der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Molekulargenetische Untersuchungen zur kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Jens Tetens
aus Heide
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Dr. Cord Drögemüller
1. Gutachter: Dr. Cord Drögemüller
2. Gutachter: Prof. Michael H. Boevé, PhD
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2006
Diese Arbeit wurde gefördert von der H. Wilhelm Schaumann Stiftung, Hamburg.
Martina und meinen Eltern
gewidmet.
1. Einführung... 11
2. Literaturübersicht... 12
2.1. Augenentwicklung bei Vertebraten... 12
2.1.1. Embryologische Grundlagen... 12
2.1.2. Genetische Aspekte der Augenentwicklung und von Augenmissbildungen ... 16
2.2. Mikrophthalmie... 21
2.1.2. Definition und Vorkommen ... 21
2.1.2. Die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes ... 24
2.3. Genomkartierung... 26
2.3.1. Genetische Kartierung... 27
2.3.2. Physikalische Kartierung... 28
2.3.3. Vergleichende Genomkartierung ... 31
2.4. Stand der Genomanalyse beim Schaf... 32
2.4.1. Genomkartierung beim Schaf... 32
2.4.2. Molekulare Aufklärung hereditärer Merkmale ... 34
2.5. Schlussfolgerungen ... 38
3. Material und Methoden... 39
3.1 Material ... 39
3.1.1. Tiere und Probenmaterial ... 39
3.1.1.1. Beschaffung des Probenmaterials ... 39
3.1.1.2. Einteilung der Familien für die Kopplungsstudie ... 39
3.1.1.3. Durchführung des Zuchtversuches... 43
3.1.2. Oligonukleotide, Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Glaswaren... 46
3.1.2.1. Oligonukleotide... 46
3.1.2.2. Chemikalien ... 46
3.1.2.3. Verbrauchsmaterialien und Glaswaren ... 46
3.1.3. Laborgeräte... 47
3.2. Methoden... 49
3.2.1. Versuchsstrategie ... 49
3.2.1.1. Kopplungsanalyse ... 49
3.2.2.1. Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut... 52
3.1.2.2. Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 52
3.1.2.3. Polyacrylamidgelelektrophorese ... 53
3.1.2.3.1. Mikrosatellitengele... 53
3.1.2.3.1. Auswertung der Mikrosatellitengele ... 55
3.1.2.3. Agarosegelelektrophorese ... 55
3.2.3. Statistische Methoden und Computeranalysen ... 56
3.2.3.1. Abstammungskontrolle, Qualitätskontrolle der Genotypisierungsdaten und Pedigree-Analyse ... 56
3.2.3.2. Auswertung der Markereigenschaften ... 57
3.2.3.3. Kopplungs- und Haplotypenanlyse ... 57
3.2.3.4. Sequenzvergleich und Primerdesign ... 58
3.2.3.4. Radiation Hybrid Mapping... 58
3.2.4. Klinische Untersuchungen ... 59
3.2.5. Pathologisch-anatomische und pathologisch-histologische Untersuchungen... 60
4. Ergebnisse ... 61
4.1. Klinische Untersuchungen ... 61
4.2. Pathologische und pathologisch-histologische Untersuchungen ... 63
4.3. Kopplungsanalyse ... 68
4.3.1. Markerstatistik... 68
4.3.2. Nicht-parametrische Kopplungsanalyse... 68
4.3.2.1. Analyse mit einem initialen Markerset ... 68
4.3.2.2. Analyse mit einem erweiterten Markerset ... 68
4.3.3. Parametrische Kopplungsanalyse für Chromosom 23 ... 72
4.3.4. Haplotypenanalyse ... 74
4.4. Radiation- Hybrid Mapping ... 76
4.4.1. Markerentwicklung ... 76
4.4.2. Zweipunktanalyse... 80
4.4.3. Erstellung der RH-Karte... 80
5.1. Zuchtversuch ... 84
5.2. Klinische und pathologische Untersuchungen ... 85
5.3. Kopplungs- und Haplotypenanalyse ... 86
5.4. RH-Kartierung... 91
6. Zusammenfassung... 98
7. Summary... 99
8. Literaturverzeichnis... 100
9. Anhang ... 129
Anhang 1: In der Kopplungsanalyse eingesetzte Marker.. ... 129
Anhang 2: Anzahl der Allele, Allelgrößen, PIC und Allelfrequenzen der in der Kopplungsanalyse eingesetzten Marker... 132
Anhang 3: Am Familienmaterial getestete Rindermikrosatelliten von BTA24... 136
Anhang 4: Stammbäume der 28 Familien sowie Haplotypen für OAR23 ... 137
Anhang 5: In der RH-Kartierung eingesetzte STS- und EST- Marker.. ... 166
Anhang 6: Detaillierte Befunde der pathologisch-anatomischen und pathologisch- histologischen Untersuchungen am Institut für Pathologie... 167
A Adenin Abb. Abbildung ad. adult
APS Ammoniumperoxidsulfat Aqua bidest. Aqua bidestilata, doppelt destilliert BAC bacterial artificial chromosome BES BAC-Endsequenz BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp base pairs (Basenpaare)
BTA Rinderchromosom, Chromosom von Bos taurus bzw. beziehungsweise
C Cytidin ca. circa
cDNA copyDNA (durch reverse Transkriptase aus mRNA erzeugt) CHI Ziegenchromosom, Chromosom von Capra hircus
cM Centimorgan cm Zentimeter cR Centiray
D genetische Distanz
d.h. das heißt
Diss. Dissertation DMSO Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraacetat
EST expressed sequence tag et al. et alii
E-Wert Erwartungswert, Expectation value FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung G Guanidin
g Gramm h Stunde HCl Salzsäure
HLOD Heterogeneity LOD IBD identical by descent
IMF International Mapping Flock der AGResearch, Neuseeland INRA Institut National de la Recherche Agronomique
juv. juvenil Kap. Kapitel kb Kilobasen kg Kilogramm KG Körpergewicht l Liter
ln natürlicher Logarithmus
LOD Logarithm logarithm of the odds
log dekadischer Logarithmus
M Molar (mol / l)
mA Milliampére
MARC Meat Animal Research Center des USDA Mb Megabasen
min Minute ml Milliliter mM Millimolar (mmol / l)
mRNA messenger-RNA
MS Mikrosatellit µl Mikroliter
NCBI National Center for Biotechnology Information nm Nanometer
OAR Schafchromosom, Chromosom von Ovis aries OMIA Online Mendelian Inheritance in Animals
PAA Polyacrylamid
PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) pg Pikogramm
PIC polymorphism information content Prnp Prionprotein
RFLP Resriktionsfragmentlängen-Polymorphismus
s Sekunde s. siehe
skFS Schwarzköpfiges Fleischschaf
SNP single nucleotide polymorphism
sOMS Schwarzes Ostfriesisches Milchschaf SSCP single strand conformation polymorphism
STS sequence tagged site T Thymidin Tab. Tabelle
TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TEMED N,N,N,N-Tetramethylendiamin TRIS Aminohydroxymethylpropandiol TSP-Units ,Travelling Salesman Problem´ - Units
θ Rekombinationsfrequenz oder Bruchfrequenz U Units (Enzymeinheiten)
USDA United States Department for Agriculture UV-Licht ultraviolettes Licht
V Volt
v/v Volumen zu Volumen
W Watt
w/v Gewicht zu Volumen
z.B. zum Beispiel
1. Einführung
Seit der Einfuhr von Schafen der Rasse Texel aus den Niederlanden nach Deutschland in den 1960er Jahren sind in verschiedenen Zuchtgebieten immer wieder Lämmer mit bilateraler Mikrophthalmie ohne weitere Missbildungen geboren worden (HARING und GRUHN 1970).
Bereits Ende der 1950er Jahre war der Defekt in den Niederlanden und Frankreich beschrieben worden (DE GROOT 1957; ZWIEP 1958; HANSET 1961). Im Jahre 2003 wurde das Auftreten erstmals für Neuseeland beschrieben (ROE et al. 2003).
Die betroffenen Lämmer sind hilflos und finden in der Herde ihre Mutter nicht. Sie bedürfen zu ihrer Erhaltung bis zum schlachtreifen Alter der besonderen individuellen Pflege und Betreuung, welche ihnen aber in der Praxis von großen Schäfereien in der Regel nicht zuteil werden kann. Daher müssen sie im Allgemeinen den Lämmerverlusten zugerechnet werden.
Bisherige Untersuchungen zur kongenitalen Mikropthalmie des Texelschafes beschäftigen sich hauptsächlich mit morphologischen Aspekten (LABS 1977; VAN DER LINDE SIPMAN et al. 2003). Genetische Untersuchungen konnten einen monogen autosomal rezessiven Erbgang zeigen (HARING und GRUHN 1970).
Im Jahr 2000 wurden allein in Deutschland mehr als 230.000 Texelmutterschafe gehalten. Die Gründe dafür sind die gute Fleischleistung und die Eignung zur Koppelschafhaltung. Dadurch wird das Texelschaf zum einen der stärkeren Fokussierung auf die Schlachtlammerzeugung und zum anderen der heute üblichen Koppelhaltung gerecht (SÜSS 2001). Der zunehmende Anteil an Texelschafen sowie die Einkreuzung von Texelschafen in andere Rassen hat zur Verbreitung der Mikrophthalmie beigetragen. In Deutschland werden keine systematischen Daten zum Auftreten von angeborenen Anomalien beim Schaf erfasst. In der niederländischen Zuchtpopulation wird jedoch von einer Häufigkeit von 10% unerkannten Anlageträgern aus- gegangen. Eine ungezielte Anpaarung dieser heterozygoten Elterntiere erklärt das nach wie vor relativ häufige Auftreten des Defekts. Für eine effektive Bekämpfung der Mikrophthalmie ist der Zuchtausschluss von Anlageträgern notwendig. Das würde bedeuten, die Eltern betrof- fener Lämmer sowie all deren Nachkommen von der Zucht auszuschließen, was in der Praxis jedoch nicht durchgeführt wird. Um Anlageträger zukünftig ohne einen zeitaufwändigen Nachkommentest zu identifizieren, soll ein gendiagnostisches Verfahren entwickelt werden.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung der chromosomalen Lokalisation des für die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes verantwortlichen Defektgens mit einer anschließenden Feinkartierung im Schafgenom.
2. Literaturübersicht
2.1. Augenentwicklung bei Vertebraten 2.1.1. Embryologische Grundlagen
Die verschiedenen Anteile des Auges und seiner Hilfsorgane entstammen unterschiedlichen Keimblättern. Während die Retina, der Nervus opticus und der größte Teil des Glaskörpers Derivate des Neuroektoderms sind, bilden sich Linse, Hornhautepithel, Liddrüsen und Tränenapparat aus dem Oberflächenektoderm. Alle übrigen Strukturen des Auges entwickeln sich aus dem Mesoderm. Dazu gehören die Sklera, die Choroidea, das Stroma des Ziliarkörpers und der Musculus ciliaris (SCHNORR und KRESSIN 2001).
Während der Phase der Gastrulation wird die Augenanlage vom unpaaren Augenfeld gebildet.
Dieses liegt median am vorderen Ende der Neuralplatte. Die unpaare Anlage teilt sich und die getrennten Augenanlagen erfahren eine Lateralisation (GRAW 2003).
Das erste morphologische Zeichen der Augenentwicklung im Stadium der frühen Neurula ist dann die Ausbildung der Augengruben, die sich schließlich durch Ausstülpung des Diencephalons zu den Augenblasen entwickeln (CHOW und LANG 2001). Die Augenblasen wachsen durch das Mesenchym hindurch auf das Oberflächenektoderm zu. Dabei setzen sie sich durch den Augenblasenstiel immer weiter vom Zwischenhirn ab (SCHNORR und KRESSIN 2001). Die Augenblase tritt schließlich unter Verdrängung des Mesenchyms mit dem sich dabei zur Linsenplakode verdickenden Oberflächenepithel in Kontakt.
Morphologisches Äquivalent der an diesem entscheidenden Punkt der Augenentwicklung ablaufenden Induktionsvorgänge ist der enge Kontakt zwischen Augenblase und Linsenplakode, die durch ein Netzwerk von zahlreichen Kollagenfibrillen und Zytoplasma- fortsätzen miteinander in Verbindung treten (MCAVOY 1980).
Mit der Verdickung des Oberflächenektoderms zur Linsenplakode beginnt die Entwicklung der Linse. Auf molekularer Ebene ist dies gekennzeichnet durch den Beginn der Crystallin- Expression (GRAW 1996, 1997, 2004; BHAT 2003). Als Ergebnis der Interaktionen zwischen Linsenplakode und Augenblase stülpt sich die Linsenplakode zur Linsengrube und zum Linsenbecher ein und schnürt sich schließlich als Linsenbläschen vollständig vom Oberflächenektoderm ab. Dabei wird die Augenblase zum doppelwandigen Augenbecher eingestülpt (SCHNORR und KRESSIN 2001).
Gleichzeitig mit dem Umformungsprozess zum Augenbecher wird dessen unterer mittlerer Rand zur Becherspalte eingestülpt, die sich als Stielrinne auf den Augenbecherstiel fortsetzt.
Gemeinsam stellen sie die fetale Augenspalte oder optische Fissur dar, in welche die Arteria hyaloidea einwächst. Die Ränder der Augenspalte vereinigen sich miteinander, so dass der Augenbecherstiel zu einem doppelwandigen Rohr wird, in dem die Arteria hyaloidea verläuft.
Gleichzeitig rundet sich die Öffnung des Augenbechers ab und bildet die vorläufige Pupille (CHOW und LANG 2001; SCHNORR und KRESSIN 2001). Ein unvollständiger Schluss der fetalen Augenspalte ist die embryologische Grundlage kongenitaler Kolobomata (ONWOCHEI et al. 2000; LEVIN 2003; GREGORY-EVANS et al. 2004).
In der weiteren Entwicklung der Linse beginnen die Zellen der retinaseitigen Wand des Linsenbläschens in die Länge zu wachsen und primäre Linsenfasern zu bilden. Dabei schwindet der flüssigkeitsgefüllte Hohlraum und die Linse wird zu einem soliden Gebilde.
Die Zellen der anterioren Seite bleiben ein Leben lang als Linsenepithel erhalten. Mitotisch aktive Zellen des Linsenepithels wachsen im Bereich des Linsenäquators in die Länge und differenzieren sich zu sekundären Linsenfasern. Das ist ein Prozess, der sich lebenslang fortsetzt (RÜSSE und SINOWATZ 1991).
Das innere Blatt der Augenbecherwandung entwickelt sich zur Neuroretina, während das äußere Blatt sich zum Pigmentepithel weiterentwickelt (SCHNORR und KRESSIN 2001).
Das vordere Fünftel des Augenbechers entwickelt sich zur Pars caeca retinae, während der hintere Teil sich zur Pars optica retinae differenziert. Im vorderen Teil bleiben beide Blätter einschichtig. Die beiden Blätter verwachsen miteinander und überziehen als Pars ciliaris retinae bzw. Pars iridica retinae den Ziliarkörper und die Iris. Am Pupillenrand gehen beide Blätter ineinander über. Im Bereich der Pars optica retinae bleibt das äußere Blatt einschichtig und entwickelt sich zum Pigmentepithel (Stratum pigmentosum). Das innere Blatt bildet die vielschichtige Neuroretina (Stratum nervosum). Diese Entwicklung beginnt mit der Bildung einer Neuroepithelschicht, aus der die Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und die so genannte Mantelschicht hervorgehen. Die Mantelschicht differenziert sich zu den übrigen Anteilen der Neuroretina (Ganglienzellen, bipolare Zellen, amakrine Zellen, Horizontalzellen, Stützzellen) (SCHNORR und KRESSIN 2001).
Die Neuriten der Ganglienzellen der Netzhaut wachsen im Bereich des späteren Sehnervenkopfes in den Augenbecherstiel ein. Dieser dient den auf das Gehirn zuwachsenden Neuriten als Leitstruktur und aus seinen Epithelzellen gehen die Gliazellen des Nervus opticus hervor (SCHNORR und KRESSIN 2001; GRAW 2003).
Zeitgleich mit der Entwicklung von Retina und Linse kommt es auch zur Bildung des Glaskörpers. Er entwickelt sich aus Mesenchymzellen, die mit der Arteria hyaloidea in den Augenbecher eingewandert sind und aus Gliazellen der Retina (Müller´sche Stützzellen).
Bereits vor dem Schluss der Augenspalte beginnen diese mit der Bildung von radiären Fasern, die bis an die Hinterseite der Linse reichen. Diese Fasern liefern die Grundlage des primitiven Glaskörpers. Später bilden sie Querverzweigungen, wodurch das Grundgerüst des definitiven Glaskörpers gebildet wird. In den Maschen dieses Netzwerkes lagert sich eine extrazelluläre Matrix ein, die reich an Glykosaminoglykanen, insbesondere Hyaluronsäure, ist. Die Arteria hyaloidea, welche im Wesentlichen für die Versorgung der Linse zuständig ist, durchquert anfangs noch innerhalb eines Kanals (Canalis hyaloideus) den Glaskörper. Gegen Ende der Gravidität obliteriert sie und der Canalis hyaloideus wird vom Glaskörper ausgefüllt (RÜSSE und SINOWATZ 1991; SCHNORR und KRESSIN 2001).
Die Entwicklung der Kornea und der vorderen Augenkammer erfolgt gemeinsam. Die Bildung der Kornea aus dem Oberflächenektoderm sowie aus dem umgebenden Mesenchym, das der Neuralleiste entstammt, ist ein mehrstufiger Prozess, in dem das Linsenbläschen die Bildung des Korneaepithels aus dem über ihm liegenden Ektoderm induziert (HAY 1979;
CHOW und LANG 2001). Das Corneaepithel besteht aus ein bis zwei Zelllagen, die einer Basalmembran (Bowman´sche Membran) aufsitzen (GOULD et al. 2004). Die Epithelzellen sezernieren eine kollagenreiche extrazelluläre Matrix. Später kommt es zur Einwanderung von Mesenchymzellen aus dem periokulären Gewebe. Diese Migration erfolgt in zwei Wellen (CHOW und LANG 2001; GRAW 2003). Die während der ersten Welle einwandernden Mesenchymzellen formieren sich zum Korneaendothel, das ebenfalls einer Basalmembran (Descemet´sche Membran) aufliegt. Die während der zweiten Migrationswelle einwandernden Zellen differenzieren sich zu Keratinozyten. Sie sezernieren Kollagen Typ I und Hyaluronidase, was zur Schrumpfung des umgebenden Stromas führt. Unter dem Einfluss eines erhöhten Thyroxinspiegels aus der sich entwickelnden Schilddrüse kommt es parallel zur Dehydratation des Stromas. So entwickelt sich aus der kollagenreichen extrazellulären Matrix, die einerseits von den Zellen des Korneaepithels und andererseits von den Keratinozyten produziert wurde, die transparente Kornea (GRAW 2003).
Nach der Formierung des Korneaendothels kommt es zwischen Kornea und Linse zur Bildung eines Spaltes, der die Anlage der vorderen Augenkammer darstellt (GOULD et al. 2004). Die Entwicklung eines funktionellen Endothels scheint eine Grundvoraussetzung für die Bildung der vorderen Augenkammer zu sein (KIDSON et al. 1999; RENEKER et al. 2000).
Das hinter der vorderen Augenkammer am Frontalpol der sich entwickelnden Linse liegende Mesenchym entwickelt sich peripher zum Irisstroma, während es zentral die Membrana pupillaris bildet. Diese Membran enthält zahlreiche Blutgefäße, die der Versorgung der gefäßlosen Linse dienen. Diese Gefäße stehen in Verbindung mit dem aus der Arteria hyaloidea kommenden Gefäßsystem der Tunica vasculosa lentis (CRISPIN 2000). Im letzten Drittel der Gravidität atrophieren die Blutgefäße. Die Tunica vasculosa lentis und die Membrana pupillaris verschwinden (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Eine ungenügende Rückbildung wird als Membrana pupillaris persistens bezeichnet (JACOBS et al. 1991;
CRISPIN 2000; LEVIN 2003). Der periphere Bereich der Membrana pupillaris entwickelt sich zum Irisstroma. Dieses verbindet sich mit dem vorderen Rand des zweischichtigen Augenbechers (Pars iridica retinae) zur Iris. Nach Auflösung der Membrana pupillaris stehen vordere und hintere Augenkammer miteinander in Verbindung und die definitive Pupille ist entstanden (SCHNORR und KRESSIN 2001).
Das dem Augenbecher außen direkt anliegende Mesenchym differenziert sich innen zur Aderhaut (Choroidea) und verdichtet sich außen zur faserreichen Sklera. Außerdem stellt das Mesenchym die Grundlage für die Ziliarfortsätze und den Musculus ciliaris dar. Zusammen mit der Pars ciliaris retinae wird so der Ziliarkörper gebildet (SCHNORR und KRESSIN 2001).
Über die zeitliche Abfolge der Ereignisse während der Augenentwicklung gibt es insbesondere für den Menschen und die Maus detaillierte Angaben (CVEKL und PIATIGORSKY 1996; GRAW 2004). Abbildung 2-1 zeigt den zeitlichen Verlauf der wichtigsten Ereignisse der Augenentwicklung am Beispiel der Maus.
Diesbezügliche Angaben sind für das Schaf nur begrenzt verfügbar. Die Augenblase ist beim Schaf am 19. Tag der Gravidität entwickelt und am Tag 21 ist die Linsenplakode aus- zumachen. Der Augenbecher entwickelt sich zwischen dem 24. und 25. Tag (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Am Tag 24 ist erkennbar, dass sich das Linsenbläschen vom Ober- flächenektoderm separiert hat und zwei Tage später ist es bereits teilweise mit primären Linsenfasern angefüllt und die vordere Augenkammer beginnt sich zu entwickeln (VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003).
Abbildung 2-1: Ablauf der grundlegenden Prozesse der Augenentwicklung am Beispiel der aus (modifiziert nach CVEKL und PIATIGORSKY 1996)
iert und desto schwerwiegender sind in der Regel die Defekte, die M
2.1.2. Genetische Aspekte der Augenentwicklung und von Augenmissbildungen
Man kennt heute eine Vielzahl von Genen der Augenentwicklung und auch viele okuläre Phänotypen, die durch Mutationen in diesen Genen hervorgerufen werden. Je weiter oben Gene in der Hierarchie der Augenentwicklung liegen, desto früher in der Augenentwicklung werden sie exprim
Mutationen in diesen Genen hervorrufen können. Die bisher identifizierten Gene, die am Anfang der Entwicklungskaskade stehen und grundlegende Prozesse der Augenentwicklung in Gang setzten sowie weitere Gene, für die ein Mikrophthalmie-Phänotyp bei Mensch oder Maus bekannt ist, werden im Folgenden dargestellt (Tab. 2-1). Unter den in Tabelle 2-1 aufgeführten Genen sind zahlreiche, die als ursächlich für Mikrophthalmie-Phänotypen identifiziert wurden. Bislang sind jedoch lediglich fünf dieser Gene (CHX10, SHH, SOX2, RAX, MFRP) mit kausalen Mutationen für die isolierte nicht syndromische bilaterale
en, jedoch sind die ursächlichen Genveränderungen derzeit noch unbekannt.
rosophila stellt einen Schlüsselorganismus dar, anhand dessen viele Zusammenhänge der Augenentwicklung bei Vertebraten aufgeklärt werden konnten. Man kennt sieben grundlegende Kontrollgene der Augenentwicklung bei Drosophila: twin of eyeless (toy), eyless (ey), eyes absent (eya), sine oculis ( o), optix (opt), eye gone (eyg) und dachshund (dac) (BONINI et al. 1993; CHEYETTE et al. 1994; MARDON et al. 1994; QUIRING et al.
1994; SERIKAKU und O´TOUSA 1994; HALDER et al. 1998; CZERNY et al. 1999;
SEIMIYA und GEHRING 2000). Eine Null-Mutation in einem dieser Gene resultiert in einem Fehlen der Augen oder zumindest einer drastischen Reduktion des Auges (KUMAR 2001). Im Gegenzug sind diese Gene mit Ausnahme von sine oculis in der Lage, die ektopische Bildung okulärer Strukturen zu
MARDON 1997; CZERNY et al. 1999; S MOSES 2001).
Das Studium dieser so genannten Kerng Zusammenwirken in der Augenentwickl Entwicklungsbiologie geliefert. Wenngleich
trukturiert ist, folgen sie keiner einfachen linearen Hierarchie (Abb. 2-2). Vielmehr handelt s sich um ein dichtes Netzwerk von regulatorischen Interaktionen, in dem neben diesen Mikrophthalmie aufgeklärt worden. Für die beiden Phänotypen NNO1 (OTHMAN et al.
1998) und MCOP (BESSANT et al. 1999) sowie einen weiteren, noch unbenannten Phänotyp (MICHON et al. 2004) konnte bislang eine Kopplung zu bestimmten Chromsomenabschnitten identifiziert werd
Gene, die mittels der von ihnen in der Regel codierten Transkriptionsfaktoren eine Reihe ihnen hierarchisch untergeordneter Gene unter Kontrolle halten und dadurch grundlegende Mechanismen der Entwicklung kontrollieren, werden als so genannte Master-Kontrollgene bezeichnet. Andere entwicklungssteuernde Gene codieren für Signalmoleküle, Rezeptoren, Elemente der Signaltransduktion oder extrazelluläre Enzyme (MÜLLER und HASSEL 1999;
GRAW 2003).
D
s
induzieren (HALDER et al. 1995; SHEN und EIMIYA und GEHRING 2000; KUMAR und ene hat grundlegende Erkenntnisse über ihr ung und über grundlegende Prinzipien der
das Zusammenspiel dieser Gene hierarchisch s
e
sieben zentralen Genen noch zahlreiche andere Faktoren eine Rolle spielen (HANSON 2001;
KUMAR 2001).
Abbildung 2-2: Genetische Steuerung der Augenentwicklung: grundlegende Wechsel- wirkungen zwischen den sieben so genannten Kerngenen der Augenentwicklung bei Droso- phila. (modifiziert nach TREISMAN 1999 und KUMAR 2001).
rm Pax6(5a) ähnelt (DOMINGUEZ et al. 2004). Es konnte gezeigt
nd Sowohl für die oben genannten Gene als auch für weitere bei Drosophila identifizierte Gene der Augenentwicklung existieren orthologe Gene in Wirbeltieren. Von den sieben Kerngenen bei Drosophila sind die beiden paralogen Gene eyeless und twin of eyeless dem PAX6 des Menschen ortholog, wobei twin of eyeless in der Hierarchie der Augenentwicklung bei Drosophila noch oberhalb von eyless steht (QUIRING et al. 1994; CZERNY et al. 1999). Ein orthologes Gen von eye gone, das synergistisch mit eyeless wirkt, ist bei Wirbeltieren nicht bekannt (JANG et al. 2003). Es codiert jedoch ein PAX-ähnliches Protein, das in seiner Struktur der Pax6-Isofo
werden, dass Mäuse, die zwar Pax6 aber kein Pax(5a) exprimieren können, Irishypoplasie und Defekte an Kornea, Retina und Linse zeigen (SINGH et al. 2001). Die Gene sine oculis und optix codieren Transkriptionsfaktoren, die neben eine DNA bindenden Homöobox- Domäne eine proteinbindende so genannte sine oculis-Domäne enthalten. Bei Wirbeltieren hat man die sechs orthologen Gene SIX1-6 (sine oculis homeobox homolog 1-6) identifiziert.
Von diesen sechs Genen hat SIX3 die größte Ähnlichkeit zu sine oculis, während SIX6 (Optx2) die größte Ähnlichkeit mit optix aufweist. Beide Wirbeltiergene spielen eine wichtige Rolle in der Augenentwicklung (SEO et al. 1999; KENYON et al. 2005). Die drei während der Embryonalentwicklung bei Wirbeltieren in unterschiedlichen okulären Strukturen exprimierten Gene EYA1-3 stellen Orthologe des Drosophila-Gens eyes absent dar, währe
ACH1 bei Wirbeltieren ortholog zu dachshund bei Drosophila ist (BONINI et al. 1997;
funktions-
f zus e ekt kann bei Drosophila durch das murine
P duz we Gene haben also die gleiche Funktion: sie initiieren die
A ntw ng
(HALDER et al. 19 e Entwicklung der
Facettenaugen von gleiche orthologe
Evolution des Auges geführt (GEHRING 2002, 2005), die jedoch kontrovers diskutiert wird
( Y e 200
Phänotypen bei Mensch und Maus, die auf Mutationen im PAX6
G ruhe e ner heterozygoten Null-Mutation führt bei
small eye sen Haploinsuffizienz d
d fe ist
H NG nd
http://pax6.hgu.mrc
zentrale Rolle, -Mutationen neben Anophthalmie auch zu Nasenmissbildunge
( l 1; G
Tabelle 2-1: Gene
m pr e, d
(modifiziert nach W
2)
D
TREISMAN 1999).
PAX6 ist der Prototyp des Master-Kontrollgens der Augenentwicklung. Es konnte gezeigt werden, dass die ektopische Expression von eyeless in Drosophila zur Bildung
ähiger ätzlich r Augen führt. Der gleiche Eff ax6 in iert rden. Beide
ugene icklu und starten damit eine Kaskade, an der ca. 2000 Gene beteiligt sind 95; GEHRING 2000). Die Beobachtung, dass sowohl di
Drosophila, als auch die Entwicklung des Wirbeltierauges durch das Gen induziert werden konnten, hat zur Theorie einer monophyletischen BAILE t al. 4).
Es gibt mehrere bekannte
en be n. Ein Haploinsuffizienz aufgrund ei
Mäu zu Mikrophthalmie (HILL et al. 1991). Beim Menschen ist PAX6 ie häufigste Ursache der erblich bedingten Aniridie. Das Erscheinungsbild ieses De ktes sehr variabel und schließt die so genannte Peters-Anomalie ein (VAN
EYNI EN u WILLIAMSON 2002; Human PAX 6 Allelic Variant Database Website:
.ac.uk/). PAX6 spielt auch bei der Entwicklung weiterer Organe eine da homozygote Null
n sowie Hirn- und Pankreasmissbildungen führen und perinatal letal sind HILL et a . 199 LASER et al. 1994; GRINDLEY et al. 1995; ST-ONGE et al. 1997).
für Transkriptionsfaktoren, Signalmoleküle sowie Linsen- und Trans- ge
embran otein ie bei kon nitalen Augenanomalien von Mensch und Maus beteiligt sind AWERSIK und MAAS 2000; KUMAR 2001; GRAW 2003).
Gen1) Fkt. Phänotypen / Bemerkungen PAX6 TF siehe Text
RAX TF Mensch: Anophthalmie / Mikrophthalmie bei Haploinsuffizienz (VORONINA et al. 2004)
Maus: Rezessive Anophthalmie (TUCKER et al. 2001)
Der Effekt tritt sehr früh auf; bereits die Bildung der Augenblase bleibt aus, was darauf hindeutet, dass Rax bei Wirbeltieren in der Hierarchie über Pax6 steht (MATHERS et al. 1997; ZHANG et al. 2000; BAILEY et al. 2004).
SOX2 TF Mensch: Anophthalmie / Mikrophthalmie (FANTES et al. 2003)
Tabelle 2-1: Fortse Gen1) Fkt.2)
tzung.
Phänotypen / Bemerkungen
SIX3 TF Mensch: Holoprosenzephalie bei Haploinsuffizienz, aber auch mildere Phänotypen mit Mikrophthalmie und Kolobomata (WALLIS et al. 1999) SIX6
(Optx2)
TF Mensch: Chromosomale Deletionen der Optx2-Region führen zu bilateraler Anophthalmie (GALLARDO et al. 1999, 2004).
EYA1 TF Mensch: branchio-oto-renales Syndrom bei Haploinsuffizienz
et al. 1997 XU et al. 1997).
DACH1 TF ei Drosophila neben
4). Die AVIS et al. 1999).
(ABDELHAK et al. 1997); auch andere Mutationen sind bekannt, die Katarakte und Missbildungen des vorderen Augensegmentes hervorrufen (AZUMA et al. 2000).
Auch EYA2 und EYA3 werden im Auge in Abhängigkeit von Pax6 exprimiert (BONINI
Null-Mutationen des dachshund-Gens (dac) führen b
anderen Mutationen zum Fehlen der Augen (MARDON et al. 199
Rolle des dachshund-Homologs Dach1 in der Augenentwicklung der Wirbeltiere ist unklar, wenngleich das Expressionsmuster eine Rolle in
legt (D der Augenentwicklung nahe
PITX2 TF Mensch: PITX2-Mutationen wurden im Zusammenhang mit des vorderen Augensegmentes (Axenfeld-
identifiziert (WALTER 2003).
verschiedenen Missbildungen Rieger-Syndrom, Irishypoplasie)
PITX3 TF Mensch: Katarakt und mesenchymale Dysgenesie des vorderen Augensegmentes (SEMINA et al. 1998)
Maus: Aphakie (SEMINA et al. 2000; RIEGER et al. 2001) Mensch
FOXC1 TF : Axenfeld-Rieger-Syndrom, Glaukom (MEARS et al. 1998;
NISHIMURA et al. 1998; SMITH et al. 2000)
FOXE3 TF Mensch: Defekte des vorderen Augensegmentes, Peters-Anomalie (SEMINA et al. 2001; ORMESTADT et al. 2002; LEHMANN et al.
2003)
Maus: Linsenmissbildungen in homozygoten Tieren (BLIXT et al. 2000) MAF TF Mensch: Katarakte, Mikrophthalmie, Kolobomata (JAMIESON et al.
2002; LYON et al. 2003)
Maus: Katarakt in heterozygoten Tieren; in homozygoten Tieren neben anderen Missbildunegn Mikrophthalmie und Katarakt (RING et al 2000);
Verschiedene Autoren konnten eine Beteiligung an der Regulation der Crystallin-Expression nachweisen (GRAW 2004).
CHX10 TF Mensch: Mikrophthalmie und Katarakt (PERCIN et al 2000; BAR- YOSEF et al. 2004)
Maus: Mikrophthalmie (BURMEISTER et al. 1996)
In homozygoten Knock-out Mäusen lassen sich noch in der adulten Retina Progenitorzellen nachweisen (DHOMEN et al. 2006).
MITF TF Mensch: Waardenburg-Syndrom (LALWANI et al. 1998; HERSHEY und FISHER 2005)
Maus: Mikrophthalmie (STEINGRIMSSON 1994)
VSX1 TF Mensch: Keratokonus und Korneadystrophie (HÉON et al. 2002)
OTX1 TF Maus: Augenmissbildungen in Knock-out-Mäusen (ACAMPORA et al.
1996; SIMEONE et al. 2002)
Tabelle 2-1: Fortsetzung.
Gen1) Fkt.2) Phänotypen / Bemerkungen
SHH SM Mensch: Holoprosenzephalie, Mikrophthalmie mit Kolobomata (SCHIMENTI et al. 2003)
Maus: Shh-knock-out-Mäuse zeigen schwere Entwicklungsdefekte inklusive Zyklopie (CHIANG et al. 1996).
ist anzunehmen, dass SHH sehr weit oben in der Hierarchie steht, n die Zyklopie resultiert aus dem Ausbleiben eines der frühesten er Augenentwicklung, nämlich der Zweiteilung des Es
den
Ereignisse in d Augenfeldes.
BMP4 SM Maus: Heterozygote Knock-out-Mäuse zeigen Anomalien des vorderen Augensegmentes; in homozygoten Tieren bleibt die Bildung der Linsenplakode aus (FURUTA und HOGAN 1998).
BMP7 SM Maus: Eine Deletion des Bmp7-Gens führt zu schweren renalen Missbildungen und Anophthalmie (DUDLEY et al. 1995; LUO et al.
1995); die PAX6-Expression bleibt aus, was eine Rolle upstream von Pax6 nahe legt (WAWERSIK et al. 1999).
GJA1 LP Mensch: Neben andere Missbildungen treten Katarakte, Mikrophthalmie sowie Missbildungen des vorderen Augensegmentes auf (PAZNEKAS et al. 2003).
MFRP
(NNO2) TM Mensch: isolierte bilaterale Mikrophthalmie (SUNDIN et al. 2005)
1) PAX6: paired box gene 6; RAX: retina and anterior neural fold homeobox gene; SOX2: SRY- box-containing gene 2; SIX: sine oculis homeobox homolog; Optx2: optic homeobox 2; EYA:
eyes absent homolog; DACH1: dachshund homolog 1; SHH: sonic hedgehog homolog; BMP:
bone morphogenic protein; PITX: paired-like homeodomain transcription factor; FOX:
forkhead box C1; MAF: musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog; CHX10:
Caenorhabditis elegans ceh-10 homeodomain containing homolog; MITF: microphthalmia associated transcription factor; VSX1: visual system homeobox 1 homolog; OTX1:
orthodenticle homolog 1; GJA1: gap-junction membrane-channel protrein; NNO:
nanophthalmus; MFRP: membrane-type Frizzled-related protein;.
2) Funktion: TF: Transkriptionsfaktor; SM: Signalmolekül; LP: Linsenprotein; TM: Trans- membranprotein.
2.2. Mikrophthalmie
2.1.2. Definition und Vorkommen
Als Mikropthalmie werden alle Fälle von Augenmissbildungen bezeichnet, bei denen der Augapfel eine mehr oder weniger ausgeprägte Verkleinerung zeigt. Es sind jedoch stets Bulbusreste in der Orbita vorhanden, was die Mikrophthalmie von der Anophthalmie abgrenzt, die durch ein vollständiges Fehlen okulärer Strukturen gekennzeichnet ist. Das ist
jedoch ein vergleichsweise seltenes Ereignis. In den meisten Fällen von klinischer Anophthamie lassen sich durch histopathologiache Serienschnitte Reste okulärer Strukturen in der Orbita nachweisen (COOK 1998). Das von Mikrophthalmie betroffene Auge kann weitgehend normal oder von weiteren Missbildungen betroffen sein. Die Ursache der Mikrophthalmie ist ein Sistieren der Augenentwicklung in dem Zeitraum nach der Bildung der Augenblase. Das Ausmaß der Affektionen ist davon abhängig, zu welchem Zeitpunkt das Sistieren der Augenentwicklung einsetzt. Wird die Entwicklung noch vor dem Schluss der fetalen Augenspalte gestört, ist in der Regel mit weiteren okulären Defekten wie zum Beispiel einer Dysgenesie des vorderen Augensegmentes, Katarakt oder Retinadysplasie zu rechnen.
Findet die Störung jedoch erst zu einem späteren Zeitpunkt statt, resultiert daraus ein einfacher Mikrophthalmus, das heißt ein verkleinerter Augapfel ohne größere Missbildungen (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Diese Form der Mikrophthalmie bezeichnet man auch als Nanophthalmus (GELATT 2000). Auf Grund dieser unterschiedlichen Formen und Ausprägungsgrade ist die Beeinträchtigung des Sehvermögens variabel. Diese reicht von einer leichten Fehlsichtigkeit bis hin zu völliger Blindheit. Angaben darüber, unterhalb welcher Bulbusgröße man von Mikrophthalmie spricht, fehlen für die Haustiere. In der Humanmedizin findet ein Klassifizierungsschema Anwendung, demzufolge unterhalb eines anterio-posterioren axialen Bulbusdurchmessers von 20 mm bei Neugeborenen eine Mikrophthalmie vorliegt (WARBURG 1993). Mikrophthalmie tritt häufig syndromisch, das heißt in Verbindung mit anderen Missbildungen auf. Dabei handelt es sich in erster Linie um Gesichtsmissbildungen, aber auch andere Organsysteme sind beteiligt (RÜSSE und SINOWATZ 1991).
Das Auftreten von Mikrophthalmie ist für verschiedene Spezies beschrieben. In der OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) Datenbank (http://omia.angis.org.au/) befinden sich derzeit 15 Einträge von Mikrophthalmie- oder Anophthalmie-Phänotypen bei 10 verschiedenen Wirbeltierspezies. Beim Rind ist das Auftreten von Mikrophthalmie und Anophthalmie bei Kälbern verschiedener Rassen beschrieben worden (ZAYED und GHANEM 1964; LEIPOLD und HOUSTON 1968; MORIMOTO et al. 1994). Anophthalmie wurde isoliert, in Verbindung mit Schwanzmissbildungen (THOM 1963; MORIMOTO et al.
1995) oder mit weiteren Missbildungen im Kopfbereich (KOCH und FISCHER 1950;
KUNDU und PANDEY 1967; ASOKAN und PATTABIRMAN 1982; BÄHR et al. 2003) beobachtet. Die Ursachen dieser Defekte sind im Einzelnen nicht klar. In einigen Fällen wurde ein monogen autosomal rezessiver Ergang vermutet (KOCH und FISCHER 1950;
ZAYED und GHANEM 1964). Beim japanischen Schwarzvieh wurde eine als MOD
llständige Blindheit gekennzeichnet ist.
he Wolfshund (KERN 1981). Mikrophthalmie in ariabler Ausprägung ist außerdem ein Bestandteil des Merle-Syndroms (Merle ocular ye anomaly, CEA). Beim Merle-
, kommen auch (congenital multiple ocular defects) bezeichnete kongenitale Augenanomalie beschrieben, die duch Mikrophthalmie, Torsion der Augäpfel und vo
Der putative Defektgenort wurde auf dem bovinen Chromosom 18 lokalisiert (ABBASI et al.
2005, 2006). Beim Schwein wurden verschiedene Formen der Mikrophthalmie und Anophthalmie beschrieben und unter anderem auf eine Vitamin-A-Unterversorgung der tragenden Sau zurückgeführt (HALE 1933, 1935; BENDIXON 1944; ROBERTS 1948).
Beim Hund wurde Mikrophthalmie im Zusammenhang mit anderen Missbildungen des Auges wie Defekten des vorderen Augensegmentes, Katarakten oder Retinadysplasie bei verschie- denen Rassen beschrieben. Zu den betroffenen Rassen gehören der Bernhardiner (MARTIN und LEIPOLD 1974), der Dobermann (ARNBJERG und JENSEN 1982; PFEIFER und FISCHER 1983; BERGSJO et al. 1984; LEWIS et al. 1986), der Altenglische Schäferhund (BARRIE et al. 1979), der Akita (LARATTA et al 1985) der Zwergschnauzer (GELATT et al. 1983, SAMUELSON et al. 1987), der Chow Chow (COLLINS et al. 1992), der Cavalier King Charles Spaniel (NARFSTROM und DUBIELZIG 1984) und der Cocker Spaniel (STRANDE et al. 1988) sowie der Irisc
v
dysgenesis, MOD) und der Collie-Augenanomalie (Collie e
Syndrom ist Mikrophtalmie dabei häufiger und in stärkerer Ausprägung zu beobachten als bei der Collie-Augenanomalie (COOK et al. 1991). Darüber hinaus enthält die OMIA Datenbank Einträge über das Auftreten von Mikrophthalmie oder Anophthalmie bei der Ziege (ASHTURKAR et al. 1996), beim Wasserbüffel (GARG et al. 1990), beim Hamster (HUGES und GEERAETS 1962; WADA und TSUDZUKI 1998), beim Wapiti und bei der Ratte sowie beim Huhn (EHRLICH et al. 1989; SOMES 1992).
Wenngleich viele Formen der Mikrophthalmie genetische Ursachen haben
andere auslösende Faktoren in Betracht. Viele teratogene Substanzen können Mikrophthalmie verursachen. So können beispielsweise nach der Verabreichung von Griseofulvin an trächtige Katzen oder Stuten betroffene Welpen oder Fohlen auftreten (RÜSSE und SINOWATZ 1991;
SCHUTTE und VAN DEN INGH 1997). Als Ursache beim Schaf wurde eine chronische Selenose beschrieben (ROSENFELD und BEATH 1947). Dieser Zusammenhang wird jedoch kontrovers dikutiert (O´TOOLE et al. 1996). Bei Kaninchen wurden Pilztoxine als Auslöser identifiziert (WANGIKAR et al. 2005). Auch Giftpflanzen sind als Auslöser kongenitaler Augenanomalien bekannt. Beim Schaf wurde nach der Ingestion von Veratrum californicum am Tag 14 der Trächtigkeit das Auftreten von Lämmern mit verschiedenen Missbildungen des Kopfes, darunter Zyklopie und Anophthalmie, beschrieben (BINNS et al. 1965). Auch
eine Fehlernährung trächtiger Tiere, insbesondere Vitamin-A-Mangel, kommt als Auslöser in Betracht (HALE 1935; ROBERTS 1948).
2.1.2. Die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes
lärt das nach wie vor relativ häufige Auftreten dieses Defekts. In den
ellen sowie einer inkörnigen amorphen Substanz fibrinösen Charakters. Das umgebende Bindegewebe enthält Ende der 1950er Jahre wurde in den Niederlanden und Frankreich eine Form von kongenitaler bilateraler isolierter Mikrophthalmie bei Texelschafen sowie deren Kreuzungen beschrieben (DE GROOT 1957; ZWIEP 1958; HANSET 1961). Bereits DE GROOT (1957) nahm an, dass eine erbliche Genese zu Grunde liege, da insbesondere Nachkommen aus Inzuchtanpaarungen betroffen gewesen seien. Durch Versuchsanpaarungen konnte schließlich gezeigt werden, dass sich die Mikrophthalmie bei Texelschafen mit einem monogen autosomal rezessiven Erbgang erklären lässt (HARING und GRUHN 1970).
Seit der Einfuhr von Schafen der Rasse Texel aus den Niederlanden nach Deutschland in den 1960er Jahren sind in verschiedenen Zuchtgebieten immer wieder Lämmer mit zumeist bilateraler Mikrophthalmie ohne weitere Missbildungen geboren worden (HARING und GRUHN 1970). Vereinzelt tritt diese kongenitale Anomalie auch in anderen Schafrassen auf.
Die betroffenen Lämmer sind hilflos und finden in der Herde ihre Mutter nicht. Sie bedürfen zu ihrer Erhaltung bis zum schlachtreifen Alter der besonderen individuellen Pflege und Betreuung, welche ihnen aber in der Praxis von großen Schäfereien in der Regel nicht zuteil werden kann. Eine ungezielte Anpaarung von in der Regel unerkannten heterozygoten Elterntieren erk
Niederlanden wird eine Häufigkeit von 10% Anlageträgern ohne phänotypische Anzeichen in der Zuchtpopulation angenommen. In Neuseeland wurde das erstmalige Auftreten dieser Missbildung bei Texelkreuzungen im Jahre 1999 auf den Import von Texelschafen sowie Embryonen aus Dänemark und Finnland im Jahre 1986 zurückgeführt (ROE et al. 2003).
Anhand von sechs betroffenen Tieren im Alter von 2 bis 12 Wochen aus dem Material der Versuchsanpaarungen von HARING und GRUHN (1970) erfolgte eine Beschreibung der Morphologie der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes. Iris, Linse und Glaskörper fehlen bei betroffenen Augen vollständig. Das vordere Augensegment ist von einer bindegewebigen Masse angefüllt, die freie Epithelzysten enthält. Der Inhalt dieser Zysten besteht größtenteils aus Ansammlungen isolierter, großer, polymorpher Z
fe
häufig Drüsengewebe, Knorpelinseln und Fettgewebe. Der Ziliarkörper ist rudimentär vorhanden und in die bindegewebige Masse integriert. Regelmäßig wird ein Fehlen der
ufgrund der Veränderungen am Auge erlangen kaum retinale Ganglienzellen Verbindung um Gehirn. Daher können atrophische Veränderungen am Nervus opticus sowie im visuellen
ortex des Großhirns beobachtet werden (ARNDT et al. 1978).
AN DER LINDE-SIPMAN et al. (2003) beschreiben die Augen betroffener neugeborener ämmer wie folgt: Die Augen sind klein, aber normal geformt. Die vordere Augenkammer nd die Linse fehlen. Stattdessen ist eine konische, bindegewebige Masse ausgebildet, die an et´schen Membran beschrieben. Innerhalb der Bindegewebsmasse befinden sich Knorpelgewebe, glatte Muskulatur und Fettgewebe sowie epitheliale Zysten, die mit Keratin und manchmal Haaren gefüllt sind. Ziliarkörper und -fortsätze sind in die Masse integriert. Die Netzhaut scheint normal entwickelt, ist aber von der Unterlage abgelöst und in Falten gelegt.
Das erste histopathologisch nachweisbare Ereignis in der Morphogenese der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes ist eine abweichende Entwicklung des Linsenbläschens ab dem 24. Tag der Gestation (VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003). Zu diesem Zeitpunkt besteht das Linsenbläschen aus einer soliden Zellproliferation ohne Linsenkapsel. Ab dem Tag 35 ist die Linse nicht mehr auszumachen und ungeordnete mesenchymale Proliferation bestimmt das Bild. Der Augenbecher wird zunächst normal angelegt, bleibt aber ab dem 45.
Tag der Embryonalentwicklung deutlich im Größenwachstum zurück. Die Retina ist anfänglich ebenfalls regelgerecht entwickelt, löst sich aber zwischen dem 45. und 56. Tag von ihrer Unterlage (VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003).
Bowman´schen und Descemet´schen Membran sowie des Endothels der vorderen Augenkammer beschrieben. In einigen Fällen wurden ein desquamiertes vorderes Hornhautepithel sowie Einlagerungen von Drüsengewebe im Korneaparenchym beobachtet.
Die Retina haftet lediglich im Bereich des Sehnervenkopfes am teilweise mehrschichtigen Pigmentepithel. Ansonsten ist sie abgelöst und liegt ungeordnet rosettenförmig im Auge. Die identifizierbaren Zellen lassen die retinaspezifische Schichtung weitestgehend vermissen (LABS 1977).
A z C V L u
der Sehnervenpapille befestigt ist. Mikroskopisch wird ein Fehlen der Descem
Normale Entwicklung Mikrophthalmie Tag 24
Tag 32
Abbildung 2-3: Vergleich von mikrophthalmischen (rechte Bildhälfte) mit sich normal entwickelnden (linke Bildhälfte) Augenanlagen am Tag 24 (obere Bildhälfte) und Tag 32 (untere Bildhälfte) der Embryonalentwicklung beim Schaf (modifiziert nach VAN DER
.3. Genomkartierung
s die gezielte Suche nach einzelnen Genen.
Abhilfe verspricht die vollständige Sequenzierung der Genome, die mittlerweile beim LINDE-SIPMAN et al. 2003).
2
Generell erschwert die Größe des Säugergenom
Menschen (VENTER et al. 2001), bei der Maus (WATERSTON et al. 2002), beim Hund (KIRKNESS et al. 2003; LINDBLAD-TOH et al. 2005) und bei der Ratte (GIBBS et al.
2004) durchgeführt wurde. Bei weiteren Spezies bestehen derzeit entsprechende internationale Initiativen zur Entschlüsselung der Genome (http://www.intlgenome.org/).
Bevor diese umfassenden Informationen zur Verfügung standen, wurde mit der Kartierung zunächst kleinerer Genomanteile begonnen, um ein Bild über das gesamte Genom zu erhalten.
Das Ziel der Genomartierung ist die Erstellung möglichst dichter Markerkarten mit gleichmäßig über das gesamte Genom verteilten hochpolymorphen Markerloci. Durch den
955). Dabei werden
auf 100 Meiosen entspricht. Besteht keine Nachweis von Kopplung eines bisher unbekannten Gens mit einem oder mehreren chromosomal bereits lokalisierten DNA-Markern kann das Gen einer bestimmten Chromo- somenregion zugeordnet werden. Durch schrittweises Einengen dieser Region mit zusätzlichen Markern und verschiedenen Klonierungsstrategien erhält man schließlich die korrekte Position des Gens. Man bezeichnet dieses Verfahren auch als positionelles Klonieren (COLLINS 1992).
Man unterscheidet zwischen genetischen und physikalischen Genomkarten. Genetische Karten geben den relativen Abstand zwischen den Loci wieder, während physikalische Genomkarten die Lage von DNA-Sequenzen direkt auf dem Chromosom darstellen.
2.3.1. Genetische Kartierung
Die genetische Karte wird durch Kopplungsanalyse erstellt (MORTON 1
die Abstände zwischen polymorphen DNA-Fragmenten gemessen, die über das gesamte Genom verteilt vorkommen Dies geschieht indirekt auf Basis der beobachteten Frequenz meiotischer Rekombinationen innerhalb so genannter Ressourcenfamilien, die in der Regel eine Sammlung umfangreicher Vollgeschwisterfamilien darstellen. Rekombinante und nicht- rekombinante Nachkommen innerhalb der Familie müssen unterscheidbar sein. Dazu muss mindestens ein Elternteil für die untersuchten Genorte doppelt heterozygot sein (OTT 1991).
Die genetische Distanz zwischen zwei Loci ergibt sich aus der Rekombinationsfrequenz θ und wird in Centimorgan (cM) angegeben, wobei 1 cM einer Rekombinationsfrequenz von 1%, also dem Auftreten von einer Rekombination
Kopplung zwischen zwei Loci, beträgt die Rekombinationsfrequenz θ = 0,5. Unabhängig davon also, wie weit zwei Loci voneinander entfernt sind, kann die Rekombinationsfrequenz nie größer als 0,5 sein (0 ≤ θ ≤ 0,5). Daher ist die Rekombinationsfrequenz nicht additiv und muss zur Erstellung einer genetischen Karte in die genetische Distanz umgerechnet werden (OTT 1991). Dazu dienen verschiedene Kartierungsfunktionen, zum Beispiel nach Haldane oder Kosambi. Diese Funktionen unterscheiden sich insofern, als dass die Funktion nach Kosmabi im Gegensatz zu der nach Haldane die Interferenz berücksichtigt. Wenn ein Crossing-over die Entstehung weiterer Chiasmata in der Nähe verhindert, bezeichnet man das als Interferenz (BROMAN und WEBER 2000). Als Faustregel kann gelten, dass ein cM auf einer genetischen Karte einem Abstand von durchschnittlich einer Million Basenpaaren (1 Mb) entspricht. Es gibt aber sowohl Unterschiede zwischen einzelnen chromosomalen Regionen als auch zwischen den Geschlechtern (BROMAN et al. 1998).
Je geringer der Abstand zwischen zwei Genorten auf einem Chromosom ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwischen ihnen kein Rekombinationsereignis stattfindet und sie gekoppelt vererbt werden. Bei der Kopplungsanalyse wird θ am genotypisierten Familienmaterial geschätzt und getestet, wie groß die Wahrscheinlichkeit für Kopplung ist.
azu wird bei der klassischen Kopplungsanalyse ein LOD-Score (logarithm of the odds) rüfung der Hypothese der Kopplung gegenüber der Nullhypothese der freien Rekombination. Ist der Wert ≥ 3, so betrachtet man die Genorte als
ymorphismen (RFLPs), SNPs (single nucleotide polymorphisms), SSCPs (single
rtierung
hysikalische Genomkarten stellen die Lage von DNA-Sequenzen direkt auf dem Chromosom dar. Häufig eingesetzte Methoden für die Kartierung sind die Fluoreszenz-in- situ-Hybridisierung (FISH), die Verwendung von somatischen sowie radiation hybrid (RH) Zell-Hybriden und die Anordnung überlappender genomischer Klone zu so genannten Contigs.
Bei der zytogenetischen Technik der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung werden fluoreszenz- markierte DNA-Sonden auf fixierten Metaphase-Chromosomen dargestellt (SOLINAS- D
bestimmt. Dieser dient zur P
gekoppelt. Bei einem Wert gleich oder kleiner als -2 kann man die Kopplung für die betrachteten Genorte ausschließen (OTT 1991).
Als Marker für die Kopplungsanalyse benötigt man polymorphe genetische Marker, das heißt Genorte, an denen verschiedenen Allele auftreten, zum Beispiel Restriktionsfragment- längenpol
strand conformation polymorphisms) und Mikrosatelliten. Mikrosatellitenmarker sind in der Regel wesentlich polymorpher als die übrigen Typen genetischer Marker. Sie bestehen aus einer Aneinanderreihung von Mono-, Di-, Tri- oder Tetra- Nukleotidsequenzen, wobei die Motivlänge zwischen 1-10 Basenpaare variieren kann (TAUTZ 1989). Die Anzahl der Motive beträgt bis zu 30 und mehr so genannte Tandem- Wiederholungen (HEARNE et al. 1992).
Mikrosatellitenmarker sind gut geeignet zur Identifizierung der chromosomalen Lokalisation von Genorten durch Kopplungsanalyse bei der Aufklärung monogener Merkmale (HOLMES 1994; Kap. 2.4.2.). Je polymorpher sich ein Marker verhält, desto höher ist die Chance, informative Meiosen zu beobachten, bei denen die Weitergabe der Markerallele an die Nachkommen verfolgt werden kann (FRIES 1993). Ein Marker ist umso informativer, je mehr Allele er besitzt und je niedriger die Frequenz des häufigsten Alles ist. Ein Maß für den Informationsgehalt ist der so genannte PIC (polymorphism information content). Dieser könnte im Idealfall (alle Meiosen informativ) einen Maximalwert von 1 annehmen.
2.3.2. Physikalische Ka P
TOLDO et al. 1993). Bei der radiation hybrid (RH) Kartierung werden durch Bestrahlung von Donor-Zelllinien (z.B. ovine Fibroblasten) mit Röntgen- oder γ-Strahlen so genannte Radiation Hybrid Panels erzeugt (GOSS und HARRIS 1975). Die Chromosomen der Donorzellen werden durch die Bestrahlung in Fragmente gespalten. Anschließend werden die letal geschädigten Zellen unter Einsatz von Polyethylenglycol mit Rezipientenzellen (Hamster- oder Mauszelllinien) verschmolzen. Durch die Integration von Fragmenten in das Genom der Rezipientenzelle entstehen Hybridzellen. Die Fragmente werden entweder in die Chromosomen der Rezipientenzelle integriert oder rekonstituieren sich zu „neuen“
Chromosomen (Abb. 2-2). Ein Selektionssystem gewährleistet, dass nur Hybridzellen überleben (WALTER et al. 1994). Die durchschnittliche Größe der Fragmente und damit das Auflösungsvermögen des verwendeten RH-Panels ist abhängig von der Strahlendosis, was bedeutet, dass das Auflösungsvermögen steuerbar ist. Generell besitzen RH-Karten ein etwa 15 bis 20-fach höheres Auflösungsvermögen als Kopplungskarten (COX et al.1990;
WALTER et al. 1994).
Abbildung 2-2: Herstellung von Hybridzellen durch Bestrahlung (modifiziert nach WALTER et al. 1994).
Zur Kartierung werden Marker-Loci mittels PCR an den Zelllinien typisiert, das heißt es wird bestimmt, ob ein bestimmter Genort in einer hybriden Zelllinie vorhanden ist oder nicht. Es werden also im Gegensatz zur genetischen Kartierung keine hochpolymorphen DNA-Marker benötigt. Es genügen spezifische DNA-Sequenzen für die Auswahl geeigneter PCR-Primer (COX et al. 1990; WALTER et al. 1994; YANG et al. 1998). Die lineare Anordnung sowie die physikalische Distanz zwischen den Genorten können anhand der Koretentionsfrequenz, das heißt der Häufigkeit, mit der die Genorte gemeinsam in einer hybriden Zelllinie vorkommen, geschätzt werden (GOSS und HARRIS 1975; COX et al. 1990). Je enger die Genorte auf einem Chromosom benachbart sind, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie durch einen zufälligen Bruch getrennt werden und desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie gemeinsam in einer Zelllinie vorhanden sind. Diese einfache Betrachtungsweise wird allerdings dadurch verkompliziert, dass die Hybridzellen häufig mehr als nur ein chromosomales Fragment enthalten. Zwei Marker können gemeinsam in einer hybriden Zelllinie vorkommen, weil sie nicht durch einen Bruch getrennt wurden und in einem Fragment liegen oder weil sie durch einen Bruch getrennt wurden und auf zwei erschiedenen Fragmenten in der Hybridzelle vorliegen. Wenn zwei Genorte in einer Zelllinie icht vorliegen, lässt sich ebenfalls keine Aussage darüber machen, ob sie gemeinsam oder en sind. Deshalb lässt sich die Bruchfrequenz θ
n. Für weit voneinander entfernte Marker
ch v
n
unabhängig voneinander verloren gegang
zwischen Markern nicht direkt aus dem beobachteten Retentionsmuster ableiten. Nimmt man aber an, dass der Bruch unabhängig vom Verbleib der beiden Marker ist und dass die Retention eines Fragments unabhängig von jedem anderen beliebigen Fragment ist, lässt sich die Bruchfrequenz schätzen. Die Bruchfrequenz θ ist mit meiotischen Rekombinations- frequenz vergleichbar. Anders als diese kann sie aber von 0 (die Marker werden nie getrennt) bis 1 (die Marken werden immer getrennt) variiere
wird die tatsächliche Distanz (D) von der Bruchfrequenz unterschätzt. Die Distanz ergibt sich aus der Funktion D = -ln(1- θ) und wird in Centiray (cR) angegeben. Da die Bruchfrequenz und somit auch die Distanz von der Strahlendosis abhängen, wird diese Angabe um die Angabe der zur Erzeugung des RH-Panels eingesetzten Strahlendosis ergänzt. Ein Abstand von 1 cR5000 zwischen zwei Genorten entspricht einer Bruchfrequenz von einem Prozent na einer Exposition mit einer Strahlendosis von 5000 Rad (COX et al. 1990).
ms für andere, weniger gut kartierte Spezies.
90er Jahren wurde damit onservierte Chromosomensegmente zwischen verschiedenen Säugerspezies und dem
das Schwein (GOUREAU et al. 1996), das Rind S-TOLDO et al. 1995), das Pferd (RAUDSEPP et al.
eiche zu bekannten
einer Auswahl aus den ständig zunehmenden bovinen EST Sequenzen 2.3.3. Vergleichende Genomkartierung
Das Ziel der vergleichenden Genomkartierung ist zum Beispiel die Nutzbarmachung der detaillierten Informationen des humanen Geno
Neben den Erkenntnissen zur Evolution der Säugergenome vereinfachen und beschleunigen diese vergleichenden Genomkarten die Arbeiten an weniger detaillierten Karten. Die Suche nach Genen bei einer Spezies kann durch die Kenntnis konservierter Chromosomenabschnitte bei anderen Spezies wesentlich erleichtert werden.
Eine Methode zur Verknüpfung von Spezieskarten ist die Verwendung von genassoziierten Markern, so genannten Ankergenorten, deren Anwendung speziesübergreifend möglich ist (O´BRIEN et al. 1993; LYONS et al. 1997). Auch Mikrosatelliten, die von spezies- spezifischen Sequenzen flankiert werden, können bei nah verwandten Arten als Marker zur vergleichenden Kartierung Verwendung finden (z.B. CRAWFORD et al. 1995, Kap. 2.6.).
Eine Möglichkeit der Identifizierung von konservierten Chromosomensegmenten zwischen verschiedenen Spezies durch interspezifische in-situ-Hybridisierung bietet die so genannte ZOO-Fish-Methode (SCHERTHAN et al. 1994). Damit können auch Vergleiche zwischen Arten aus verschiedenen Ordnungen angestellt werden. In den 19
k
Menschen identifiziert, so zum Beispiel für (CHOWDHARY et al. 1996; SOLINA
1996) und das Schaf (IANNUZZI et al 1999).
Eine Verfeinerung der vergleichenden Kartierung kann dann durch die Erstellung hoch auflösender RH-Karten erreicht werden. Dazu wurden beispielsweise beim Rind so genannte expressed sequence tag (EST) Sequenzen aus der ungerichteten Sequenzierung von Klonen gewebespezifischer cDNA-Bibliotheken herangezogen (SMITH et al. 2001). Die Zuordnung der anonymen bovinen EST Sequenzeinträge erfolgte über Identitätsvergl
cDNA Sequenzen humaner Gene. Eindeutig übereinstimmende Sequenzen wurden danach auf der bovinen RH Karte über das gesamte Rindergenom verteilt kartiert (BAND et al. 2000).
Mit der RH Kartierung
der Sequenzdatenbanken wurde die vergleichende Genomkarte zwischen Mensch und Rind mittlerweile weiter verfeinert (ITOH et al. 2005; EVERTS-VAN DER WIND et al. 2004). Im Gegensatz zum Rind stehen für das Schaf vergleichsweise wenige EST-Sequenzeinträge in den öffentlichen Sequenzdatenbanken zur Verfügung (Stand: 18.02.2006: 15.888 ovine und 1.588.784 bovine EST Sequenzen; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
2.4. Stand der Genomanalyse beim Schaf 2.4.1. Genomkartierung beim Schaf
en (CRAWFORD et al. 1994). Das war die Konsequenz aus einem Genomscan zur Kartierung des Booroola-Genortes (MONTGOMERY
satelliten getestet wurden, Das Schaf besitzt drei meta- und 23 akrozentrische Autosomen und unterscheidet sich darin vom Rind und der Ziege, die beide 29 akrozentrische Autosomen besitzen. Dieser Unterschied erklärt sich durch drei im Laufe der Evolution des Schafes aufgetretene Robertson-Translokationen, bei denen jeweils zwei akrozentrische zu einem metazentrischen Chromosom fusionierten. Daher sind die ovinen Chromosomen 1 bis 3 jeweils homolog zu zwei verschiedenen Rinder- und Ziegenchromosomen (MADDOX 2004).
Vor 1994 war die genetische Karte des Schafes nur rudimentär. Es waren lediglich 17 genetische Marker in sieben Kopplungsgruppen bekannt (MONTGOMERY und CRAWFORD 1997).
Der Grundstein für eine genetische Karte war gelegt, als 1994 52 polymorphe genetische Marker (46 Mikrosatelliten und 6 RFLPs) in 19 syntänischen Gruppen angeordnet und 13 Schafchromosomen zugeordnet werden konnt
et al. 1993; Kap. 2.4.2.). Diese unvollständig dominant vererbte Mutation beeinflusst die Ovulationsrate und wurde danach als Marker zur Selektion auf eine verbesserte Wurfgröße eingesetzt.
Die erste umfangreichere genetische Karte beinhaltete 246 polymorphe genetische Marker auf allen Autosomen und umfasste 2070 cM (CRAWFORD et al. 1995). Als Vorraussetzung dafür wurde eine Ressourcenfamilie (International Mapping Flock, IMF) erzeugt, die aus neun umfangreichen, sich über drei Generationen erstreckenden Vollgeschwisterfamilien mit insgesamt 98 Nachkommen besteht. Insgesamt 133 der auf dieser Karte angeordneten Marker stellen bovine Mikrosatelliten dar (CRAWFORD et al. 1995). Aufgrund der hohen Sequenzhomologien zwischen Rind und Schaf liegt die Verwendung boviner Mikrosatelliten nahe. Jedoch ist nicht mit jedem heterologen Primerpaar ein PCR-Produkt zu erzielen und nicht alle bovinen Mikrosatelliten erweisen sich beim Schaf als polymorph (COCKETT 2003a). Insgesamt erwiesen sich 53% der getesteten bovinen Mikrosatelliten als polymorph beim Schaf. In einer späteren Studie, in der über 1000 bovine Mikro
ließen sich mit ca. 39% der heterologen Primerpaare polymorphe Mikrosatelliten-Loci amplifizieren (DE GORTARI et al. 1997).
DE GORTARI et al. veröffentlichten 1998 eine genetische Karte mit 519 genetischen Markern. Neben 101 ovinen Mikrosatelliten enthält diese Karte 402 bovine Mikrosatelliten
http://www.marc.usda.gov/genome/genome.html).
esamt 247 Nachkommen. Durch eine internationale Kooperation verschiedener Laboratorien
osom. In ihr waren zunächst 121 bekannte Gene
rde in Zusammenarbeit mit der Texas A&M University ein und 16 bekannte Gene. Sie umfasst 3063 cM auf allen Autosomen mit einem durch- schnittlichen Markerabstand von 6,5 cM (
Zur Erstellung dieser Karte wurde neben dem IMF auch eine weitere Ressourcenfamilie des USDA / MARC verwendet. Diese besteht aus vier Halbgeschwisterfamilien mit insg
entstand schließlich unter Verwendung des IMF eine genetische Karte mit 1062 Loci (MADDOX et al. 2001). Diese als SheepMap 4 bezeichnete Karte umfasste 3400 cM auf den Autosomen und 132 cM auf dem X-Chrom
enthalten. Die Konstruktion dieser Karte wird laufend fortgesetzt. Im Januar 2006 wurde die Version SheepMap 4.5 veröffentlicht (Australian Sheep Gene Mapping Website:
http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm). Diese enthält 1372 Loci und umfasst etwa 3500 cM auf den Autosomen und 132 cM auf dem X-Chromosom.
Diese Karte enthält Mikrosatelliten, die durch systematische Durchmusterung einer Haut- cDNA-Bibliothek des Schafes nach repetitiven Dinukleotid-Sequenzmotiven entwickelt wurden. Durch 5´Sequenzierung wurden EST Sequenzen generiert. Diese wurden zur Identifizierung der Gene und zur Anordnung innerhalb der humanen Genomsequenz genutzt.
Der Vorteil ist, dass diese Marker sowohl als genassozierte wie auch anonyme Markerloci fungieren können (DE SILVA et al. 2003).
Insgesamt 2030 Marker-Loci, die aus 518 Publikationen zusammengetragen wurden sind derzeit in der öffentlichen Datenbank Sheep Base (http://www.thearkdb.org/) enthalten.
An der Utah State University wu
RH Panel mit einer Strahlendosis von 5.000 Rad erzeugt, das zur vergleichenden Kartierung beim Schaf dienen soll (COCKETT 2003b).
Der Vergleich des Schafgenoms mit dem Rindergenom erbrachte einen hohen Grad an Konservierung innerhalb der Familie der Bovidae. Ein Vergleich mit der genetischen Karte des Rindes von KAPPES et al. (1997) ergab lediglich in acht Fällen eine Inversion von Markerpositionen (DE GORTARI et al. 1998). Durch Hybridisierungsexperimente wurden 48 zwischen Schaf und Mensch konservierte Chromosomensegmente gefunden (BURKIN et al.
1997; IANNUZZI et al. 1999). MADDOX et al. (2003) identifizierten 53 syntänische Beziehungen zwischen Schaf und Mensch. SCHIBLER et al. (1998) berichten über mehr als 100 zwischen den Bovidae und dem Menschen konservierte Chromosomenabschnitte mit einer durchschnittlichen Größe von 25 cM. Sie kommen deshalb zu dem Schluss, dass der Grad chromosomaler Umordnungen, der durch Hybridisierungsexperimente ermittelt wurde,
die tatsächlichen Verhältnisse unterschätzt. Die von EVERTS-VAN DER WIND et al. (2005) erstellte hochauflösende vergleichende RH-Karte zwischen Rind und Mensch enthält 201 zwischen zwischen den Spezies konservierte Chromosomenabschnitte mit einer durch- schnittlichen Größe von 7,6 Mb.
Die Triebfeder intensiver Bemühungen zur Entschlüsselung des Schafgenomes ist die Verbesserung der Produktivität, insbesondere die Maximierung der Fleisch- und Wollproduktion und –qualität sowie die Erhöhung der Resistenz gegen Endoparasiten (FADIEL et al. 2005). Um diese Ziele zu erreichen, wurde im September 2004 das Programm SheepGenomics ins Leben gerufen (www.sheepgenomis.com). Vornehmlich australische Investoren haben mittlerweile 50 Millionen Dollar in dieses Projekt investiert. Das Ziel des Projektes ist die Entwicklung praxistauglicher DNA Marker für kommerzielle Zuchtprogramme und letztlich die Sequenzierung des Schafgenoms. Zur Entwicklung von
arkern wurde im Jahr 2004 ein Zuchtprogramm begonnen, das etwa 5000 Schafe beinhaltet.
essierenden Merkmalen differieren
nbanken zur Verfügung (Stand:
18.02.2006; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Für das Jahr 2006 ist die genomweite
er Merkmale M
Dabei fanden Deckböcke Verwendung, die in inter
(FADIEL et al. 2005; www.sheepgenomics.com). Im Zuge von SheepGenomics wurden zudem genomische Ressourcen erstellt. Das bacterial artifical chromosome (BAC) Klonierungssystem hat sich aufgrund des einfachen Umgangs und der Stabilität des Klonierungssystems zur experimentellen Analyse der Säugergenome durchgesetzt. Für das Schaf steht eine BAC Genbank zur Verfügung, deren Klone durchschnittlich etwa 180 kb genomische Schafsequenz beinhaltenden (http://bacpac.chori.org/). Die Enden zufällig ausgewählter BAC Klone wurden 2005 entschlüsselt und es stehen derzeit 376.602 ovine BES Sequenzeinträge in den öffentlich zugänglichen Date
Entwicklung von SNP Markern geplant, wobei zur Anordnung der Marker auch die Genomsequenz des Rindes genutzt werden soll. Bis 2008 ist die Entwicklung eines DNA Mikroarrays zur genomweiten Typisierung von DNA Markern für wirtschftlich relevante Merkmale geplant, der in kommerziellen Zuchtprogrammen eingesetzt werden soll (www.sheepgenomics.com).
2.4.2. Molekulare Aufklärung hereditär
Die genetische Grundlage ist bislang nur für vergleichsweise wenige hereditäre Merkmale des Schafes bekannt. Von insgesamt 179 beim Schaf bekannten hereditären Merkmalen beruhen 59 auf einem monogenen Erbgang (OMIA, http://www.angis.org.au/omia/). Für verschiedene
t growth factor receptor 3 (FGFR3)-
enort mittels Kopplungsanalyse auf OAR6 lokalisiert werden (MONTGOMERY et al. 1994). Der dieser Merkmale konnte durch genetische Kartierung eine Kopplung zu bestimmten Chromosomenregionen nachgewiesen werden. Auf diese Weise wurde beispielsweise der so genannte Horn-Locus beim Merinoschaf auf OAR10 lokalisiert (MONTGOMERY et al.
1996). Derzeit wird in einer genomweiten Kopplungsanalyse nach dem Genort für die ovine kongenitale Arthrogrypose gesucht (MURPHY et al. 2004)
Der Nachweis kausaler Mutationen ist bisher nur für sehr wenige Merkmale gelungen. Eine autosomal rezessiv vererbte Form der hereditären Chondrodysplasie wurde in den 1970er Jahren erstmals bei Schafen der Rasse Suffolk beschrieben (SAPERSTEIN et al. 1975). Die Krankheit äußert sich neben verschiedenen anderen Skelettdeformationen auch in langen, gebogenen Beinen, was zu der Bezeichnung Spider Lamb Syndrome geführt hat. Durch eine genomweite Kopplungsanalyse konnte der Genort auf OAR6 lokalisiert werden (COCKETT et al. 1999). Als verursachendes Gen wurde das fibroblas
Gens identifiziert (BEEVER et al. 2006).
Die als Callipyge-Syndrom bezeichnete Muskelhypertrophie des Schafes zeigt einen Erbgang, den man als paternale polare Überdominanz bezeichnet (COCKETT et al. 1996). Das bedeutet, der Callipyge-Phänotyp wird nur gezeigt, wenn das betreffende Tier vom Vater das mutierte und von der Mutter das Wildtyp-Allel erhalten hat. Durch Kopplungsanalyse wurde zunächst die chromosomale Lokalisation des Callipyge-Locus OAR18 identifiziert (COCKETT et al. 1994). Es wurde eine kausale Punktmutation identifiziert, die jedoch in einer intergenischen Region liegt (FREKING et al. 2002). Es konnte gezeigt werden, dass das benachbarte DLK1-Gen (delta-like 1 homolog) in betroffenen Tieren während der postnatalen Periode viel stärker exprimiert wird als in nicht betroffenen Individuen. Der molekulare Zusammenhang zwischen der Mutation und der gesteigerten Expression ist noch unklar (MURPHY, S. K. et al. 2005). Andere bekannte Genorte für eine erhöhte Muskelfülle sind der Rib-eye muscle (REM)-Genort (MCEWAN et al. 1998) sowie der Double-Muscling- Genort des Texelschafs. Von letzterem wurde auf Grund von Kopplungsanalysen angenommen, das Myostatin-Gen beinhalte die ursächliche Mutation. Eine Mutation konnte aber nicht nachgewiesen werden (MARCQ et al. 1998).
In drei verschiedenen Genen wurden bisher Mutationen mit Einfluss auf die Ovulationsrate identifiziert. Für den Genort des Booroola-Phänotyps (FecB) wurde zunächst eine Kopplung zu Markern nachgeweisen, die einer Region auf HSA4q zugeordnet werden konnten (MONTGOMERY et al. 1993). Nach der Entwicklung neuer Marker konnte der G
Phänotyp beruht auf einer Mutation im bone morphogenic protein receptor 1B (BMPR1B) Gen. Der Effekt dieser Mutation wirkt additiv, das heißt homozygote Mutterschafe zeigen die höchste Ovulationsrate von durchschnittlich 5 bis 14 Eizellen pro Ovulation (WILSON et al.
2001). Durch Nachkommenschaftstests bei Romney-Schafen mit überdurchschnittlicher Wurfgröße konnte ein weiteres Gen mit Einfluss auf die Ovulationsrate auf dem X- Chromosom lokalisiert werden (DAVIS 1991). Insgesamt vier unabhängige Punktmutationen konnten daraufhin im bone morphogenic protein 15 (BMP15)-Gen nachgewisen werden.
I H G
während Tiere ohne Wildtypallel steril sind.
ndlage der bekannten Funktion des murinen Gdf9 Gens
l des so genannten
ät und Porphyrinurie wurde bei Schafen der Rasse Schwarzköpfiges
(NEZAMZADEH et al. 2004, 2005).
Diese Mutationen wurden als Inverdale- (FecX), Hanna- (FecX ), Cambridge- (FecX ) und Belclare- (FecXB) Mutation bezeichnet (GALLOWAY et al. 2000; DAVIS et al. 2001;
HANRAHAN et al. 2004). Mutterschafe, die neben dem Wildtypallel eines der mutierten Alle aufweisen, zeigen eine erhöhte Ovulationsrate,
Eine weitere Mutation ist im autosomalen growth differentiation factor 9 (GDF9)-Gen bekannt. Heterozygote Mutterschafe zeigen einer erhöhte Ovulationsrate, während homozygote Tiere steril sind. In Tieren, die sowohl heterozygot für eine FecX- als auch für eine GDF9-Mutation sind, verstärkt sich dieser Effekt noch (HANRAHAN et al. 2004).
Das Vorgehen bei der Identifizierung der kausalen Mutation im GDF9 Gen unterscheidet sich grundlegend von der Aufklärung der zuvor genannten monogenen Merkmale. Anstatt einer Kopplungsanalyse wurde auf der Gru
eine gezielte Kandidategenanalyse vorgenommen (HANRAHAN et al. 2004). Dieses Vorgehen ist nur möglich, sofern ein vergleichbarer Phänotyp bei einer anderen Spezies, in der Regel Mensch oder Maus, existiert und das ursächliche Gen bekannt ist. Auf diese Weise konnten weitere monogene Merkmale beim Schaf aufgeklärt werden.
Die dominant schwarze Fellfarbe des Schafes wird durch das EB-Alle
Extension-Locus hervorgerufen. Auf der Grundlage bekannter Mutationen bei Maus und Fuchs wurde als molekulargenetische Grundlage eine Punktmutation im melanocortin 1 receptor (MC1R) Gen ist (VÅGE et al. 1999).
Verschiedene Formen der Porphyria cutanea tarda des Menschen werden durch Mutationen des uroporphyrinogen decarboxylase (UROD) Gens hervorgerufen. Ein ähnlicher Phänotyp mit Photosensibilit
Fleischschaf beobachtet. Als ursächliches Gen konnte auch hier das UROD-Gen identifiziert werden. Die Tatsache, dass alle untersuchten Tiere heterozygot für die Defektmutation waren führte zu dem Schluss, dass das homozygote Vorliegen der Mutation embryonal letal sei
