 1999). Es wurde festgestellt, daß die Prosequenzen nicht vorrangig der Verhinderung der früh- zeitigen Aktivierung der β-Untereinheiten dienen, sondern vielmehr dem Schutz des kataly- tisch aktiven Threonins vor Acetylierung und der daraus resultierenden Inaktivierung (Jäger et al., 1999; Arendt et al., 1999). Die Zugabe der Propeptide in trans kann zwar zu einem verbes- serten Wachstums der Deletionsstämme führen, aber nicht einen Schutz des Threonins vor ungewollter Acetylierung bieten (Jäger et al., 1999). Die Prosequenzen spielen für die Anord- nung der β-Untereinheiten im Ring keine Rolle (Schmidt et al., 1999; Schmidt et al., 1997).
Bei den α-Untereinheiten sind die N-Termini stark konserviert. Sie sind essentiell für die As- semblierung der 20S Komplexe (Seelig et al., 1993; Zwickl et al., 1994) und beschränken den Zugang zu den katalytischen Zentren (Groll et al., 2000).
1.2 Regulatorische Komplexe des 20S Proteasoms
Der 20S Komplex benötigt zum Erfüllen seiner Aufgaben in Eukaryonten die Interaktion mit regulatorischen Komplexen. Am besten charakterisiert sind der 11S Regulator (auch PA28) sowie der 19S regulatorische Komplex (auch PA700), die im Folgenden näher vorgestellt wer- den. Prinzipiell können ein oder zwei regulatorische Komplexe einer Art an das 20S Protea- som binden. Auch die gleichzeitige Bindung von je einem 11S und einem 19S Komplex wurde beobachtet (Hendil et al., 1998; Tanahashi et al., 2000).
1.2.1 Der regulatorische 19S Komplex
1.2.1.1 Der Aufbau des regulatorischen 19S Komplexes
Der 19S Komplex besteht aus 18–20 verschiedenen Untereinheiten, wobei die Anzahl der Untereinheiten speziesabhängig ist. Einen Überblick über die Untereinheiten gibt Abbildung 1.6. Der 19S Komplex ist asymmetrisch und ca. 15 nm lang (Peters et al., 1993; Yoshimura et al., 1993).
Es wurde gezeigt, daß beide α-Ringe des 20S Proteasom Komplexes mit je einem 19S Kom- plex interagieren können (Glickman et al., 1998a; Walz et al., 1998). Dabei scheinen die 19S Komplexe eine festgelegte Position einzunehmen, was für einen hochspezifischen Kontakt zwischen beiden Komplexen spricht und die C2-Symmetrie des 20S Komplexes fortsetzt (Walz et al., 1998). Der resultierende Komplex zwischen dem 20S Proteasom und seinem regulatorischen 19S Komplex heißt 26S Proteasom, der 20S Komplex wird in diesem Zusam- menhang auch Core-Komplex genannt.
Durch Deletion der Rpn10-Untereinheit in Saccharomyces cerevisiae (Rpn10) konnte man die Un- terteilung des 19S Regulators in zwei Subkomplexe zeigen (Glickman et al., 1998b). Der soge- nannte Base-Subkomplex besteht aus den sechs AAA-ATPasen (AAA = ATPases associated to a variety of cellular activities) des Regulators, sowie den Untereinheiten Rpn1, Rpn2 (beides hochmolekulare Proteine) und Rpn10. Es wird vermutet, daß ein Hexamer-Ring aus den ATPasen direkten Kontakt zu dem heptameren α-Ring des 20S Proteasoms hat. Interaktionen zwischen Hexa-und Heptamer-Ringen sind in der Natur nicht ungewöhnlich. Ähnliches findet man auch bei den eubakteriellen Clp-Proteasen, bei denen ein ClpA-Komplex (Hexamer,
1. Einleitung ATPasen) mit dem ClpP-Komplex (Heptamer) eine aktive Mehrkomponentenprotease bildet (Kessel et al., 1995).
Zum sogenannten Lid-Subkomplex gehören alle anderen Untereinheiten des 19S Regulators.
Die Untereinheiten des Lid-Komplexes weisen starke Sequenzhomologien zu Untereinheiten des IF3 Komplexes (translational initation factor) sowie des COP9/Signalosom Komplexes, der an Signaltransduktionsprozessen beteiligt ist, auf (Glickman et al., 1998b).
Neue Bezeichnung Alternative Bezeichnung Alternative Bezeichnung Genname Subkomplex in S. cerevisiaea in S. cerevisiae in höheren Eukaryonten in Säugern
Rpn1 Hrd1, Nas1 S2, TRAP-2, p97 PSMD2 Base
Rpn2 Sen3 S1, p112 PMSD1 Base
Rpn3 Sun2 S3, p58 PMSD3 Lid
Rpn4b Son1, Ufd5 Lid
Rpt1 Cim5, Yta3 S7, MSS1 PSMC2 Base
Rpt2 Yta5 S4, p56 PSMC1 Base
Rpt3 Yta2, Ynt1 S6, TBP7, p48 PSMC4 Base
Rpt4 Crl13, Sug2, Pes1 S10b, p42 PSMC6 Base
Rpt5 Yta1 S6´, TBP1 PSMC3 Base
Rpn5 Nas5 p55 PSMD12 Lid
Rpn6 Nas4 S9, p44,5 PSMD11 Lid
Rpn7 ORF u32445 S10, p44 PSMD6 Lid
Rpt6 Sug1, Cim3, Crl3 S8, TRIP1, p45 PSMC5 Base
Rpn8 nas3 S12, p40 PSMD7 Lid
Rpn9 nas7 S11, p40,5 Lid
Rpn10 Meb1, Sun1 S5a PSMD4 Base
Rpn11 Mpr1 Poh1 Lid
Rpn12 Nin1 S14 PSMD8 Lid
S5bc Lid
S15d Lid
a Sortierung nach Molekularer Masse in Saccharomyces cerevisiae
b bis jetzt nur in S.c.gefunden, aber dort auch nicht in allen Isolierungen zu sehen (Glickman et al., 1998a)
c, d bis jetzt nur in humanen Zellen gefunden
Abb. 1.6: Nomenklatur der Untereinheiten des 19S Regulators sowie ihre Zuordnung zu den Subkomplexen. Die Darstellung erfolgte nach Daten aus Tanaka et al. (1997a), Glickman et al. (1998a) und Voges et al. (1999).
1.2.1.2 Die Funktionen des 19S Komplexes und seiner Untereinheiten
In den vergangenen Jahren wurde gezeigt, daß das 26S Proteasom für die ATP- und Ubiqui- tinabhängige Degradation von Proteinen in eukaryotischem Zytoplasma und Kern verant- wortlich ist (Hershko et al., 1998). Es wird vermutet, daß durch die Hydrolyse von ATP durch die 19S ATPasen oder auch nur durch Nukleotidbindung die Assemblierung von 20S Protea- som und 19S Komplex zum 26S Proteasom unterstützt wird (Peters et al., 1994; Hoffmann et al., 1997). Der 19S Komplex dient der Erkennung der abzubauenden Substrate. Die meisten der durch das Proteasom abzubauenden Proteine werden vorher durch eine Polyubiquitylie- rung markiert. Die Proteinsubstrate können aufgrund des strukturellen Aufbaus des Protea- soms nur in entfalteter Form zu den aktiven Zentren im Inneren des 20S Core Partikels des 26S Proteasoms gelangen. Für die Entfaltung der Substrate und ihrer Translokation zu dem proteolytischen Kernkomplex scheint ebenfalls der 19S Regulator verantwortlich zu sein. Der Kristallstrukturanalyse zufolge, ist der Zugang zu den katalytischen Zentren des 20S Protea-
1. Einleitung soms in S. cerevisiae verschlossen (Groll et al., 1997). Es wird vermutet, daß der Zugang erst durch die Interaktion zwischen 19S und 20S Komplex geöffnet wird (Groll et al., 1997, 2000;
Glickman et al., 1998a; Ferell et al., 2000; Köhler et al., 2001). Peptide können auch in Abwe- senheit des 19S Regulator zu den aktiven Zentren gelangen, allerdings ist dann die Abbaurate der Peptide verlangsamt (Adams et al., 1998).
Für die Öffnung des Zugangs zu den katalytisch aktiven Seitenketten, sind wahrscheinlich die 19S ATPasen verantwortlich. Dafür spricht ihre direkte Nachbarschaft zu den α-Unterein- heiten, die diesen Zugang blockieren. Außerdem könnten sie die Energie für diesen Öffnungs- prozess durch die Hydrolyse von ATP bereitstellen. Die Hydrolyse von ATP hat möglicher- weise auch Bedeutung für die Entfaltung der Substrate. Dafür spricht ein Vergleich von 26S Proteasom mit bekannten Chaperonkomplexen und deren Funktionen. Chaperone sind durch Interaktion mit nichtnativen Proteinen in der Lage, diese vor Aggregation zu schützen indem sie bei der Proteinfaltung/-entfaltung mitwirken. Sie können aber auch bereits entstandene Aggregate auflösen (Wickner et al., 1999). Es gibt bei den Clp-Komplexen in Bakterien einen ATPase-Komplex (ClpA), der mit einem Proteasekomplex (ClpP) interagiert (Kessel et al., 1995). Die ClpA-Untereinheiten gehören, genauso wie die 19S-ATPasen, zur Familie der AAA-ATPasen (Neuwald et al., 1999). Der ClpA-Komplex bindet und entfaltet Substrate für den ClpP-Komplex und erleichtert den Transport dieser Substrate zum proteolytischen Zen- trum. Für die Substratbindung ist die Anwesenheit von Nukleotiden hinreichend, die nachfol- genden Schritte benötigen die Hydrolyse von ATP (Wickner et al., 1994; Hoskins et al., 1998;
Weber-Ban et al., 1999). So könnte es auch möglich sein, daß im 26S Proteasom Energie für die Translokation der Substrate zu den aktiven Zentren benötigt wird, die durch die 19S ATPasen bereitgestellt wird. Es wurde gezeigt, daß das 20S Proteasom mit assoziiertem Base- Subkomplex in der Lage war, die Hydrolyse von Peptiden und dem strukturell instabilen Pro- tein Casein in Gegenwart von ATP zu aktivieren (Glickman et al., 1998b). In dem Zusammen- hang wurde auch festgestellt, daß für den Abbau von ubiquitylierten Proteinsubstraten der vollständige regulatorische 19S Komplex nötig war. Dies deutet auf die vermutete Hauptfunk- tion des Lid-Subkomplexes hin: der Erkennung von Abbausubstraten, die durch den gesamten 19S Komplex dann weiter auf die Proteolyse vorbereitet werden. Die Rpn10 Untereinheit kann in vitro Ubiquitin binden (van Nocker et al., 1996; Rubin et al., 1997). In Saccharomyces cerevisiae ist RPN10 jedoch nicht essentiell. In den entsprechenden Deletionsstämmen werden ubiquitylierte Proteine normal abgebaut (Rubin et al., 1997). Diese in vivo Befunde sprechen dafür, daß noch mindestens eine weitere ubiquitinbindene Stelle im 19S Komplex vorhanden sein muß. Desweiteren zeigt der 19S Komplex eine Isopeptidaseaktivität (Lam et al., 1997), durch die die Ubiquitine der Abbausignale abgespalten werden können. Das 26S Proteasom kann allerdings auch nicht ubiquitylierte Proteine abbauen, sofern diese genügend entfaltet sind. Es wurde gezeigt, daß die Ornithin-Decarboxylase (ODC) durch Interaktion mit Anti- zym destabilisiert wird und dann der ODC-Antizym-Komplex als Degradationssubstrat vom 26S Proteasom erkannt wird (Murakami et al., 1992, 1996). Demzufolge ist Ubiquitin ein hin- reichendes aber nicht notwendiges Degradationssignal.
Viele der Untereinheiten des 19S Komplexes wurden ursprünglich durch Effekte, ausgelöst durch Mutationen anderer Proteine, oder durch Interaktionen mit „proteasomfremden“ Pro- teinen entdeckt (Voges et al., 1999). Mutationen in den Untereinheiten vom 19S Komplex in S. cerevisiae führen teilweise zu Wachstumsdefekten, die oft auf Zellzyklusarresten in der Mitose beruhen (Ghislain et al., 1993; Rubin et al., 1998). Diese sind vermutlich auf einen gestörten Substratabbau und damit verbundenen Anstau von Zellzyklusregulatoren zurückzuführen.
Eine von der Proteindegradation unabhängige Rolle spielt der 19S Regulator bei der SOS- Reparatur von Nukleotidsträngen (Nucleotid Excision Repair) (Russell et al., 1999). Lommel et al. (2000) glauben hingegen an eine negative Abhängigkeit zwischen Proteinabbau durch das Proteasom und der SOS-Reparatur.
1. Einleitung
1.2.2 Der 11S Regulator
Den 11S Regulator, auch PA28 oder REG genannt, fand man bisher nur in Zellen aus höhe- ren Eukaryonten. Er wird aus α- und β-Untereinheiten gebildet, die beide IFN-γ induzierbar sind (Dubiel et al., 1992). Die Untereinheiten lagern sich zu Hexa- oder Heptamer-Ringen zusammen (Ahn et al., 1996; Tanaka et al., 1997b; Zhang et al., 1998; Stohwasser et al., 2000) und gehen als Ring vermutlich eine ähnliche Interaktion wie der 19S Regulator mit den α- Ringen des 20S-Proteasoms ein (Gray et al., 1994). Rekombinant exprimierte PA28α-Unter- einheiten bilden einen Heptamerring (Knowlton et al., 1997). Auch die PA28β-Untereinheiten sind dazu in der Lage. Letztere liegen in niedrigen Konzentrationen aber auch als Monomer oder in kleineren Multimerkomplexen vor (Wilk et al., 2000; Realini et al., 1997). Durch Ko- kristallisation von 20S Proteasom aus Hefe mit einem zum 11S Regulator homologen Kom- plex aus Trypanosoma brucei (= PA26 Komplex) konnte gezeigt werden, das diese Interaktion die Öffnung des Zuganges zu den katalytischen Zentren des Proteasoms ermöglicht (Whitby et al., 2000).
Der Einfluß des 11S Regulators auf das 20S Proteasom ist ATP-unabhängig und führt zu einer Stimulierung der Peptidabbauraten. Durch die Interaktion zwischen dem 11S Komplex und dem 20S Proteasom werden andere Peptide aus den Proteinen durch veränderte Schnitt- präferenzen generiert. Das führt meist zu einer effizienteren und schnelleren Generierung von Peptidfragmenten, die zum Teil auch durch MHC Klasse I-Proteine auf der Zelloberfläche präsentiert werden können (Pamer et al., 1998; Groettrup et al., 1996a).
Interessanterweise sind die Gene der ebenfalls γ-Interferon induzierbaren 20S Proteasom Untereinheiten β1i und β5i in MHC KlasseII-Genlocies gemeinsam mit anderen an der Antigenpräsentierung beteiligten Proteine, z.B. TAP, lokalisiert (Tanaka et al., 1997b). Diese Information stützt noch die Vermutung, daß sowohl der PA28-Komplexes als auch unab- hängig davon das Immunoproteasom an der MHC Klasse I-Antigenprozessierung einiger Proteine beteiligt ist (Kloetzel, 2001).
1.3 Zelluläre Funktion der proteasomalen Komplexe
Studien mit Proteasominhibitoren zeigten, daß der Hauptteil der zellulären Proteine (ca.
80–90 %) durch das Proteasom abgebaut wird (Rock et al., 1994).
Es wurde gezeigt, daß das 26S Proteasom an dem Abbau anormaler und beschädigter Proteine (Coux et al., 1996), von Transkriptionsfaktoren, von Zellzyklusregulatoren, z.B. Cyclin B (Tokumoto et al., 1997), sowie von Onkogenen und Tumorsupressoren (Lee et al., 1998) beteiligt ist. Desweiteren ist das 26S Proteasom zusammen mit dem 11S-20S-Proteasomkom- plex oder als 19S-20S-11S-Komplex an der Antigenprozessierung beteiligt (Pickart et al., 2000;
Hendil et al., 1998). Proteasomkomplexe haben nicht nur eine Funktion bei der Degradation von Proteinen, sondern auch bei der Proteinprozessierung durch beispielsweise einer defi- nierten Spaltung von Proproteinen. So ist die Bildung der p50-Untereinheit von NF-kB aus dem p105-Vorläuferprotein durch das 26S Proteasom nachgewiesen worden (Orian et al., 2000). Darüber hinaus hat das Proteasom eine zentrale Rolle in der Qualitätskontrolle sekre- torischer Proteine, die direkt auf der cytoplasmatischen Seite des ER abläuft, was einen retro- graden Transport aus dem ER voraussetzt (Plemper et al., 1998).
1. Einleitung
1.4 Intrazelluläre Lokalisation des Proteasoms
In höheren Eukaryonten wurde das Proteasom während der Interphase sowohl frei im Zyto- plasma und Zellkern (Peters et al., 1994; Rivett et al., 1998), als auch an Centrosomen
(Fabunmi et al., 2000) oder Filamenten (Palmer et al., 1996) assoziiert nachgewiesen. Für die Mitose wurden ebenfalls unterschiedliche Lokalisationen beschrieben. Einige Gruppen fanden es am Spindelapparat (Wojcik et al., 1995), andere am Chromosom (Palmer et al., 1996) und wieder andere frei im Zytoplasma und Zellkern (Reits et al., 1997). In S. cerevisiae konnte nach- gewiesen werden, daß 20S Proteasom und 19S Regulator überwiegend am ER-Kernhüllen- Netzwerk lokalisiert sind, was dort ein lokales Bedürfnis an proteolytischer Aktivität impliziert (Enenkel et al., 1998; Wilkinson et al., 1998). Eine 19S Untereinheit wurde mittels Immuno- goldmarkierung in elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe an der inneren Seite der Kernmembran lokalisiert (Wilkinson et al., 1998). Die Lokali- sation des 26S Komplexes am ER könnte für eine Beteiligung des 26S Proteasoms an der Qualitätskontrolle und cotranslationalen Prozessierung von neu synthetisierten Proteinen sprechen (Enenkel et al., 1998). Dies könnte durchaus erforderlich sein, da Hefen eine per- manente Membranbiogenese betreiben. Der Transport des 26S Proteasoms in den Zellkern der Hefen muß über die Kernporen erfolgen, da bei Hefen die Mitose „geschlossen“ erfolgt, das bedeutet ohne Auflösung der Kernmembran.
In Mausfibroblastenzellen wurde PA28α und PA28β sowohl im Zytoplasma als auch im Kern lokalisiert. Unterschiede zwischen beiden Untereinheiten gab es in der Verteilung innerhalb des Zellkerns. So war PA28α nur sehr schwach in den Nucleoli zu detektieren, PA28β hin- gegen zeigte dort eine starke Anreicherung (Soza et al., 1997).
1.5 Zielsetzung
Der 19S Komplex spielt eine große Rolle bei der Substraterkennung und -bereitstellung im 26S Proteasom. Ähnlich wie bei bakteriellen ATP-abhängigen Proteasen, könnten die ATPasen des 19S Komplexes an der Substraterkennung und -entfaltung beteiligt sein. Ziel eines Teils dieser Arbeit war es, am Beispiel der Citratsynthase, einem typischen Modellsub- strat für Chaperone, die potentielle Beteiligung der 19S ATPasen an der Substraterkennung und -entfaltung nachzuweisen. Zu diesem Zwecke sollten das 26S Proteasom sowie seine Teilkomplexe isoliert und mittels Citratsynthase in biochemischen Analysen auf Chaperon- aktivität überprüft werden.
Die Assemblierung und Reifung von eukaryotischem 20S Proteasom, insbesondere die letzte Phase, ist noch nicht endgültig aufgeklärt. Die Hypothese für diesen Schritt ist, daß der 19S Regulator dabei eine Rolle spielen könnte, da er möglicherweise auch Strukturveränderungen des reifen 20S Proteasom Komplexes bewirkt (z.B. Öffnen des Eingangs zum katalytischen Innenraum des Komplexes). So ist es vorstellbar, daß es durch die Interaktion zwischen den 19S ATPasen und den α-Untereinheiten zu strukturellen Veränderungen der α-Untereinheiten kommt, durch die diese ein Signal zum Prozessierungsbeginn der β-Untereinheiten geben. Für dieses Ereignis wird eventuell Energie benötigt. Um diese Hypothese zu untermauern, sollten im zweiten Teil dieser Doktorarbeit bereits vorhandene S. cerevisiae Stämme mit Mutationen in der ATP-bindenden Region der 19S ATPasen auf Effekte bei der Prozessierung von β-Unter- einheiten untersucht werden. Auch sollte die Suche nach weiteren Regionen in den 19S ATPasen mit potentieller Bedeutung für die Assemblierung des 20S Proteasoms erfolgen.
In einem dritten Teil der Doktorarbeit sollte der Einfluß der Threonin-1-Alanin-Mutation in Maus-beta2i, welches in humanen T2-Zellen exprimiert wurde, auf die Prozessierung und den Einbau anderer β-Untereinheiten untersucht werden. Ziel dieser Experimente war es, die spe-
1. Einleitung zielle Wechselwirkung zwischen den einzelnen β-Untereinheiten während der 20S Proteasom- biogenese zu analysieren.
2. Materialien und Methoden
2 Materialien und Methoden
2.1 Chemikalien
Laborchemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von Merck (Darmstadt), Sigma (Steinheim), Roth (Karlsruhe), Applichem (Darmstadt), Serva (Heidelberg) sowie Fluka (Neu- Ulm) in analytischer Qualität bezogen.
Alle Lösungen wurden mit voll entsalztem H2O angesetzt, das zusätzlich über eine Filteran- lage von Millipore gereinigt wurde.
2.2 Oligonukleotide, Vektoren, Stämme und Zellinien
2.2.1 Oligonukleotide
Nr. Oligonukleotidname Sequenz (5´-3´) Bemerkung BB1 oligo1
(16882-29)
AAA AGG ATC CCA AGC TAT
TGC CGA TAG TT für Amplif. eines Teils der cod. Sequenz von yeast-BETA5 (5´–3´) ohne Stop-Codon BB2 Pre2 BamHI last aa
(20266-30)
AAA GGA TCC AAT AAC GTT
GTT GAA AGA TCC für Amplif. eines Teils der cod. Sequenz von yeast-BETA5 (3´–5´), BamHI-Schn.St. (3´) BB3 EcoRI 5´sense
(20267-27)
AAA GAA TCC CAT ATG TAT
ATG CAC ATC für Amplif. eines Teils der nichtcod. Sequenz von yeast-BETA5 (5´–3´), EcoRI-Schn.St. (5´) BB4 XhoI 3´ antisense
(20268-27)
AAA CTC GAG CCG ACG AAG
AAG GTC ATG für Amplif. eines Teils der nichtcod. Sequenz von yeast-BETA5 (3´–5´), XhoI-Schn.St. (3´) BB5 Rpt1-C-Term-SM-s
(15448-63)
p-GAT CTG TTT GCA CAG AAG CCG GTA TGT TTG CCA TTA GAG CTC GAA GAA AGG TGG CTA CTT GAG
für Anneal. eines Teils d. C-Term. der cod.
Sequenz von yeast-RPT1 (5´–3´) mit SM für SacI- Schn.St., Teil BglII-Schn.St. (5´), 5´-Ende des Oligonucleotids phosphoryliert
BB6 Rpt1-C-Term-SM-as (15449-63)
p-GAT CCT CAA GTA GCC ACC TTT CTT CGA GCT CTA ATG GCA AAC ATA CCG GCT TCT GTG CAA ACA
für Anneal. eines Teils d. C-Term. der cod.
Sequenz von yeast-RPT1 (3´–5´) mit SM für SacI- Schn.St., Teil BamHI-Schn.St. (3´), 5´-Ende des Oligonucleotids phosphoryliert
BB7 yRpt2-s-NheI (12606-24)
GCT GCT AGC AAA GGC TGT
TGC AAA für Amplif. des C-Term. der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit Del. der letzten 150 bp (5´–3´), NheI-Schn.St. (5´)
BB8 yRpt2-deltaC-as-BamHI (12607-30)
GGA GGA TCC CAA ATC ATC
CTT TGT TGT TAC für Amplif. des C-Term. der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit Del. der letzten 150 bp (3´–5´), BamHI-Schn.St.(3´)
BB9 Rpt2(1)-s-SacI (23891-30)
GAG GAG CTC AAT AAA ATG
GGA CAA GGT GTA für Amplif. der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit HA-Fusion (5´–3´), SacI-Schn.St.t ( 5´)
BB10 HA-3´-Ende as (9086-27)
TCT TCT AGA CTG CAT AGT
CAG GTA CGT für Amplif. der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit HA-Fusion (3´–5´), XbaI-Schn.St. (3´)
BB11 Rpt2(2)-s-SalI (23864-34)
AAA GTC GTC GAC CAT TTT
TCT ATA ATA GAT TTA C für Amplif. eines Teils der nichtcod. Sequenz von yeast-RPT2 (5´–3´), SalI-Schn.St. (5´)
BB12 Rpt2(2)-as-XhoI (23865-30)
TTT CTC CTC GAG ATG AAC
ATC TTC CAT TGT für Amplif. eines Teils der nichtcod. Sequenz von yeast-RPT2 (3´–5´), XhoI-Schn.St. (3´)
BB13 Rpt1-AS440-467 D442K-s (17429-106)
CGA AGA AAG GTG GCT ACT GAA AAG TTC CTG AAG GCT GTC GAC AAA GTT ATT AGC GGA TAC AAG AAG TTT AGT TCC ACA TCG CGT TAT ATG CAA TAT AAT TGA G
für Annealing eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT1 mit Mutation für D→K (5´–3´), Teil SacI-Schn.St. (5´)
2. Materialien und Methoden
BB14 Rpt1-AS440-467 D442K-as (17430-114)
GAT CCT CAA TTA TAT TGC ATA TAA CGC GAT GTG GAA CTA AAC TTC TTG TAT CCG CTA ATA ACT TTG TCG ACA GCC TTC AGG AAC TTC TTT TCA GTA GCC ACC TTT CTT CGA GCT
für Annealing eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT1 mit Mutation für D→K (3´–5´), Teil BamHI-Schn.St. (3´)
BB15 Rpt1-AS440-467 Y466G-s (17431-106)
CGA AGA AAG GTG GCT ACT GAA AAG GAT TTC CTG AAG GCT GTC GAC AAA GTT ATT AGC GGA TAC AAG AAG TTT AGT TCC ACA TCG CGT TAT ATG CAA GGT AAT TGA G
für Annealing eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT1 mit Mutation für Y→G (5´–3´), Teil SacI-Schn.St. (5´)
BB16 Rpt1-AS440-467 Y466G-as (17432-114)
GAT CCT CAA TTA CCT TGC ATA TAA CGC GAT GTG GAA CTA AAC TTC TTG TAT CCG CTA ATA ACT TTG TCG ACA GCC TTC AGG AAA TCC TTT TCA GTA GCC ACC TTT CTT CGA GCT
für Annealing eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT1 mit Mutation für Y→G (3´–5´), Teil BamHI-Schn.St. (3´)
BB17 yRpt2-D415K-s1 (19386-24)
GCT GCT AGC AAA GGC TGT
TGC AAA für Amplif. eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit SM für SacII-Schn.St. (5´–3´), NheI-Sch.St. (5´)
BB18 yRpt2-D415K-as1 (19387-24)
CCG CCG CGG TAA CTT GCA
TTC TTC für Amplif. eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit SM für SacII-Schn.St. (3´–5´) BB19 yRpt2-D415K-s2
(19388-24)
CCG CCG CGG AGA AGT TTA
AAC AAG für Amplif. des HA-Gens und eines Teils der cod. Sequenz von yeast-RPT2 mit Mut. für D→K und SM für SacII-Schn.St. (5´–3´) BB20 yRpt2-D415K-as2
(19389-31)
CCG CCG CGG TCT AGA CTG
CAT AGT CAG GTA C für Amplif. des HA-Gen und eines Teils der cod.
Sequenz von yeast-RPT2 mit Mut. für D→K und SM für SacII-Schn.St. (3´–5´)
BB21 yRpt6-s1 (22506-20)
CAG TTA GGT TAG GTT TTA TG für Amplif. von yRPT6 und Mappen der Mutation im Hefe-Stamm Fys10 (5´–3´) BB22 yRpt6-as1
(22508-20)
CAC ATA CAC TAA GTA ACA TA für Amplif. von yRPT6 und Mappen der Mutation im Hefe-Stamm Fys10 (3´–5´) BB23 N-yRpt1-s1-SalI, XbaI
(2722-39)
GTC GTC GAC TCT AGA ATG CCA CCA AAA GAA GAC TGG GAA
für Amplif. von yRPT1 und Mappen der Mutation im Hefe-Stamm Fys11 (5´–3´) BB24 C-yRpt1-as-BamHI, NotI
(2725-41)
GCG GCG GCC GCG GAT CCT CAA TTA TAT TGC ATA TAA CGC GA
für Amplif. von yRPT1 und Mappen der Mutation im Hefe-Stamm Fys11 (5´–3´) BB25 oligo3
(5494-29)
AAA GGA TCC ATG AAT ATC
GTC CCA CAA GA für analyt. PCR auf yeast-∆ump1 und UMP1 (5´–3´)
BB26 oligo4 (5495-29)
AAA GCG GCC GCT TAA ATG
CCT AAT TGT TT für analyt. PCR auf yeast-∆ump 1 und UMP1 (3´–5´)
BB27 pre2 sense BamHI (3075-29)
AAA GGA TCC ACT ACA ACC
TTA GCA TTT AG für analyt. PCR auf yeast-BETA5 (5´–3´) BB28 pre2(2)-as-5´Ende
(5408-21)
ATA GAT GTG CAT ATA CAT
ATG für analyt. PCR auf yeast-BETA5 (3´–5´)
BB29 MMECLVE GCA GGC GAA TTC ATG CTG
AAG CAG GCA GTG für analyt. PCR auf Maus-BETA2iT1A (MECL1T1A) (5´–3´)
BB30 MMECLABg2 CTG TTT AGA TCT TCA TTC
CAC CTC CAT GGC für analyt. PCR auf Maus-BETA2iT1A (MECL1T1A) (3´–5´)
BB31 ybeta5-s1 (04159-20)
ATG CAA GCT ATT GCC GAT für Ampl. eines Teils der cod. yeast-BETA5- Sequenz für spätere RNA-Transkription (5´–3´) BB32 ybeta5-as1-T7P
(04160-40)
TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT TAG CCA ATA ACG TTG TTG A
für Ampl. eines Teils der cod. yeast-BETA5- Sequenz mit T7-Prom.-Se. (3´) für spätere RNA- Transkription (3´–5´)
BB33 yRpt6-ms1 (22507-20)
AGG AGT GAC TCT TAT ATG TT für Ampl. eines Teils der cod. yeast-RPT6- Sequenz für spätere RNA-Transkription (5´–3´) BB34 yRpt6-as2-T7P
(04161-40)
TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CAC TTG AAC AGC TTG GCG A
für Ampl.eines Teils der cod. yeast-RPT6- Sequenz mit T7-Prom.-Se. (3´) für spätere RNA- Transkription (3´–5´)
BB35 yalpha4-s1 (04166-20)
ATG AGT GGT TAC GAT AGA GC für Ampl eines Teils der cod. yeast-ALPHA4- Sequenz für spätere RNA-Transkription (5´–3´)
