Herstellung, Charakterisierung und biologische Testung durch Metallspritzgießen hergestellter poröser Titanmaterialien

Volltext

(1)Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg Fachbereich Naturwissenschaftliche Technik. Herstellung, Charakterisierung und biologische Testung durch Metallspritzgießen hergestellter poröser Titanmaterialien. Diplomarbeit Im Studiengang Medizintechnik. vorgelegt von. Farida Ali Hamburg April 2012. 1. Gutachter: Prof. Dr. Claus-Dieter Wacker (HAW-Hamburg) 2. Gutachter: Prof. Dr. Regine Willumeit (Helmholtz-Zentrum Geesthacht).

(2) Eidesstattliche Erklärung. II. Eidesstattliche Erklärung Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit ohne fremde Hilfe selbstständig verfasst und nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Wörtlich oder dem Sinn nach aus anderen Werken entnommene Stellen sind unter Angabe der Quellen kenntlich gemacht.. Hamburg, 23.04.2012. ____________________________________ Unterschrift Farida Ali.

(3) Danksagung. III. Danksagung Die vorliegende Diplomarbeit entstand in der Abteilung WPS des Instituts für Werkstoffforschung des Helmholtz-Zentrum Geesthacht. Bei Frau Prof. Dr. Regine Willumeit möchte ich mich für die Betreuung meiner Arbeit seitens des Helmholtz-Zentrum Geesthacht bedanken. Ich danke Herrn Prof. Dr. Claus-Dieter Wacker für die Betreuung seitens der Hochschule für angewandte Wissenschaften. Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung WPS besonders Herrn Dr. Frank Feyerabend und Frau Dr. Bérengère Luthringer für die wissenschaftliche Betreuung und die stete Bereitschaft zur Unterstützung in allen Belangen dieser Arbeit bedanken. Zudem möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für Werkstoffforschung, die mir durch kleine Hilfestellungen und Anregungen geholfen haben, diese Diplomarbeit entstehen zu lassen, bedanken..

(4) Inhaltsverzeichnis. IV. Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... VI Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... VII Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... VIII 1. Einleitung .................................................................................................................... 1. 2. Grundlagen ................................................................................................................. 3. 2.1. Knochenzellen .................................................................................................... 3. 2.2. Stammzellen ....................................................................................................... 4. 2.3. Verschiedene Differenzierungsmarker ................................................................ 4. 2.4. Ti-6Al-4V ............................................................................................................. 5. 2.5. Poröses Titan als Implantat ................................................................................. 6. 2.6. MIM Verfahren .................................................................................................... 7. Material und Methoden .............................................................................................. 9. 3.1. Probenherstellung mittels MIM ............................................................................ 9. 3.2. Metallographische Probenpräparation ................................................................ 10. 3.3. Mikroskopie ........................................................................................................ 11. 3.4. Geometrische Dichtebestimmung ...................................................................... 11. 3.5. Vorbereiten der Zellen........................................................................................ 12. 3.6. Adhäsion und Proliferation ................................................................................. 14. 3.7. Differenzierung der Zellen .................................................................................. 16. 3. 4. Ergebnisse ................................................................................................................. 23 4.1. Charakterisierung der Porösitäten der Proben ................................................... 23. 4.2. Gesamte Porengrößenverteilung ....................................................................... 25. 4.3. Biologische Charakterisierung der porösen Ti-6Al-4VProben ............................. 27 4.3.1. Initiale Adhäsion der Osteoblasten- und HUCPV-Zellen ........................ 27. 4.3.2. Visualisierung der Zellkerne durch DAPI Färbung ................................. 27. 4.3.3. Initiale Proliferation der Osteoblasten und HUCPV-Zellen ..................... 30. 4.3.4. Parallelfärbung für Osteokalzin, Osteopontin und DAPI ........................ 31. 4.3.5. ALP Produktion von Osteoblasten und HUCPV-Zellen .......................... 32. 4.3.6. Osteokalzinproduktion der Osteoblasten und HUCPV-Zellen ................ 33. 4.3.7. RT-PCR ................................................................................................ 34.

(5) Inhaltsverzeichnis. 5. 6. V. Diskussion der Ergebnisse....................................................................................... 36 5.1. Porosität und Porengrößenverteilung ................................................................. 36. 5.2. Initiale Zellviabilität der Zellen ............................................................................ 37. 5.3. Zelldifferenzierung ............................................................................................. 40. Zusammenfassung.................................................................................................... 44. Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 46 Anhangsverzeichnis......................................................................................................... 50.

(6) Abbildungsverzeichnis. VI. Abbildungsverzeichnis Abb. 1:. Entwicklung des Menschen .................................................................................. 4. Abb. 2:. Lichtmikroskopische Aufnahme 20x von der Oberfläche der Ti-6Al-4V-Probe ..... 23. Abb. 3:. REM-Aufnahme 20kv/200x/25mm von der Oberfläche der Ti-6Al-4V-Probe ....... 24. Abb. 4:. Porengrößenverteilung der unterschiedlichen Ti-6Al-4V-Proben ......................... 25. Abb. 5:. Darstellung der unterschiedlichen Porositäten (Vol.-%) von Ti-6Al-4V ................ 26. Abb. 6:. Initiale Adhäsion der Osteoblasten (A) und der HUCPV-Zellen (B) auf den verschiedenenTi-6Al-4V-Proben ......................................................................... 27. Abb. 7:. DAPI-Färbung der Osteoblasten auf den unterschiedlichen Ti-6Al-4V-Proben nach 1 h, 2 h und 4 h Inkubation ......................................................................... 28. Abb. 8:. DAPI-Färbung der HUCPV- Zellen auf den unterschiedlichen Ti-6Al-4V-Proben nach 1 h, 2 h und 4 h Inkubation ......................................................................... 29. Abb. 9:. Initiale Proliferation der adhärierenden Osteoblasten (A) und HUCPV-Zellen (B) nach mehreren Tagen im Vergleich nach 1 h Inkubation..................................... 30. Abb. 10: Parallelfärbung der Osteoblasten auf den unterschiedlich porösen Proben nach 4 Wochen ................................................................................................... 31 Abb. 11: Parallelfärbung der HUCPV-Zellen auf den unterschiedlich porösen Ti-6Al-4V-Proben nach 4 Wochen....................................................................... 32 Abb. 12: ALP-Synthese von Osteoblasten (A) und HUCPV-Zellen (B) nach 2, 3 und 4 Wochen zum Vergleich mit der Viabilität nach 15 Tagen .................................. 32 Abb. 13: Osteokalzin-Produktion von Osteoblasten (A) und HUCPV-Zellen (B) nach 2, 3und 4 Wochen zum Vergleich mit der Viabilität nach 15 Tagen ............ 33 Abb. 14: Die Differenzierungsmarker ALP, BSP, cbfa1, col1, OC, OPG, OPN und RANKL normiert auf den endogenen Referenzgen GAPDH nach 2 Wochen (A), 3 Wochen (B) und 4 Wochen (C) Differenzierung ........................ 34.

(7) Tabellenverzeichnis. VII. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Streckgrenze, Zugfestigkeit, Bruchdehnung und E-Modul von Implantatwerkstoffen........................................................................................................ 6. Tabelle 2: 96 Well Platte mit den Proben für den Versuch ................................................ 17 Tabelle 3: Primersequenzen der verwendeten Marker für die PCR ................................... 21 Tabelle 4: Mechanische Eigenschaften von MIM-Ti-6Al-4V ermittelt durch Zugversuche .................................................................................................... 36.

(8) Abkürzungsverzeichnis. VIII. Abkürzungsverzeichnis A260 A ALP Aluminium ANNOVA bp BSA BSP β-ME Cbfa1 cDNA Col1 DAPI dH2O ddH2O v ρ theoretisch DMSO DMEM DNA dNTP EDTA EIGA ELI ELISA E-Modul EtOH FIB FITC FKS GAPDH H2O2 HCL HF HNO3 HRP HUCPV HV MEM. Absorption bei 260 nm Bruchdehnung Alkalische Phosphatase ≤ 45 µm +1 % Al Probe Analysis of Variance (Varianzanalyse) Basenpaare Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin) Bone Sialo Protein beta-Mercaptoethanol core binding factor alpha 1 complementary Desoxyribonukleinsäure (komplementäre Desoxyribonukleinsäure) Kollagen Typ 1 4′,6-Diamidin-2-phenylindol Dihydrochloride (Fluoreszenzfarbstoff) destilliertes Wasser doppelt destilliertes Wasser Volumenausdehnungskoeffizient theoretische Dichte Dimethylsulfoxid Dulbecco's Modified Eagle's Medium Desoxyribonukleinsäure Didesoxy-Varianten des Nukleosidtriphosphat Ethylendiamintetraacetat (Komplexbildner) Electrode Induction melting Gas Atomization (Elektrode Induktionsschmelzen Gaszerstäubung) Extra Low Interstitial(extrem niedrig interstitiell) Enzyme linked Immuno sorbent assay (Enzymimmonoassay) Elastizitätsmodul Ethanol Focus Ion Beam (Fokussierter Ionenstrahl) Fluoresceinisothiocyanat Fetales Kälberserum Glyceraldehyde-3-phosphate-Dehydrogenase Wasserstoffperoxid Salzsäure Flusssäure Salpetersäure Horse radish peroxidase(Enzym Meerretichperoxidase) Human umbilical cord perivascular cells (Nabelschnurstammzellen) Härteprüfung nach Vickers Minimum Essential Medium.

(9) Abkürzungsverzeichnis. IX. MG MIM Mischung. Molekulargewicht Metal Injection Moulding (Metallspritzguß) 125-180 µm+ ≤ 45 µm. MTT OB OC OD OPG OPN OPS PBS PCR P/S RANKL REM PIGA Rm RNA RNase RNS rpm Rp0,2 rRNA. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid Osteoblasten Osteokalzin Optische Dichte Osteoprotegerin Osteopontin Feinpoliersuspension phosphate buffered saline (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kettenreaktion) Penicillin/Streptomycin Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand Rasterelektronenmikroskop Plasma-melting Induction-guiding Gas Atomization (Pulververdüsungsanlage) Zugfestigkeit Ribonukleinsäure Endoribonuklease Ribonukleinsäure revolutions per minute (Umdrehung pro Minute, Drehzahl) Dehngrenze Ribosomale RNA. RT-PCR Rz SDS TAE TBS TLS TMB Ti-6Al-4V TiO2 Tm TMP 1 % Al. Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion Rauheit Sodiumdodecylsulfate Tris-Acetat-EDTA-Puffer Tris-Buffered Saline TLS Technik GmbH & Co Spezialpulver KG Tetramethylbenzidin Titanlegierung Titaniumdioxid Schmelztemperatur Substrat Lösung ≤ 45 µm + 1 % Aluminium.

(10) 1 Einleitung. 1. 1. Einleitung. Um die Lebensqualität der Menschen zu verbessern, gewinnen orthopädische Implantate immer mehr an Bedeutung. Im Jahr 2004 bekamen 234.000 Patienten ein künstliches Hüftgelenk, und es wird bis zum Jahre 2030 ein kontinuierlicher Anstieg um 174 % im Bedarf solcher Hüftimplantate erwartet (AAOS 2006a/c) [1]. In dieser Statistik ist nicht die wachsende Zahl von Revisionsoperationen beinhaltet. Der Begriff Revision definiert den Austausch von einem bereits im Körper vorhandenem Implantat. Der Austausch der Implantate erfolgt meistens nicht aufgrund der beschränkten Materialhaltbarkeit. Die heutigen Implantate besitzen eine ausreichende Belastbar- und Benutzbarkeit für die gesamte Lebensdauer des Patienten. Der Grund für eine Revision dafür liegt meist in der nicht dauerhaften Verankerung des Implantats im Knochen. Die Folge ist eine Lockerung des Implantats, die zu Problemen und daraus folgend zu einer Entfernung des Implantats führen [2]. Da die durchschnittliche Lebensdauer eines Implantats im Körper eines Menschen bei 10-15 Jahren liegt, wird ein doppelter Anstieg von Revisionsoperationen bis zum Jahre 2026 erwartet. Revisionsoperationen sind mit vielen Nachteilen verbunden [1]. Im Vergleich zu Erstoperationen sind sie viel schwieriger und aufwendiger. Es entsteht außerdem ein größerer Verlust von Knochensubstanz und sie sind mit höheren Kosten verbunden. Ziel der Forschung ist deshalb die Vermeidung von Revisionen durch die Verwendung von Produkten mit guten Langzeitergebnissen [2]. Bei dem Anforderungsprofil an Implantatwerkstoffe müssen zwei Blickrichtungen berücksichtigt werden: zum einen die mechanischen und zum anderen die biologischen Anforderungen. Der Ideale Implantatwerkstoff wäre ein Material der Knochenähnliche Eigenschaften vorweist. Zudem ist die Oberflächengestaltung wichtig, da dieser Parameter die dauerhafte Verankerung des Implantats maßgeblich beeinflusst [73]. Bei den biochemischen Voraussetzungen ist in erster Linie die Biokompatibilität, sowie die Korrosionsbeständigkeit der Werkstoffe zu berücksichtigen. Da die Implantatoberfläche direkten Kontakt zum lebenden Gewebe hat, muss eine gute Wechselwirkung der Zellen mit dem Implantat und der Umgebung gegeben sein, so dass eine sichere und starke Bindung, d. h. Anwachsen der Knochen an das Implantat gewährleistet ist [70]. Diese sogenannte Osseointegration ist ein wesentlicher Faktor für eine erfolgreiche Implantation. Durch die Integration des Implantats in die Knochenstruktur kann dessen Überlebenszeit im Körper des Patienten erheblich verlängert werden [1]. Implantate, die in den Knochen eingebracht werden, müssen gut mit den Knochenzellen, den Osteoblasten, die für den Knochenaufbau verantwortlich sind, verträglich sein. Somit sind sie ein wichtiger Parameter für die Knochenneubildung wie z. B. beim Knochenwachstum und der Osseointegration von Implantaten [5]. Die Bedeckung der Implantatoberfläche mit Osteoblasten ist entscheidend für die Gewebeantwort an der Oberfläche des Biomaterials [6]. Um eine optimale Bindung des Implantats mit dem umgebenden Knochen zu erreichen, kann beispielsweise die Implantatoberfläche verändert werden. Aus diesem Grund wurde die Wirkung der Oberflächentopographie auf das Gewebe umfangreich in vitro und in vivo über die.

(11) 1 Einleitung. 2. letzten Jahrzehnte getestet. Nach den Aussagen einiger Forscher wird ein Zusammenhang zwischen der Oberflächenrauhigkeit und der verbesserten Zelladhäsion und der Proliferation gefunden. Angeblich sollen Osteoblasten Oberflächen mit erhöhter Rauigkeit bevorzugen. Ziel dieser Diplomarbeit ist, ein Material für die Herstellung permanenter poröser Implantate zu finden, welches im orthopädischen Bereich eingesetzt werden kann. Das Metallpulverspritzgießen ermöglicht es, komplexe Teile kostengünstig in ihrer Endgestalt herzustellen. Durch diesen Herstellungsprozess kann, durch eine Auswahl bestimmter Pulvergrößen, gezielt eine Porosität in das zu produzierende Teil eingebracht werden. Der Vorteil der Porosität besteht darin, dass durch das Einwachsen des Knochens in die porösen Strukturen eine festere Verbindung zwischen Implantat und Knochen geschaffen werden kann. Dies soll zu einer dauerhaften Einbringung des Implantates im Körper führen. Die Diplomarbeit umfasst die Herstellung der Proben mit der die Analyse der Porengrößenverteilung und der Porosität sowie als Schwerpunkt die biologische Untersuchung. Die intensivere Auseinandersetzung mit der mechanischen Charakterisierung der Proben wird in der Diplomarbeit von Haithem Akaichi behandelt [9]. Die in der Anwendung befindliche Titanlegierung Ti-6Al-4V wurde zur Herstellung poröser Prüfkörper, deren mechanische Eigenschaften näher an denen des Knochens sein sollen, gewählt. Da der optimale Porengrößenbereich für das Einwachsen von Zellen in der Literatur sehr divers diskutiert wird, wurden fünf verschiedene Porositäten biologisch getestet. Bei einer Probe wurden zusätzlich als Platzhalter Aluminiumfäden verwendet. Der Vorteil der Aluminiumfäden besteht darin, dass durch die Diffusion der Fäden im Material größere Poren entstehen können. Im Biologischen Teil dieser Diplomarbeit wurden die Adhäsion, Proliferation und die Differenzierung der Osteoblasten und der Nabelschnurstammzellen (HUCPV) untersucht. Die Differenzierung der Zellen kann auf verschiedene Weise getestet werden. Analysiert werden soll die Alkalische Phosphatase (ALP) Produktion, das für die Knochenproduktion zuständig ist, sowie das Osteokalzin, das Teil der extrazellulären nicht kollagenen Knochenmatrix ist. Durch eine Parallelfärbung kann weiterhin der Nachweis von Osteopontin bewiesen werden, dass an der Erhaltung der Knochensubstanz beteiligt ist [65]. Durch die RT-PCR sollen zusätzlich zudem die Differenzierungsfaktoren BSP, RANKL, Osteoprotegerin sowie weitere Proteine wie col1 und cbfa1 analysiert werden..

(12) 2 Grundlagen. 2. Grundlagen. 2.1. Knochenzellen. 3. In dieser Diplomarbeit wurden Osteoblasten verwendet. Die Differenzierung von Osteoblasten ist meist die wichtigste Stufe, um ein stabiles und dauerhaftes Implantat zu erhalten, da die Matrix produzierenden Osteoblasten direkt an der Knochenbildung beteiligt ist und dadurch für den Aufbau von Knochengewebe zuständig ist. Da der Knochen kein starres, statisches Gebilde ist befindet es sich im ständigen Auf- und Abbau. Das wichtige hierbei ist das es ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Aufbau und Abbau geben muss. Der mechanische Stimulus ist deshalb sehr wichtig. Ist der mechanische Stimulus größer als die Sollspannung, so überwiegt der Aufbau, und ist andererseits der Stimulus niedriger als die Grenzspannung, so überwiegt der Abbau [72]. Als Sollspannung wird die Dehngrenze, innerhalb derer die Knochenmasse zu- und abnimmt nach Pauwels bezeichnet [62]. Beim ständigen Auf- und Abbau des Knochens sind Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beteiligt. Sie steuern außerdem auch den Calciumstoffwechsel [17]. Die Osteoblasten aktivieren die Mineralisierung (Verkalkung). Die Mineralisierung findet im Osteoid statt, welches das organische Grundgerüst des Knochens ist. Die Aufbaurate ist je nach der Aktivität und der Anzahl der Osteoblasten abhängig. Die Osteoblasten und die kollagenen Fibrillen werden während der Osteoidbildung eingeschlossen. Die eingeschlossenen Osteoblasten im Osteoid werden als Osteozyten bezeichnet, welches in knöchernen Höhlen eingelagert ist. Für den Knochenabbau sind die Osteoklasten zuständig, die vielkernige Riesenzellen sind [15]. Die Mineralsalze bilden zusammen mit den kollagenen Fibrillen und der glykoproteinhaltigen Grundsubstanz, die von den Osteoblasten abgesondert werden einen Materialverbund, welcher gegen mechanische Beanspruchung beständig ist und damit die Festigkeit des Knochens bewirkt. Dieses hoch organisierte Verbundmaterial (Knochengewebe) besteht aus einer organischen Matrix und einem anorganischen Anteil [15]. Die Gesamtheit aller Makromoleküle im Interzellulärraum ist Bestandteil der extrazelluläre Matrix, die für die Kompressionsfestigkeit und für die Zugfestigkeit zuständig ist. Die organische Matrix ist wiederum für die Zugfestigkeit zuständig. Knochen besteht im Allgemeinen zu zwei Drittel aus einer extrazellulären Matrix und zu einem Drittel aus organischen Substanzen. Die Zusammensetzung der organischen Matrix besteht hauptsächlich aus 90 % Typ1 Kollagen und anorganischer Matrix, die größtenteils aus Hydroxylapatit besteht [63][16]. Typ1 Kollagen wird von Osteoblasten synthetisiert und enthält Fasern mit 300 nm in der Länge und 0,5 nm im Durchmesser. Hydroxylapatit-Kristalle können eine Dicke von 2-5 nm und 20-80 nm Länge erreichen. Zusammen sind diese chemischen Komponenten der Knochenmatrix verantwortlich für die mechanische Beschaffenheit von Knochen (Härte des Knochens). Die restlichen 10 % der organischen bestehen aus verschiedenen Proteinen. Einige der Proteine sind: Knochenspezifische Proteine wie Osteokalzin, Osteonektin und Osteopontin, die zusammen mit der alkalischen Knochenphosphatase zu einer kontrollierten Mineralisierung des Knochens beitragen [16]. Der E-Modul des kortikalen Knochens liegt bei 20 GPa [18]..

(13) 2 Grundlagen. 2.2. 4. Stammzellen. Abb. 1: Entwicklung des Menschen [10]. Mesenchymale Stammzellen sind für die Entwicklung und Neubildung von Körperzellen verantwortlich. Sie sind in verschiedenen adulten und embryonalen Geweben des Menschen zu finden. In der Zellkultur haben die adulten Stammzellen ein deutlich geringeres Selbsterneuerungsvermögen und ein eingeschränktes Differenzierungspotenzial als embryonale Stammzellen. Adulte Stammzellen sind unter anderem im Knochenmark, Haut, Gehirn, Leber Nabelschnur und Nabelschnurblut zu finden [64]. Durch 3 Besonderheiten unterscheiden sich Stammzellen von anderen Zellen in unserem Körper: 1. Sie teilen sich über einen längeren Zeitraum, im Vergleich haben andere Zellen nur eine begrenzte Lebensdauer. 2. Sie sind nicht spezialisiert. 3. Durch Teilung können Stammzellen spezialisierte Zellen herstellen. Sie sind multipotent und können sich unter geeigneten in vitro- und in vivo- Bedingungen (in der richtigen Umgebung mit den richtigen Nährstoffen versehen) zu verschiedenen mesenchymalen Geweben ausdifferenzieren und zu spezialisierten Zellen werden. Mit bestimmten Wachstumsfaktoren können die Stammzellen zu verschiedenen Zelltypen differenzieren wie z. B. in Hautzellen, Osteoblasten, Chondrocyten, Adipozyten, Myocyten differenzieren, und Knochen-, Knorpel-, Fett-, und Muskelgewebe bilden [11][12][57]. Mesenchymale Stammzellen haben die Eigenschaft, schnell und stabil auf Plastik- oder Glasoberflächen zu adhärieren, und koloniebildende Fibroblasten zu produzieren [13][14].. 2.3. Verschiedene Differenzierungsmarker. Das BSP ist ein glyckosyliertes, sulfatiertes Phosphoprotein welches 12 % der nicht kollagenen Proteine des Knochens ausmacht. BSP wird durch Osteoblasten zeitgleich mit dem Osteokalzin und der Mineralisation gebildet. Weiterhin sind Osteozyten und Osteoklasten in der Lage BSP zu bilden. BSP ist neben dem Osteokalzin eine Hauptkomponente der nicht kollagenen Proteine des Knochens [8] RANKL (= Osteoprotegerin Ligand oder Osteoklastendifferenzierungsfaktor) spielt eine entscheidende Rolle in der Reifung und Aktivierung von Osteo-.

(14) 2 Grundlagen. 5. klasten und ist für deren Überleben notwendig. Es wird von Osteoblastenstammzellen gebildet. Eine gesteigerte RANKL Produktion führt lokal zu einer gesteigerten Knochenresorption durch die vermehrte Bildung von Osteoklasten und in weiterer Folge zum Abbau von Knochensubstanz. Damit eine einmal stimulierte Knochenresorption nicht bis zur vollständigen Auflösung des Knochens weiterläuft, existiert ein Gegenspieler nämlich das Osteoprotegerin. Osteoprotegerin dockt an RANKL an und hemmt dadurch die biologische Wirksamkeit. Der RANKL-OPG-Komplex blockiert die RANKL-Aktivität und damit wird die Reifung der Osteoklasten gehemmt [71]. Das Osteopontin ist auch ein wichtiger Differenzierungsmarker, es wird durch die Osteoblasten gebildet und ist ein Protein, das an der Erhaltung der Knochensubstanzen beteiligt ist. Es bildet Hydroxylapatit und stellt die Grundstruktur (Matrix) für Knochen her [7].. 2.4. Ti-6Al-4V. Es werden hohe Anforderungen an Biowerkstoffe gestellt. Sie müssen Biokompatible, Korrosionsbeständig und eine gute Bioadhäsion aufweisen. Genauso wichtig ist ihre mechanische Eigenschaft wie die Dauerfestigkeit und der Elastizitätsmodul sowie ihre Verfügbarkeit (Angebot und Nachfrage) Von den metallischen Werkstoffen können nur eine begrenzte Auswahl die Kombinationen dieser Eigenschaften erfüllen. Ti-6Al-4V ist eines der Materialien wird hauptsächlich in der Medizintechnik sowie in der Luft und Raumfahrttechnik eingesetzt [23]. Die hohe Bruchfestigkeit und geringes Gewicht zeichnet das Titan aus. Steinemann hat in seinen Versuchen die Biokompatibilität der Titanlegierung Ti-6Al-4V nachgewiesen und damit die Grundlage für die Verwendung der Titanwerkstoffe in direktem Knochenkontakt gelegt [74][24]. Obwohl Titan ein eher unedleres Metall ist, das zur Freisetzung von Ionen in einer Elektrolytlösung neigt, weist diese Legierung eine hohe Korrosionsfestigkeit auf [23]. Werkstoffkundlich ist jedoch nicht das reine Metall Titan biokompatibel, sondern die sich im Millisekundenbereich bildende natürliche Oxidschicht (TiO2) an der Oberfläche der Implantate [75][23]. Die Freisetzung von Ionen aus dem Metall stellt eine Grundvoraussetzung für allergische und systemtoxische Reaktionen dar, was jedoch weitgehend durch die Oxidschicht verhindert wird. Nach einer Minute beträgt die Dicke der Oxidschicht bereits 100 Å. Die Osseointegration und die Zellanlagerung auf der Oberfläche wird durch die Oxidschicht beeinflusst [15]. Die in dieser Arbeit verwendete Titanlegierung besteht aus 6 % Aluminium, 4 % Vanadium und 90 % Titan. Das Element Vanadium ist in hohen Dosen für seine zytotoxischen Eigenschaften bekannt und wird daher standardmäßig nur für hochbelastete Implantate verwendet. Metallische Biomaterialien werden oft mit zytotoxischen oder wenig biokompatiblen Elementen legiert, um die mechanischen Eigenschaften des Implantats den Anforderungen unter physiologischen Bedingungen anzupassen. Diese Legierung wird trotz des Vanadiumgehalts als biokompatibel eingestuft, weil der Vanadiumgehalt gering ist und teilweise in fester Lösung in der β-Phase vorliegt [23]..

(15) 2 Grundlagen. 6. Als schwerstes Leichtmetall liegt die Dichte von Ti-6Al-4V bei 4,43 g/cm3. Vergleicht man die Ausgewogenheit zwischen der Dichte und den mechanischen Eigenschaften des Materials mit der von Aluminium- oder Stahlwerkstoffen, wird der Vorteil der Titanlegierungen für den Einsatzgebiet in der Medizin für Implantate erkannt [23]. . Härte: 300-400 HV. . E-Modul: (20 °C) = ~115000 MPa. . Bruchdehnung: 14-17 %. . Brucheinschnürung: 35-55 % [25]. Reines Titan und Titanlegierungen zeigen sich nachweislich als hervorragend körperverträglich [23]. Streckgrenze [N/mm^2]. Zugfestigkeit [N/mm^2]. Bruchdehnung [%]. E-Modul [GPa]. Ti-6Al-4V. 800. 900. 12. 110. Rostfreier Stahl. 200. 650. 40. 210. 20-60. 75-110. 7. 70. -. 133. 0,6. 17. Werkstoff. Aluminium Knochen [23][53][54][26][27]. Tabelle 1: Streckgrenze, Zugfestigkeit, Bruchdehnung und E-Modul von Implantatwerkstoffen. 2.5. Poröses Titan als Implantat. Die Aufgabe von medizinischen Implantaten ist, die Körperfunktionen zu unterstützen oder zu ersetzen. Ein Implantat ist ein künstliches Material, das in den Körper eingepflanzt wird. Für verschiedene Implantate gibt es auch vielerlei Varianten von Materialien und Härten die verwendet werden. Bei den Hüft- und Kniegelenken werden die härtesten Materialien verwendet [19]. Aufgrund der auftretenden hohen Zugspannungsbelastungen bestehen die Implantate aus metallischen Werkstoffen, da nur diese Werkstoffe in der Lage sind, die Zugspannungen zu tolerieren. Beim Implantat sind Form, Größe und Steifigkeit ausschlaggebend. Als Steif wird das Implantat angesehen weil sein Elastizitätsmodul etwa zehnmal größer ist als der des Knochens. Titan erfüllt die Bedingungen der optimalen Steifigkeit als Implantat [76]. Das Implantat sollte im optimalen Fall den Knochen ideal nachahmen mit einem E-Modul von etwa 8-28 GPA, je nach Mineralgehalt, Dichte, Feuchtigkeit, Beanspruchungsrichtung und Geschwindigkeit des Knochens. Bezüglich der Elastizität ist Titan noch am besten geeignet mit einem E- Modul von etwa 105-110 GPa. Ziel ist es, dass das Poröse Ti-6Al4V z. B. im Bereich der Orthopädie eingesetzt werden kann für z. B. Hüftimplantate oder als Füllmaterial für Knochendefekte..

(16) 2 Grundlagen. 7. Das Anforderungsprofil z. B. an Hüftprothesen ist sehr hoch gestellt, sie müssen . korrosionsbeständig. . abriebbeständig. . verträglich (keine Allergien!!!). . widerstandsfähig gegenüber den Druck- und Biegebelastungen der Körperbewegungen sein.. Diesem Anforderungsprofil werden nur wenige Metalllegierungen wie Ti-6Al-4V gerecht. Es gibt drei verschiedene Prothesentypen, die sich in der Art und Weise der Prothesenverankerung im körpereigenen Knochen unterscheidet. Je nach Erkrankungen und Beschaffenheit des Knochens werden die Hüftendoprothesen in den Knochen zementiert, verklemmt oder geschraubt [22]. Für die porösen Implantate würde die Zementfrei Prothese sich eignen. Die Prothese wird bei der zementfreien Verankerung genau in den Oberschenkel eingepasst oder eingeschraubt. Zwischen beiden Substanzen wird eine enge Verbindung eingegangen, da der umgebende Knochen an die Prothese heran wächst. Der Knochen verwächst umso stärker mit der Prothese, je länger die Prothese im Knochen verbleibt [20].. 2.6. MIM Verfahren. Das MIM Verfahren (MIM = Metal Injection Molding) umfasst 4 Schritte. Die Teilschritte bestehen aus: . Feedstock Herstellung. . Spritzgießen des Grünlings. . Entbinderung des Braunteils. . Sintern zum Endprodukt. Der erste Schritt in diesem Prozess ist die Feedstock Herstellung. Der Feedstock selber besteht aus Ti-6Al-4V Pulver und einem Binder. Ti-6Al-4V Pulver alleine hat eine sehr hohe Schmelztemperatur von T=1649 °C(+/- 15 °C). Die verspritze Masse wird in der Spritzgießmaschine ca. auf 100 °C erwärmt. Das Pulver kann nicht fließen, deswegen werden Wachse und Kunststoffe als Binderkomponenten benutzt, damit der Feedstock in der Förderschnecke in den Fließeigenschaften dem Kunststoff ähnelt [31]. Eine wichtige Eigenschaft des Binders sollte sein, dass er sich rückstandsfrei wieder entfernen lässt und keinen Einfluss auf die Eigenschaften des Werkstoffes ausübt [34]. Der Binder besteht aus Thermoplasten, Wachsen und/oder Harzen die verschiedene Schmelztemperaturen besitzen. Um den fertigen Feedstock zu erhalten werden beide Komponenten miteinander vermischt..

(17) 2 Grundlagen. 8. Über eine Spritzanlage wird der fertige Feedstock in ein Formwerkzeug gepresst, der die Geometrie des zu fertigenden Bauteils bestimmt. Das entstehende Bauteil dieses Vorgangs nennt man Grünteil [31]. Die Entbinderung muss vor dem Sintern möglichst vollständig abgeschlossen sein, da sich beim Sintern geschlossene Poren bilden, wodurch etwaige Binderreste nicht mehr abgebaut werden können. Das Entbinderungsverhalten wird in 2 Stufen realisiert: chemische Entbindung und thermische Entbinderung. Die Entbinderung ist nötig um einzelne Anteile der Binder, auf unterschiedliche Weise zu entfernen. Mit Hilfe von Lösungsmitteln/-dämpfen wie Wasser, Alkohol, Aceton oder Kohlenwasserstoffe wird bei der chemischen Entbinderung mehr als 60 m. % des gesamten Binderbestandteils aus dem Bauteil entfernt ohne sie zu Zersetzen. Dabei werden die Paraffine durch eine Hexanbehandlung unter Normaldruck in 20 Stunden entfernt. Das ganze verläuft bei Temperaturen oberhalb des Schmelzpunktes des Binders (hier 20-40 °C) [31][37][32]. Nach Ablauf der Entbindung sollte das Bauteil in einem Schutzgas wie Argon getrocknet und bis zur Sinterung gelagert werden [37]. Anschließend erfolgt die Entfernung der langkettigen Polymere Lupolen V und der Stearinsäure in dem Braunling durch die thermische Entbindung. Dazu wird das Bauteil auf 400 °C aufgeheizt, es finden hier bereits die Anfänge des Sinterns statt, die bereits die Pulverteilchen mit einander verbinden. Diese Temperatur wird für eine Stunde gehalten. Durch Nachheizen bei 850 °C wird erreicht, das sich erste Sinterhälse zwischen den Körner ausbilden, wodurch die Formstabilität nach der vollständigen Entbinderung gesichert ist. Diese Prozesse benötigen einen Großteil der gesamten Produktionszeit [32]. Durch das herausgelöste Volumen des Binders ist eine Porosität entstanden. Diese wird im letzten Prozessschritt durch Sintern dicht unterhalb der Schmelztemperatur des Metalls reduziert. Die Verfestigung von kristallinen, körnigen oder pulverigen Stoffen durch das Zusammenwachsen von Partikeln bei Temperaturen dicht unterhalb des Schmelzpunktes Tm des Materials (üblich ist 0,8 - 0,9 * Tm) werden als Sintern bezeichnet [31][32]. Vor dem Sintern existiert noch keine metallische Bindung zwischen den einzelnen Partikeln. Die Pulverteilchen liegen in lockerer Packung (Braundichte) vor. Für das Sintern werden die Teile entweder mit einem Restbindergehalt oder bereits angesintert in den Sinterofen gegeben. Während des Sintervorgangs beginnt der Braunling in allen Raumrichtungen gleich zu schrumpfen und erreicht Enddichte und Masse des Bauteils und somit die hohe Festigkeit [31]..

(18) 3 Material und Methoden. 3. Material und Methoden. 3.1. Probenherstellung mittels MIM. 9. Zur Herstellung der Plättchen, die in dieser Diplomarbeit verwendet wurden, werden zunächst Metallpulver und Bindersystem zusammengemischt. Das Metallpulver ist argongasverdüstes sphärisches Ti-6Al-4V Eli (Extra Low Interstitial Alloys) mit unterschiedlichen Teilchengrößen. ELI werden α-Legierungen bezeichnet, die bis zu tiefen Temperaturen bei sehr geringen Anteilen interstitiell gelöster Elemente erhalten bleibt [58]. Bei dieser Diplomarbeit wurden die Pulverteilchengrößen ≤ 45 µm, 45 - 63 µm und 125 -180 µm verwendet. Die Pulverteilchengröße 125 µm - 180 µm wurde mit dem PIGA-Verfahren im Helmholtz-Zentrum Geesthacht hergestellt, die beiden anderen Pulverteilchengrößen wurden von der Firma TLS Technik GmbH & Co. Spezialpulver KG aus Bitterfeld mit dem EIGA- Verfahren hergestellt [59]. Beim Piga-Verfahren wird das zu verdüsende reaktive Metall induktiv zerschmolzen oder mittels Plasma in einem Wassergekühlten Kupfertiegel [29]. Das EIGAVerfahren ist eine Kombination der Inertgasverdüsung mit einem keramikfreien Schmelzprozess [28]. Feedstock Herstellung Das Pulver wird zusammen mit dem Binder in einer Glovebox durch einen Schaufelkneter, das aus zwei Schaufeln des Typs Sigma besteht, vermischt. Der Binder beträgt 10 % des Feedstockgewichtes. Er besteht aus den Komponenten Paraffinwachs 1.07157.1000 (10 %), Paraffinwachs 1.07158.1000 (50 %), Stearinsäure 1.00671.9020 (5 %) und Lupolen V 2920K (35 %). Die verwendete Bindermenge müsste jedes Pulverpartikel ausreichend benetzen, aber wiederum sollte die Menge an Binder möglichst gering sein, weil sich das Ausmaß der Schrumpfung bei der Sinterung proportional zum Binderanteil verhält. Die Paraffinwachse bestimmen die Fließeigenschaften der Masse. Die Komponenten Lupolen V gibt dem Feedstock die Formstabilität. Daneben stabilisiert die Stearinsäure die Bindung zwischen den Binderkomponenten und den Metallpartikeln [37]. Die Feedstock Herstellung verläuft so: Beim Vermischen wird zunächst das Pulver auf Vorlauftemperatur erhitzt. Sie beträgt 100 °C - 105 °C und wird über ein Thermoelement direkt in der Knetmasse abgegriffen. Nach einer halben Stunden Temperierung wird die Mischtemperatur erreicht, woraufhin die leicht schmelzenden Binderanteile und schließlich das Polyethylen hinzu gegeben werden. Man erhält nach einer weiteren Knetzeit von einer Stunde einen homogenen Feedstock in dem die einzelnen Metallpulverteilchen benetzt sind, der durch Weiterfahren der Maschine während des Abkühlvorganges granuliert wird. Spritzgießen bis zum Grünling Die Proben sind mit der Spritzgießmaschine MTT-100KSA hergestellt worden. An diesem Gerät wird nur sehr wenig Feedstock benötigt, um die gewünschten Proben herstellen zu können. Der Feedstock wird in die Spritzmaschine gegeben, wo es bei einer Temperatur zwischen 110 - 120 °C plastifiziert wird und mit einem Druck von ca. 5 bar in einem tempe-.

(19) 3 Material und Methoden. 10. rierten Formwerkzeug eingespritzt wird. Dieser besteht aus einem hochfesten Stahl, es ist in zwei Hälften geteilt und mit zwei Auswerfern versehen. Somit kann die Probe nach dem Erstarren problemlos aus der Form entfernt werden. Folgende Parameter wurden eingestellt: . Einspritztemperatur: 110 °C - 120 °C. . Einspritzdruck: 5 bar - 5,7 bar. . Einspritzzeit: 1 s. . Werkzeugtemperatur: 60 °C. Entbindung zum Braunteil Durch das Formwerkzeug können Plättchen mit einem Durchmesser von ca. 28 mm hergestellt werden. Diese Proben sind auf einem Blech in den Entbinderungsofen von der Firma LÖMI Typ: LRA-50/EBA-50 platziert worden, wo sie für 20 Stunden unter Hexanbehandlung bei einer Temperatur zwischen 20-40 °C verweilten. Nach der chemischen Entbinderung sind die Proben in Argon über Nacht getrocknet worden. Der fertige Braunteil, wird durch ein 8 mm Ausstanzwerkzeug in 5 kleine 8 mm Plättchen ausgestanzt, die anschließend gesintert werden und dann für die biologischen Test verwendet werden können. Sintern zum Endprodukt Im MIM-labor finden die thermische Entbinderung und das Sintern im kombinierten Entbinderungs-Sinterofen XVAC der Firma Xerion Ofentechnik GmbH statt. Der Ofenverlauf für die thermische Entbinderung und das Sintern von den Teilen wird so programmiert, dass die Braunlinge zuerst bei 400-500 °C in 4-5 Stunden thermisch entbindert werden wie oben erklärt und anschließend bei 1350 °C in 2 Stunden einer passenden Atmosphäre gesintert werden.. 3.2. Metallographische Probenpräparation. Die Ti-6Al-4V Proben wurden eingebettet, damit sie die Stabilität zum Schleifen und Polieren erhalten. Bei der Einbettung muss die Härte des Einbettmittels mit der Härte der Probe abgestimmt werden. Für die Ti-6Al-4V Proben wurden die Kalteinbettmethode mit dem Einbettmittel Demotec 30 benutzt. Die Proben werden in Gießformen fixiert. Das Einbettmittel wurde gemixt und schnell in die Formen gegossen. Die Blöcke härten sich innerhalb einer halben Stunde aus. Die Schleifarbeit erfolgt an einer Schleifmaschine Tegrapol-35, Struers. Zum Erlangen der glatten Schliffoberfläche werden die Siliziumkarbid- Nassschleifpapier mit verschiedenen.

(20) 3 Material und Methoden. 11. Körnungen wie 320, 500, 800, 1000, 1200 und 2400 benutzt. Die Schleifarbeit erfolgt unter einer Andruckkraft von 60 N für je 1 min bei 300 Umdrehungen pro Minute. Die Polierarbeit erfolgte mit derselben Maschine wie beim Schleifen, aber mit niedriger Andruckkraft 30 N und mit einer Drehung der Schleifscheibe von 150 Umdrehungen pro Minute. Für den Vorgang wurden ein besonderes Poliertuch und eine Poliersuspension aus 250 mL OPS, 40 mL H2O2, 1 mL HNO3, 0,5 mL HF verwendet. Das Polieren dauert 5 Minuten. Zum Abschluss wurde die Probe mit Wasser und Pril gereinigt und mit Warmluft getrocknet.. 3.3. Mikroskopie. Lichtmikroskopische Untersuchung Die lichtmikroskopischen Aufnahmen aller Proben wurden bei 50 - fach Vergrößerung, an einem Leica MZ 95 mit polarisiertem Licht erstellt. Die Analyse erfolgte mit dem AdobePhotoshop-Programm. Aus einem schwarz / weiß Abgleich, wobei die schwarze Fläche die Poren und die weißen Flächen das Material darstellen, wird die Porosität berechnet. Bei der Bestimmung der Porengrößenverteilung wurde ein lichtmikroskopisches Bild mit dem AnalySIS-Programm auf schwarz / weiß Abgleich eingestellt. Bei der Bildverarbeitung werden die Porengrößen je nach Größe farbig dargestellt. Poren gleicher Größe wurden mit einer Farbe gekennzeichnet. Verbundene Poren werden als einzelne Pore betrachtet. Das Programm misst den mittleren Durchschnitt einer Pore und stellt die Werte in einer ExcelTabelle aus. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung Die REM- Bilder in dieser Diplomarbeit wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop von der Firma Zeiss, DSM962 hergestellt. Die REM- Aufnahmen sind bei 20kV Beschleunigungsspannung und 25mm Arbeitsabstand im SE-Modus direkt von der Oberfläche der zu untersuchenden Ti-6Al-4V-Proben aufgenommen worden.. 3.4. Geometrische Dichtebestimmung. Diese Methode kann für Körper, die eine einfache Geometrie besitzen angewendet werden. Zunächst werden die Proben nach dem Sintern gewogen und ihre Abmessungen bestimmt. Daraus wird das Volumen V = π * d^2 / 4 * H und nach der Formel ρ=m/V die Dichte der Proben berechnet..

(21) 3 Material und Methoden. 12. Die relative Dichte wurde nach der Formel D = ρ / ρtheoretisch ermittelt. Abschließend wird die Restporosität der Proben mittels dieser Formel berechnet: P (%) = (1 - D) * 100 % Isolierung von Zellmaterial aus Hüftknochen Die Knochenzellen (Osteoblasten) wurden aus der Epiphyse des menschlichen Oberschenkelknochens gewonnen. Die Epiphyse stellte das Schön Klinikum Eilbek in Hamburg zur Verfügung. Bevor die Epiphyse präpariert wurde, wurde sie in sterilem 1x PBS-Puffer (pH 7,4) gelagert. Mit sterilem Besteck wurden die Gewebestückchen aus der Spongiosa der Epiphyse heraus geschabt und in ein steriles Falconröhrchen überführt. Die Gewebestückchen wurden so oft mit PBS gewaschen, bis das PBS eine klare Farbe zeigte. Anschließend wurden die Stückchen in eine sterile Kulturflasche überführt und mit Medium versorgt (DMEM +10 % FKS und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S)). Die Zellen wurden mehrere Wochen ohne die Gewebstücke zu bewegen inkubiert, um sie aus dem Zellverband wachsen zu lassen. Alle 2 - 3 Tage fand ein Mediumwechsel statt. Nach 4 - 8 Wochen konnten die Zellen, die auf dem Boden der Kulturflasche adhäriert sind, mit einem Zellschaber gelöst werden. Das Medium mit den gelösten Zellen wurde in ein steriles Falconröhrchen überführt und zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und durch erneute Mediumzugabe, konnte die gewünschte Zellzahl/mL eingestellt werden. Nach Bedarf wurden sie entweder weiterkultiviert oder eingefroren. Isolierung von Stammzellen Die HUCPV-Zellen, die in dieser Diplomarbeit verwendet wurden, wurden schon vorher Isoliert und für die Verwendung für die Testung bereitgestellt. Die Mesenchymalen Stammzellen wurden von einer Nabelschnur isoliert. Sie wurde in 5 cm Stücke zerschnitten. Die Gefäße von der Nabelschnur wurden isoliert und am Endstück zu einer Schleife zusammen gebunden und zugenäht. Diese wurden in einer T175 Zellkulturflasche platziert und für 10 Tage in α-MEM + 10 % FKS ohne Mediumwechsel inkubiert. Nachdem der erste Auswuchs der Zellen aus der Schleife sichtbar wurde, wurde das Medium alle 2-3 Tage gewechselt. Nach dem eine Konfluenz von ca. 60 % erreicht wurde, wurden die Zellen mit einem Zellschaber geerntet und in einer Dichte von 1000 Zellen/cm-2 kultiviert. Nähere Informationen können aus dem Protokoll von Herrn Feyerabend entnommen werden [60].. 3.5. Vorbereiten der Zellen. In den meisten Fällen wurde mit eingefrorenen Zellen gearbeitet. Sie wurden zügig in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Nach dem Auftauen werden die Zellen in einem Falcon überführt. Diese werden dann für 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Zum Pellet wird frisches Medium aus der Vorratsflasche gegeben und vorsichtig.

(22) 3 Material und Methoden. 13. durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Danach wird es in eine Zellkulturflasche überführt. Es wird das entsprechende Nährmedium für Osteoblasten (DMEM + Glutamax mit einem Zusatz von 10%igem Fetalem Kälber Serum (FKS)) oder Stammzellen (MEM-Alpha mit einem Zusatz von 15%igem humanem FKS) hinzu gegeben und 1 % Penicillin/Streptomycin, um bakterielle Kontamination zu vermeiden. Anschließend wird dann die Zellsuspension bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Die Zellen werden alle zwei bis drei Tage mit frischem Medium versorgt. Trypsinieren Es wird trypsiniert, um die Zellen von der Oberfläche der Kulturflasche zu lösen. Dazu wird 0,05 % Trypsin- EDTA (Ethylendiamintetraacetat) verwendet, das ein Komplexbildner für zweifach geladene Metallionen ist. Trypsin EDTA dient dem Verdau von Zelladhäsionsproteinen am Boden der Zellkulturflasche. Durch Entzug von Ca2+, das eine tragende Rolle bei Zell-Zell-Verbindungen spielt, kommt es zu einer Auflösung der Zellverbände. Aus einer mit Zellen bewachsenen Zellkulturflasche wird das verbrauchte Medium mit einer sterilen Pasteurpipette, die über einen Schlauch an einer Vakuumpumpe angeschlossen ist, abgesaugt. Je nach Größe der Flasche wird entsprechend viel PBS gegeben. Für große Flaschen (T 175) wird 10 mL PBS; für mittlere Flaschen (T 75) 5 mL PBS zur Flasche gegeben, um die Zellen mit PBS zu waschen. Das PBS wird ebenfalls abgesaugt. Mit einer Einwegpipette je nach Größe der Flasche (große Flasche 6 mL 0,05 % Trypsin-EDTA; mittlere Flasche 4 mL 0,05 % Trypsin-EDTA) wird Trypsin-EDTA hinzugegeben. Anschließend wird die Flasche für drei Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden alle Zellen durch leichtes Schlagen gegen den Boden abgelöst und vereinzelt. Um den Enzymverdau zu stoppen, wird bei großen Flaschen 10 mL und bei mittleren Flasche 6 mL frisches Medium aus einer Vorratsflasche hinzu gegeben. Einfrieren Zellen, die nicht gebraucht werden, werden eingefroren. Idealerweise sollten mindestens 1 x 106 (pro 1 mL) Zellen eingefroren werden. Die Zellen die eingefriert werden sollen werden zunächst einmal trypsiniert und in ein Falcon überführt, wo die Suspension dann für 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert wird. Vorher wird 50 µL von der Suspension zur Zellzahlbestimmung entnommen. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das entstandene Pellet mit 1 mL DMSO (Dimethylsulfoxid) resuspendiert und in ein Cryotube überführt. DMSO dringt leicht durch Zellmembranen und verhindert Eiskristallbildung beim Einfrieren. Das Cryotube wird in einer Isopropanolbox in einer Kühltruhe zunächst auf -80 °C heruntergekühlt (Δν = 1° C/min). Nach 24 h kann das Cryotube in einem Flüssigstickstofftank bei -196 °C gelagert werden..

(23) 3 Material und Methoden. 14. Vorbereitung der Titanproben für die Zellkulturversuche Die Ti-6Al-4V-Proben sind für die Versuche mehrmals verwendet worden. Nach jedem Versuch mussten die Proben sorgfältig gereinigt werden, um sie für den nächsten Versuch frei von Zellresten zu bekommen. Die Reinigung besteht aus mehreren Waschschritten. Zunächst werden alle Proben einer Porengröße in ein Glasgefäß sortiert. Bei jedem Waschschritt werden die Proben für 20 min. im Ultraschallbad gereinigt. Die generelle Reinigung findet in einer 2%igen Hellmanex Lösung statt (die in destilliertem Wasser verdünnt ist). Nach der Reinigung im Ultraschallbad wird die Lösung dekantiert und die Proben mit destilliertem Wasser gespült. Um die Proben von Fetten und Lipiden zu lösen, verwendet man Chloroform. Nach 20 Minuten Ultraschallbad werden auch hier die Proben mit destilliertem Wasser gespült. Die Entfernung von Proteinen bzw. Zellbestandteilen wird durch 100 % Ethanol erreicht. Nach dem Ultraschallbad und dem Spülen mit destilliertem Wasser werden die Proben abschließend zweimal für je 20 Minuten im Ultraschallbad in destilliertem Wasser gereinigt, um die restlichen Lösungsmitteln auf den Proben zu entfernen. Bevor aber die Proben für die Versuche benutzt werden konnten, wurden die gereinigten Proben in Sterilisiertütchen, je 5 Proben in Reihen platziert, laminiert und anschließend im Autoklaven für 20 min bei 2 bar und 121 °C sterilisiert. Anschließend wurden die Proben in den Sterilisiertüten im Trockenschrank getrocknet.. 3.6. Adhäsion und Proliferation. MTT-Test Der MTT-Test ist eine Zellviabilitätsmessung. Bei hoher Zellaktivität wird der gelbe Farbstoff Tetrazoliumsalz 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu blauviolettem Formazan reduziert. Diese kann dann mit geeigneten Substanzen aus den Zellen herausgelöst und photometrisch ermittelt werden [61]. Die Farbreaktion von dem schwach gelben MTT zu den dunkelblauen Formazan Kristall kommt durch die Aufspaltung des Tetrazoliumringes zustande, wobei zu sehen ist, dass die Reduktion zu Formazan enzymabhängig und hauptsächlich auf mitochondriale Dehydrodenase zurückzuführen ist [38]. Die Zugabe des Solubilisierungslösung (10 % SDS in 0,01 M HCl) führt zur Lyse der Zellmembran. Die Konzentration des katalytischen Produktes Formazan ist direkt proportional zur metabolischen Aktivität lebender Zellen. Der MTT-Test wurde für die Untersuchung der Zelladhäsion und der Proliferation angewendet. Bei der Bestimmung der Adhäsion wurde nach 1 h, 2 h und 4 h Inkubation MTT zu dem Überstand der zu testenden Proben hinzugegeben und bei der Proliferation nach 5, 10 und 15 Tagen. Es wurde zunächst aus jedem Well 1,5 mL Medium abgenommen (Ausfüllvolumen der Wells ca. 3 mL Flüssigkeit). Es wird in jedem Well 1:10 MTT (= 150 µL) pipettiert und anschließend für 4 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation wird 1:1 Solubilisierungslösung (1,5 mL) in jedes Well hinzu gegeben. Die Platte wird über Nacht im Brutschrank aufbewahrt. Die Messung der Zellviabilität erfolgt am nächsten Tag am Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge < 655 nm..

(24) 3 Material und Methoden. 15. Zelladhäsion auf porösen Titanmaterialien Untersucht wurde die Adhäsion von Osteoblasten und Stammzellen auf 5 verschiedenen porösen Ti-6Al-4V-Oberflächen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten: nach 1 h, 2 h und 4 h Inkubation. Für diesen Versuch wurden 12 Multiwellkulturplatten verwendet. Damit die Zellen nicht am Boden der Platten adhärieren, wurde der Boden mit 1%igem Agarosegel beschichtet. Damit soll erreicht werden, dass nur die Zellen erfasst werden, die direkt auf den Probenkörpern adhärieren. Die sterilen Titanproben werden in je ein Well überführt. Es werden für jede Porosität 4 Ansätze gemacht. Die zu testenden Zellen werden zu 75000 Zellen in 50 µL Medium pro Träger ausgesät und für 30 min darauf zum Adhärieren inkubiert. Nach den 30 min werden die Proben mit 3 mL Medium überschichtet, um die nicht-adhärierten zu entfernen. Anschließend werden die Plättchen in neue 12 Well Platten überführt. Um weitere Adhäsionszeiten zu testen wurden die Zellen für weitere 30 Minuten (Gesamtadhäsionszeit 1 h Inkubation), 90 Minuten (Gesamtadhäsionszeit 2 h Inkubation) und 210 Minuten (Gesamtadhäsionszeit 4 h Inkubation) inkubiert. Anschließend wurde der gewünschte Versuch durchgeführt. Zellproliferation auf porösen Titanmaterialien Die Vorbereitung für die Proliferation ist ähnlich wie die der Zelladhäsion. Die sterilisierten Proben werden in die Agarose beschichteten 12 Well Platten überführt. Es wird für diesen Test das Proliferationsverhalten von Osteoblasten und Stammzellen auf den 5 verschieden porösen Ti-6Al-4V-Oberflächen getestet. Es wurden 50000 Zellen in 50 µL Medium auf die Träger für 30-45 Minuten adhäriert. Es werden auch hier jeweils 4 Ansätze pro Porösität gemacht. 3 mL Medium wird hinzu gegeben und die Platten werden für 5, 10 oder 15 Tage im Brutschrank inkubiert. Alle 2-3 Tage wird das Medium gewechselt. Am Ende der Proliferationszeit wird mittels MTT die Viabilität der Zellen gemessen. Dies ist indirekt auch ein Maß für die Zellzahl. DAPI Färbung der Zellkerne Um genaueres über die Verteilung der Zellen auf den Proben zu erfahren, wurde die DAPI Färbung angewendet. Der Fluoreszenzfarbstoff DAPI bindet selektiv an DNA und bildet stark fluoreszierende DNA-DAPI-Komplexe (Zellkernfärbung) mit hoher Spezifität [39]. Dazu wurde den zunächst das Medium entnommen und anschließend mit PBS gewaschen. Die Dapi-Stammlösung wurde in destilliertem Wasser 1:50 verdünnt (1 µg/µL). Die verdünnte Lösung wurde anschließend noch mal 1:1000 in Methanol (1µg/mL) verdünnt. Von dieser DAPI-Lösung wurden 3 mL in jedes Well gegeben. Anschließend werden die Proben für 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Wells werden mit Abdeckfolie beklebt, dass verhindert das verflüchtigen des Methanols. Anschließend werden die Proben über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, dadurch wird die Fluoreszenz etwas stabilisiert. Danach kann mit dem Mikroskopieren begonnen werden..

(25) 3 Material und Methoden. 3.7. 16. Differenzierung der Zellen. Die osteogene Differenzierung wurde für Osteoblasten und Stammzellen durchgeführt. Die porösen sterilenTi-6Al-4V-Proben werden in die mit Agarose beschichteten 12 Well-Platten überführt. Es werden auch hier 4 Ansätze von den verschiedenen Porositäten gemacht. Es werden von beiden Zellsorten jeweils 50000 Zellen in 50 µL Medium auf die Ti-6Al-4V-Träger ausgesät und können für 30 - 45 Minuten darauf adhärieren. Dann werden noch einmal 3 mL zellspezifisches Nährmedium hinzu gegeben und für 10 Tage inkubiert, damit die Zellen auf den Proben wachsen können. Alle 2-3 Tage wird das Medium gewechselt. Ab dem 11. Tag wird mit der Differenzierung im Differenzierungsmedium begonnen. Das Kultivierungsmedium wurde mit osteogenetischen Zusätzen wie Dexamethason, L- Ascorbinsäure 2-Phosphat und 1,25-Dihydroxyvitamin D3 für die Züchtung von Knochenzellen versetzt [47]. Die Differenzierung erfolgt in 2 Schritten. Zunächst wird zwischen Tag 11-17 das Nährmedium gegen das Differenzierungsmedium getauscht. Zwischen Tag 18 und Tag 38 wird zusätzlich Glycerolphosphat hinzugegeben. Alle 2-3 Tage findet ein Mediumwechsel statt. Der Versuch wird nach 2, 3 oder 4 Wochen beendet. Danach können die Zellen auf ihren Differenzierungsgrad untersucht werden. ALP Bestimmung Die Osteoblasten produzieren 100 fach mehr ALP als andere Zellen in anderen Geweben deshalb ist ALP der am häufigsten verwendete Nachweis für ausdifferenzierten Osteoblasten. Während der Knochenbildung erzeugen die Osteoblasten große Mengen ALP, was ein zellmembrangebundenes Glykoproteinenzym ist. Die Quantifizierung des ALP’s ermöglicht in-vitro eine genauere Bestimmung des Differenzierungsprozesses [68]. Mit dem Alkalische Phosphatase-Test können Osteoblasten und die HUCPV-Zellen durch eine hohe Aktivität von ALP nachgewiesen werden. Der Test sagt aus, ob gewisse Differenzierungsstadien der Osteoblastenentwicklung vorhanden sind. Das Testprinzip basiert auf die Messung des Enzyms. Dabei wird p-Nitrophenylphosphat das als lösliches Substrat verwendet wird, von der in der Probe enthaltene Menge an ALP umgesetzt. Dabei wird die Phosphatgruppe vom Substrat abgespalten und es entsteht ein unlöslicher Farbkomplex (gelbe p-Nitrophenol). Bei einer Wellenlänge von 405 nm am Photometer kann aus der zeitlichen Zunahme der Extinktion die enzymatischen Produktion von p-Nitrophenol direkt bestimmt werden [40]. Für diesen Test wurde der Überstand der Differenzierungswochen 2,3 und 4 verwendet. Für diesen Test wird eine 96-Well Platte verwendet. In den einigen Wells (siehe Zeichnung) werden jeweils 200 µL destilliertes Wasser gegeben. Zum Vergleich werden je 200 µL Kalibrierlösung (Tartrazin) in 3 Wells übertragen, um kontrollieren zu können, ob die Messungen erfolgreich verlaufen sind. In den übrigen Wells werden 150 µL ALP-Stocklösung übertragen, um anschließend auf diese Wells 50 µL von dem Überstand der Probe hinzuzugeben. In jedem Well ist jetzt ein Gesamtvolumen von 200 µL vorhanden. Von jeder Probe werden 3 Wiederholungen gemacht. Anschließend wird die Optische Dichte (OP) der Proben sofort im Tecan Sunrise Photometer bei 405 nm zu der Zeit t = 0 und wieder 4 Minuten später zu der Zeit t = 4 gemessen..

(26) 3 Material und Methoden. 17. Die Aktivität der Alkalischen Phosphatase wurde mit der folgenden Formel berechnet: (I * (U/L) = µmol/(L * min)) = ((ODPROBE t4 - ODPROBEt0) * (Reaktions Volumen))/((ODKALIBRATOR - ODH20) * Proben Volumen * t) * 35.3 . Reaktionsvolumen = 200 µL. . Probenvolumen = 50 µL. . t=4. A B C D E F G H. 1 W W W W W W W W. 2 W W W W W W W W. 3 W W W W W W W W. 4 K. 5 K. 6 K. P17 P18 P19 P20. P17 P18 P19 P20. P17 P18 P19 P20. 7 P1 P3 P5 P7 P9 P11 P13 P15. 8 P1 P3 P5 P7 P9 P11 P13 P15. 9 P1 P3 P5 P7 P9 P11 P13 P15. 10 P2 P4 P6 P8 P10 P12 P14 P16. 11 P2 P4 P6 P8 P10 P12 P14 P16. 12 P2 P4 P6 P8 P10 P12 P14 P16. Tabelle 2: 96 Well Platte mit den Proben für den Versuch. Pi = Probe W = Wasser K = Kalibrierlösung Osteokalzinbestimmung Ein weiterer Differenzierungstest ist der Nachweis von Osteokalzin durch einen Enzymelinked Immunosorbent Assay (Elisa). Osteokalzin ist ein knochenspezifisches Markerenzym, das hauptsächlich nicht kollagene Protein der Knochenmatrix und wird in den Knochen von Osteoblasten synthetisiert. Nach der Bildung wird es teilweise in die Knochenmatrix eingebaut und teilweise in die Blutbahn freigesetzt. In zahlreichen Studien wurde gezeigt, dass die zirkulierende Menge von Osteokalzin die Rate der Knochenbildung wieder spiegelt. Mittels des ELISA erfolgt die quantitative Bestimmung des von den Zellen synthetisierten, intakten Osteokalzins. Der Test wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Vorbereitend für den Osteokalzin Test wurde der Überstand in der Differenzierungswoche 2., 3. und der 4. Woche abpipettiert, in markierte Eppendorf Tubes gegeben und eingefroren. Der Osteokalzin ELISA basiert auf der Verwendung eines monoklonalen HPR-konjugierten Antikörpers der von Mäusen gewonnen wurde gegen humanes Osteokalzin. Es wurden 25 µL Überstand von jeder Probe eingesetzt. Bei diesem Test wird eine Doppelbestimmung gemacht. Es werden zunächst in den Probenwells, dann in die Standardwells 100 µL destilliertes Wasser gegeben. Man entnimmt 25 µL von dem Überstand der zu testenden differenzierten Zellen und pipettiert es in die Probenwells. Die Wells werden mit einer Abdeckplatte abgedeckt und bei Raumtemperatur auf.

(27) 3 Material und Methoden. 18. einem Mikroplattenschüttelgerät bei 100 rpm für 2 Stunden inkubiert. Anschließend wird die Abdeckplatte entfernt, die Wells werden 3mal mit ca. 400 µL Waschpuffer (Phosphatgepufferte Salzlösung) gewaschen. Nach jedem Waschschritt muss der Puffer vollständig entfernt werden, dies wird erreicht indem man die Wells gegen ein Tuch klopft. Die Wells dürfen nicht trocknen, deshalb muss auch danach sofort in jedem Well 100 µL TMB Substrat (Tetramethylbenzidin) Lösung hinzu gegeben werden. Die Wells werden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt durch sofortige Zugabe von 100 µL Stop- Lösung (1 M Phosphorsäure) was in jedes Well gegeben wird. Die Messung erfolgt bei einer Wellenlänge von 450 nm in dem Spektrophotometer. Osteokalzin/Osteopontin/Dapi Parallelfärbung Ein weiterer Differenzierungstest, der jedoch an Zellen durchgeführt wird, ist die Parallelfärbung. Es wurde der Differenzierungsgrad von Osteoblasten und Stammzellen nach 2, 3 und 4 Wochen getestet. Die Osteokalzinfärbung ist wie oben beschrieben, ein immunhystochemischer Nachweis osteotypischen Osteokalzins. Der Primärantikörper bindet spezifisch an humanes Osteokalzin in der Matrix und wird in einem zweiten Schritt mit Hilfe eines Zweitantikörpers und folgender Farbreaktion sichtbar gemacht. Auch Osteopontin kann so nachgewiesen werden [41]. Hierzu wird die Zellsuspension mit einem monoklonalen Antikörper und einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Um eine Parallelfärbung vornehmen zu können, wurden unterschiedlich markierte Antikörper ausgewählt: für das Osteokalzin wurde das Fluoreszenzfarbstoff FITC und für Osteopontin das Fluoreszenzfarbstoff Texasred gewählt. In den Wells mit den differenzierten Zellen wird zunächst das Medium entnommen und mit PBS gewaschen. Danach werden die Proben in eine 24-Well Platte überführt und die Zellen werden mit 3,7%igem Formaldehyd fixiert. Es reichen ca. 700 µL um die Proben zu bedecken. Die Platte wird für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter dem Abzug stehen gelassen. Anschließend wird das Formaldehyd entfernt und 700 µL Extraktionslösung zu den Proben hinzugegeben, dadurch erreicht man die Permeabilisierung der Zellen. Die Platte wird wieder für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Extraktionslösung wird entfernt und 700 µL Blockierungslösung zu den Proben hinzugegeben. Die Blockierungslösung verhindert unspezifische und unerwünschte Bindungen an der Oberfläche der Proben. Anschließend wird die Platte dann für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. In diesem Versuch wurden für die primären Antikörper monoklonaler anti-osteokalzin clone OC1, der von Mäusen gewonnen wurde und spezifische Epitope Osteopontin, der von Kaninchen gewonnen wurde, verwendet. Diese wurden in 1:200 in TBS + 3 % BSA verdünnt. Die Zellen werden nun mit beiden primären Antikörpern gleichzeitig 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Danach werden die Zellen zweimal 5 Minuten mit PBS gewaschen. Anschließend wird der zweite Antikörper dazu gegeben und für 1 Stunde bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die.

(28) 3 Material und Methoden. 19. sekundären Antikörper sind 1. Goat anti-mouse IgG FITC und das 2. Antikörper ist Goat anti rabbit IgG Texas Red. Diese Antikörper werden 1:100 in TBS + 3 % BSA verdünnt. Anschließend wird 2 x für 5 Minuten mit PBS gewaschen. Im letzten Schritt wird die DAPIFärbung durchgeführt (siehe DAPI- Färbung). Anschließend lässt man die Platte über Nacht bei 4 °C im Dunkeln stehen, damit die Fluoreszenz etwas stabilisiert wird. Am nächsten Tag kann mikroskopiert werden. RNA-Gewinnung Es sind bei diesem Versuch unterschiedliche knochenspezifische Marker untersucht worden wie ALP, OC, OPN und BSP, die Matrixbildenden Proteine Kollagen1 und cbfa1 und die Osteoklastendifferenzierungsfaktor RANKL und OPG. GAPDH ist ein Housekeeping Gen und wird hier als Referenz verwendet weil die Expression in den verschiedenen Entwicklungsstufen der Knochenzellen immer gleich stark ist. RNA-Isolation Für die RNA-Analyse wurden nur die Osteoblasten getestet. Bei der RNA Extraktion wurde die RNA aus den Differenzierungswochen 2, 3 und 4 von den Osteoblasten untersucht. Um den Versuch mit den Zellen, die nach den drei Differenzierungszeiträumen gewonnen wurden, gleichzeitig durchführen zu können, wurde das Medium in dem sich die Zellen auf den Proben befinden durch waschen mit 1x PBS entfernt, und die Proben mit den Zellen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die RNA wurde aus den gewonnenen Zellproben der verschiedenen Differenzierungswochen isoliert. Dazu wurde das RNeasy Mini Kit von Qiagen verwendet. Die aufgetauten Proben wurden mit 600 µL RLT-Puffer lysiert und zur Homogenisierung in QIAShredder Spin -Säulen für 2 Minuten bei 15,000 g zentrifugiert. Anschließend wurde zu dem Lysat 600 µL 70%iges Ethanol zugegeben und durch auf und abpipettieren homogenisiert. Nachfolgend wurden 700 µL von dem Lysat in eine RNeasy Spin Säule überführt und 15 Sekunden bei ≥ 8,000 g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Um die Säule von Kontaminationen zu befreien, wurde mit RW1-Puffer gewaschen. Hierzu wurden zu der RNeasy Säule 700μL RW1-Puffer hinzugegeben und anschließend für 15 Sekunden bei ≥ 8000 g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Hierauf folgten zwei weitere Waschschritte mit 500 µL RPE nach demselben Schema nur das beim zweiten Mal waschen nicht nur 15 Sekunden bei ≥ 8,000 g zentrifugiert wurde sondern 2 Minuten. Um die RNA aus der Membran zu eluieren, wurde auf die Membran 50 µL RNase-freies Wasser gegeben und für 1 Minute bei ≥ 8,000 g zentrifugiert. Die RNA wurde in einem frischen DNAse und RNase freiem 1,5 mL Reaktionsgefäß aufgefangen und während der nachfolgenden Analyse auf Eis gelagert. Längerfristige Aufbewahrung erfolgte bei -80 °C. RNA Integrität und Konzentration Bei dem Verfahren erhält man die Information über die Qualität der RNA. Bei diesem Agarose Gel muss nur die 28S und 18S rRNA betrachtet werden. Diese 2 RNA Typen sind am häufigsten in der Zelle vorhanden, bei intakter RNA stellen sich diese RNA- Fraktionen als.

(29) 3 Material und Methoden. 20. scharfe Banden im Gel dar. Die Qualitätsbeurteilung der Gesamtmenge der gewonnen RNA durch die Betrachtung der 28S und 18S rRNA Banden ist dadurch möglich. Für die Herstellung des RNA Agarose Gels wird 0.7 g Agarose in 70 mL 1x TAE (1 % Agarose Gel) gegeben und in der Mikrowelle für 1 Minute erwärmt, um die Agarose aufzulösen. 5 µL GelRed wird in die Lösung gemischt und für 5 Minuten auf ca. 60° gekühlt. Das Gel wurde blasenfrei auf einen Gelträger gegossen und ein Kamm in das Gel hinein gesteckt. Nach der Polymerisation des Agarose Gels, wurde der Kamm entfernt, und der Gelträger in die Elektrophoresekammer überführt. Es wurde 1x TAE Puffer in die Kammer gegeben, bis das Gel darin eingetaucht war. 2 µL von jeder RNA-Probe wurden mit 2 µL Loading Puffers (Beladungspuffer) (1X) gemischt und in jeweils eine der Geltaschen, die durch den Kamm entstanden waren pipettiert. Das Gel wurde 45 min bei 120 Volt laufen gelassen, um eine optimale Auftrennung der RNA Fragmente zu gewährleisten. Nachfolgend wurde das Gel auf einem UV Transilluminator platziert, dokumentiert und analysiert. Qualitativ sehr gute RNA wurde für die nachfolgenden Analysen verwendet. Die Konzentration der RNA wurde auf einem Spektrophotometer mit einer Absorbtionswellenlänge von 260 nm bestimmt. Das Verhältnis der Messungen von 260 nm und 280 nm Wellenlänge (A260/A280) gibt Aufschluss über die Reinheit der RNA (Kontamination mit Proteinen). Konzentrationen wurden nach dem Beer´s Gesetz berechnet, basierend auf eine RNA Extinktions-Koeffizienten von 25 µL/µg/cm. Die Proben wurden bei -20 °C oder -80 °C gelagert oder für anschließende Versuche weiter verwendet. Reverse Transkription Bei der RT-PCR (Reverse Transkriptasen - Polymerasen Kettenreaktion) besteht die Methode darin die mRNA mit Hilfe einer Reverse Transkriptase in cDNA umzuschreiben. Hierfür werden Oligo- dT-Primer verwendet die komplementär zu dem Poly-A Schwanz der mRNA sind. Durch das Enzym Reverse Transkriptase wird dann ausgehend von dem Primer ein antisense Strang DNA synthetisiert. Es ensteht ein doppelsträngiges RNA-DNA Hybridmolekül, sogenannte cDNA, die als Ausgangsmaterial für die quantitative Real-time PCR dient. Für die Reverse Transkription wurde der Omniskript Reverse Transkriptase von Qiagen verwendet. Es wurden von den einzelnen Proben 2 µg RNA entnommen, bis 10 µL mit Nuklease-freiem Wasser verdünnt und mit dem Mastermix (2 µL 10x RT Puffer, 2 µL dNTP mix (0.5 mM jeweils dNTP), 2 µL Oligo-dT primer (1 µM), 1 µL RNase Hemmer (10 Einheiten) und 1 µL Omniskript Reverse Transkriptase) versetzt. Die Reverse Transkription Reaktion wird durchgeführt 60 min bei 37 °C. Es wird entweder bei -20 °C gelagert oder für weitere Versuche untersucht. Real-time PCR (qPCR) Eine Methode für die Vervielfältigung von Nukleinsäuren ist die quantitative Real-Time oder quantitative Echtzeit-PCR. Sie basiert auf die normale Polymerase-Kettenreaktion nur das zusätzlich die gewonnene DNA quantifiziert werden kann. Mit Hilfe von FluoreszenzMessungen (hier EvaGreen Dye), die während des PCR-Zyklus erfasst wird erfolgt die.

(30) 3 Material und Methoden. 21. Quantifizierung. EvaGreen ist ein Farbstoff der anfängt zu fluoreszieren wenn er DNA gebunden hat. Daher nimmt die Fluoreszenz proportional mit der Menge der synthetisierten PCR-Produkte zu und ergibt eine exponentielle Kurve, die nach mehreren Vermehrungszyklen in eine Plateau-Phase übergeht. Für die Bestimmung des DNA-Gehalts werden die Fluoreszenzwerte der exponentiellen Phase bei signifikanter Überschreitung eines definierten Schwellenwerts (für alle Messungen einheitlich) verwendet, dies ist der Ct-Wert ein hoher CtWert zeigt das eine geringe Anzahl von cDNA Kopien im Ausgangsmaterial (RNA) vorhanden war, ein geringer Ct-Wert steht für eine hohe Initiale Kopienzahl. Durch die Normalisierung auf ein Referenzgen (Endogene Kontrolle: Ein Gen mit sehr geringer Variation in der Expression, das für die geplanten Untersuchungen ermittelt wird.) nach der Vergleichenden Ct-Methode [69], wird eine Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Proben erzielt: Ct Ziel Gen - Ct Endogene Kontrolle = delta Ct Durch den Abgleich auf ein oder mehrere Referenzgene werden Probe zu Probe Variationen wie Zellzahl, RNA Qualität und Quantität ausgeglichen, da die Endogene Kontrolle für jede Probe (Extraktionsereignis) mitbestimmt wird. Für die qPCR wurde dann 2 µL von der gewonnenen cDNA verwendet. Für die PCR wurde der SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad) verwendet. Die Primersequenzen sind aus der folgenden Tabelle zu entnehmen. Marker. Primersequenz. GAPDH for. GAPDH rev. Osteokalzin for. Osteokalzin rev. Kollagen Typ 1 for. Kollagen Typ 1 rev. Cbfa1 for. Cbfa1 rev. Alkalische Phosphatase (ALP) for. Alkalische Phosphatase (ALP) rev. Human Bone Sialo Protein (BSP) for. Human Bone Sialo Protein (BSP) rev. Osteopontin for. Osteopontin rev. Osteoprotegerin for. Osteoprotegerin rev. Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) for. Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) rev.. ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC TTC ACC ACC CTG TTG CTG TA CAT GAG AGC CCT CAC A AGA GCG ACA CCC TAG AC AAA GGC AAT GCT CAA ACA CC TCA AAA ACG AAG GGG AGA TG CCC CAC GAC AAC CGC ACC CAC TCC GGC CCA CAA ATC TC. PCR-Produkt (bp) 452 452 310 310 159 159 388 388. ACG TGG CTA AGA ATG TCA TC. 475. CTG GTA GGC GAT GTC CTT A. 475. AAG CAA TCA CCA AAA TGA AGA CT TGG AAA TCG TTT TAA ATG AGG ATA CCA AGT AAG TCC AAC GAA AG GGT GAT GTC CTC GTC TGT A AGA CTT TCC AGC TGC TGA GGA TCT CGC CAA TTG TGA. 188 188 347 347 469 469. CAG GAG ACC TAG CTA CAG A. 381. CAA GGT CAA GAG CAT GGA. 381. Tabelle 3: Primersequenzen der verwendeten Marker für die PCR.

(31) 3 Material und Methoden. 22. Es wurden von den einzelnen Proben 2 µL cDNA entnommen, bis 10 µL mit Nuklease-freiem Wasser verdünnt und mit 8 μl SsoFast EvaGreen Supermix (enthält DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl2 und Reaktionspuffer), 2x 1 μl Primer Mix (enthält 10 pmol/μl Forward-Primer und 10 pmol/μl Reverse-Primer) versetzt. Das PCR-Reaktionsprotokoll wurde folgendermaßen eingestellt: . 1 x 2 min 95 °C (Initiale Denaturierung). . 35 x 30 sec 95 °C (Denaturierung des Doppelstrangs). . 30 sec 53 °C (Primerannealing). . 30 sec 72-74 °C (Elongation durch die Taq-Polymerase). . Hold bei 4 °C.

(32) 4 Ergebnisse. 23. 4. Ergebnisse. 4.1. Charakterisierung der Porösitäten der Proben. Für die Bestimmung der Porosität und der Porengrößenverteilung sind licht- und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen gemacht worden, die gleichzeitig auch das Sinterverhalten der verschiedenen Ti-6Al-4V-Proben zeigen. Die Proben, die untersucht wurden, bestehen jeweils aus unterschiedlich großen Pulverpartikel (Pulverpartikelgröße ≤ 45 µm, 45-63 µm, Mischung (125-180 µm + 10 % ≤ 45 µm), 125-180 µm und ≤ 45 µm + 1 % Al). Sie wurden bei einer Sintertemperatur von 1350 °C hergestellt. Erwartungsgemäß ist zu erkennen, dass die Poren umso größer sind je größer die Pulverpartikel sind.. a) ≤ 45. b) 45-63. d) 125-180. e) 1 % Al. c) Mischung. Abb. 2: Lichtmikroskopische Aufnahme 20x von der Oberfläche der Ti-6Al-4V-Probe. In Abb. 2 sind die Lichtmikroskopischen Aufnahmen der verschiedenen Proben abgebildet. Von a) bis e) werden die Schnittflächen der gesinterten Ti-6Al-4V-Proben der unterschiedlichen Porositäten bei 20 - fach Vergrößerung dargestellt. Auf der Probe ≤ 45 µm Abb. 2 a sind die wenigsten Poren abgebildet. Die gesamte Probe ist fast vollständig versintert. Die Pulverpartikel sind ineinander übergegangen, so dass keine sphärische Pulverpartikel mehr zu erkennen sind. Im Vergleich zu den anderen Proben sind dort die kleinsten Porengrößen vorzufinden. Die Abb. 2 b zeigt die Schnittfläche der Probe 45-63 µm. In der Aufnahme wird eine höhere Porosität als im vorigen Beispiel erkennbar. Die Umrisse der Pulverpartikeln sind gut erkennbar. Durch die größeren Pulverpartikel sind auch größere Poren entstanden, die ineinander übergehen und somit längliche Poren gebildet haben. Auf der Schnittfläche der Ti-6Al-4V-Probe, die aus einer Pulvermischung hergestellt wurde (Abb. 2 c) ist das Feinpulver ≤ 45 µm vollständig mit dem groben Pulver 125-180 µm versintert. Es sind hauptsäch-.