Universität Regensburg Fakultät Physik
Fortgeschrittenen-Praktikum Physik
Versuch: Photosynthese
(1. Version der Anleitung, 5/2003 V. Gerhardt, Dell:, „Photosynthese-Versuchsanleitung.DOC)
1. Aufgabenstellung
Die Abklingkurven der Verzögerten Fluoreszenz von Chlorella (Grünalgen) und von Cyanobakterien (Blaugrün-Algen) sollen als Funktion folgender Parameter untersucht werden:
1. Variation der Anregungsintensität:
a) Verschiedene Stufen der Redox-Zustände des Elektronentransport-Systems des Z- Schemas sollen über die Abklingkinetik analysiert werden.
b) Das Integral der DF-Abklingkurven (proportional zur Anzahl der im Dunkeln rekombinierenden Ladungsträger) soll als Funktion der Anregungsintensität gemessen werden.
2. Anregung beider Photosysteme PS I und PS II durch Weißlicht
Bevorzugte Anregung von PS I durch Rotlicht Wellenlänge > 680 nm (für diesen Versuch muß die Probentemperatur auf 12 – 17 C abgesenkt werden.
3. Einfluß eines Herbizids (Atrazin oder DCMU) auf die Abklingkinetik der DF 4. Zusatzversuche (als Option, Hardware noch nicht vollständig vorhanden):
a) Temperaturabhängigkeit der Abklingkinetik der DF im Bereich 8 C bis 38 C b) Simulation des Z-Schemas mit einem „Analogrechner“
2. Grundlagen
Der Versuch dient zur Einarbeitung in die Grundlagen der Photosynthese (Siehe Lehrbücher der Pflanzenphysiologie). Mit der speziellen Untersuchungsmethode „Delayed Fluorescence“
(DF) können die Ladungszustände des Elektronentransports der Lichtreaktionen der Photosynthese „in-vivo“ - also an intakten photosynthetisch aktiven Zellen untersucht werden. Als Untersuchungsmaterial werden einzellige Algen (Phytoplankton) verwendet, die in einem Bioreaktor gezüchtet werden.
3. Schlüsselworte für die Vorbereitung:
Elektronenniveaus von Molekülen, Molekülspektroskopie (UV, VIS, IR ), Elektronischer Übergang, Schwingungsübergang, Rotationsübergang, Jablonski-Diagramm, Fluoreszenz, Rekombinations-Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Moleküle in eine Proteinmatrix, Thylakoid- Membran, Z-Schema, Elektronentransport-Kette, Funktionelle Molekülgruppen des Z- Schemas, PS I und PS II, Reaktionszentren P680 und P700, Elektronen-Donator und Akzeptor-Moleküle, Qa, Qb, Plastoquinon, Wasserspaltendes Mn-Enzym, ADP, ATP, NADPH, NADPH+, Sauerstoff-Entwicklung, Induktion der Photosynthese (Kautzky-Effekt) prompte Fluoreszenz, verzögerte Fluoreszenz, zyklische Phosphorilierung.
4. Versuchsaufbau
Abb. 1:
Versuchsaufbau „Photosynthese“: Die Komponenten der Apparatur zur Messung der DF- Kinetik.
Die Apparatur wird durch einen µProzessor (BASICTIGER, 16 BIT) gesteuert. Dieser ist zuständig für das Photoncounting, Steuerung der Schrittmotore für die Schlauchpumpen (mit Rampe starten, schnell, langsam, vor, zurück, stop) und die Lichtregelung der Leuchtdioden für die Variation der Anregungsintensität. Der µProzessor erhält seine Befehle vom PC durch ein „Testpoint“-Steuerprogramm. Testpoint ist ein Realtime-Programmiersystem, mit dem Windows-Benutzeroberflächen für Gerätesteuerungen programmiert werden können. Es enthält unter anderem Programmierwerkzeuge für
• die seriellen Schnittstellen (RS232),
• das HP-IB-Interface (IEEE 488), mit dem viel Meßgräte wie Digitalmultimeter, Counter/Timer, Oszillographen usw. an den PC angeschlossen werden können,
• PC-Mess-und Steuerkarten, die im ISA- oder im PCI- Bus des PC´s stecken.
Einzelne Photonen der sehr niedrigen Intensität der verzögerten Fluoreszenz werden mit einem „Channel-Photomultiplier“, der über der Emissionsküvette montiert ist, im photon- counting-Modus detektiert.
Die Lichtintensität der LED´s (oder Jod-Quarz-Glühlampe) für das Anregungslicht wird über einen Lichtleiter am Boden der Anregungsküvette mit einer Si-Photodiode und dem am HP- IB-Bus angeschlossenen Digitalvoltmeter (Auflösung 100 nV !) gemessen.
Abb. 2:
Schema des Versuchsaufbaus.
Die aus dem Bioreaktor entnommenen Algen (Chlorella (Chlorophyta) oder Synechocystis (Cyanophyta)) werden mit Leitungswasser verdünn (ca. 1:10 ) und in ein Becherglas (1000 ml) eingefüllt. Dieses Becherglas wird für die Dunkeladaption der Algen unter den
Messingzylinder gestellt. Die Dunkeladaption soll mindestens 15 Minuten betragen.
Über die Pumpe P2 „Füllen“ wird unter der Kontrolle des Computers die Anregungsküvette mit Algensuspension gefüllt. Hier werden die Algen mit Rotlicht (620 nm) über zwei
ultrahelle Leuchtdioden beleuchte. Die Anregungsintensität kann über eine Stromregelung für die LED´s vom PC gesteuert werden. Die maximal erzielbare Lichtintensität beträgt ca. 100 W/m2. Für höhere Anregungsintensitäten bis zu 2000 W/m2 (ca. zweifache Sonnenlicht- Intensität) können die LED´s durch eine Iod-Quarz-Glühbirne mit Reflektor ersetzt werden.
Am Boden der Anregungsküvette, bedeckt von der Algensuspension, befinden sich ein Lichtleiter und eine Si-Photodiode zur Relativmessung der Anregungsintensität.
(Strommessung mit Arbeitswiederstand, der Spannungsabfall wird vom HP-Digitalvoltmeter gemessen).
Zwischen Lichtquelle und Anregungsküvette können verschiedenen Filter gelegt werden, z.B.
Graufilter zur Abschwächung des Glühlampenlichts oder Kantenfilter zur Erzeugung von dunkelrotem Licht mit Wellenlängen > 680 nm (z.B. RG 695 = „RotGlas“ mit 50 % Transmission bei 695 nm).
Die Pumpe P1 „DF-Kreislauf“ pumpt die Algensuspension von der Anregungsküvette in die DF-Emissionsküvette und zurück. Der Flüssigkeitskreislauf ist so angeordnet, daß absolut kein Licht von der Anregungsküvette in die Emissionsküvette dringen kann. Während des Umpumpens werden die Algen mit einer gemittelten Lichtintensität durch die
Anregungslichtquelle beaufschlagt. Zur Messung der Abklingkurve der DF wird die Pumpe P1 schlagartig angehalten und dann die Intensität der DF mit dem rotempfindlichen Channel- Photomultiplier (Trialkali-Kathode) im Wellenlängenbereich zwischen 680nm bis 750 nm
gemessen. Die detektierten DF-Photonen werden pro Sekunde über einen Zähler vom
µProzessor registriert und über die serielle Schnittstelle zum Testpoint-Meßprogramm in den PC übertragen. Das Abklingen der DF der Algenzellen wird in der Regel 60 s lang gemessen (Variation der Meßzeit ist über das Testpoint-Programm möglich).
Das Meßprogramm speichert die Meßwerte automatisch mit einem aus Datum und Uhrzeit erzeugten Dateinamen ab.
Das Meßprogramm erlaubt die Einzelsteuerung der Pumpen P1 –P3: Nehmen einer neuen Algenprobe aus dem Dunkeladaptionsgefäß (mit vorgeschaltetem Entleeren der alten Algenprobe), Messen einer oder mehrere Abklingkurven, Einstellen der Lichtintensität der LED-Anregung, Messen der Lichtintensität.
Anmerkung:
Apparatur und Meßprogramm sollen noch erweitert werden, insbesondere mit einer
Temperierung der Algenprobe zur Messung der Temperaturabhängigkeit der Abklingkinetik der DF (Bestimmung des (relativen) chemischen Potentials der Elektronenakzeptoren im Z- Schema).
5. Verwendete experimentelle Techniken
• Photoncounting, Channel-Photomultiplier.
• µProzessor-Steuerung.
• Realtime-Ablaufsteuerung durch Testpoint-Programm auf dem PC (Einzelheiten oder Einführung in diese Programmiertechnik bei V. Gerhardt).
• Auswertung mit Origin: Darstellung der Ergebnisse, Fitprogramm mit “Userdefined Funktion“.
• Licht- und Temperaturmessung mit dem HP-Voltmeter 5357A, HP-IB-Bus.
6. Einführende Literatur „Photosynthese“
A) Powerpoint-Präsentation zum Versuch B) Lehrbücher der Pflanzenphysiologie, z.B.:
1. Biologie- Schulbuch: Klett Verlag Kapitel…
2. Mohr-Schopfer, Springer-Verlag, Kap….
3. Straßburger (Herausgeber) ….
4. Haeder (Herausgeber): „Photosynthese“ , Thime Verlag
Verschiedene internationale Internetseiten, die leicht unter dem, Stichwort „Photosynthese“
gefunden werden können (z.B. Uni-Hamburg, USA: Govindee, Kock….).
Abb. 4:
Nur eine kleine Auswahl von Büchern!
7. Weiterführende Literatur zum FP-Versuch “Photosynthese”
(für den Versuch wichtigere Literatur ist fett gedruckt)
Berman, T., Yacobi, Y.Z., and Pollingher, U. (1992): Lake Kinneret phytoplankton: stability and variability during twenty years (1970-1989). Aquat. Sci. 54, 104-127.
Bodemer, U. (1998): DF excitation spectroscopy of phytoplankton: realtionship between dynamics of algal populations and discharge. Arch. Hydrobiol. Suppl. 115/2 (Large Rivers 11 No 2), 125-138.
Bodemer, U. (2001): Adaptation of photosynthesis of Chlorella spp. to light conditions:
changes in efficiency of charge separation detected by in vivo delayed fluorescence exci- tation spectroscopy. Proc. 12th International Congress on Photosynthesis, Brisbane 2001, S22-039, CSIRO Publishing, Collingwood (Australia).
Bodemer, U., Gerhardt, V., Yacobi, Y.Z., Zohary, T., Friedrich, G. and Pohlmann, M. (2000):
Phytoplankton Abundance and Composition of Freshwater Systems Determined by DF- Excitation Spectroscopy and Conventional Methods. Arch. Hydrobiol. Spec. Issues Advanc. Limnol. 55, 101-120.
Dokulil, M.T. and Teubner, K (2000): Cyanobacterial dominance in lakes. Hydrobiologia 438 (1-3), 1-12.
Friedrich, G., Gerhardt, V., Bodemer, U. and Pohlmann, M. (1998): Phytoplankton composition and chlorophyll concentration in freshwaters: Comparison of delayed fluorescence excitation spectroscopy, extractive spectrophotometric method, and Utermöhl method. Limnologica 28(3), 232-328.
Fujita, Y., Murakami, A., Aizaura, K. and Ohki, K. (1994): Short-term and long-term
adaptation of the photosynthetic apparatus: Homeostatic properties of thylakoids.
In: Bryant, D.A. (ed): The Molecular Biology of Cyanobacteria, Kluwer Academic Publishers, 677-692.
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(eds.): Methoden der biologischen Wasseruntersuchung, Band 2: Biologische Gewässeruntersuchung, Jena, 375-398.
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