High-Pressure-Liquid-Chromatography High-Performance-Liquid-Chromatography

14.11.2007 AC – BPBS HS07 1

Analytische Chemie

für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

LC / HPLC

LC / HPLC

High-Pressure-Liquid-Chromatography High-Performance-Liquid-Chromatography

High-Price-Liquid-Chromatography

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie

HPLC vs GC Apparatur Theorie

Mobile Phase

Säule und Stationäre Phase

Unterarten HPLC Detektoren

Dünnschichtchromatographie Walh einer Methode

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Warum HPLC ?

• GC: nur Trennung von Substanzen, die sich bis ca. 300°C unzersetzt verdampfen lassen

• Sehr polare und thermisch labile Substanzen

• Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere

• Selektivität hängt ... ab

! von der stationären Phase

! von der mobilen Phase (Polarität, Gradientselution)

• Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer (kleinere Diffusionskoeffizienten), Hochdruck ist nötig

• Analytische, Präparative und Produktive

Scheme HPLC

300 – 400 bar LM 10 ml/min

Trennsäule LM Aufteilungsvalve He/Ar

LM Behälter

Detektor

Injektorvalve

Vorsäule Pumpe

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Apparatur

6-port-Valve Injektor

Eluentvorrat (Entgaser, Aufteilungsvalve) Pumpe (reproduzierbar und konstant Druck) Injektor (bestimmte Menge zur Säule)

Filter/Vorsäule (fein Partikel in LM und Probe)

Säule

Detektor

Vor- und Nach-derivatisierungsteile

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Klassische Theorie

!

K =

[ ]

[ ]

!

v = L t_R

!

u= L t_M

!

k = K V

V

!

k = t

" t

t

= t

t

" = K_B

K_A " = k_B

k_A

"

!

N =N_eff " k+1 k

#

$ % &

' (

2

= t_R^' )

#

$ % &

' (

2

" k+1 k

#

$ % &

' (

! 2

N= L H = t_R²

"² =16 t_R w

#

$ % &

' (

2

!

t

= t

" t

Trennfaktor / Selektivätsfaktor Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor Retentionszeit / Geschwindigkeit Verteilungskoeffizient

Auflösung

!

H= L 16

w t_R

"

# $ %

&

'

2

Bodenzahl und Bodenhöhe

!

R= t_B "t_A

w_B +w_A 2

=2(t_B "t_A) w_B +w_A

R= "#1

"

$

% & ' ( ) * k_B

1+k_B * N 4

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Van Deemter Gleichung

Minimaler H-Wert

Theoretische BodenhöheH

!

H =2"#d_p +2k_D#D_M

u +u# f(d_p²,d_c²)

D_M + q#k#d_f²

(1+k)²D_S oder 2t_d #k (1+k)²

$

% & '

( )

optimale u Minimum H

A B C

Mobile Phase

Reinheit, Siedepunkt, Preis

Inert, Korrosionsbeständigkeit, Toxizität UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex

Mischbarkeit Puffer

Haltbarkeit

!

Viskosität

!

Elutionsstärke

!

Selektivität

Isokratische Trennung: Eluent bleibt während des Laufs unverändert.

Gradiententrennung: Eluent wird während des Laufs verändert.

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Stationäre Phasen

Unpolare Analyten erst eluiert Polare Analyten erst eluiert

Stationäre Phase

Si O OH

O Si

Si

O OH

O Si O OH

OH

Si

Si O O

O Si

OH

OH OH single

silanol group

two silanol group

three silanol group

SiO₂: ideale SP, aber ...

Polymere: Copolymer von Styrene und Divinylbenzene

! Partikelgrösse, Form und Grössenverteilung

! Porosität, Porengrösse, Oberfläche und Volumen

! Poröse und Nichtporöse

! Stärke (mechanische) gegen Druck und LM (Bruch und Deformation)) Physikalische Eigenschaften:

14.11.2007 AC – BPBS HS07 11

Modifikation der SP

Si OH

Si R₂

Cl R

R₁

Modifikation:

Si R₁

R₂ R Si

O

Si

OH HN[Si(CH₃)₃]₂

Entcapping:

Si(CH₃)₃ Si

O

Normale (Polare) Phase

Original SiO₂, Al₂O₃: Polare OH-Gruppe Modifizierte polare NP:

O Si R₁

R₂

CN O Si

R₁

R₂

NH₂

O Si R₁

R₂

O OH

OH Cyano (C₃–CN)

Amino (C₃–NH₂)

Diol (C₃–OCH₂CH(OH)CH₂(OH)

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Modifizierte NP-Säule

Nonpolare Mobile Phase z.B., Kohlenwasserstoff Hydrophile Eigenschaft

Umkehrphase (RP)

O Si R₁

R₂ R

R = C₁ – C₁₈

Straight-chain hydrocarbons (C₁₈, C₁₂, C₈ C₆, C₄, C₃, C₂, C₁))

Cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl

O Si R₁

R₂ O Si

R₁

R₂

O Si R₁

R₂

Unpolare Modifikation durch Kohlenwasserstoffketten

14.11.2007 AC – BPBS HS07 15

Umkehrphase (Reversed Phase, RP )

Si CH₃

CH₃ (CH₂)₁₇

R = CH₃

Hydrophobe Eigenschaft

Unterarten der HPLC

"

Adsorptions-Chromatographie

"

Verteilungs-Chromatographie

"

Umkehrphasen-Chromatographie (RP)

!

Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)

!

Ionenpaaren-Chromatographie

!

Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)

# Affinitäts-Chromatographie

# Komplexierungschromatographie

# Chirale Chromatographie

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Adsorptionschromatographie

Elutrope Reihe:

Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan

< Tetrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol <

Methanol < Wasser

Probenmoleküle Reihenfolge:

Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe

< gesättigte Kohlenwasserstoffe

< Aromaten < halogenierte Verbindungen

< Äther < Nitrile < Nitroverbindung < Ester

< Ketone < Aldehyde < primäre Amine

< Amide < Phenole < Carbonsäuren

Präparative Trennung im Labor Feste stationäre Phase

Verteilungschromatographie

Flüssige stationäre Phase Nur chemisch-verbundene flüssige Filme

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Wechselwirkungsmechanismus

schwach

stark schwach

stark

Hydrophob Hydrophil Dipol-Dipol

Ionenchromatographie (IC)

$ Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography)

$ Ionenpaarchromatographie (Ion Pair Chromatography)

$ Ionenausschlusschromatographie (Ion Exclusion Chromatography) Schnelligkeit, Empfindigkeit, Selektiivität, und Simultanität

Organische Polymere als Trägermaterial, hohen pH-Stabilität; frei vom ionische Verunreinigungen aus Edelstahl und korrosive Elutionsmittel zu vermeiden

Detektor – Leitfähigkeitsdetektor häufig, aber alle andere Detektoren auch einsetzen können

Suppressor: Reduktion der Grundleitfähigkeit auf minimalen Wert und Erhöhung des Signal/Untergrund Verhältnisse

Mobile Phase: Wasser oder Puffer (mit pH)

14.11.2007 AC – BPBS HS07 21

Ionenaustauschchromatographie (IC)

Stationäre Phase mit funktionellen Gruppen

• SO₃^–H⁺ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14

• COO^–H⁺ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14

• NR₃⁺OH^– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10

• NR₂ (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei niedrigem, pH 0 – 6.

Ionenaustauschschromatographie

Beispiel stark saurer Kation- enaustauscher:

Harz-SO₃H + M⁺(aq) ! Harz- SO₃M + H⁺(aq)

Der Selektivitätskoeffizient S für den Austausch zweier verschiedener Metallionen ist gegeben durch den Quotienten der entsprechend- en Gleichgewichtskonstanten K:

S(M₁/M₂) = K(M₁)/K(M₂) More highly charged

molecules are more tightly bound to the resin, and so travel slowly and are eluted later.

Moderately charged molecules equilibrating between the resin and the moving buffer more readily.

Less charged molecules bind less strongly to the resin, equilibrate with the moving buffer more readily, and so travel rapidly and are eluted faster.

14.11.2007 AC – BPBS HS07 23

Elutionsreihenfolge

Elutionsreihenfolge für Kationen:

Ba²⁺ < Ca²⁺ < Zn²⁺ < Mg²⁺ < Cs⁺ < Rb⁺ < K⁺ < NH₄⁺ < Na⁺ < H⁺ < Li⁺

Elutionsreihenfolge für Anionen:

Citrat (COO^–)₃ < Sulfat < Oxalat (COO^–)₂ < Iodid < Nitrat (NO₃^–) <

Phosphat < Bromid < Nitrit (NO₂^–) < Chlorid <Acetat < Hydroxid

MP: Wasser, Puffer (gewisser pH-Werte einstellen) Leitfähigkeitsdetektor mit Supressionsäulen

Ionenpaar-Chromatographie

Um die organische grösse Ionen zu Trennen:

ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente wird der mobilen Phase zugesetzt, um neutral Ionenpaar zu bilden, dann kann man die Umkehrphasen-Säule benutzen.

$ das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben

$ das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben

14.11.2007 AC – BPBS HS07 25

Trennung – Nucleotidegemisch

Mixture of nucleotides resolved by IPC Mixture of biogenic amines:

1. Adrenaline 2. Dopamine 3. Tyramine 4. Tryptamine

Buffer: 0.005 M heptanesulfonic acid sodium/0.01 M phosphoric acid pH 2.4 Weigh-in: ~ 2 mg in 10 ml

acetonitrile/phosphoric acid (0.01 M) 1:9;

Injection volume: 20 µl

Detection: 220 nm; Temperature: ambient DiscoveryTM C18 (RP): 250/4.0 mm, ID 5 µm

Eluent: acetonitrile, Flow: 1.5 ml/min, gradient:

t=0 min : 6%, t=5 min : 6%, t=18 min : 25%

Heptanesulfonic acid

Ionenausschluss

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Vorteile der Ionenchromatographie

$ Schnelligkeit

für Analyse der wichtigsten 7 anorganischen Anionen benötigt man heute nur noch 3 Minuten – Bruchteil der Zeit, die für traditionelle nasschemische Methoden aufgewendet werden muss

$ Empfindlichkeit

Nachweis von Konzentrationen im mittleren und unteren ppb-Bereich ohne Voranreicherung routinemäßig (Absolutmengen im untersten ng-Bereich), bei Aufkonzentrierung können NWG bis auf 10 ppt gesenkt werden

$ Selektivität

erreichbar durch Auswahl geeigneter Trenn-und Detektionssysteme.

Probenvorbereitung besteht oft nur aus Verdünnung und Membranfiltration der Proben

$ Simultane Bestimmungen

werden durch Vorliegen extremer Konzentrationsverhältnisse begrenzt

$ Stabilität der Trennsäulen

hohe pH-Stabilität der verwendeten Polymere, vertragen auch verdünnte Säuren und Basen, sind aber gegenüber organischen Lösungsmitteln empfindlich; hohe Unempfindlichkeit gegenüber komplexen Matrices

Gelpermeationschromatographie

Grössenausschluss-Chromatographie/Size Exclusion Chromatography Mechanismus: Grösse / Molekularer Radius

SP:

5 – 100,000 nm Ausschluss-Limit Eindringen-Limit Geeignet für

10% Unterschied in MW Kein Wechselwirkung Biopolymer, Polymer Organische Moleküle

14.11.2007 AC – BPBS HS07 29

Größenausschlusschromatographie

t

" 1 log

MW

CH₃(CH₂)_nCOOH

14.11.2007 AC – BPBS HS07 31

Dünnschichtchromatographie (HPTLC)

DC-laufmitteltest Wahl der DC Platte

Probeauftragen Laufmitteltest

Entwicklung Detektion

Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C 18-50 (50% silanization) and C 18-100 (100% silanization) with fluorescent indicator

Entwicklung der DC

Laufmittel

Wahl des Laufmittels (Rein oder Gemisch) Entwicklung

14.11.2007 AC – BPBS HS07 33

Selektivität und Trennleistung

!

R

= S

S

Detektoren für HPLC

• Brechungsindex-Detektor (RID)

• UV/Vis-Absorption-Detektor (UVD)

• Lichtstreudetektor (ELSD)

• Fluoreszenzdetektor

• Elektrische Leitfähigkeitsdetektor (für Ionen)

• Massenspektrometrie (MS): molekulare Information

• IR, NMR

$ Nachweisgrenze

$ Linearer Messbereich

$ Kompatibilität mit der mobilen Phase

$ Selektivität

$ Flexibilität, Robustheit, Preis

14.11.2007 AC – BPBS HS07 35

Brechungsindex-Detektor

refractive index detectors, RID

Universell, aber geringe Empfindlichkeit wegen kleiner RID-Unterschied von LM und Analytenmolekülen

Verdampfungs-Lichtstreudetektor ELSD

EBULIZE ELUENT AND SELECT SMALL

DROPLETS TO MINIMIZE BACKGROUND NOISE

EVAPORATE AT LOW TEMPERATURE

DETECT LIGHT SCATTERING

Universell einsetzbarer Detektor, wenn

• Analytmolekül keine UV-Absorbtion

• Mit einem Brechungsindex-Detektor nicht detektierbar

• Eine Gradientenelution anstatt

isokratischen Laufmittel Partikelgrösse und -anzahl

Partikelgrösse und -anzahl

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Beispiel mit ELSD als Detektor

RP–Säule:

a hydrophobic chain and an acidic functional group as a cation exchanger

UV/vis-Detektor

Variiert ! oder PDA (Photodiodenarray) um ein ganzes UV- Spektrum aufzu- nehmen

Br, I, S Carbonyl Konjugierte Aromatische

14.11.2007 AC – BPBS HS07 39

Fluoreszenzdetekor

Nachweisgrenze +++

Linearbereich +++

Nur einsetzbar für:

• Nativ

fluoreszierenden Substanzen

• Nach derivati- sierung nicht- fluoreszierender Analyten mit einem Fluoreszenz-

marker

Massenspektrometrische Detektor

Interface – LC und MS

Senkrecht

Off-linear räumlich

zeitlich

14.11.2007 AC – BPBS HS07 41

Leitfähigkeitsdetektor

• Universell für Ionenchromatographie

• Grundleitfähigkeit des Eluenten wird durch Suppressortechnik erniederigt, um die Nachweisgrenzen zu senken.

!

" = "

# $ % C

Harz-NR₃OH + H⁺ + Cl^– ––> Harz-Cl + H₂O Harz-SO₃H + Na⁺ + HCO₃^– ––> Harz-Na + H₂CO₃

Für Kationenanalytik, Suppressorsäule mit OH^– beladen : Für Aionenanalytik, Suppressorsäule mit Protonen beladen:

Harz-SO₃H + Na⁺ + Cl^– ––> Harz-Na + H⁺+ Cl^– Harz-SO₃H + Na⁺ + Br^– ––> Harz-Na + H⁺+ Br^–

Suppressor

Suppressor

Harz-SO₃H + Na⁺ + HCO₃^– ––> Harz-Na + H₂CO₃ Harz-SO₃H + Na⁺ + Cl^– ––> Harz-Na + H⁺ + Cl^– Harz-SO₃H + Na⁺ + Br^– ––> Harz-Na + H⁺ + Br^–

Grundleitigkeit zu erniedrigen Analyt-signal zu verstärken

" (H⁺) = 350

" (Na⁺) = 50

Beispiel von Cl^– and Br^–

14.11.2007 AC – BPBS HS07 43

Charakteristika der Detektoren

Detektor Nachweisgrenze Linearer Bereich

Spezielle Eigenschaften des Analytmoleküls oder Bulk-Eigenschaften von Analytmolekül und Lösungsmittel: Nachweisgrenze, Linearer Messbereich, Kompatibität mit MP, Selektivität, Flexibilität und Robustheit, Preis.

10⁵ 10^–12 – 10^–15 g

ICP-MS

10³ 10^–9 – 10^–12 g

AAS

10⁵ 10^–7 – 10^–9 g

MS

10⁵ 10^–8 g.mL^–1

Leitfähigkeit

10⁵ 10^–14 g

Fluoreszenz

10⁴ 10^–11 g

UV/Vis

Trennstrategie (1)

$ Polarität

$ Löslichkeit

$ Ionenisch

$ Molekulare Masse

Auswahl: Flüssig- chromatographie

NP RP

Ausschluss

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Trennstrategie (2)

• Auswahl: Gradient-Elution

• Derivatisierung:

Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )

Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer

• Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP

Derivatisierungsreagenzien

Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der HPLC:

Funktionelle Gruppe Derivatisierungsreagenz

-NH₂ (Amine, Aminosäuren) 5-(N,N-Dimethylamino)- naphthalin-1-sulphonylchlorid 2,4-dinitrofluorbenzol

-OH (Alkohole) 3,5-Dinitrobenzochlorid Silylierungsreagenzien

-CHO (Aldehyde) 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) -C(O)R (Ketone) 4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan -COOH (Säuren) 4-Brommethyl-7-methoxycoumarin

-SH (Thiole) Dansylaziridin

14.11.2007 AC – BPBS HS07 47

Einfluss der Eluentenpolarität

Complex Mixture of Acids, Bases, Amino Acids, and Neutral Compounds RP/IC Säule