Einfluss zweier progesteronfreisetzender Präparate (PRID®alpha, CIDR®) auf die Synchronisation der Empfängertiere im Rahmen eines
Embryotransferprogramms beim Rind
INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Barbara Auinger Wassertrüdingen
Hannover 2011
wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christine Wrenzycki, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken 2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme, Klinik für Pferde
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2011
Gefördert durch die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl-Stiftung in Neustadt an der Aisch
1 Einleitung ... 1
2 Literatur ... 2
2.1 Zyklus des Rindes ... 2
2.1.1 Endokrinologischer Zyklus ... 2
2.1.1.1 Sexualhormone ... 2
2.1.1.2 Hormonelle Zyklusregulation ... 4
2.1.2 Nicht endokrinologische, zyklische Veränderungen ... 6
2.2 Brunstsynchronisation beim Rind ... 10
2.2.1 Ovsynch ... 11
2.2.2 Synchronisation mit PGF
2α... 15
2.2.3 Synchronisation mit Gestagenen ... 17
2.3 Endometrium des Rindes ... 20
2.3.1 Histologisch- anatomischer Aufbau des Endometriums ... 20
2.3.2 Zyklische Veränderung des Endometriums ... 20
2.3.2.1 Veränderung der Drüsen ... 20
2.3.2.2 Veränderung der Rezeptoren... 22
2.3.2.3 Veränderung der Genexpression im Endometrium ... 25
3 Material und Methoden ... 29
3.1 Tiermaterial ... 29
3.2 Zykussynchronisation ... 29
3.3 Allgemeiner Versuchsablauf ... 31
3.4 Brunstbeobachtung, rektale Untersuchung und Befunderhebung ... 31
3.5 Embryotransfer ... 34
3.5.1 Auswahl der Empfängertiere ... 34
3.5.2 Vorbereitung der Embryonen ... 34
3.5.3 Durchführung des Embryotransfers ... 36
3.6 Trächtigkeitsuntersuchung ... 36
3.7 Endometriumsbiopsie ... 37
3.8 Blutentnahmen, Aufbereitung der Blutproben und Plasmaprogesteronbestimmung ... 38
3.9 RT-qPCR der Biopsieproben ... 39
3.9.1 Isolierung der RNA ... 39
3.9.2 Reverse Transkription (RT) ... 40
3.9.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 41
3.10 Statistik ... 43
4 Ergebnisse ... 48
4.1 Einfluss der Präparate auf die Brunstsynchronisation ... 48
4.1.1 PRID-Synchronisation für 8 Tage ... 48
4.1.2 CIDR-Synchronisation für 8 Tage ... 49
4.1.3 PRID-Synchronisation für 9 Tage ... 49
4.1.4 CIDR-Synchronisation für 9 Tage ... 49
4.1.5 Vergleich der Medikationsdauer und des verwendeten Medikaments ... 50
4.2 Einfluss der Präparate auf den Plasmaprogesteronspiegel ... 50
4.2.1 PRID-Synchronisation für 8 Tage ... 50
4.2.2 CIDR-Synchronisation für 8 Tage ... 51
4.2.3 PRID-Synchronisation für 9 Tage ... 52
4.2.4 CIDR-Synchronisation für 9 Tage ... 53
4.2.5 Vergleich der Medikationsdauer und des Medikaments ... 54
4.3 Einfluss der Präparate auf die ET-Nutzungsrate und die Trächtigkeitsraten . 56 4.4 messangerRNA-Expression des Endometriums ... 57
5 Diskussion... 59
5.1 Einfluss der Medikationsdauer auf den Brunstsynchronisationserfolg, die ET- Nutzungsrate und die Trächtigkeitsraten ... 59
5.2 Einfluss des Zyklusstandes zu Beginn der Synchronisation ... 61
5.3 Einfluss auf den Erfolg des Embryotransfers ... 62
5.4 Bedeutung des Progesteronwerts am Tag des Embryotransfers ... 64
5.5 Eignung der Synchronisationsprogramme zur Empfängertiervorbereitung .. 65
5.6 Einfluss der Präparate auf die mRNA-Expression des Endometriums ... 67
6 Zusammenfassung ... 70
7 Summary ... 72
8 Literaturverzeichnis ... 74
9 Anhang ... 91
10 Abkürzungsverzeichnis ... 93
11 Abbildungsverzeichnis ... 95
12 Tabellenverzeichnis ... 96
1 Einleitung
MOET (multiple Ovulationen und Embryotransfer)-Programme, d. h. die Superovulation eines Spendertieres mit anschließender Übertragung geeigneter Embryonen auf zyklussynchrone Empfängertiere, sind seit mehreren Jahrzehnten fest in die züchterische Praxis integriert. Diese Methode bietet den Landwirten und Tierzüchtern die Möglichkeit von einem Muttertier mehrere Nachkommen pro Jahr erzeugen zu können. Damit lassen sich züchterisch wertvolle, weibliche Tiere vermehren bzw. vom Aussterben bedrohte Rinderrassen erhalten. Darüber hinaus erleichtert diese Technologie den Export von Zuchtmaterial ins Ausland, da nicht Tiere, die strengen seuchenhygienischen Bestimmungen unterliegen, sondern nur tiefgefrorene, d. h.
in flüssigem Stickstoff konservierte Embryonen, deren Export weniger Auflagen unterliegt, transportiert werden müssen (HASLER 2003, HANSEN u. BLOCK 2004, BUSCH u.
WABERSKI 2007).
Ein häufig auftretendes Problem bei der Anwendung dieser reproduktionsmedizinischen Biotechnologie stellt die Bereitstellung zyklussynchroner Empfängertiere dar. In den vergangen Jahren wurden v. a. Synchronisationsprogramme mit Prostaglandin F2α (PGF2α) verwendet.
Schwierigkeiten, die dabei auftreten, sind zum Einen, dass sich bei Tieren, die sich in den ersten sechs Tagen des Sexualzyklus befinden, keine Brunst durch PGF2α induzieren lässt (ODDE 1990, BÓ et al. 2002, LUCY et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Zum Anderen kann die Brunst zwischen zwei und fünf Tagen nach Prostaglandinapplikation eintreten (MACMILLAN u. HENDERSON 1984, BÓ et al. 2002, KANITZ u. BECKER 2005), wodurch der Landwirt zu einer intensiven und zeitaufwändigen Brunstbeobachtung gezwungen wird.
Eine andere Möglichkeit Empfängertiere zu synchronisieren besteht darin, die Tiere vor der PGF2α-Gabe mittels eines intravaginalen, progesteronfreisetzenden Präparates zu behandeln. In Deutschland sind dafür im Moment zwei Produkte zugelassen, zum einen die PRID®alpha (Progesterone releasing intravaginal device)-Spirale, zum anderen die CIDR® (controlled intravaginal drug release)-Spange.
In der vorliegenden Arbeit sollen die beiden Darreichungsformen vergleichend im Hinblick auf ihre Eignung zur Empfängertiersynchronisation untersucht werden. Darüber hinaus soll der Einfluss der Präparate auf das Endometrium der Rezipienten am Tag des Embryotransfers dargestellt werden.
2 Literatur
2.1 Zyklus des Rindes
2.1.1 Endokrinologischer Zyklus 2.1.1.1 Sexualhormone
Die äußerlich sichtbaren Veränderungen am weiblichen Genital des Rindes und die Verhaltensänderungen sind auf den Anstieg bzw. den Abfall verschiedener Sexualhormone zurückzuführen. Die wichtigsten Hormone sind hierbei GnRH (Gonadotropin Releasing Hormon), die beiden Gonadotropine FSH (Follikel stimulierendes Hormon) und LH (Luteinisierendes Hormon), das Gestagen Progesteron (P4), das Östrogen17β-Östradiol (E2), das Gewebshormon Prostaglandin F2α (PGF2α), sowie das Peptidhormon Oxytocin (OT).
Tabelle 1 zeigt einen Überblick über diese Hormone, ihre Zielorgane, sowie ihre Wirkungen.
Tab. 1: Übersicht über die Wirkung der wichtigsten Sexualhormone (modifiziert nach GRUNERT 1999).
Hormon Zielorgan Direkte Wirkung Indirekte Wirkung GnRH
(Gonadotropin Releasing Hormon)
Hypophysen- vorderlappen (HVL)
Ausschüttung von FSH und
LH Ovulation (falls Tertiär-
follikel vorhanden);
Rückbildung von Follikel-Theka-Zysten FSH (Follikel
stimulierendes Hormon)
Ovar Follikelwachstum (Bildung multipler GRAAFscher Follikel), Superovulation LH
(Luteinisieren- des Hormon)
Ovar
(Tertiärfollikel, Follikel-Theka- Zysten)
Ovulation, z. T.
Luteinisierung von Follikel- Theka-Zysten
Corpus-luteum-Bildung;
Rückbildung von Follikel-Theka-Zysten P4
(Progesteron)
a) Uterus Induktion und Aufrechter- haltung der Sekretionsphase im Endometrium;
Verschluss der Zervix
Aufrechterhaltung der Gravidität
b) Hypothalamus- HVL
Blockierung der
Sensibilisierung gegenüber GnRH
Rebound-Effekt nach P4- Abfall, Brunst
E2
(17β-Östradiol)
a) Uterus Induktion der Proliferations- phase im Endometrium;
Zervixöffnung
Brunst
b) Ovar Luteolyse Brunst
c) HVL Ausschüttung von LH Ovulation (falls Tertiär- follikel vorhanden);
Rückbildung von Follikel-Theka-Zysten Prostaglandin
F2α (PGF2α)
Ovar
(Gelbkörper;
Luteingewebe, z. B. in Follikel oder Zyste)
Luteolyse Brunst
Oxytocin (OT) Uterus Kontraktion des Uterus;
Freisetzung von PGF2α
Luteolyse
2.1.1.2 Hormonelle Zyklusregulation
Die verschiedenen hormonellen Veränderungen und die dadurch bedingten Verhaltensänderungen dienen letztendlich dazu, den Genitaltrakt auf eine Befruchtung und anschließende Implantation vorzubereiten (RATHBONE et al. 2001). Zu Beginn des Östrus bilden die Granulosazellen des präovulatorische Follikels große Mengen an 17β-Östradiol, das über den Blutkreislauf zum Hypothalamus gelangt und dort die plötzliche Freisetzung von GnRH stimuliert. Außerdem bereitet 17β-Östradiol den Genitaltrakt auf die Befruchtung und den Transport der Gameten bzw. des Embryos vor (RATHBONE et al. 2001). Der Progesteronspiegel ist zu diesem Zeitpunkt niedrig, da kein oder nur ein Rest von Gelbkörpergewebe vorhanden ist. Der hohe Östrogenspiegel führt zu einer Ödematisierung der Mukosa und einer Erhöhung der Kontraktilität der glatten Muskulatur (MITKO et al. 2008).
Durch die Stimulierung der GnRH-Freisetzung gelangt Gonadoliberin über die Portalvene an den Hypophysenvorderlappen, wo es den präovulatorischen Anstieg der LH- und FSH- Sekretion bewirkt. Zeitgleich nimmt die Konzentration an 17β-Östradiol im Blut ab, bleibt aber bis zur vollständigen Ausbildung des Gelbkörpers auf einem hohen Level. Die FSH- Ausschüttung stimuliert das Follikelwachstum, LH löst die Ovulation aus. Nach der Ovulation fördert LH die Luteinisierung der Theka- und Granulosazellen zu Luteinzellen. Es folgt eine schnelle Vaskularisation und Zellproliferation. Nach dem Gipfel gehen die FSH- und LH-Werte wieder auf ihre basalen Werte zurück. Auf Grund der niedrigen Progesteronkonzentration ist die Frequenz der pulsatilen LH-Ausschüttung zu Beginn des Zyklus (Tag 2-3) höher als während der Lutealphase. Mit der Ausbildung eines funktionsfähigen Gelbkörpers steigt der Progesteronspiegel an (bis Tag 6-7). Dies verhindert einen präovulatorischen LH-Peak (RATHBONE et al. 2001), da Progesteron eine anitöstrogene Wirkung hat (MCCRACKEN et al. 1999). Progesteron hemmt über einen kompetitiven Antagonismus die durch Östrogen bedingte Sensibilisierung des Hypophysenvorderlappens gegenüber GnRH. Zusätzlich wird auch die GnRH-Ausschüttung reduziert. Die FSH-Sekretion bleibt nahezu unbeeinflusst, so dass während der Lutealphase weiterhin Follikelreifungswellen stattfinden (DÖCKE 1994).
Gegen Ende der Lutealphase reguliert Progesteron seinen eigenen Rezeptor über die Abnahme der entsprechenden mRNA herunter (SPENCER u. BAZER 1995, MCCRACKEN et al. 1999, OKUMU et al. 2010). Dadurch wird die hemmende Wirkung des Progesterons auf die
Prostaglandinsynthese aufgehoben. Nun tritt die 17β-Östradiolwirkung in den Vordergrund, E2 stimuliert dabei die Synthese von Prostaglandin F2α im Endometrium über zwei Wege. Zum einen erhöht 17β-Östradiol die Enzymaktivität von Phospholipase A2, welches der limitierende Faktor bei der PGF2α-Bildung ist. Zum anderen vermehrt es die Zahl der endometrialen Oxytocinrezeptoren (DÖCKE 1994, MCCRACKEN et al. 1999). Diese sind vorher auf Grund der antiöstrogenen Wirkung von Progesteron erniedrigt (MCCRACKEN et al. 1999), da Progesteron die Genexpression des Oxytocinrezeptors inhibiert (GOFF 2004). Diese Hemmung wird über ca. 12 Tage beibehalten (KOMBÉ et al. 2003). Oxytocin aus dem Gelbkörper und der Hypophyse führt über eine Aktivierung der Adenylatzyklase letztendlich zur Synthese von PGF2α aus Arachidonsäure (DÖCKE 1994, ASSELIN et al. 1997). Durch den Anstieg von Prostaglandin F2α kommt es zur Regression des Corpus luteums (CL), die sich durch eine verringerte Durchblutung des Gewebes, eine Veränderung der Zellmembran, eine Abnahme der sekretorischen Granula, Lipideinlagerungen im Zytoplasma, sowie eine Reduktion des endoplasmatischen Retikulums in den Luteinzellen äußert. Durch die Auflösung des Gelbkörpers kommt es zu einem schnellen Abfall der Progesteronkonzentration, so dass der Progesteronblock auf den Hypothalamus aufgehoben wird. Zudem produziert der sich nun anbildende dominante Follikel vermehrt 17β-Östradiol und es kommt wieder zu einem ovulationsauslösenden LH-Peak (DÖCKE 1994). Abbildung 1 zeigt das Hormonprofil der Sexualhormone während des Zyklus des Rindes.
Abb. 1: Schematische Darstellung des Hormonprofils des weiblichen Rindes während des Zyklus (nach REHFELD 2005)
2.1.2 Nicht endokrinologische, zyklische Veränderungen
Das domestizierte Rind ist anders als die Wildform ein asaisonal, polyöstrisches Tier. Die durchschnittliche Dauer des Sexualzyklus beträgt dabei 21 Tage, Zyklen zwischen 18 und 24 Tagen werden aber ebenfalls als physiologisch angesehen. Färsen haben einen kürzeren Zyklus von im Durchschnitt 20 Tagen. Einfluss auf die Zykluslänge haben sowohl genetische als auch umweltabhängige Faktoren (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999).
Dabei lässt sich der Zyklus des Rindes rein deskriptiv unterteilen. Mit dem äußeren Zyklus werden Verhaltensänderungen und bei der Adspektion feststellbare Veränderungen während des Zyklus beschrieben. Der ovarielle Zyklus umfasst zyklische Veränderungen an den Eierstöcken. Der Schleimhautzyklus beschreibt Veränderungen an den Genitalschleimhäuten im makro- und mikroskopischen Bereich (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999)
Äußerer Zyklus
Auf Grund der auftretenden Verhaltensänderungen, die auf die endokrinologischen Veränderungen (siehe 2.1.1) zurück zu führen sind, wird der Brunstzyklus in vier Phasen unterteilt.
• Östrus (auch Brunst, Haupt- oder Hochbrunst): Dauer ca. 18 Stunden
• Postöstrus (auch Nachbrunst oder Metöstrus): Dauer etwa 2-3 Tage
• Interöstrus (auch Zwischenbrunst oder Diöstrus): entspricht dem Intervall zwischen Postöstrus und Präöstrus, ca. 16 Tage
• Präsöstrus (auch Vorbrunst oder Proöstrus): Dauer ca. 2-3 Tage (GRUNERT u.
BERCHTOLD 1999).
Der Östrus ist die Zeitspanne, in der das weibliche Rind den Aufsprung duldet und dauert durchschnittlich 18 Stunden (2-30 Stunden). Letztendlich ist für dieses Verhalten das neuroendokrine System verantwortlich, das durch verschiedenste Umwelteinflüsse stimuliert wird (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999, BUSCH u. WABERSKI 2007).
Der Postöstrus lässt sich nicht genau abgrenzen, ist aber als Zeitraum zwischen dem Ende der Duldungsbereitschaft und dem Verschwinden der äußeren und inneren Brunstsymptome definiert. In die Nachbrunst fällt die Ovulation. Rinder ovulieren ca. 30 - 35 Stunden nach Beginn und etwa 7 Stunden nach Ende des Östrus. Die Anbildung des Gelbkörpers, sowie die Befruchtung findet ebenfalls im Metöstrus statt (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999).
Der Diöstrus ist die Zeitspanne der sexuellen Ruhe und entspricht weitestgehend der Gelbkörperphase des ovariellen Zyklus und der Sekretionsphase des Schleimhauzyklus. Er dauert vom Ende des Postöstrus bis zum Beginn des Präöstrus, was ca. 16 Tagen entspricht. Der Interöstrus endet mit der Luteolyse, die durch Prostaglandin F2α aus dem Uterus induziert wird (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999).
Der Präöstrus ist ebenso wie der Postöstrus nicht exakt definierbar. Er wird umschrieben als Zeitraum zwischen dem Beginn der Verhaltensänderung und der erstmaligen Duldung des Aufsprungs. Äußerlich fällt eine leichte Vulvaschwellung, eine Hyperämie der Scheidenschleimhaut, sowie gelegentlich der erste Schleim auf, dieser ist zunächst noch viskös, gegen Ende des Proöstrus wird er aber vermehrt klar, durchsichtig und fadenziehend.
(GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Abbildung 2 zeigt schematisch die Verhaltensänderungen geschlechtsreifer Rinder während des Sexualzyklus.
Abb. 2: Schematisch Darstellung des Brunstverhaltens von geschlechtsreifen Rindern in zeitlicher Abfolge (nach BUSCH u. WABERSKI 2007, BOSTEDT 2004)
Ovarieller Zyklus
Der ovarielle Zyklus umschreibt die palpatorisch erfassbaren, zyklusbedingten Veränderungen an den Ovarien. Das Ovar ist dabei einerseits das Erfolgsorgan der neuroendokrinen Reize, andererseits produzieren die Funktionsgebilde auf den Eierstöcken Hormone, die den Zyklus aufrecht erhalten. Der ovarielle Zyklus lässt sich in drei Phasen unterteilen.
• Follikelreifungsphase: entspricht den Tagen 19/20-21 des alten und Tag 1 des neuen Zyklus
• Ovulationsphase: 1. und 2. Tag des Brunstzyklus
• Gelbkörperphase: dauert von Tag 2/3 bis Tag 18/19 des Zyklus
Die Größe der Ovarien ist von dem jeweiligen Funktionskörper beeinflusst und ändert sich während des Zyklus. Während des gesamten Zyklus ist ein Follikelwachstum vorhanden. Es gibt Zyklen mit zwei bzw. drei Follikelwellen. Wobei Tiere mit drei Wellen meist eine
verlängerte Gelbkörperphase aufweisen. In jeder Follikelwelle entwickelt sich aus dem Pool an Tertiärfollikeln ein dominanter Follikel, die restlichen Follikel atresieren (BO et al. 1994, GINTHER et al. 1996). Zur Ovulation kommt nur der dominante Follikel der letzten Follikelreifungswelle und wird zum GRAAFschen Follikel, da nun die Blockade durch Progesteron aufgehoben ist. Nach der Ovulation bildet sich ein Corpus luteum an der Stelle des Follikels (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Dieser ist palpatorisch zwischen Tag 6 / 7 und 18 nachweisbar. Das Corpus luteum ist der Hauptbildungsort von Progesteron. Das meiste P4 synthetisiert der Blütegelbkörper. Findet keine Befruchtung statt, bildet sich der Gelbkörper wieder zurück und ein neuer Follikel kommt zur Ovulation, da die hemmende Wirkung des Progesterons entfällt (ZEROBIN 1987).
Schleimhautzyklus
Der Schleimhautzyklus umfasst alle zyklischen Veränderungen an der Schleimhaut des Genitaltraktes. Die Umbauprozesse schaffen optimale Bedingungen für die Befruchtung der Eizelle und für die Ernährung des Embryos. Bedingt werden die Veränderungen durch Hormone des Follikels und des Gelbkörpers. Der Fokus liegt hier v. a. auf dem Endometrium.
So kommt es nach der Regenerationsphase (Tag 15-19) unter dem Einfluss von Östrogenen aus dem Follikel zur Proliferationsphase (19. – 2.Tag). Diese geht auf Grund des Progesteronanstiegs bedingt durch das Wachstum des Gelbkörpers in die Sekretionsphase (Tag 3 – 14) über. Etwa ein bis zwei Tage nach dem Östrus kommt es insbesondere bei Färsen zu petechialen Blutungen im Karunkelbereich. Dies wird als sogenanntes „Abbluten“ sichtbar. Das Abbluten ist ein Zeichen für eine erfolgte Ovulation, lässt aber keine Rückschlüsse auf eine erfolgreiche Konzeption zu. Die Ausprägung des von der Zervix gebildeten Schleims ist in der Gelbkörperphase eher viskös und wird unter Östrogeneinfluss vermehrt flüssig. Die Scheidenschleimhaut lässt wegen der adspektorisch feststellbaren Veränderungen (Hyperämie der Scheidenschleimhaut, Ödembildung der Portio vaginalis cervicis) einen Rückschluss auf den jeweiligen Zyklusstand zu (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Mit einem Ultraschallgerät lässt sich zudem die ansonsten schwer zu untersuchende Uterusschleimhaut darstellen. So kann z. B. die sich zyklisch oder krankhaft verändernde Schleimhautdicke erfasst werden (BONAFOS et al. 1995).
2.2 Brunstsynchronisation beim Rind
Die Brunstsynchronisation beim Rind findet in der modernen Rinderzucht verschiedene Anwendungsmöglichkeiten. Größer werdende Betriebe mit steigenden Tierzahlen führen dazu, dass eine genaue Brunstbeobachtung aller Tiere schwierig ist. Mehrere Studien zeigten, dass nur ca. 50 % der Brunsten erkannt werden und somit genutzt werden können (LYIMO et al.
2000, VAN EERDENBURG et al. 2002, RODRIGUES et al. 2010). Durch die Brunstsynchronisation ist es möglich, eine terminorientierte Besamung ohne vorherige Brunstbeobachtung durchzuführen (TENHAGEN et al. 2001, MARTÍNEZ et al. 2002b, KANITZ u. BECKER 2005, RODRIGUES et al. 2010). Darüber hinaus wird in Regionen mit saisonaler Abkalbung die Brunstsynchronisation genutzt, um möglichst alle Tiere innerhalb eines bestimmten Zeitraums belegen zu können (BARUSELLI et al. 2004). Ein weiterer Anwendungsbereich ist die Synchronisation von Empfängertieren für den Embryotransfer. Bei der Übertragung von Embryonen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Empfängertiere zyklussynchron mit dem Spendertier bzw. dem Alter der Embryonen sind (NIEMANN u.
BURKHARD 1993, LOONEY et al. 2006, BUSCH u. WABERSKI 2007). Die besten Ergebnisse werden erreicht, wenn die Rezipienten zwischen 12 Stunden vor bzw. nach dem Empfänger ovulieren. Da sich Embryonen, die durch Superovulation entstanden sind, schneller entwickeln, sind Tiere, die bis zu 24 Stunden vor dem Spender ovuliert haben ebenfalls noch als Empfänger geeignet (HASLER et al. 1987, SPELL et al. 2001, LOONEY et al. 2006).
HASLER (1987) stellte zudem fest, dass Embryonen im Morulaestadium eine höhere Synchronität zwischen Spender und Empfänger benötigen, als Embryonen im Blastozystenstadium. Auch bei der Übertragung in vitro generierter Embryonen ist eine höhere Synchronität zwischen Spender und Empfänger nötig als bei in vivo gewonnenen Embryonen (LOONEY et al. 2006). Um eine möglichst hohe Ovulationssynchronität zu erreichen, gibt es verschiedene Verfahren, die Rezipienten zu synchronisieren. Die einzelnen Möglichkeiten werden im folgenden aufgeführt.
2.2.1 Ovsynch
Im Jahr 1995 entwickelten PURSLEY et al. (1995) das sogenannte Ovsynch-Programm, ein Brunstsynchronisationsprogramm ohne Brunstbeobachtung (KANITZ u. BECKER 2005).
Dabei wird die Ovulation mittels GnRH und PGF2α synchronisiert. Den Tieren wird bei diesem Programm zunächst unabhängig vom Zyklusstand 100 µg GnRH intramuskulär (i.m.) appliziert.
GnRH induziert einen Anstieg von LH und FSH. Dies wiederum führt zur Ovulation des dominanten Follikels (THATCHER et al. 2001). Nach sieben Tagen erhalten die Rinder 35 mg PGF2α i.m., was zur Luteolyse vorhandener Gelbkörper führt. Wenn es nach der ersten Injektion von GnRH zur Ovulation gekommen ist, ist der neu gebildete Gelbkörper bereits auf PGF2α
ansprechbar und es kommt zur Rückbildung des CLs. Weiter 48 Stunden später wird erneut GnRH (100 µg) verabreicht. Nun ovuliert der neue dominante Follikel, der zwischen der ersten und zweiten GnRH-Gabe bis zur präovulatorischen Größe gewachsen und nun ansprechbar auf den induzierten LH-Peak ist (PURSLEY et al. 1995, RATHBONE et al. 2001). Eine künstliche Besamung erfolgt 12 bis 24 Stunden nach der zweiten GnRH-Injektion (KANITZ u. BECKER 2005).
Vorteil dieses Programms ist es, dass eine Brunstbeobachtung unterbleiben kann, was v. a. in Betrieben mit einer geringen Brunsterkennungsrate ökonomische Bedeutung hat (TENHAGEN et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Allerdings ist ein mehrmaliges Fixieren und Handling der Tiere notwendig, was Arbeitszeit kostet und Stress für die Tiere bedeutet. Außerdem ovulieren einige Tiere je nach Zyklusstand bereits nach der ersten GnRH-Applikation (VASCONCELOS et al. 1999, MOREIRA et al. 2000). Diese fertilen Brunsten werden aber nicht genutzt (KANITZ u. BECKER 2005). Es gibt verschieden Modifikationen des Ovsynch- Programms, sie sollen entweder die Ovulationssynchronisation verbessern oder den Arbeitsaufwand im Rahmen eines terminorientierten Besamungsprogramms verringern. Ihr Ablauf sowie Vor- und Nachteile sind in Tabelle 2 dargestellt.
Presynch Ovsynch Programm Tab. 2a: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind Ovsynch, Presynch, Heatsynch, Cosynch und Selectsynch.
T – 26 PGF2α, T – 12 PGF2α, T 0 GnRH, T 7 PGF2α, T 9 GnRH + KB T 0 GnRH, T 7 PGF2α, T 9 GnRH, T 10 KB Ablauf derSynchronisation
Kühe Kühe undFärsen Tiermaterial
•Alle Tiere befindensich im Diöstrusbeim Beginn desOvsynch•Höhere TR-Raten als bei Ovsynch•Weitere Vorteilesiehe Ovsynch •Synchronisation unabhängig vomZyklusstand•Keine Brunstbeob-achtung•Terminorientierte Besamung möglich •Synchronisation auch azyklischer Tieremöglich Vorteile
•Hohe Medikamenten-kosten, •häufige Fixation der Tiere notwendig•fertile Brunsten werden nicht genutzt •Presynchronisation bei anöstrischen Tieren nicht erfolgreich •Hohe Medikamenten-kosten, •häufige Fixation der Tiere notwendig•ohne Brunstbeob-achtung reduzieteTrächtigkeitsraten •Färsen sprechen nicht so gut auf GnRH an Nachteile
(MOREIRA et al. 2001, EL-ZARKOUNY etal. 2004, PORTALUPPI u. STEVENSON2005) (PURSLEY et al. 1995, MIALOT et al. 2003, STEVENSON2008) Autor(en)
Cosynch e Heatsynch
Programm Tab. 2b: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind Ovsynch, Presynch, Heatsynch, Cosynch und Selectsynch (Fortsetzung).
T 0 GnRH, T 7 PGF2α, T 10 GnRH + KB T 0 GnRH, T 7 PGF2α, T 8 17β-Östra-diol-Zypionat T 10 KB Ablauf derSynchronisation
Kühe Kühe Tiermaterial
•geringerer Arbeitsaufwand •siehe Ovsynch •Deutlichere ÄußereBrunst (Duldungs-reflex, gegenseitigesBespringen) aufGrund der höheren E2-Konzentration•Bessere Induktiondes LH-Peaks durchGnRH bei anöstrischen Tieren •Siehe Ovsynch Vorteile
•Schlechtere Ovulati-onssynchronisation •KEINE Zulassung von E2-enthaltenden Medikamenten in der EU•Keine Verbesserungder TR-Raten imVergleich zu Ovsynch•Hoher Medikamenten undArbeitsaufwand Nachteile
(DEJARNETTEu. MARSHALL2003, PORTALUPPI u. STEVENSON2005, RABIEE et al. 2005, STERRY et al. 2007) (PANCARCI et al. 2002, BARTOLOME etal. 2005b, BARTOLOME etal. 2005a, LANEet al. 2008) Autor
Selectsynch Programm Tab. 2c: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind Ovsynch, Presynch, Heatsynch, Cosynch und Selectsynch (Fortsetzung).
T 0 GnRH, T 7 PGF2α, T 8 -10 KB nach Brunstbeob-achtung Ablauf derSynchronisation
Kühe undFärsen Tiermaterial
•geringerer Medika-menteneinsatz•seltenere Fixationnötig, v. a. bei Fleischrindernvorteilhaft Vorteile
•schlechtere Brunst-synchronisation •Brunstbeobachtungnotwendig•nicht zyklische Tierezeigen oft keine Brunst Nachteile
(CARTMILL et al. 2001b, LAMBet al. 2004) Autor
2.2.2 Synchronisation mit PGF2α
Die Tatsache, dass PGF2α und seine Analoga die Luteolyse bei Rindern auslösen, hat dazu geführt, dass die Hormone seit den 1970er zur Verkürzung der Lutealphase genutzt werden (LUCY et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Den Tieren wird dabei einmalig PGF2α oder eines seiner Analoga appliziert, nach anschließender Brunstbeobachtung über mehrere Tage können die Rinder dann besamt werden, bzw. bekommen sechs bis acht Tage nach der Brunst einen Embryo transferiert (BO et al. 1994, LOONEY et al. 2006). Je nach Zyklusstand zum Zeitpunkt der Injektion, rindern die Kühe und Färsen im Durchschnitt zwei bis fünf Tage später, auf Grund der erfolgten Luteolyse. Es ist eine Variation der Brunsteintritte von 2 – 10 Tagen möglich (MACMILLAN u. HENDERSON 1984, LUCY et al. 2004). Werden Tiere im frühen oder späten Diöstrus (Tag 7-9 oder Tag 14-16) behandelt, erfolgt der Brunsteintritt ca. drei bis vier Tage später, da sich die dominanten Follikel der ersten bzw. zweiten Follikelwelle zu diesem Zeitpunkt jeweils entwickelt haben (LUCY et al. 2004). Erfolgt die Injektion zwischen Tag 10 und 12, dauert es hingegen drei bis sieben Tage bis zum Brunsteintritt, da sich der dominante Follikel der ersten Follikelwelle zu diesem Zeitpunkt in Atresie befindet und der Follikel der zweiten Welle noch unreif ist (BÓ et al. 2002, LUCY et al. 2004). Entscheidend bei diesem Vorgehen ist, dass Rinder in den ersten fünf bis sechs Tagen des Zyklus nicht auf eine Injektion mit PGF2α reagieren, da die Gelbkörper zu diesem Zeitpunkt noch refraktär gegenüber der Behandlung sind (MACMILLAN u. HENDERSON 1984, BÓ et al. 2002, LUCY et al.
2004, KANITZ u. BECKER 2005). Um dieses Problem zu umgehen, können Rinder zweimal im Abstand von 11 bzw. 14 Tagen mit PGF2α (siehe Tabelle 3) behandet werden (LUCY et al.
2004, KANITZ u. BECKER 2005, LANE et al. 2008). Damit wird sichergestellt, dass sich alle zyklischen Tiere bei der zweiten Injektion im frühen Diöstrus befinden und somit die Brunstinduktion synchroner wird. In Tabelle 3 ist der Ablauf der Synchronisation mittels PGF2α, sowie deren Vor- und Nachteile dargestellt.
Zweimalige PGF2α- Injektion im
Abstand von 11 bzw. 14 Tagen Einmalige
PGF2α-Injektion Programm Tab. 3: Ablauf, Vor- und Nachteile der Brunstsynchronisation mittels ein- oder zweimaliger PGF2α-Gabe
T – 14 bzw. -11 PGF2α, T 0 PGF2α, T 2 – 5 Brunst-beobachtung+KB T 0 PGF2αT 2-5 Brunstbe-obachtung+KB Ablauf desProgramms
Kühe Kühe undFärsen Tiermaterial
•Bei der zweiten PGF2α-Gabe sind alle Tiere imgleichen Zyklusstand => bessere Brunst-synchronisation => Zyklusunabhängige Synchronisation möglich •Geringer Kosten für dieSynchronisation als bei Ovsynch mit vergleich-baren Ergebnissen •Terminorientierte Besamung möglich •Geringe Medikamen-tenkosten, durch eine rektale Voruntersuchung auf vorhandene CLs noch weiter minimierbar •kaum Stress für die Tiere•Verkürzung der Lutealphase Vorteile
•Brunstbeobachtungnotwendig•Azyklische Tieresprechen nicht auf die Behandlung an •Brunsteintritt zwischen 2 – 6Tagen => Brunstbeobachtungnotwendig•nur Tiere im Diöstrussind synchronisierbar •azyklische Tiere sindnicht synchronisierbar Nachteile
(JOBST et al. 2000, TENHAGEN etal. 2001, BORMAN et al. 2003, LEAN et al. 2003, KANITZ u. BECKER 2005) (MACMILLAN u. HENDERSON1984, ODDE 1990, LUCY et al. 2001, KANITZ u. BECKER 2005) Autor(en)
2.2.3 Synchronisation mit Gestagenen
Eine weitere Möglichkeit der Östrussynchronisation ist der Einsatz von Gestagenen in Kombination mit PGF2α. In Deutschland sind dafür die PRID®alpha-Spirale und die CIDR®- Spangen zugelassen. Beide Präparate werden unabhängig vom Zyklusstand intravaginal eingelegt und verbleiben für 7 Tage. Einen Tag vor Ziehen der Präparate bekommen die Tiere eine einmalige Injektion von PGF2α (GRUNERT u. ZERBE 1999, LUCY et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Der Brunsteintritt erfolgt ca. 48 Stunden nach Implantatentfernung, somit ist eine terminorientierte Besamung ohne vorherige Brunstbeobachtung möglich, da der Brunsteintritt im Vergleich zur Synchronisation mittels PGF2α eine geringere Variation aufweist (LANE et al. 2008). Die Wirkung beruht darauf, dass durch das exogen zugeführte Progesteron die Blutprogesteronkonzentration über 1 ng/ml liegt und dadurch der präovulatorische LH-Peak und die daran anschließende Ovulation unterbleiben (KINDER et al. 1996, HEUWIESER u.
MANSFELD 1999, LUCY et al. 2004). Zu Beginn wurden die Spiralen / Spangen für 14 Tage und länger belassen, was der natürlichen Lebenszeit eines Corpus luteums entspricht (LUCY et al. 2004). Dadurch können zwar sehr gute Ovulationsynchronisationsergebnisse erreicht werden, allerdings sind die Trächtigkeitsraten stark reduziert (BÓ et al. 2002, LUCY et al.
2004, KANITZ u. BECKER 2005). Durch die längere Verweildauer wird die Ovulation des sprungreifen, dominanten Follikels verhindert. Dies führt dazu, dass nach Entfernen der Progesteronpräparate ein nun überreifer, persistierender, dominanter Follikel ovuliert, was zu den schlechten Trächtigkeitsraten führt (BÓ et al. 2002, MANTOVANI et al. 2005). Die reduzierte Fruchtbarkeit nach der verlängerten Medikationsdauer ist eine Folge dessen, dass die Oozyte zum Zeitpunkt der Ovulation schon weiter entwickelt bzw. überaltert ist und auf ein nicht synchrones Eileitermillieu trifft, was letztendlich zum embryonalen Tod führt (KINDER et al. 1996, WEHRMAN et al. 1997, BINELLI et al. 2001, SANTOS et al. 2004). In Tabelle 4 ist der Ablauf, die Vor- und Nachteile der verschiedenen progesteronenthaltenden Brunstsynchronisationsprogramme aufgeführt.
Progesteron + PGF2α
+ E2-
Benzoat Progesteron
+ PGF2α Programm Tab. 4a: Ablauf, Vor- und Nachteile der verschiedenen Synchronisationsprogramme mit Progesteron
T 0 Setzen der PräparateT 6 PGF2α-InjektionT 7 Ziehen der Präparate T 8 E2-InjektionT 9 KB T 0 Setzen desPräparats T 6 PGF2α-InjektionT 7 Ziehen desPräparats T 9 Brunst +KB Ablauf desProgramms
Färsen Kühe undFärsen Tiermaterial
•kürzere Zeit bis zumEintritt der Brunst •genauereOvulationssynchro-nisation •alle Tiere unabhängigvom Zyklusstandsynchronisierbar •VerbesserteTrächtigkeitsraten •keine Brunstbeobachtungnötig => terminorientierte Besamung •auch azyklische undzystische Tieresynchronisierbar Vorteile
•KEINEZulassung vonE2 bei Lebensmittel liefernden Tieren in der EU•keine Verbesserungder TR-Raten •hohe Medika-mentenkosten •Verlust der Präparatemöglich •Vaginitis bei der Entnahme Nachteile
(LOONEY et al. 1999, LANE et al. 2001, LANE et al. 2008) (BROADBENT et al. 1993, MACMILLAN u. PETERSON 1993, GRUNERT u. ZERBE1999, LUCY et al. 2004, KANITZ u. BECKER2005, LANE et al. 2008) Autor(en)
Progesteron
+ Ovsynch Programm Tab. 4b: Ablauf, Vor- und Nachteile der verschiedenen Synchronisationsprogramme mit Progesteron (Fortsetzung)
T 0 Setzen der Präparate + GnRH-InjektionT 6/7 PGF2α-InjektionT 7 Präparatentnahme T 9 GnRH-InjektionT 10 KB Ablauf desProgramms
Kühe undFärsen Tiermaterial
•genauereOvulationssyn-chronisation•bessereTrächtigkeits-raten als mit Ovsynch •terminorientierte Besamung möglich •kürzere Güstzeit Vorteile
•erhöhter Medikamenten-einsatz•häufigeres Handling der Tierenotwendig Nachteile
(MARTÍNEZ et al. 2002b, EL-ZARKOUNY et al. 2004, HITTINGER etal. 2004, SCHAFER et al. 2007, WALSH et al. 2007, AMBROSE et al. 2008) Autor(en)
2.3 Endometrium des Rindes
2.3.1 Histologisch- anatomischer Aufbau des Endometriums
Das Endometrium (Gebärmutterschleimhaut) ist die innerste Schicht der Gebärmutterwand und setzt sich beim Rind aus dem Epithelium pseudostratificatum columnare und der Lamina propria mucosae (Stroma endometrialis) zusammen. Das Epithel ist bei den Wiederkäuern teilweise mehrreihig und hochprismatisch. Während der zyklischen Veränderungen tragen die Zellen zeitweise Kinozilien (Flimmerzellen) oder Mikrovilli (sezernierende Zellen). Die Sekretionsaktivität wird endokrin beeinflusst (LIEBICH 1993). Die Lamina propria ist die drüsenreiche Schicht und liegt unmittelbar der Muskelschicht an. Sie ist aus spinozellulärem Bindegewebe aufgebaut und besitzt eine große Zahl tubulär verzweigter Uterindrüsen. Die Drüsen reichen teilweise bis in die darunterliegende Tunica muscularis (LIEBICH 1993). Die Schleimhaut des Rindes besitzt Längs- bzw. Querfalten, diesen sitzen meist in vier unregelmäßigen Reihen die Karunkeln auf. Im trächtigen Uterus bilden sie zusammen mit den Kotyledonen der Plazenta die Plazentome und dienen der maternal-embryonalen Kommunikation (LIEBICH 1993). In den Bereichen der Kotyledonen sind keine Drüsen vorhanden (LIEBICH 1993, LEISER 2004). Das Endometrium unterliegt starken zyklischen Veränderungen. Diese dienen dazu, die Uterusschleimhaut für die Implantation des Embryos vorzubereiten. Da das Endometrium an der Ausbildung der Plazentarschranke beteiligt ist, finden sich subepithelial zahlreiche spezifische und unspezifische Immunzellen, wie z. B.
Makrophagen, Lymhozyten, Plasmazellen und Mastzellen (LIEBICH 1993).
2.3.2 Zyklische Veränderung des Endometriums 2.3.2.1 Veränderung der Drüsen
Der Schleimhautzyklus unterteilt sich in drei Phasen, die Proliferationsphase, die Sekretionsphase und die Regenerationsphase (siehe 2.1.2). Die Proliferationsphase umschließt den Proöstrus und den Östrus. Sie ist v. a. durch 17β−Östradiol beeinflusst und dadurch gekennzeichnet, dass die Schlauchdrüsen gestreckt sind. Die Drüsenlumina sind verengt, da die Anzahl der Epithelzellen zunimmt (LIEBICH 1993). Während der Proliferationsphase finden vermehrt Mitosen im Epithel und im Stroma statt, die Epithelzellen bilden Zilien aus und die
Uterindrüsen werden verzweigter (OHTANI et al. 1993, WANG et al. 2007). Das Endometrium weist während dieser Phase die größte Dicke auf, was auf die durch 17β-Östradiol beeinflusste Aufnahme von Interzellularflüssigkeit ins Gewebe zurückzuführen ist. Die Schleimhaut ist zu diesem Zeitpunkt stark vaskularisiert (LIEBICH 1993). Durch die Volumenzunahme des Endometriums ist die Dichte der Drüsenkanäle, deren Zahl im Laufe des Zyklus unverändert bleibt, herabgesetzt (WANG et al. 2007). DHALIWAL et al. (
2002)
stellten fest, dass die Schleimhaut bei Kühen ca. 30 % dicker ist als bei Färsen. Darüber hinaus waren das Drüsenvolumen und die Oberflächendichte bei Kühen geringer als bei Färsen. Im Bereich der Karunkeln ist die Schleimhautdicke erhöht, Drüsen fehlen in diesem Bereich (LIEBICH 1993, DHALIWAL et al. 2002). Am Ende der Proliferationsphase werden die hochmolekularen Grundsubstanzen zu niedermolekularen umgebaut und die Mikrovaskularisation ist vermehrt (LIEBICH 1993). In der Sekretionsphase (Postöstrus und Diöstrus) steht der Einfluss von Progesteron im Vordergrund, die Schlauchdrüsen schlängeln sich zusehends und die Lumina der Uterindrüsen sind erweitert und sekretgefüllt. Das Epithel ist nun einschichtig und hochprismatisch, beim Rind teilweise auch mehrreihig. Die Zellen geben mukoides Sekret ab (LIEBICH 1993, OHTANI et al. 1993). Die Drüsen produzieren nun die Histotrophe, auf die der Embryo für die Ernährung, Weitentwicklung und Einnistung angewiesen ist. Die Histotrophe enthält Enzyme, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe, Cytokine, Transport- und Adhäsionsmoleküle (GRAY et al. 2001, FORDE et al. 2010). Die Produktion der Histotrophe wird durch die Progesteronkonzentration beeinflusst, höhere Progesteronspiegel zu Beginn des Zyklus stimulieren die Produktion (GREEN et al. 2005, FORDE et al. 2009). WANG et al.(2007) postulierten, dass die Dicke des Endometriums und die Größe der Drüsen in der frühen Sekretionsphase negativ korreliert ist mit der Zunahme der Progesteronkonzentration. Die Dichte der Drüsenkanäle ist hingegen positiv mit der Zunahme an Progesteron korreliert. Durch die Dickenabnahme des Endometriums steigt die Dichte der Drüsenkanäle, da sich die gleiche Anzahl an Drüsen auf ein kleineres Volumen verteilt (WANG et al. 2007). Mit der Luteolyse fällt der Progesteronspiegel wieder und 17β-Östradiol tritt in den Vordergrund, so dass wieder eine Zellproliferation eintritt. SHAHAM-ALBALNCY et al. (1997) konnten zeigen, dass die Morphologie der Drüsen durch eine Synchronisation mittels CIDR im nachfolgenden Zyklus verändert wird. So waren die Drüsen an Tag 3 des nachfolgenden Zyklus weiter entwickelt als bei unbehandelten Tieren. Die Drüsen waren rund und gewunden und eine vermehrte
Durchblutung des endometrialen Stomas lag vor (SHAHAM-ALBALANCY et al. 1997). An Tag 15 des folgenden Zyklus waren die Drüsen länglicher als bei den Vergleichstieren (SHAHAM-ALBALANCY et al. 1997).
2.3.2.2 Veränderung der Rezeptoren
Aufbau und Wirkungsweise der Rezeptoren
Für die Fortpflanzungsregulation sind mehrere Rezeptoren wesentlich. Dies sind unter anderem die Östrogen-, die Progesteron- und der Oxytocinrezeptor. Die Rezeptoren für 17β-Östradiol (E2-Rezeptoren, ER) und Progesteron (P4-Rezeptoren, PR) gehören zu den nukleären Hormonrezeptoren (COUSE et al. 2006, OKUMU et al. 2010). Diese Rezeptoren sind aus fünf Modulen zusammengesetzt. Dabei ist die A/B-Domäne das N-terminale Ende, die C-Domäne dient der DNA-Bindung, die D-Domäne ist ein Gelenkstück und dient als Verbindungsstück zwischen der hoch konservierten C- und E-Domäne und die E-Domäne dient der Ligandenbindung (COUSE et al. 2006).
Der ER hat dabei zwei Isoformen, ERα und ERβ, die zu 96 % homolog sind. Beide weisen dieselbe DNA-Bindungsdomäne auf. Allerdings ist die Ligand-Bindungsdomäne nur zu 60 % homolog, was eine Selektivität bei der Hormonbindung zur Folge hat (KUIPER et al. 1997, SAJI et al. 2001, SCHAMS et al. 2003). Die ERα-Isoform hat dabei eine deutlich höhere Affinität zu 17β-Östradiol als die ERβ-Isoform (SAJI et al. 2001). Im Uterus kommt hauptsächlich die ERα-Isoform vor (ROBINSON et al. 2001, SPENCER et al. 2004). Auch für den PR gibt es mehrere Isoformen A, B und C (PIEBER et al. 2001, SCHAMS et al. 2003, COUSE et al. 2006). Die Isoform B vermittelt dabei die Effekte von P4 auf die Gentranskription, die Aufgabe der Isoform A während der Trächtigkeit ist unklar (PIEBER et al. 2001). Die Isoform C ist eine am N-terminalen Ende verkürzte Form kann aber trotzdem den Liganden binden und stimuliert die Aktivität der anderen beiden Isoformen (COUSE et al.
2006).
Nach der Hormonbindung (P4 bzw. 17β-E2) kommt es zu einer Dimerisierung der Rezeptoren, was über eine Abspaltung der Heat-Shock-Proteine vermittelt wird. Die Bindung der lipophilen Hormone findet dabei im Zytoplasma statt. Der entstandene Komplex dimerisiert mit einem weiteren Komplex und wandert zum Zellkern und stimuliert dort die Transkription. Im
Anschluss daran kommt es zur Proteinsynthese an den Ribosomen (MEYER 1994, SCHAMS et al. 2003).
Der Oxytocinrezeptor (OT-Rezeptor) ist ein Klasse I G-Protein gekoppelter Rezeptor, der über das G-Protein die Phospholipase C aktiviert. Für die hochaffine Bindung benötigt Oxytocin sowohl Mg2+-Ionen als auch Cholesterin, die vermutlich als allosterische Modulatoren dienen.
Der Rezeptor ist ein heptahelikales Transmembranprotein (GIMPL u. FAHRENHOLZ 2001).
Nach der Bindung von Oxytocin wird die Phospholipase C aktiviert, dadurch entsteht Inositoltriphosphat und Diacylglycerol. Inositoltriphosphat erhöht die Freisetzung von Ca2+- Ionen aus den intrazellulären Speichern. Diacylglycerol stimuliert die Proteinkinase C, die wiederum bestimmte Proteine phosphoryliert. Die phosphorylierten Proteine sind bei der Synthese von PGF2α von Bedeutung. Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel führt zur Kontraktion der glatten Muskulatur des Uterus (MEYER 1994, ASSELIN et al. 1997, GIMPL u. FAHRENHOLZ 2001).
Zyklische Konzentrationsänderungen der Rezeptoren
Während des Östrus ist sowohl die Konzentration der Östrogen- als auch die der Progesteronrezeptor-mRNA im Endometrium hoch (SPENCER u. BAZER 1995, ROBINSON et al. 2001, COUSE et al. 2006, MCNEILL et al. 2006). Im Diöstrus weisen beide Rezeptoren eine niedrige mRNA-Konzentration auf. Die Konzentrationsänderungen sind darauf zurückzuführen, dass 17β-Östradiol einen stimulierenden Effekt auf die Genexpression der E2- und P4-Rezeptoren hat (MCNEILL et al. 2006, OKUMU et al. 2010), wohingegen Progesteron einen hemmenden Effekt auf die mRNA-Expression ausübt (BOOS et al. 1996, LEUNG u.
WATHES 2000, KIMMINS u. MACLAREN 2001, MEIKLE et al. 2001, ROBINSON et al.
2001). In den oberflächlichen Drüsen steigt die Expression der E2-Rezeptor-mRNA im frühen Diöstrus an (OKUMU et al. 2010), während das Protein des Rezeptors zur gleichen Zeit sinkt.
Daraus lässt sich schließen, dass die posttranskriptionale Kontrolle einen Einfluss auf die Expression hat (ROBINSON et al. 2001). In den tiefen Drüsen ist die Genexpression des E2- Rezeptors während des gesamten Zyklus hoch (SPENCER u. BAZER 1995, ROBINSON et al.
2001, COUSE et al. 2006, MCNEILL et al. 2006). Dies dient wahrscheinlich der parakrinen Interaktion. Die Konzentration des PR ist im uterinen Bindegewebe höher als im Epithel. Die
Expression der Rezeptor-mRNA im subepithelialen Bindegewebe ist am höchsten zwischen dem Östrus und dem frühen Diöstrus. In der Mitte der Lutealphase, ca. an Tag 13 des Zyklus, ist die Genexpression sehr niedrig (ROBINSON et al. 2001, ROBINSON et al. 2008, OKUMU et al. 2010). Die höchste P4-Rezeptorkonzentration in den Endometriumsdrüsen findet sich zwischen Tag 4 und 10 (KIMMINS u. MACLAREN 2001, ROBINSON et al. 2008). Im frühen Diöstrus steigt die Konzentration des P4-Rezeptors weiter an, obwohl zu diesem Zeitpunkt die Progesteronkonzentration im Blut noch gering ist. Die Stimulierung erfolgt wahrscheinlich durch 17β-Östradiol aus der ersten Follikelwelle (ROBINSON et al. 2008). Unter dem nun stärker werdenden Progesteroneinfluss sinkt die PR-Konzentration, da es zu einer Autodownregulation des P4-Rezeptors im luminalen Epithel durch P4 kommt (SPENCER u.
BAZER 1995, MCNEILL et al. 2006, ROBINSON et al. 2008, OKUMU et al. 2010). Dieser Vorgang kann durch hohe Progesteronwerte zwischen Tag 3 und 7 noch beschleunigt werden (OKUMU et al. 2010). Auch die Oxytozinrezeptor-mRNA ist im Östrus am höchsten und während des Diöstrus kaum nachweisbar (JENNER et al. 1991, LEUNG u. WATHES 2000, ROBINSON et al. 2001). Die hemmende Wirkung von Progesteron auf die Ausbildung der OT- Rezeptoren hält nur für eine begrenzte Dauer an, da es auch hier nach ca. 10 Tagen zu einer Autodownregulierung des P4-Rezeptors durch Progesteron kommt. Das endometriale Epithel wird daraufhin wieder sensitiv für E2, welches seinerseits die OT-Rezeptorbildung stimuliert und damit letztendlich die pulsatile PGF2α-Ausschüttung fördert (SPENCER u. BAZER 1995, ROBINSON et al. 2008, BAZER et al. 2010). Dadurch steigt gegen Ende der Lutealphase die OT-Rezeptorexpression wieder an (SPENCER u. BAZER 1995, LEUNG u. WATHES 1999, KIMMINS u. MACLAREN 2001). In Anwesenheit eines Embryos schüttet dieser beim Rind zwischen Tag 12 und 24 der Trächtigkeit Interferon τ (IFNT) aus (ROBINSON et al. 1999).
IFNT verhindert die OTR-Hochregulation über eine Blockade der ER-Transkription und damit letztendlich die Luteolyse (ROBINSON et al. 1999, MANN u. LAMMING 2001, ROBINSON et al. 2001, BAUERSACHS et al. 2006, ROBINSON et al. 2008, BAZER et al. 2010). Neben der Beeinflussung durch Steroidhormone kommt auch der parakrinen Regulation der Transkription bzw. Translation der Steroid- und OT-Rezeptoren eine große Bedeutung zu (KIMMINS u. MACLAREN 2001). Abbildung 3 stellt graphisch die Regulation der Rezeptorkonzentration im Endometrium während des Zyklus dar.
Abb. 3: Hormonelle Beeinflussung der Rezeptorexpression im Endometrium während des Zyklus bzw.
der frühen Trächtigkeit (SPENCER et al. 2004)
2.3.2.3 Veränderung der Genexpression im Endometrium
Neben der Regulation der Rezeptoren sind die zyklischen Veränderungen der Genexpression im Endometrium Voraussetzung für eine erfolgreiche Implantation und Trächtigkeit. In Tabelle 5 sind die biologischen Prozesse und molekularen Funktionen dargestellt, die zu den verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus einer vermehrten Genexpression unterliegen.
Tab. 5: Übersicht über die biologischer Prozesse bzw. molekulare Funktionen, die zu verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus eine vermehrte Genexpression aufweisen.
Zyklustag vermehrte Genexpression Autor Tag 0 • Proteinfaltung
• Proteine der extrazelluläre Matrix
• Proteine des Zytoskeletts
• Zellwachstum (z. B. insulin like growth factor) und Apoptose
• Zelladhäsion und -motilität
• Signaltransduktion
• Modulation des Immunsystem
• Angiogeneseprozess
(BAUERSACHS et al.
2005, BEERDA et al.
2008, MITKO et al.
2008)
Tag 7 Produktion und Sekretion der Histotrophe
• Glukosetransport
• Triglyceridsynthese
• ATP (Adenosintriphosphat)-Synthese
• Protein- und Nukleotidsynthese Umbau des Zytoskeletts
(BAUERSACHS et al.
2005, FORDE et al.
2009, FORDE et al.
2010)
Tag 13 – 16) • Interferon stimulierte Gene
• ATP-Synthase
• Zelladhäsion
(BAUERSACHS et al.
2005, FORDE et al.
2009) Tag 18
(trächtig) • Signaltransduktion
• Modulation des maternalen Immunsystem
• Zelladhäsion
• verschiedene Enzyme (Hydrolasen, Transferasen, Peptidasen, Kinasen und Dehydrogenasen)
• Transportproteine für Nährstoffe
• Zellproliferation
• Transkriptionsregulation
• Angiogenesprozess
(BAUERSACHS et al.
2005, BAUERSACHS et al. 2006, MITKO et al. 2008, BAZER et al.
2009, FORDE et al.
2009, BAZER et al.
2010)
Die Veränderungen während des Östrus führen zu einem Umbau des Bindegewebes des Endometriums (BAUERSACHS et al. 2005, MITKO et al. 2008). Zudem kommt es zu einer Veränderung des uterinen Vaskularisation (MITKO et al. 2008). Für die Steuerung der Gentranskription während der Follikelphase ist 17β-Östradiol zum Teil verantwortlich (MITKO et al. 2008). Danach wird die Regulation hauptsächlich von Progesteron beeinflusst. Sie ist dabei abhängig von der Konzentration, höhere Progesteronspiegel zwischen Tag 3 – 5 führen zu einer stärkeren Expression dieser durch Progesteron beeinflussten Gene (FORDE et al. 2009, FORDE et al. 2010). Dafür muss kein Embryo anwesend sein, da auch an Tag 7 des Zyklus
transferierte Embryonen sich besser entwickelten, wenn zwischen Tag 3 und Tag 5 höhere Progesteronwerte vorlagen (CLEMENTE et al. 2009, FORDE et al. 2010). Eine ausreichende Produktion an Histotrophe gewährleistet dabei die Ernährung und Entwicklung des Embryos in der Präimplantationsphase. So führt eine erhöhte Histotrophenproduktion zu einer schnelleren Elongation des Embryos (GRAY et al. 2001, FORDE et al. 2009). In der Mitte der Lutealphase (ca. Tag 12 bis 13) kommt Interferon τ (IFNT), welches vom Trophektoderm des Konzeptuses bei trächtigen Tieren sezerniert wird, als weiterer Einflussfaktor auf die mRNA-Expression hinzu (BAZER et al. 1994, BAUERSACHS et al. 2006). IFNT ist eine wichtige antilutiolytische Substanz, die parakrin die Ausschüttung von PGF2α verhindert. Vermittelt wird diese Funktion durch die verminderte Transduktion des ER durch IFNT. Dies führt dazu, dass auch die Genexpression der OTR im uterinen Epithel vor dessen Anstieg an Tag 14 reduziert wird (BAZER et al. 2008, BAZER et al. 2010). Dadurch unterbleibt die Luteolyse des Gelbkörpers, was für die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit essentiell ist (BAZER et al. 1994, 1998). Darüber hinaus beeinflusst INFT auch Gene der Zelladhäsion, was eine Voraussetzung für die Implantation des Embryos darstellt (MITKO et al. 2008, FORDE et al. 2009, BAZER et al. 2010). Viele durch Progesteron initial stimulierten Gene werden nach der Sekretion von INFT durch dieses weiter stimuliert. Progesteron und Interferon τ wirken somit additiv bzw.
synergistisch über gemeinsame oder komplementäre Zellsignal-Pathways (BAZER et al. 2010).
Die Modulation des maternalen Immunsystems gegen Ende der Lutealphase (Tag 16) ist notwendig, um eine Abstoßung des Embryos durch die Mutter zu verhindern (BAUERSACHS et al. 2005, MITKO et al. 2008, BAZER et al. 2010). Bei nicht trächtigen Tieren wird die Genexpression in der späten Lutealphase durch den Abfall an Progesteronrezeptoren im uterinen Epithel reguliert.
In einer Studie von SALILEW-WONDIM et al. (2010) konnte gezeigt werden, dass die Tiere, die nach einem Embryotransfer trächtig werden, bereits im vorhergehenden Zyklus an Tag 7 eine erhöhte Genexpression für Produkte bestimmter biologischer Prozesse und molekularer Pathways aufweisen, als Tiere die nicht trächtig wurden. Diese Gene sind an Transportprozesse, wie die Solute-carrier (SLC), Anionenkanäle und Transmembranproteine, der Zelladhäsion (Gap junctions, Adhäsionsmoleküle) und –proliferation beteiligt. So sind z. B. antiapoptotische Gene, die für das Zellwachstum notwendig sind, im aufnehmenden Endometrium vermehrt zu finden. Bestimmte Gene im Zusammenhang mit dem Immunsystem und Chemokine-Moleküle
waren hingegen bei den aufnehmenden Tieren vermindert exprimiert. Was darauf hinweist, dass das Endometrium dieser Tiere eine Immuntoleranz gegenüber dem Embryo aufbaut. An Tag 14 des vorherigen Zyklus war der Unterschied zwischen aufnehmenden und nicht aufnehmenden Tieren nicht mehr so groß, was vermutlich an dem verminderten Einfluss von P4 an Tag 14 liegt. Die Ausschüttung von OT wird nicht mehr verhindert und die Produktion von PGF2α
beginnt. Die durch Progesteron stimulierten Gene werden deshalb weniger exprimiert. Somit kann bereits im Zyklus vor dem Transfer eine Voraussage über einen erfolgreichen Embryotransfer getroffen werden (SALILEW-WONDIM et al. 2010).
3 Material und Methoden 3.1 Tiermaterial
Für die Versuche wurden Tiere der Empfängertierstation Brandhof des Besamungsvereins Neustadt an der Aisch e. V. verwendet. Es handelte sich dabei um Färsen der Rasse Deutsches Fleckvieh. Zwischen Oktober 2009 und Juni 2010 wurden insgesamt 104 Tiere untersucht und synchronisiert. Die Tiere waren zwischen 15 und 24 Monaten alt und wogen zwischen 350 und 500 kg. Es wurden nur Tiere aus BHV1 unverdächtigen Betrieben eingestallt. Bei der Einstallung erhielten die Tiere Impfungen gegen BVD/MD (Vacoviron®, Fa. Merial, Halbergmoos, Deutschland) und Trichophytie (Permavax® Tricho, Fa. Essex Tierarznei, München, Deutschland), sowie ein Antiparasitikum (Cydectin® pour on, Fa. Fort Dodge, Aachen, Deutschland). Nach einer zweiwöchigen Quarantäne wurden alle Rinder auf BHV1- Antikörper und BVD/MD-Antigen untersucht. Nach der Entfernung eventueller Reagenten wurden alle anderen Tiere nach weiteren zwei Wochen nochmals getestet. Die Haltung der Färsen erfolgte in Gruppen von 6 bis 8 Tieren in Tiefstreuboxen mit Selbstfangfressgittern in einem Warmstall. Die Fütterung bestand aus Grassilage und Heu ad libitum. Zusätzlich erhielten die Rinder ca. 50 g Mineralfutter pro Tier und Tag, sowie 25 – 50 g β-Carotin (Blattiviko beta plus, Fa. Blatin, Dormagen, Deutschland).
3.2 Zykussynchronisation
Alle Versuchstiere wurden zunächst auf ihren Allgemein- und Geschlechtsgesundheit hin untersucht. Tiere der Versuchsgruppe 1 erhielten für 8 Tage ein progesteronfreisetzendes Präparat (siehe Abbildung 5). Unabhängig vom Zyklusstand wurden alternierend entweder eine Spirale (PRID® alpha 1,55 g Progesteron, Fa. Ceva Sante Animale, Liboure, Frankreich, Gruppe 1A) oder eine Spange (CIDR® 1,38 g Progesteron, Fa. Pfizer, Karlsruhe, Deutschland, Gruppe 1B) intravaginal appliziert. In der Gruppe 1A (PRID 8 Tage) waren 33 Tiere, die Gruppe 1B (CIDR 8 Tage) umfasste 34 Tiere. Das Setzen der Präparate erfolgte mit Hilfe eines entsprechenden Applikators (siehe Abbildung 4). Einen Tag vor Entnahme der Präparate (Tag 7) erhielten alle Rinder eine einmalige i.m. Injektion mit 2 ml PGF2α (Estrumate®, Fa. Essex Tierarznei, München, Deutschland, Wirkstoff Cloprostenol 0,25 mg/ml). Sowohl die CIDR-
Spange als auch die PRID-Spirale wiesen einen Faden als Hilfsmittel zum Ziehen der Präparate auf (siehe Abbildung 4). Dieser wurde nach dem Setzen der Spiralen / Spangen gekürzt, um ein gegenseitiges Ziehen der Präparate durch andere Tiere zu verhindern. Nach dem Entfernen der Spangen / Spiralen an Tag 8 bekamen alle Tiere eine Scheidenspülung mit 50 ml 10-iger Iodlösung. Etwa 24 bis 72 Stunden nach der Entnahme der Präparate trat die Brunst ein. Bei den Tieren der zweiten Versuchgruppe wurde genauso vorgegangen, nur dass die progesteronfreisetzenden Medikamente für neun Tage in der Vagina verblieben. Die PGF2α- Injektion erfolgte entsprechend an Tag 8. Dabei wurden 11 Tiere mit einer PRID-Spirale (Gruppe 2A) und 13 Tiere mit einer CIDR-Spange (Gruppe 2B) synchronisiert. Abbildung 4 zeigt die beiden Präparate im Vergleich. Eine dritte Versuchsgruppe erhielt das gleiche Synchronisationsprogramm wie Gruppe 1, nur das bei den Tieren anstatt eines ETs an Tag 17 eine Endometriumsbiopsieentnahme vorgenommen wurde (siehe 3.7).
Abb. 4: Das obere Foto zeigt die vorgewickelte PRID® alpha-Spirale mit dem benutzten Applikator, das unter Foto zeigt die CIDR®-Spange mit den benutzten Applikatoren (Fotos: V. Walter).
3.3 Allgemeiner Versuchsablauf
In Abbildung 5 ist ein schematischer Überblick über den Versuchsablauf der Gruppe 1 und Gruppe 3 (nur bis Tag 17) dargestellt. Für Versuchsgruppe 2 ergab sich ein ähnliches Bild, nur dass durch die längere Medikationsdauer von 9 Tagen die Termine für die rektalen Untersuchungen und die Blutprobenentnahmen ab Tag 7 einen Tag später vorgenommen wurden.
Abb. 5: Schematischer Überblick über den Versuchsablauf der Gruppe 1.
3.4 Brunstbeobachtung, rektale Untersuchung und Befunderhebung
Brunstbeobachtung
Die Brunstbeobachtung erfolgte zweimal täglich für eine halbe Stunde an den Tagen 9 – 11 (Gruppe 1) bzw. 10 – 12 (Gruppe 2) nach Beginn der Synchronisation, bzw. zwei bis vier Tage nach dem Ziehen der Präparate. Tiere wurden als brünstig bewertet, wenn sie entweder das
= Zeitpunkte der rektalen Untersuchung
= Entnahmezeitpunkte der Blutproben
53 Setzen der
Präparate
Gruppe 1 PGF2α-
Injektion Tag der
Brunst Tag des
ET 1. TU 2. TU
17 42 1 2 8
0 Versuchstag
7 9 10
Ziehen der Präparate
Bespringen durch andere Tiere duldeten, oder einen klar, fadenziehenden Brunstschleim aufwiesen. Aufspringen auf Artgenossinnen, Schamlippenschwellung und erhöhte Unruhe wurden als Indiz für eine Brunst gewertet und nur in Kombination mit einem entsprechenden Ovarbefund als Zeichen für eine Brunst eingestuft.
Der Brunstsynchronisationserfolg entspricht dabei dem Prozentsatz der Tiere, die nach dem Entfernen der Präparate innerhalb von 24 bis 72 Stunden in Brunst kamen.
Anzahl brünstige Tier Brunstsynchronisationserfolg =
(Anzahl synchronisierte Tier – Anzahl verlorene Präparate)
Rektale Untersuchung und Befunderhebung
Die rektale Untersuchung, der im Selbstfangfressgitter fixierten Tiere, erfolgte gemäß GRUNERT et al. (2002). Dabei wurden Befunde am Uterus, den Ovarien und etwaige sonstige Auffälligkeiten erhoben und dokumentiert. Am Uterus waren dies, die Größe, Symmetrie und Kontraktilität, an den Ovarien die Größe, Funktionsgebilde und die Konsistenz eventuell vorhandener Blasen. Die Größe der Ovarien sowie die der darauf befindlichen Funktionsgebilde wurde dabei in Länge mal Breite mal Höhe in cm angegeben.
Am Tag der Präparatentfernung wurde zusätzlich die lokale Reaktion der Scheide auf die Spirale / Spange erfasst. Die Vaginitis wurde in drei Stufen unterteilt: geringgradig, mittelgradig und hochgradig (Einteilung siehe Tab. 6).
Bei der Brunst wurde das Vorhandensein von Brunstschleim und dessen Konsistenz dokumentiert. In Tabelle 6 sind die Befundschlüssel für die einzelnen Merkmale dargestellt.
Tab. 6: Befundschlüssel für die rektale Untersuchung des Gebärmutter und der Eierstöcke (modifiziert nach (GRUNERT 1990)
Uterus
Größe G I Gebärmutter unter der Hand zu versammeln, Hörner etwa fingerstark
G II Gebärmutter unter der Hand zu versammeln, Hörner etwa zweifingerstark
G III Gebärmutter unter der Hand zu versammeln, Hörner etwa drei- bis vierfingerstark
G IV Gebärmutter mit der Hand abgrenzbar, männerarmstark bis brotlaibgroßes Organ
G V Gebärmutter fast mit der Hand abzugrenzen, größer als Brotlaib Symmetrie S Beide Hörner gleichgroß (symmetrisch)
As Uterushörner unterschiedlich groß (asymmetrisch) As
(+++)
rechtes Horn wesentlich größer als das linke (+) As linkes Horn wenig größer als das rechte Kontraktilität K I Gebärmutter schlaff, wenig kontraktil
K II mäßige Kontraktionsbereitschaft K III starke Kontraktionsbereitschaft Ovar
Größe Länge * Breite * Höhe in cm Funktionsgebilde CL Corpus luteum
F Follikel
Z Zyste (= Blase > 2,5 cm)
Blasenkonsistenz 1 derb, prall, kaum erkennbare Fluktuation 2 Pralle Fluktuation
3 deutliche Fluktuation
4 schlaffe (weiche) Fluktuation (reifer Follikel) 5 knetbar, lappig-weich (frisch geplatzter Follikel) Vagina
Vaginitis 0 Keine Vaginitis
1 geringgradige Vaginitis, geringe Mengen an Eiter, kein Blut und mäßig gerötete Vaginalschleimhaut
2 mittelgradige Vaginitis, große Mengen an Eiter, Spuren von Blut und stärker gerötete Vaginalschleimhaut
3 hochgradige Vaginitis, sehr große Mengen an Eiter, mit Blutbeimengungen, hochgradig gerötete Vaginalschleimhaut Brunstschleim 0 kein Schleim
1 wenig, trüb, pappig, gelartig 2 mittel, dickflüssig
3 viel, klar, fadenziehend
3.5 Embryotransfer
3.5.1 Auswahl der Empfängertiere
Alle Tiere, die nach der Synchronisation termingerecht gerindert hatten, wurden sieben Tag nach der Brunst rektal untersucht, um eine eventuelle Eignung als Rezipient festzustellen. Die Untersuchung führte ein erfahrener ET-Tierarzt durch. Bei der Untersuchung wurde das Vorhandensein eines Gelbkörpers und dessen Größe als Auswahlkriterium erfasst. Für die Corpus luteum-Größe wurden Punkte gemäß dem Vorgehen des ET-Teams des Besamungsvereins Neustadt an der Aisch vergeben. Eine CL-Größe kleiner 1 cm entspricht einen Punkt, eine CL-Größe bis 2 cm entspricht zwei Punkten und Gelbkörper größer 3 cm bekamen drei Punkte. Nur Tiere mit Gelbkörpern, die mehr als 1,5 Punkte erhielten, bekamen einen Embryo übertragen.
Die ET-Nutzungsrate entspricht dabei dem Prozentsatz der Tiere, die nach einer termingerechten Brunst (Tag 10 bzw. Tag 11 des Versuchs) an Tag 17 bzw. Tag 18 des Versuchs als Empfängertiere ausgewählt wurden.
Anzahl als Empfänger genutzte Tiere ET-Nutzungsrate =
Anzahl brünstige Tiere
3.5.2 Vorbereitung der Embryonen
Für die Versuche wurden ausschließlich tiefgefrorene, in vivo generierte Embryonen verwendet. Diese waren entweder in 10 % Glycerin (36 Embryonen) oder 1,5 M Ethylenglycol (Fa. ICPbio LtD., New Zealand, 40 Embryonen) als Tiefgefriermedium eingefroren. Alle Embryonen wurden zum Auftauen sechs Sekunden an der Luft gehalten und anschließend 15 Sekunden in 25 °C warmen Wasser verbracht. Im Anschluss daran wurden die in Ethylenglykol eingefrorenen Embryonen in PBS (Phosphat buffered saline, Fa. Biochrom AG, Berlin, Deutschland)-Lösung, die mit 0,4 % BSA (bovines Serumalbumin, Fa. Sigma-aldrich, Steinheim, Deutschland) angereichert war, umgesetzt und unter dem Stereomikroskop bei 40- facher Vergrößerung nochmals klassifiziert. Die in Glycerin eingefrorenen Embryonen wurden in einem Glycerin-Sucrose-Gemisch ausverdünnt. Die erste Dilution enthielt dabei 6,6 %