Aus dem Institut für Toxikologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Generierung einer
zweiten Gangliosidbindungstasche in Botulinum Neurotoxin A
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt von Kristin Remke aus Haselünne
Hannover 2018
• Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 12.10.2018
• Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
• Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
• Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Johannes Bigalke
• Kobetreuer der Arbeit: Dr. rer. nat. Andreas Rummel
• 1. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Harald Genth
• 2. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Matthias Gaestel
• Tag der mündlichen Prüfung: 12.10.2018
• Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. med. Dirk Stichtenoth 1. Prüfer: PD Dr. rer. nat. Astrid Rohrbeck 2. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Ralf Lichtinghagen
Danksagungen
Mein besonderer Dank für die hervorragende Betreuung gilt vor allem Herrn Dr.
Andreas Rummel und Herrn Dr. Thomas Binz, die mir gegenüber viel Geduld aufgebracht haben, immer ein offenes Ohr für mich hatten und mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen.
Vielen Dank auch an meinen Doktorvater Herrn Prof. Dr. Hans Bigalke.
Ich möchte mich auch bei den weiteren Mitarbeitern beider Arbeitsgruppen, insbesondere bei Dr. Tino Karnath, Dr. Jasmin Weisemann, Dr. Stefan Mahrhold, Dr.
Stefan Sikorra und Nadja Krez sowie Jennifer Paijo für ihre große Hilfsbereitschaft und Unterstützung während der Doktorarbeit bedanken.
Hervorheben möchte ich zudem die Geduld und Herzlichkeit meiner Eltern mit mir, die mich wieder und immer wieder motiviert und mit viel Liebe unterstützt haben. Ein großes „Danke“ hierfür und für noch vieles mehr!
Zuletzt natürlich auch noch einen großen Dank an eine wichtige Person in meinem Leben, die mir vor allem beim Endspurt dieser Arbeit zur Seite stand: Danke, Wayel!
Für meine Eltern Monika und Karl Remke
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... - 7 -
1.1 Clostridielle Neurotoxine ... - 7 -
1.2 Botulinum Neurotoxin – Botulismus... - 7 -
1.3 Tetanus Neurotoxin – Tetanus ... - 11 -
1.4 Medizinischer Nutzen und Bioterrorrismus... - 13 -
1.5 Aufbau und Struktur der clostridiellen Neurotoxine ... - 14 -
1.6 Wirkmechanismus clostridieller Neurotoxine... - 18 -
1.6.1 Das Doppelrezeptormodell – neurospezifische Bindung an Zielzellen und Internalisation durch Vesikelendozytose... - 20 -
1.6.2 Translokation ins Zytosol und Transport... - 24 -
1.6.3 Proteolytische Aktivität... - 24 -
1.6.4 Retrograd axonaler Transport... - 26 -
1.6.5 Zwei Gangliosidbindungstaschen in der HCC-Domäne von Tetanus Neurotoxin ... - 27 -
2 Aufgabenstellung... - 32 -
3 Material und Methoden... - 33 -
3.1 Arbeiten mit DNA – Herstellung der Expressionsplasmide... - 33 -
3.1.1 Polymerase-Kettenreaktion ... - 33 -
3.1.2 GeneTailorTM-ortsgerichtete Mutagenese ... - 34 -
3.1.3 Oligonukleotide... - 35 -
3.1.4 Restriktionsspaltung ... - 36 -
3.1.5 Dephosphorylierung ... - 37 -
3.1.6 Agarose-Gelelektrophorese... - 38 -
3.1.7 DNA-Konzentrationsbestimmung ... - 39 -
3.1.8 Reinigung der DNA aus PCR-Produkten... - 39 -
3.1.9 Ligation... - 40 -
3.1.10 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen ... - 40 -
3.1.11 Plasmid-Präparation (sogenannte „Mini-Prep“) ... - 41 -
3.1.12 Sequenzierung ... - 42 -
3.2 Arbeiten mit Proteinen – Produktion der BoNT/A-HC - und BoNT/A-Mutanten ... - 43 -
3.2.1 Proteinexpression in E. coli... - 43 -
3.2.2 Reinigung über Affinitätstags (StrepTag®II) ... - 44 -
3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... - 46 -
3.2.4 Coomassiefärbung ... - 48 -
3.2.5 Proteinkonzentrationsbestimmung ... - 48 -
3.3 Analyse der Proteine ... - 49 -
3.3.1 Discovery Studio Visualiser 2.0 ... - 49 -
3.3.2 ELISA ... - 49 -
3.3.3 MPN Toxizitätsassay (mouse phrenic nerve) ... - 50 -
4 Ergebnisse ... - 52 -
4.1 Identifizierung homologer Peptidabschnitte im Bereich der Sialinsäurebindungstasche in der HCC-Domäne von TeNT durch Superimposition der Kristallstukturen von BoNT/A und TeNT ... - 52 -
4.2 Herstellung der ToNT-Hybridtoxine ... - 55 -
4.3 Bindungsanalyse von ToNT an Gangliosidmix mittels ELISA ... - 58 -
4.4 Optimierung von ToNT durch Verkürzung des ToNT II-Peptidabschnittes sowie Mutagenese bindungsrelevanter Aminosäuren zur Kontrolle der
Bindungstaschen ... - 63 -
4.5 Überprüfung der Gangliosidspezifität der HCToNT II-Mutanten an die Ganglioside GM1, GD1a, GD1b und GT1b... - 66 -
4.6 Überprüfung der Toxizität mithilfe des Maus Nervus phrenicus Hemidiaphragma-Assays (MPN-Assay)... - 69 -
5 Diskussion ... - 72 -
5.1 Bestätigung des Bindungsverhaltens von BoNT/A und TeNT an Ganglioside ... - 72 -
5.2 Spezifität der Sialinsäurebindungstasche zu Diasialylresten wie in den Gangliosiden GD1b oder GT1b... - 73 -
5.3 Kristallisation von ToNT IIc... - 74 -
5.4 Beitrag von HcToNT II L1202 und D1203 zur Bindung an GM1... - 76 -
5.5 Effekte der Punktmutationen von Arginin 1204 und 1207 in HCToNT IIc - 77 - 5.6 Geringe strukturelle Veränderungen bedingen instabilere Bindung von ToNT IIc an Disialyllactose... - 78 -
5.7 R1204 als Schlüsselaminosäure einer weiteren „dritten“ Zuckerbindungstasche in ToNT IIc ... - 82 -
5.8 Kristallstruktur von BoNT/A an SV2C unterstützt Hypothese der neu geschaffenen „zweiten“ Gangliosidbindungstasche in BoNT/A... - 84 -
5.9 Mutationen in BoNT/A bewirken Abnahme der Toxizität ... - 86 -
6 Ausblick ... - 89 -
7 Zusammenfassung... - 91 -
8 Literaturverzeichnis ... - 93 -
9 Abkürzungsverzeichnis... - 102 -
10 Lebenslauf ... - 104 -
11 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 der Promotionsordnung der Medizinischen Hochschule Hannover... - 105 -
1 Einleitung
1.1 Clostridielle Neurotoxine
Die sieben etablierten Serotypen A bis G des Botulinum Neurotoxins (BoNT), die drei putativen BoNT/HA, BoNT/X und eBoNT/J sowie Tetanus Neurotoxin (TeNT) gehören zu der Familie der Clostridiellen Neurotoxine (CNT) und zählen zu den giftigsten bekannten Substanzen. Die LD50 beträgt 1 ng pro Kilogramm Körpergewicht, d.h., dass weniger als 100 ng ausreichen, um einen Menschen zu töten (Gill 1982, Arnon et al. 2001).
Die CNT werden von anaeroben Bakterien der Spezies Clostridium synthetisiert, die aufgrund ihrer Form nach einem Trommelstock (lat. closter) benannt worden sind.
Die extreme Toxizität begründet sich durch ihre hochspezifische Bindung an Nervendigungen und die Fähigkeit, SNARE (engl. soluble N-ethylmaleimide- sensitive-factor attachment receptor)-Proteine katalytisch zu spalten. Nach der Aufnahme in den Organismus verbreiten sie sich über Blut- und Lymphbahnen im Körper und entfalten ihre Wirkung an Synapsen von cholinergen Motoneuronen.
Während die sieben Serotypen des BoNT an den Präsynapsen von Motoneuronen wirken und dort die Acetylcholinfreisetzung aus den synaptischen Vesikeln verhindern, sodass es zu einer Erschlaffung der Muskulatur kommt, wirkt TeNT im zentralen Nervensystem. Nach seiner Aufnahme wird das TeNT retrograd axonal in das Rückenmark transportiert. Hier verlässt es das Motoneuron und gelangt in ein inhibitorisches Interneuron, wo es die Freisetzung der Neurotransmitter Glycin und γ- Aminobuttersäure (GABA) blockiert und eine spastische Parese verursacht (Schwab
& Thoenen 1976).
Durch die Wirkung der CNT werden die Krankheiten Botulismus und Tetanus verursacht. Damit stellen sie für die Gesundheit von Mensch und Tier eine große Gefahr dar.
1.2 Botulinum Neurotoxin – Botulismus
Die verschiedenen Serotypen A-G der BoNT sowie die putativen Serotypen HA und X werden von grampositiven, obligat anaeroben, sporenbildenden Bakterien
produziert, wobei hauptsächlich drei Gruppen der Spezies C. botulinum für die Produktion von BoNT/A bis F (sowie HA und X) zuständig sind. Gruppe I sind proteolytisch, eng verwandt mit C. sporogenes und produzieren BoNT/A, B und F (HA, X), die Gruppe II sind nicht proteolytische Clostridien und produzieren BoNT/B, E und F und Gruppe III sind eng verwandt mit C. novyi und produzieren BoNT/C und D. Die Gruppe IV von C. botulinum, auch C. argentinense genannt, produziert BoNT/G, während BoNT/E bzw. BoNT/F auch von C. butyricum bzw. C. baratii produziert weden können (Collins & East 1998, Peck 2009).
Hinweise auf ein mögliches BoNT/HA (Dover et al. 2014, Barash & Arnon 2014), BoNT/X (Zhang et al. 2017) und eBoNT/J (Zhang et al. 2018, Brunt et al. 2018) gab es erst kürzlich. Weitere Experimente hierzu stehen allerdings noch aus, um diese als neue Serotypen bezeichnen zu können.
Weitere mit BoNT assoziierte bakterielle Proteine sind Hämagglutinine (HA) und das nicht toxische nicht-Hämagglutinin (NTNHA), die in Form eines BoNT-HA-NTNHA- Komplexes vorliegen (Hatheway 1990). Diese Proteine stellen Schutzproteine dar, die um BoNT eine Schutzhülle bilden, um so das Toxin während der Passage durch den Gastrointestinaltrakt vor Denaturierung durch das vorliegende saure Milieu und vor Proteasen zu schützen und um es anschließend effizienter in die Zirkulation freilassen zu können (Gu et al. 2012).
Das BoNT/A ist das für den Menschen potenteste Neurotoxin (Gill 1982). Weitere humanpathogene BoNT sind die Serotypen B, E und spärlich auch BoNT/F (Sobel 2005; Thanongsaksrikul and Chaicumpa 2011). Die ersten durch mit BoNT verseuchte Nahrung verursachten Intoxikationen sind zwischen den Jahren 1795 und 1813 in Württemberg während des Napoleonischen Krieges („Freiheitskriege“) dokumentiert worden. Justinus Kerner (1786-1862) beschrieb die Krankheit Botulismus schließlich erstmals im Jahr 1822 in seiner Monografie, in der er auch die Hypothese aufstellte, dass Botulinum Neurotoxin in geringen Mengen als Therapeutikum bei Krankheiten mit einer Hyperaktivität der Nerven nutzbar sein könnte, um diese zu reduzieren oder gar blocken zu können (Erbguth 2004, Erbguth
& Naumann 1999).
Dass ein anaerobes Bakterium das Botulinumtoxin als eigentliche Ursache für die Erkrankung produziert, wurde erst in den letzten Jahren des 19. Jahrhunderts durch van Ermengem bekannt (Ermengem 1897). Er nannte das Bakterium Bacillus botulinus (lat. botulus = Wurst), da die Symptome der erkrankten Menschen denen
jener „Wurstvergiftung“ ähnelten, welche Justinus Kerner etwa 80 Jahre zuvor beobachtet hatte (Erbguth & Naumann 2000).
Die Krankheit Botulismus ist in Deutschland mit 145 Fällen zwischen 2001 und 2016 eine seltene Erkrankung (»Robert Koch-Institut: SurvStat, http://www3.rki.de/SurvStat; Datenstand: 19.03.2018«.) (Abb. 1). Dies ist u.a.
dadurch bedingt, dass heutzutage bei der Herstellung von Konservengütern in den westlichen Industrieländern ein hoher Hygienestandard vorherrscht. Die Erkrankung kommt in der Natur in vier verschieden Formen vor. Zumeist wird mit Botulismus der durch die Nahrung erworbene Botulismus gemeint, da dieser als erstes beschrieben wurde. Weitere seltenere Formen sind der Wundbotulismus, der durch Kolonisation einer Wunde mit C. botulinum und anschließender Toxinproduktion entsteht (meist bei Drogenkonsumenten) und zwei Formen des intestinalen Botulismus: der Säuglingsbotulismus (auch „infantiler Botulismus“) und der sehr seltene „adulte infektiöse Botulismus“, der nach einer Zerstörung der Darmflora z.B. durch orale Antibiotikatherapie auftreten kann. Beide Formen entstehen durch eine intestinale Besiedelung mit dem Bakterium und dortiger Toxinbildung.
Eine weitere nicht natürlich vorkommende Form ist der Botulismus durch Inhalation eines mit Botulinumtoxin verunreinigten Aerosols im Rahmen eines Laborunfalls oder im Rahmen des Bioterrorismus (Sobel 2005). Aufgrund der möglichen Übertragung über Aerosole gilt BoNT als eine der gefährlichsten biologischen Waffen (Arnon et al.
2001).
Für alle Formen des Botulismus gelten dieselben charakeristischen Symptome. Die ersten Symptome treten etwa 12 bis 48 Stunden nach Vergiftung mit dem Toxin auf (Humeau et al. 2000). Die Krankheit beginnt klassischerweise zunächst mit gastrointestinalen Störungen, trockenem Mund und Händen sowie Doppelbildern und endet mit einer schlaffen Lähmung der gesamten Skelettmuskulatur (Abb. 2) (Bigalke
& Rummel 2005). Ein möglicher Tod tritt durch Lähmung der Atemmuskulatur ein, wobei dies nur bei schwerer Ausprägung und ohne Therapie vorkommt und eher ein seltener Fall ist.
Durch die verschleierten und mit anderen Krankheiten verwechselbaren Symptome der Erkrankung gibt es vermutlich eine hohe Dunkelziffer an unbekannt gebliebenen Botulismusfällen – z.B. im Rahmen des „plötzlichen Kindstod“, bei dem einige Fälle auf eine Infektion mit BoNT zurückzuführen sind.
Bei einer Intoxikation sollte möglichst rasch eine Therapie mit einem Pferde-Antitoxin (USA: HBAT heptavalent, EU: trivalentes ABE Botulismus-Antitoxin Behring) erfolgen. Dieses kann den Progress und das Ausmaß der Lähmung begrenzen. Es sollte idealerweise bis 24 h nach dem Auftreten der Symptome verabreicht werden, weil das Antitoxin nur ungebundene bzw. nicht aufgenommene Toxinmoleküle neutralisieren kann. Wenn nötig und nicht zu verhindern, muss eine sorgfältige Intensivpflege mit maschineller Beatmung durchgeführt werden (Sobel 2005). Aktuell liegt noch kein lizenzierter Impfstoff gegen das Botulinumtoxin vor.
Abb. 1: Übermittelte Botulismus-Erkrankungen nach Meldejahr 2001-2016 Deutschland (aus dem infektionsepidemiologischen Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten 2016, Stand 1. März 2017)
Abb. 2: Pathogenese der Krankheit Botulismus verursacht durch Clostridium botulinum, aus Medical Microbiology, 4. Aufl., Baron S, Galveston (TX):University of Texas Medical Branch at Galveston 1996
Tetanus Neurotoxin – Tetanus
Das Krankheitsbild ´Tetanus`, im allgemeinen Sprachgebrauch als Wundstarrkrampf bekannt, wurde schon vor 25 Jahrhunderten von Hippokrates beschrieben. Er schrieb von gelähmten Patienten mit hyperkontraktiler Skelettmuskulatur und benannte die Krankheit nach dem griechischen Wort „tetanos“, was „sich kontrahieren“ bedeutet. Dass die Ursache ein grampositives, obligat anaerobes und sporenbildendes Bakterium namens Clostridium tetani ist, wurde Ende des 19.
Jahrhunderts ausfindig gemacht (Carle and Rattone 1884, Kitasato 1891).
Die Sporen kommen überall im Erdboden vor. Unter optimalen anaeroben Bedingungen keimen die Bakterien in Wunden aus und bilden die zwei Exotoxine Tetanospasmin (heute TeNT) und Tetanolysin, wobei ersteres durch seine neurotrope Wirkung die typischen Symptome verursacht. Letzteres hat eine hämatotoxische und kardiotoxische Wirkung (Abb. 3). Therapeutisch kann den Patienten mit Tetanus zur Neutralisation von noch nicht gebundenem Tetanustoxin humanes Tetanus-Immunglobulin (HTIG, bis 10.000 IE i.m.) verabreicht werden.
Wichtig sind zusätzlich eine zeitnahe chirurgische Wundversorgung und eine umfassende Intensivtherapie u.a. mit Suxamethonium zur Muskelrelaxation.
Antibiotische Therapien mit Metronidazol oder auch Penicillin können zwar nicht das zirkulierende Toxin verringern, können jedoch die für die Toxinbildung verantwortlichen Bakterien abtöten (RKI-Ratgeber für Ärzte 2010). Meist endet die Krankheit aber durch Lähmung der Atemmuskulatur tödlich. In Entwicklungsländern sterben jährlich noch Hunderttausende von Menschen (v.a. Neugeborene und Kinder) an Tetanus, da hier die Durchimpfungsrate - anders als in den Industrienationen - sehr gering ist (Bleck 1991). Bedingt durch die hohe Immunisierungsrate treten in Deutschland jährlich nur etwa 15 an Tetanus erkrankte Fälle auf (RKI-Ratgeber für Ärzte 2010). Laut TESSy (The European Surveillance System) gab es für 2015 117 übermittelte Fälle von Tetanus in der EU und den Mitgliedsländern des EWR. Unter diesen waren 72% über 65 Jahre alt, was der fehlenden Durchimpfungsrate dieser Subpopulation geschuldet sein könnte.
Tendenziell kam es seit 2011 eher zu einer Abnahme aller Fälle, wobei für 2015 im Vergleich zu 2014 ein kleiner Anstieg zu verzeichnen war (European Centre for Disease Prevention and Control. Tetanus. In: ECDC. Annual epidemiological report for 2015. Stockholm: ECDC; 2017).
Abb. 3: Pathogenese der Krankheit Tetanus verursacht durch Clostridium tetani, aus Medical Microbiology, 4. Aufl., Baron S, Galveston (TX):University of Texas Medical Branch at Galveston 1996
1.3 Medizinischer Nutzen und Bioterrorrismus
Die Idee, Botulinum Neurotoxin als Medikament nutzen zu können, stammt ebenso wie die erstmalige Beschreibung der Krankheit Botulismus von Justinus Kerner (Erbguth & Naumann 1999).
160 Jahre später gelang Alan B. Scott erstmals ein Erfolg bei der Umsetzung dieser Idee durch erste Versuche mit Affen (Scott et al. 1973) und späterer Anwendung an mit Blepharospasmus erkrankten Menschen (Scott 1981). Die „US Food and Drug Administration“ genehmigte 1989 schließlich die Zulassung von BoNT/A als „orphan drug“ zur Anwendung bei Strabismus, Blepharospasmus und hemifaszialen Krämpfen (Turton et al. 2002), die vier Jahre später auch in Deutschland folgte.
Heutzutage wird BoNT/A aufgrund seiner langandauernden Wirkung von bis zu zehn Monaten, im Mittel jedoch vier bis fünf Monate, zur Behandlung einer Vielzahl neuromuskulärer Erkrankungen mit neuronaler Hyperaktivität wie z.B. Dystonien eingesetzt (Davletov et al. 2005, Montecucco & Molgo 2005, Antonucci et al. 2008).
Auch in der ästhetischen Medizin hat BoNT/A sich zur Behandlung von Falten etabliert, indem das in der Öffentlichkeit auch als „BOTOX“ bekannte Toxin intramuskulär oder auch subkutan in die gewünschte Region gespritzt wird.
Die Indikationen nehmen stetig zu - so wird BoNT/A mittlerweile auch durch seine mögliche Wirkung im autonomen Nervensystem erfolgreich in der Behandlung von Hyperhidrosis sowie in der Schmerztherapie eingesetzt (Porta 2000, Heckmann et al.
2001, Antonucci et al. 2008). Ein neueres Anwendungsgebiet ist seit einiger Zeit der Einsatz von Botulinumtoxin in der Behandlung der chronischen Migräne (Kim et al.
2010). Tabelle 1 zeigt eine Auswahl an in der Therapie angewandten Botulinumtoxinen mit ihrem Handelsnamen und Indikationen.
Eine mögliche Antikörperbildung beim Einsatz von Therapeutika auf Proteinbasis muss in Kauf genommen werden. So kann es zu einer Abnahme der Effizienz oder gar zum Nichtansprechen der Therapie kommen. Dies macht unter den Patienten allerdings nur einen kleinen Prozentsatz von etwa 1 bis 3% aus und tritt vor allem bei denen auf, die wiederholt mit hohen Dosen behandelt worden sind (Turton et al.
2002).
Tabelle 1: Botulinumtoxin-Medikamente
Bezeichnung Wirkstoff Hersteller Zulassung für/in
Botox BoNT/A-
Komplex Allergan Medizinische Anwendungen Botox® Cosmetics
(USA)
Vistabel® (Europa)
BoNT/A-
Komplex Allergan Kosmetische Anwendungen
(Vistabel® : Glabella- Falte zwischen den Augenbrauen)
Dysport® BoNT/A-
Komplex Ipsen Medizinische
Anwendungen (Dystonien)
Azzalure® BoNT/A-
Komplex Galderma Kosmetische
Anwendungen (Glabella- Falte zwischen den Augenbrauen)
Xeomin® BoNT/A Merz Schiefhals (Torticollis)
und Lidkrampf (Blepharospasmus)
Bocouture® BoNT/A Merz Kosmetische
Anwendungen (Glabella- Falte zwischen den Augenbrauen) Myobloc® (USA)
Neurobloc® (Europa) BoNT/B-
Komplex US World
Meds Medizinsche/kosmetische Anwendungen
Aufgrund der leichten Übertragungsmöglichkeit via Aerosol und der fehlenden präventiven Immunisierung gegen BoNT/A stellt das BoNT eine potentielle biologische Waffe dar (Arnon et al. 2001, Bigalke & Rummel 2005). Das CDC (engl.
Centers for Disease Control and Prevention) der USA stuft BoNT in die Kategorie A der select agents ein (zum Vergleich: Anthrax entspricht ebenso der Katgorie A) (Arnon et al. 2001).
1.4 Aufbau und Struktur der clostridiellen Neurotoxine
Durch biochemische und kristallographische Analysen konnten die clostridiellen Neurotoxine den AB-Toxinen zugeordnet werden. Die A-Untereinheit stellt die aktive, katalytische Einheit dar, während die B-Untereinheit für die spezifische Bindung an Zellen zuständig ist.
Sowohl TeNT als auch BoNT werden als 150 kDa (dies entspricht je nach Serotyp 1251-1315 Aminosäuren (Minton 1995)) große, einkettige (single chain) Proteine
synthetisiert, die posttranslational in aktive dichain Proteine umgewandelt werden.
Diese bestehen aus drei funktionalen Einheiten. Eine 50 kDa große leichte Kette (light chain, LC) ist mit einer 100 kDa schweren Kette (heavy chain, HC) über eine Disulfidbrücke aus Cysteinen und einem Peptidloop (zugehörig zur HN-Domäne, =
„belt“-Region) verbunden (Niemann et al. 1991, Lacy & Stevens 1999).
Die HC lässt sich weiter in eine 50 kDa große N-terminale Translokationsdomäne (HN), und eine 50 kDa große C-terminale Zellbindungsdomäne (HC) aufteilen, die wiederum aus zwei 25 kDa großen Untereinheiten besteht (Abb. 4a). Im C-terminalen Anteil (HCC) findet die Bindung statt (Schiavo et al. 1992, Schiavo et al. 1994), die Funktion des N-terminalen Anteils (HCN) war lange nicht geklärt. 2009 konnte erstmals durch Muraro et al. eine schwache Interaktion mit Phosphatidylinositolphosphat gezeigt werden (Muraro et al. 2009). Aktuelle Mutationstudien von Wang et al., in denen eine BoNT/A-Mutante mit fehlender HCN- Domäne hergestellt wurde, zeigten eine deutlich reduzierte Letalität, sodass von einem Beitrag zum Internalisations- und Translokatiosprozess ausgegangen werden kann (Wang et al. 2017).
Während die LC als Zink-Endopeptidase die katalytische A-Untereinheit darstellt, ist die HC als B-Untereinheit für die neurospezifische Bindung an komplexen Polysialogangliosiden und spezifischen Proteinrezeptoren sowie für die Translokation der LC aus dem endozytierten Vesikel ins neuronale Zytosol zuständig (Brunger &
Rummel 2009a, Schiavo et al. 1990, Montecucco & Schiavo 1995, Rummel et al.
2003, Rummel et al. 2007, Rummel et al. 2004b, Strotmeier et al., Strotmeier et al.
2010, Jin et al. 2006, Strotmeier et al. 2011). Die Hypothese, dass die Bindung nach dem Prinzip des Doppelrezeptormodells erfolgt (Montecucco 1986), konnte für die HCC von BoNT/B und G bewiesen werden (Rummel et al. 2007).
Die Botulinum Neurotoxine und das Tetanus Neurotoxin sind in ihrer Aminosäuresequenz zu 35% identisch und zu 65% homolog. Die LCs zwischen den BoNTs haben eine Sequenzidentität von 36%, die zwischen BoNT/B und TeNT liegt sogar bei 50% (Kurazono et al. 1992, Niemann et al. 1994, Lacy & Stevens 1999).
Alle Sequenzen beinhalten innerhalb der je zur Hälfte aus α-Helices und β- Faltblättern bestehenden LC das konservierte Zink-Bindungs-Motiv HEXXH + E, welches typisch für Zink-Endopeptidasen ist (Lacy & Stevens 1999, Swaminathan 2011). Die katalytische Domäne sitzt in einer tiefen Tasche der Proteinoberfläche. In BoNT/A ist diese Stelle durch die „belt“-Region – dem großen Loop der HN-Domäne
– verdeckt. In BoNT/B ist dieser Loop ein wenig kürzer und befindet sich im Bereich der Aminosäuren 481 bis 532 (Swaminathan 2011). Einzig für die HN-Domäne sind zusätzlich zur „belt“-Region die 105 Å langen α-Helices. Die Sequenzhomologie der HN-Domänen liegt zwischen 34 und 62% und ist somit ähnlich hoch wie die Homologie der LCs. Die HN-Domäne ist über eine Disulfidbrücke kovalent mit der LC verbunden. Die in BoNT/A an Position 430 und 454 sitzenden Cysteine und die daraus resultierende Disulfidbrücke sind aufgrund ihrer Wichtigkeit im Intoxikationsprozess zwischen den CNTs strikt konserviert (Schiavo et al. 1990).
Durch die posttranslationale proteolytische Spaltung zwischen den Cysteinen wird aus dem inaktiven single chain Protein ein aktives dichain Protein.
Die HC-Domäne mit ihren zwei Untereinheiten HCN und HCC liegt abgekippt von der zentral liegenden HN-Domäne, um die für die Bindung an Zielzellen nötigen oberflächlichen Loops zugänglich machen (Turton et al. 2002). Sie besteht aus einer
„β-barrel“-Struktur im „jelly-roll“-Motiv, wobei der C-terminale Anteil vowiegend in Form eines Kleeblattes („β-trefoil fold“) vorliegt (Umland et al. 1997). Unter den BoNTs und dem TeNT weist dieser strukturelle Teil des Toxins die geringste Sequenzhomologie auf. Sie liegt bei nur 21% bis 53% und erklärt damit u.a. die unterschiedliche Bindung der einzelnen CNTs an verschiedene Proteinrezeptoren (Ginalski et al. 2000).
Die dreidimensionalen Strukturen der HC-Fragmente aller CNTs sowie die der LC konnten bereits identifiziert werden. Von den Holotoxinen liegen die Kristallstrukturen von BoNT/A, BoNT/B und BoNT/E vor (Lacy et al. 1998, Swaminathan &
Eswaramoorthy 2000a, Kumaran et al. 2009, Swaminathan 2011).
Kürzlich zeigten Masuyer et al. eine pH-abhängige Konformationsänderung von TeNT. Aufgrund des flexiblen Loops zwischen den Domänen ist die HC- Bindungsdomäne des TeNT beweglich, während LC und HN eine positiv geladene Oberfläche formen. Vermutlich begünstigt dies bei der Ansäuerung der lokalen Umgebung Wechselwirkungen mit der HC-Domäne. TeNT wird zu Beginn des Intoxikationsprozesses in seine Transportvesikel sortiert und kommt hier mit einer neutralen Umgebung in Berührung, was eine offene Konformation des TeNT begünstigt. Nach der Transzytose in inhibitorische Interneuronen kommt es durch die nun saure Umgebung erneut zu einer Konformationsänderung. TeNT nimmt eine geschlossene Konformation an. Möglicherweise stellt dies einen rezeptorgebundenen Zwischenzustand vor der Porenbildung dar. Die genauen
strukturellen Veränderungen, denen die CNT unterliegen, um die Translokation der LC ins Zytosol zu ermöglichen, bleiben weiterhin unklar. Die Tatsache jedoch, dass TeNT multiple Formationen einnehmen kann, bringt wichtige Konsequenzen für seine Funktion mit sich und trennt es klar von den BoNT ab (Abb. 4b und c) (Masuyer et al.
2017).
a)
b)
HC
HOOC
Neurospezifische Bindung
HC
HN Be
Translokation der LC
S LC
NH Zn2+- Endopeptidase S
Lo
c)
Abb. 4: a) Schematische Darstellung der vier Domänen von Clostridiellen Neurotoxinen (oben) und Kristallstruktur am Beispiel von BoNT/B (1EPW.pdb) (unten). Während die 50 kDa große LC (rot) mit ihrer Zink-Metalloprotease die katalytische Domäne darstellt, ist die HC sowohl für die Translokation der LC aus dem endozytiertem Vesikel ins Zytosol der Nervenzelle (HN, grün) als auch für die neurospezifische Bindung an die präsynaptische Membran (HC, blau) zuständig (Swaminathan & Eswaramoorthy 2000a) b) Struktur von TeNT mit seiner katalytischen Domäne LC (türkis), der „belt“-Region (lila), der Translokationsdomäne HN (blau) sowie der Bindungsdomäne HC (grau). Die zwei Disulfidbrücken sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Die jeweils dazugehörenden Cysteine sind als Stäbchen gezeigt. Rechts im Bild ist TeNT über seine GBT an GD1a (orange) gebunden (Masuyer et al. 2017) c) Vergleich der Kristallstrukturen von TeNT, BoNT/B (PDB-file: 1EPW) und BoNT/E (PDB-file: 3FFZ). Die obere Abbildung zeigt eine schematische Darstellung der Organisation der einzelnen Domänen zu den darunter korrespondierenden Toxinen (Masuyer et al. 2017)
1.5 Wirkmechanismus clostridieller Neurotoxine
Nachdem die clostridiellen Neurotoxine in die Blutbahnen des Körpers gelangt sind, können sie zu den Motoneuronen gelangen und dort spezifisch an unmyelinierte Nervendigungen binden (Dolly 1994, Dolly et al. 1984). Während BoNT direkt in der Synapse wirkt und durch Spaltung von SNARE-Proteinen die Freisetzung von Acetylcholin verhindert, wandert TeNT retrograd axonal ins ZNS zu inhibitorischen
Neuronen und verhindert dort die Freisetzung von den inhibitorischen Neurotransmittern Glycin und GABA.
Die SNARE-Familie als Zielproteine der clostridiellen Neurotoxine besteht aus SNAP- 25 (25 kDa synaptosome-associated protein; t-SNARE) und Syntaxin (t-SNARE) auf der Innenseite der Zellmembran sowie Synaptobrevin/VAMP (vesicle-associated membrane protein; v-SNARE) auf der Vesikeloberfläche (Lalli et al. 2003); Dolly and Aoki 2006). Sie sind bei der Freisetzung von Neurotransmittern in den synaptischen Spalt für die Fusion der synaptischen Vesikel mit der präsynaptischen Membran verantwortlich (Turton et al. 2002, Jahn et al. 2003). Abbildung 5 zeigt eine Übersicht über den aus vier Schritten bestehenden Wirkmechanismus.
Nach der spezifischen Bindung an Lipid- und Proteinrezeptoren auf neuronalen Zellen (1) kommt es zu einer rezeptorvermittelten Internalisation des Toxins mittels Vesikelendozytose (2a). Während TeNT in andere Vesikel als BoNT sortiert zu werden scheint, um zu seinem Wirkort gelangen zu können (2b), verbleibt BoNT peripher und entfaltet dort nach Translokation der LC ins Zytosol (3) seine enzymatische Aktivität (4) (Montecucco & Schiavo 1994, Bohnert & Schiavo 2005).
N L
LE
CV CV
EsE
RE
RE SV
SV TGN
Golgi ER
L LE
CV
CV clathrinbedecktes Vesikel
L Lysosom
LE spätes Endosom (engl. )
EsESV synaptisches Vesikel
TGN
ER endoplasmatisches Retikulum N Zellkern (engl. )
late endosome early sorting endosome
trans golgi network nucleus RE recycling endosoem
retrograd axonaler Transport
TeNT BoNT
Motoneuron inhibitorisches Interneuron
1
2a
3 2b 4
1
2a
3 4
Abb. 5: Schematische Darstellung des Wirkmechanismus von BoNT und TeNT: 1) neurospezifische Bindung an die Zielzellen über einen Gangliosid- und einen Proteinrezeptor, 2a) rezeptorvermittelte Internalisation des Toxin-Rezeptorkomplexes mittels Vesikelendozytose, 2b) retrograd axonaler Transport des TeNT, 3) Translokation der LC ins neuronale Zytosol , 4) Spaltung der SNARE-Proteine durch die LC von BoNT und TeNT; aus Dissertation S. Mahrhold 2008
1.5.1 Das Doppelrezeptormodell – neurospezifische Bindung an Zielzellen und Internalisation durch Vesikelendozytose
Montecucco stellte 1986 für die Wirkungsweise der CNTs die Hypothese eines Doppelrezeptormodells auf, welche 2007 durch Rummel et al. für die HCC-Domäne von BoNT/B und G sowie 2014 durch Strotmeier et al. für die HCC-Domäne von BoNT/A bewiesen werden konnte (Rummel et al. 2007, Strotmeier et al. 2014).
Verantwortlich für die spezifische Bindung an cholinerge Nervendigungen ist der C- terminale Anteil der HC-Domäne der CNTs, der an Ganglioside – eine Klasse unter den Glycosphingolipiden – bindet (Simpson and Rapport 1971, van Heyningen 1974).
Ganglioside, die reichlich in der präsynaptischen Membran vorhanden sind, bestehen aus einem an ein Ceramid gebundenem Zuckerrückgrat (Gal(β1-3)GalNAc(β1- 4)Gal(β1-4)Glc(β1-1)Cer), an dem ein oder mehrere Sialinsäuren (N- Acetylneuraminsäuren = Sialinsäuren) binden (Kolter et al. 2002, Chen et al.
2008)(Abb. 6). Über zwei Kohlenstoffketten des Lipidanteils sind sie in der Zellmembran verankert.
Abb. 6 : Schematische Darstellung der Ganglioside GT1b, GD1b, GD1a, GM1a (GQ1b ist nicht dargestellt): Sie bestehen aus einem an einen Ceramidrest gebundenem Oligosaccharidanteil, der ein oder mehrere N-Acetylneuraminsäurereste besitzt; Disialyllactose ist ein α-Neu5Ac- (2→8)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-d-Gal-(1→4)-d-Glc (Sia-1-Sia-2-Gal-3-Glc-4), abgekürzt als ds-lac.
Glc=Glucose; Gal=Galactose; Gal-NAc= N-Acetygalactosamin (Chen et al. 2008)
Botulinum und Tetanus Neurotoxine binden im Allgemeinen an die Ganglioside GQ1b, GT1b, GD1b und GD1a, die mindestens zwei Sialinsäurereste beinhalten (Montecucco & Schiavo 1994, Kitamura et al. 1999, Binz & Rummel 2009). Durch kristallographische Analysen konnten für BoNT/A und für BoNT/C GT1b und GD1a mit ihrem terminalen N-Acetylgalactosamin-Galactose (= NAcGalβ3-1Galβ)-Rest als hauptsächliche Bindungspartner publiziert werden (Schengrund et al. 1991, Stenmark et al. 2008, Tsukamoto et al. 2008, Strotmeier et al. 2011). Die zweite vorhandene Gangliosidbindungstasche (GBT) in TeNT, die auch GPI-verankerte glykosylierte Proteine als Rezeptor binden kann, zeigt vor allem hohe Affinitäten zu der Disialo-Carbohydrat Struktur von GT1b, GD1b und GQ1b (Angstrom et al. 1994, Emsley et al. 2000, Herreros et al. 2000, Herreros et al. 2001, Rummel et al. 2003, Munro et al. 2001). Auch für BoNT/D konnte eine zweite GT1b-bindende Tasche identifiziert werden. Während die erste Tasche im Bereich der GBT von BoNT/A, B, E, F und G lokalisiert ist, befindet sich die zweite – ähnlich wie bei TeNT – im Bereich der Proteinrezeptorbindungstasche von BoNT/B und G (Strotmeier et al. 2010). Für BoNT/C scheint ebenso eine solche zweite Tasche zu existieren (Strotmeier et al.
2011).
In einem ersten Bindungsschritt akkumulieren die Neurotoxine durch eine niedrigaffine Bindung an die o.g. Ganglioside auf der Oberfläche der neuronalen Zielzelle, um anschließend an einen zweiten Rezeptor, einen spärlich vorhandenen Proteinrezeptor, hochaffin zu binden.
Die Toxine binden abhängig vom Serotyp an unterschiedliche Proteinrezeptoren.
Bislang konnten nur jene von BoNT/A, BoNT/B, BoNT/DC, BoNT/E und BoNT/G zweifelsfrei identifiziert werden. Während BoNT/A an SV2A, B und C (engl. synaptic vesicle glycoprotein 2) bindet (Dong et al. 2006, Mahrhold et al. 2006), binden BoNT/B (Abb. 8), BoNT/DC und BoNT/G an Syt-I und Syt-II (Synaptotagmin I und II) (Dong et al. 2003, Rummel et al. 2007, Rummel et al. 2004a, Nishiki et al. 1994, Nishiki et al. 1996, Peng et al. 2012). Für BoNT/E konnten nur SV2A und B als Proteinrezeptoren identifiziert werden (Dong et al. 2008). BoNT/C scheint ohne einen Proteinrezeptor an die Zelloberfläche zu binden, kann aber stattdessen eine zusätzliche Gangliosidbindung ausbilden (s.o.) (Strotmeier et al. 2011). Während vor einiger Zeit die These aufgestellt wurde, dass SV2A, B und C eine Rolle als Proteinrezeptor bei BoNT/F spielen könnten (Fu et al. 2009, Rummel et al. 2009), so
wurde für BoNT/D ebenso SV2 als möglicher Proteinrezeptor postuliert (Peng et al.
2011). Yeh und Dong erforschten in Studien für TeNT SV2A und SV2B als Rezeptorproteine im zentralen Nervensystem und befürworteten daher auch für TeNT das Doppelrezeptormodell (Yeh et al. 2010). Kürzliche Studien zeigten die Wichtigkeit eines extrazellulären Matrixproteins als Teil eines Rezeptorkomplexes für TeNT an der neuromuskulären Synapse. Die Bindung von TeNT an Nidogen könnte einen endozytischen Weg von TeNT und somit retrograd axonalen Transport erklären (Bercsenyi et al. 2014).
Neuere Studien mit SV2 zeigten auf seiner Toxin-Bindungsstelle glykosylierte Reste, sodass eine mögliche klinische Relevanz dieser postuliert wurde (Yao et al. 2016, Benoit et al. 2014). Eine unterschiedliche Glykosylierung von SV2 bei verschiedenen Individuen könnte das unterschiedliche Ansprechen von BoNT/A1 bei Patienten erklären (Kammerer & Benoit 2014). Um die Vermutung zu bestätigen, müssen jedoch noch genauere Studien durchgeführt werden.
Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über die CNTs und ihre zugehörigen Proteinrezeptoren.
Tabelle 2: Übersicht über die jeweiligen zu den einzelnen CNTs zugehörigen Proteinrezeptoren;
SV2 (synaptic vesicle 2 proteins); Syt-I und-II (Synaptotagmin I und II)
Clostridelles Neurotoxin Proteinrezeptor
BoNT/A SV2A, B und C
BoNT/B Syt-I und-II
BoNT/C -
BoNT/D potentiell SV2; Isoform unbekannt
BoNT/E Glykosyliertes SV2A und B
BoNT/F potentiell SV2A, B und C
BoNT/G Syt-I und -II
TeNT SV2A und B
Das an den Proteinrezeptor gebundene Toxin gelangt schließlich mittels rezeptorvermittelter Endozytose in einem Clathrin bedeckten Vesikel in die neuronale Zelle. Die Clathrinhülle zersetzt sich sofort nach Abschnürung des Vesikels von der präsynaptischen Membran, so dass das Vesikel erst anschließend mit dem endosomalen Kompartiment fusionieren kann (Deinhardt et al. 2006a). Nach der Internalisation bindet TeNT schließlich nach seinem retrograd axonalen Transport an inhibitorische Neurone, bevor die LC von TeNT wie die der BoNTs ins neuronale Zytosol transloziert werden kann (Abb. 7).
Abb. 7: Übersicht über die Internalisation: Während TeNT an einem Interneuron aufgenommen wird, zerfällt bei den BoNTs die Clathrinhülle nach der Internalisation, sodass das Vesikel nach Translokation der LC ins Cytosol wieder mit der Plasmamembran fusionieren kann (SV- Kreislauf) (Deinhardt et al. 2006a).
Abb. 8: Darstellung des Doppelrezeptormodells am Beispiel von BoNT/B (HC: grün, HN: lila, LC:
rot). Bindung der HC an GD1a (blau) und Syt-II (braun) an der präsynaptischen Membran (Berntsson et al. 2013)
1.5.2 Translokation ins Zytosol und Transport
Nach der rezeptorvermittelten Internalisation muss die LC die hydrophobe Vesikelmembran überwinden. Der Vorgang der Translokation ist neben dem retrograd axonalen Transport des TeNT einer der am wenigsten aufgeklärten Mechanismen des Intoxikationsprozesses.
Dass die Neurotoxine nach ihrer Endozytose zunächst im Endosom verbleiben, ist bereits aufgeklärt. Die Translokationsdomäne der HC formt pH-abhängig eine Pore in der Membran, durch die die LC ins Zytosol der Nervenzelle gelangen kann (Abb. 5, 3) (Montecucco et al. 1989, Lacy & Stevens 1999, Brunger et al. 2007, Fischer &
Montal 2007a, Fischer & Montal 2007b). Der genaue Vorgang der Kanalbildung ist unklar. Bekannt ist allerdings für BoNT/A und BoNT/E, dass sich die LC vor Passage des Kanals entfalten muss, um durch den mit einem Durchmesser von 15 Å großen Kanal gelangen zu können, was ihr bei saurem pH ermöglicht wird (Swaminathan 2011, Koriazova & Montal 2003, Li & Singh 2000, Pirazzini et al. 2011, Sheridan 1998). Diese pH-Änderung des Vesikellumens wird durch eine ATPase-Protonen- Pumpe erreicht (Ahnert-Hilger et al. 2003).
Es wird postuliert, dass die HC als Chaperon für die LC wirkt (Brunger et al. 2007).
Der HC-Kanal dient demnach neben dem Transport der LC ins Zytosol auch der korrekten Rückfaltung der LC vermutlich in ihre Ausgangskonformation. Sie kann schließlich ins Zytosol entweichen, um dort nach Reduktion der Disulfidbrücke ihre volle enzymatische Aktivität zu entfalten (Brunger et al. 2007, Fischer & Montal 2007a, Fischer & Montal 2007b).
1.5.3 Proteolytische Aktivität
Nachdem die leichte Kette ins Zytosol gelangt ist, spaltet sie je nach Serotyp eines der drei vorhandenen SNARE-Proteine, die für die Verschmelzung des mit den Neurotransmittern gefüllten Vesikels und der präsynaptischen Membran verantwortlich sind. Diese Fusion kann stattfinden, sobald sich ein sogenannter trans-SNARE-Komplex geformt hat. Er ist aus vier α-Helices von Teilen der SNARE- Proteine zusammengesetzt, die zusammen eine „coiled coil“-Struktur bilden. Er
beinhaltet VAMP 2 (= Synaptobrevin) des synaptischen Vesikels und Syntaxin 1A bzw. SNAP-25 aus der präsynaptischen Membran (Abb. 9).
Dieser Vorgang wird durch die LC der CNTs unterbrochen. Damit die Vesikel mit den enthaltenen Neurotransmittern mit der präsynaptischen Membran fusionieren können, muss sich aus dem trans-SNARE-Komplex ein cis-SNARE-Komplex bilden (Hayashi et al. 1994), d.h., dass alle SNAREs in einer Membran lokalisiert sind. Beim trans-SNARE-Komplex befindet sich VAMP 2 in der Vesikelmembran.
Durch die Unterbrechung der Bildung des cis-SNARE-Komplexes können die Neurotransmitter nicht ausgeschüttet werden, was die für BoNT charakteristische schlaffe und für TeNT eine spastische Parese zur Folge hat.
Während BoNT/A und BoNT/E C-terminale Bereiche innerhalb von SNAP-25 spalten, können BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G und TeNT verschiedene Bereiche innerhalb von VAMP-2 spalten. BoNT/C hingegen kann sowohl SNAP-25 als auch Syntaxin spalten (Blasi et al. 1993b, Blasi et al. 1993a, Blasi et al. 1994, Binz et al.
1994) (Tab.3).
Abb. 9: Darstellung des trans-SNARE-Komplexes und die dazugehörigen Bestandteile: VAMP 2 (= Synaptobrevin) in blau, Syntaxin 1A in rot und SNAP-25 in grün; Zusätzlich sind die entsprechenden Spaltstellen der CNT markiert (Sutton et al. 1998)
Tabelle 3: Übersicht über die jeweils von den einzelnen etablierten BoNTs bzw. von TeNT gespaltenen SNARE-Proteine (Binz et al. 1994, Vaidyanathan et al. 1999, Sikorra et al. 2008, Deinhardt et al. 2006b, Lakadamyali et al. 2006)
Clostridelles
Neurotoxin SNARE-Protein Spaltstelle
BoNT/A SNAP-25 Gln 197 – Arg 198
BoNT/B VAMP-2 Gln 76 – Phe 77
BoNT/C SNAP-25
Syntaxin 1A Arg 198 – Ala 199
Lys 253 – Ala 254
BoNT/D VAMP-2 Lys 59 – Leu 60
BoNT/E SNAP-25 Arg180 – Ile181
BoNT/F VAMP-2 Gln 58 – Lys 59
BoNT/G VAMP-2 Ala 81 – Ala 82
TeNT VAMP-2 Gln 76 – Phe 77
1.5.4 Retrograd axonaler Transport
Nach der Aufnahme von TeNT in eine Nervendigung wandert es in einem nicht angesäuertem clathrinbedeckten Vesikel in Richtung eines „early sorting compartment“ (engl.), in dem eine Rab5/7-abhängige Sortierung stattfindet, um schließlich retrograd axonal ins ZNS zu wandern und dort seine volle Wirkung zu entfalten (Bohnert and Schiavo 2005).
Der Mechanismus des retrograd axonalen Transportes ist bis heute nicht genau verstanden. Vermutet wird aber, dass die HCC-Domäne als isolierte Domäne den Weg entlang des Rückenmarks in Richtung inhibitorischer Interneurone einschlägt (Rummel et al. 2001). Diese These wird unterstützt durch Versuche von Höltje et al., bei denen in BoNT/A die HC-Domäne bzw. die HCC-Domäne gegen die aus TeNT getauscht wurden. Im MPN-Assay konnte gezeigt werden, dass die Hybridtoxine eine deutlich reduzierte Bindung im Vergleich zu BoNT/A aufwiesen. Erklärt werden könnte dies durch eine durch den Austausch bedingte andere Sortierung (Holtje et al.
2013).
Berichtet wird auch von einem retrograd axonalen Transport von BoNT/A unter bestimmten Voraussetzungen wie z.B. dem Einsatz extrem großer Mengen oder auch der Injektion an einem bestimmten, dem ZNS naheliegenden Ort (Antonucci et al. 2008, Habermann & Dreyer 1986). TeNT dagegen kann in einer 1000-fach höheren Konzentration auch eine periphere Hemmung der ACh-Ausschüttung bewirken (Rummel et al. 2003, Simpson 1985).
1.5.5 Zwei Gangliosidbindungstaschen in der HCC-Domäne von Tetanus Neurotoxin
Der C-terminale Anteil der Zellbindungsdomäne besitzt sowohl in den verschiedenen Serotypen der BoNTs sowie im TeNT zwei Bindungstaschen. Während in den meisten BoNT hauptsächlich je eine Gangliosid- und eine Proteinbindungsstelle vorliegen, sind im TeNT zwei GBT vorzufinden (Rummel et al. 2003, Rummel et al.
2004a, Rummel et al. 2007) (Abb. 10). Ausnahmen bei den BoNT bilden BoNT/C und D, bei denen kürzlich auch eine zweite GBT identifiziert werden konnte (s.o.) (Strotmeier et al. 2010, Strotmeier et al. 2011). In TeNT befindet sich die erste GBT - auch Lactose bindende Stelle genannt - im analogen Bereich der einzigen, konservierten GBT von BoNT/A, B, E, F und G (Halpern and Loftus 1993; Shapiro, Specht et al. 1997), die zweite exklusive Sialinsäure bindende Tasche im Bereich der Proteinrezeptorbindungstasche der Syt-I und -II bindenden BoNTs (Rummel et al.
2003).
Ein gemeinsames Peptidmotiv unter den Gangliosid- bzw. Lactosebindungstaschen der CNTs beinhaltet die Aminosäurenabfolge E(D,Q)…H(K)…SXWY…G. Diese Abfolge beinhaltet alle für die Bindung an Ganglioside notwendigen Strukturen, wie sie auch in anderen Toxinen vorhanden ist. Ein aromatischer Rest (vorzugsweise Tryptophan oder Tyrosin) bildet hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Galactosering aus. Die an der Gegenseite gelegenen polaren Reste wie Glutamat, Serin oder Asparagin binden die Hydroxylgruppen der Zucker.
Abb. 10: HC-Fragment (Zellbindungsdomäne) vom Tetanus Neurotoxin mit Darstellung der Lactose- und der Disialylbindungsstelle
Disialyllactose
GT1b HCN
HCC
Durch „photoaffinity labeling“ Studien konnte bereits die Wichtigkeit der letzten 34 Aminosäuren der HCC-Domäne sowie H1293 in TeNT-HCC gezeigt werden, um den Oligosaccharidanteil der Ganglioside zu binden (Shapiro et al. 1997). In darauffolgenden Studien wurden in TeNT vier Bindungsstellen (= Loops; Lac, NeuAc, Gal, NAcGal) identifiziert (Emsley et al. 2000, Eswaramoorthy et al. 2001).
Ein Loop befindet sich im Bereich der Aminosäure H1293. Hier interagiert ein Lactosemolekül mit den Aminosäuren D1222, T1270, S1287, W1289, Y1290 und G1300. W1289 ist - homolog zu W1266 der GBT in BoNT/A (Abb. 11) - die aromatische Schlüsselaminosäure der Lactosebindungsstelle in TeNT. In einer Studie, in der TeNT mit einem synthetisierten GT1b-β ohne Ceramidrest kokristallisiert wurde (Fotinou et al. 2001), konnte gezeigt werden, dass das terminale Disaccharid der Ganglioside Galβ3GalNAcβ (auch Zuckerrückrat genannt) in der Nähe von H1293 bindet, wobei die hydrophobe Seite vom Gal-Ring parallel zu W1289 sitzt (Abb. 12). Eine Kokristallation von BoNT/B und Silalyllactose bzw.
Doxorubicin bestätigten, dass die Gangliosidbindungsstelle der BoNT der Lactosebindungsstelle von TeNT entspricht (Swaminathan & Eswaramoorthy 2000b, Eswaramoorthy et al. 2001).
Eine zweite Seite, die als Schlüsselaminosäure R1226 beinhaltet, interagiert mit den Sialinsäuren (= N-Acetylneuraminsäuren bzw. NAcNeu) eines weiteren GT1b-β, indem das Arginin eine Salzbrücke zur Carboxylgruppe der N-Acetylneuraminsäure ausbildet (Fotinou et al. 2001). Die Tasche wird duch vier Loops geformt und besteht insgesamt aus den Aminosäuren D1147, D1214, G1215, N1216, R1226 und Y1229 (Jayaraman et al. 2005) (Tab. 4, Abb. 12). Diese Seite stellt die für diese Arbeit wichtige exklusive Sialinsäurebindungsstelle des TeNTs dar.
Es konnten zwei weitere Stellen identifiziert werden, die Galactose bzw. NAcGal (engl. N-acetylgalactosamine) binden können, aber nicht als potentielle Bindungstaschen für Ganglioside in Frage kommen, da zum einen zu wenig Platz zur Verfügung steht, um ein komplettes Gangliosid zu binden und zum anderen ein zu flexibles Kohlenstoffgerüst zur Bindung geboten wird. (Emsley et al. 2000, Fotinou et al. 2001).
Tabelle 4: Übersicht der vier Loops, die die Sialisäurebindungstasche (SBT) von TeNT formen (Jayaraman et al. 2005)
Disialylbindungsstelle Bereich
Loop 1 Asn 1141 – Asp 1147
Loop 2 Asp 1214 – Ala 1217
Loop 3 Tyr 1229 – Ala 1235
Loop 4 Gln 1274 – Asn 1280
Von Bercsenyi et al. wurde 2014 Nidogen als möglicher Proteinrezeptor von TeNT postuliert, nachdem von Jayaraman et al. bereits 2005 in einer Kokristallisation von TeNT mit Disialyllactose gezeigt wurde, dass die Sialinsäurebindungsstelle ein GD3- Derivat sowie das Tripeptid YEW (Tyr-Glu-Trp) binden kann (Jayaraman et al. 2005, Bercsenyi et al. 2014).
Die Bindung des Tripeptid YEW bestätigt die Annahme, dass trotz der gezeigten Bindung von Gangliosiden an der Sialinsäurebindungsstelle zusätzlich eine von Herreros et al. erforschte Interaktion mit dem GPI verankerten Protein Thy-1 eine Rolle spielen könnte (Brunger & Rummel 2009b, Munro et al. 2001, Herreros et al.
2001).
Während bereits länger bekannt ist, dass simultan zwei GT1b- oder GD1b-Moleküle unabhängig voneinander an die Laktose- als auch an die Sialinsäurebindungsstelle von TeNT binden können (Chen et al. 2008, Rummel et al. 2003), zeigten Chen et al.
kürzlich, dass das Gangliosid GM1a spezifisch an die Lactose- und GD3 mit seinen zwei Sialinsäureresten nur an die Sialinsäurebindungsstelle bindet (Abb. 13) und beide Bindungstaschen für eine hochaffine Bindung des TeNT an die Zellmembran nötig sind. Eine Kokristallation von HCTeNT mit GT2 bestärkte zudem die Beobachtung, dass Ganglioside der ”a”-Serie (GM1a, GD1a) an die GBT und die der
”b”-Serie (GT1b, GD1b) eher an die SBT binden (Chen et al. 2009) .
Abb. 11: Gangliosidbindungsstelle von BoNT/A mit der Schlüsselaminosäure W1266; gelb:
GT1b, grau: mit GT1b interagierende AS aus TeNT (Stenmark et al. 2008)
a) b)
Abb. 12: Struktur von HCTeNT in Komplex mit Galactose und GT2; a) zeigt die Bindung der GBT mit der Schlüsselaminosäure W1289 von TeNT an Galactose; der hydrophobe Rest von Galactose sitzt parallel zum Indolring von W1289; b) zeigt die Bindung der SBT mit der Schlüsselaminosäure R1226 von TeNT-HC an GT2; drei Sialinsäuren (Sia4, Sia5, Sia6) sind sichtbar, wobei nur Sia5 und Sia6 direkte Wechselwirkungen mit HCTeNTeingehen (Chen et al.
2009)
Abb. 13: Darstellung der Bindungstaschen von TeNT. Während die GBT (Schlüsselaminosäure W1289) GalGalNAc des Gangliosids (anhand von GM1a dargestellt) bindet, bindet die SBT (Schlüsselaminosäure R1226) die Sialinsäuren eines Gangliosids (anhand von GD3 dargestellt) (Chen et al. 2009)
2 Aufgabenstellung
Die niedrigste Sequenzhomologie zwischen den sieben etablierten BoNTs (Serotyp A-G) und TeNT liegt im Bereich der HCC-Domäne. Neben der konservierten GBT (Peptidmotiv E(D,Q)…H(K)…..SXWY…..G (Rummel 2013)) in der β-Faltblatt- Domäne besitzt TeNT eine weitere exklusive Bindungstasche (=
Sialinsäurebindungstasche (SBT) (Rummel et al. 2003), die an der Stelle der Proteinrezeptorbindungstasche in BoNT/B ist. Diese Tasche scheint mitverantwortlich für den retrograd axonalen Transport des TeNTs zu sein. Ziel dieser Arbeit ist es, die in BoNT/A zur SBT aus TeNT homologe Oberfläche in der HCC-Domäne mittels Aminosäureaustausche so zu modifizieren, dass sie der SBT von TeNT entspricht. Dadurch sollte das von BoNT/A zu TeNT (= ToNT) modifizierte ToNT nach der Endozytose eine Sortierung in die neutralen Vesikel, welche retrograd axonal transportiert werden, erfahren. Aufgrund der flächendeckenden Immunisierung der Bevölkerung gegen Tetanus kann TeNT selber nicht als inaktiviertes Transportvehikel für Moleküle zur Behandlung neurologischer Krankheiten wie z.B. ALS oder multiformer Glioblastoma eingesetzt werden. Daher sollte die Eigenschaft „axonaler Transport“ mittels Proteinengineering auf das zu 35%
homologe BoNT/A, welches bereits weltweit als Muskelrelaxans in der Medizin angewandt wird, übertragen werden, um dieses möglicherweise als Transportvehikel nutzen zu können.
3 Material und Methoden
3.1 Arbeiten mit DNA – Herstellung der Expressionsplasmide
3.1.1 Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) ist ein Verfahren, welches die Vervielfältigung und Mutation eines bestimmten DNA- Abschnittes (engl. Template-DNA) mittels zweier spezifischer Oligonukleotide (engl.
primer) und einer hitzebeständigen DNA-Polymerase ermöglicht (Saiki et al. 1988).
Für die PCR wird eine rekombinante PWO-Polymerase (Peqlab) verwendet, die neben einer 5’ 3’-Polymeraseaktivität auch eine 3’ 5’-Exonukleaseaktivität besitzt, sodass es zu einer geringeren Fehlerrate (2x10-6) der Reaktion kommt. Die PCR läuft in mehreren charakteristischen Schritten ab. Zunächst wird durch einen Temperaturanstieg die Template-DNA denaturiert, wodurch der DNA-Doppelstrang in zwei Einzelstränge zerfällt. Anschließend können die Primer an die Einzelstränge hybridisieren (engl. annealing) und so kurze doppelsträngige DNA-Abschnitte bilden, die der Polymerase als Startpunkte für die Synthese komplementärer DNA-Stränge dienen. Dieser auch als Polymerisation oder Elongation bezeichnete Schritt benötigt Desoxynukleotide und verläuft vom 5’- zum 3’-Ende hin. Diese Schritte erfolgen in einem Zyklus, der 35-mal wiederholt wird. Nach der Synthese werden die neu entstandenen DNA-Doppelstränge hitzedenaturiert, damit die Primer erneut binden und die Reaktion von vorne ablaufen kann. Auch die neu synthetisierte DNA dient in den folgenden Zyklen als Template-DNA, was zur Folge hat, dass die Amplifikation der DNA-Matrize exponentiell erfolgt.
Typischerweise ist ein Reaktionsansatz für die PCR folgendermaßen zusammengesetzt:
PCR-Ansatz
5,0 µl Template-DNA (˜ 200 ng µl-1)
1,0 µl 5’-Primer (forward primer; 25 pmol µl-1) 1,0 µl 3’-Primer (reverse primer; 25 pmol µl-1) 2,5 µl Pwo-DNA-Polymerase (1,0 U µl-1)
2,0 µl dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP; jeweils 10 mM) 5,0 µl 10x Pwo-Polymerase-Puffer (Peqlab)
33,5 µl dH2O 50,0 µl ∑
In einem Thermocycler mit beheizbarem Deckel (Personal Cycler
Sensoquest oder T Gradient, Biometra) wird der PCR-Ansatz den für die verschiedenen Schritte der PCR notwendigen Temperaturen augesetzt.
Ein typisches Temperaturprogramm besteht aus den folgenden Schritten:
PCR-Temperaturprogramm
Schritt Zeit[min:sec] Temperatur[°C] Beschreibung
1 5:00 96 Denaturierung
2 0:30 96 Denaturierung
3 0:30 55 Annealing der Primer
4 6:00 72 Polymerisation
5 10:00 72 Polymerisation unfertiger Stränge
6 ∞ 4 Kühlung bis zur Aufarbeitung
Nach Beendigung der Zyklen des Temperaturprogramms (Schritt 2 bis 4) wird das Reaktionsgemisch bis zur Aufarbeitung bei 4°C gekühlt (Schritt 6).
Im Anschluss daran wird die synthetisierte DNA gereinigt und mittels Agarosegel- Elektrophorese analysiert.
3.1.2 GeneTailorTM-ortsgerichtete Mutagenese
In dieser Arbeit wurden die gewünschten Mutationen mittels ortsgerichteter Mutagenese unter Verwendung des GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System von Invitrogen in die Template-DNA eingefügt. Die ortsgerichtete Mutagenense ermöglicht den gezielten Austausch bzw. Einführung oder Entfernung von Basen in einem DNA-Fragment. Dazu wird die CpG-methylierte Template-DNA mit einem forward- und ein reverse-Primer, die die gewollte Mutation enthalten, vervielfältigt.
Die PCR-Reaktion findet entsprechend dem o.g. Protokoll statt. Das Ergebnis ist lineare doppelsträngige DNA mit der gewünschten Mutation, die anschließend in E. coli transformiert und dort zirkularisiert wird. Durch eine E. coli zugehörige MrcB- Endonuklease wird die methylierte Template-DNA abgebaut. Es bleibt also nur das mutierte Produkt in den Bakterien zurück.
3.1.3 Oligonukleotide
Oligonukleotide sind aus einer kleinen Anzahl an Nukleotiden (RNA oder DNA) aufgebaut. Die Nukleotidsequenzen bestehen aus 10 bis 100 Nukleotideinheiten.
Sie dienen bei der PCR als sogenannte Primer. Die Oligonukleotide dieser Arbeit, die zur Herstellung der Mutanten konzipiert worden sind, wurden von der MWG Biotech AG (Ebersberg, Deutschland) bezogen. Die Sequenzen zur Herstellung der unterschiedlichen ToNT-Konstrukte sehen wie folgt aus:
Konstrukt Template- DNA
Primer 5’
3’
Sequenz Zielvektor
pHCToNTI met.pHCAS wt 5ToNTI 3ToNTI
5’AAATATGtcgaCGTAAAAAATATAACAGATTATATGTATCTTAAAG3’
5’TACGtcgaCATATTTATTTGGATCATATAA3’
pHCToNTI+II pHCToNTI
pHCToNTI
Ex2 3ToNTII
5ToNTII Ex3
TAGGCGTATCACGAGGC
5’ctctACGCGTAGAATGCGATCAAGATTATTAAAGGCATTTCCATCTTTCGG ATAAGCTAACCTATATTC3’
5’ctctACGCGTAGGTTATAATGCCCCAGGTATCCCTCTTTATCAAGTAGTAG TAATG3’
TGAGGTCATTACTGGATCTA
pHCToNTI
pHCToNTI+II+
III pHCToNTI+II Ex2
3ToNTIII TAGGCGTATCACGAGGC
5’agagACTAGTATAgCCCTATTTGGATCGTTGCCTATTTGACCCTGATGAA ATCCTATAAAG 3’
pHCToNTI+II
pHCToNTI+III pHCToNTI Ex2
3ToNTIII TAGGCGTATCACGAGGC
5’agagACTAGTATAgCCCTATTTGGATCGTTGCCTATTTGACCCTGATGAA ATCCTATAAAG 3’
pHCToNTI
pHCToNTII+III pHCToNTI+II+
III Subklonierung pHCAS wt
pHCToNTII pHCAS wt Ex2
3ToNTII TAGGCGTATCACGAGGC
5’ctctACGCGTAGAATGCGATCAAGATTATTAAAGGCATTTCCATCTTTCGG ATAAGCTAACCTATATTC 3’
pHCToNTI+II
pHCToNTIIa pHCAS wt Ex2
3ToNTIIa TAGGCGTATCACGAGGC
5’ctctACGCGTAGAATGCGTTCCACGTTATTGTTTGATGCATTAGTAGCTAA CC 3’
pHCToNTII
pHCToNTIIb pHCAS wt Ex2
5ToNTIIb TAGGCGTATCACGAGGC
5’ctctACGCGTAGGTTATAACCCTGATGTAGGAAATCTAAGTC 3’ pHCToNTII
pHCToNTIIc pHCAS wt Ex2 3ToNTIIa
Ex2 5ToNTIIb
TAGGCGTATCACGAGGC
5’ctctACGCGTAGAATGCGTTCCACGTTATTGTTTGATGCATTAGTAGCTAA CC 3’
TAGGCGTATCACGAGGC
5’ctctACGCGTAGGTTATAACCCTGATGTAGGAAATCTAAGTC 3’
pHCToNTII
pHCToNTIII pHCAS wt Ex2
3ToNTIII TAGGCGTATCACGAGGC
5’agagACTAGTATAgCCCTATTTGGATCGTTGCCTATTTGACCCTGATGAA ATCCTATAAAG 3’
pHCAS wt
pHCToNTI
W1264L pHCAS
W1266L Subklonierung pHCToNTI
pHCToNTI+II
W1267L pHCAS
W1266L Subklonierung pHCToNTI+II
pH-
CToNTI+II+III W1267L
pHCAS
W1266L Subklonierung pHCToNTI+II+
III
pHCToNTIIc
W1266L pHCAS
W1266L Subklonierung pHCToNTIIc
pHCToNTIIc
R1207S met.
pHCToNTIIc 5ToNTIIR 1207S 3ToNT R1207S
5’CTTGATCGCATTCTACGCGTAGGTTATAATGCC 3’
5’TAGAATGCGATCAAGATTATTAAAGGC 3’
pHCToNTIIc
Y1117V pSPHCAA
Y1117V Subklonierung pHCToNTIIc
3.1.4 DNA-Restriktionsanalyse
DNA kann durch Restriktionsendonukleasen vom Typ II an spezifischen Stellen gespalten werden, indem diese die Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden in beiden Strängen des DNA-Doppelstranges trennen. Dabei können entweder glatte Enden (engl. blunt ends) oder überhängende 3’- oder 5’- Enden (engl. sticky ends) entstehen. Enden, die durch die Spaltung durch ein gleiches Enzym entstanden sind, können sich während einer Ligationsreaktion wieder verbinden. Auf diese Weise kann ein DNA-Fragment (engl. insert) in einen Vektor kloniert werden.
Die Restriktionsspaltung kann sowohl analytisch als auch präparativ eingesetzt werden. Im analytischen Fall wird eine geringe Menge DNA mit Restriktionsendonukleasen verdaut und die entstehenden Produkte mittels Agarose- Gelelektrophorese analysiert. Mithilfe der gefundenen Fragmentgrößen kann die analysierte DNA idenifiziert werden. Im präparativen Fall muss eine größere Menge an DNA, z.B. aus einer PCR, mit Restriktionsendonukleasen verdaut werden, um DNA-Fragmente mit definierten Enden zu erhalten. Analytische oder präparative Restriktionsansätze haben die folgende typische Zusammensetzung:
Analytischer Ansatz Präparativer Ansatz
DNA (˜ 200 ng µl-1) 4 µl 38,5 µl
10x Reaktionspuffer 1,0 µl 5,0 µl
BSA 1:10 1,0 µl 5,0 µl
Restriktionsendonuklease 0,3 µl 1,5 µl
dH2O 3,7 µl -
∑ 10,0 µl 50,0 µl
Ihre volle Aktivität können Restriktionsendonukleasen nur unter bestimmten Pufferbedingungen entfalten, weshalb sie vom Hersteller mit entsprechenden 10x Reaktionspuffern ausgeliefert werden. Zur Stabilisierung der Enzyme kann bovines Serumalbumin verwendet werden. Das Reaktionsgemisch wird schließlich bei einer für das Enzym optimalen Temperatur von etwa 37°C für 1 h und 30 min. inkubiert.
Durch eine Agarose-Gelelektrophorese wird anschließend die durch die Restriktionsenzyme geschnitte DNA in ihre Fragmente getrennt. So können die entstandenen Spaltprodukte analysiert bzw. isoliert werden.
Im Falle eines präparativen Daus werden die gewünschten DNA-Banden über einer UV-Lampe mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA nach Anletung des NucleoSpin® Extract II Kits User Manual (Macherey-Nagel, 2004) mithilfe des NucleoSpin® Extract II Kits aus dem Gel isoliert und gereinigt.
3.1.5 Dephosphorylierung
Damit es zu keiner Selbstligation einer nach Restriktionsspaltung linearisierten DNA kommen kann, werden die noch vorhandenen Phosphatreste an den 5’-Enden mittels alkalischer Phosphatase (engl. shrimp alkaline phosphatase = SAP, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) abgetrennt.
Dazu wird zur geschnittenen DNA 1 µl der alkalischen Phosphatase zugegeben.
Dieses Gemisch wird bei 37°C 45 min lang inkubiert. Nach den ersten 30 min wird noch ein weiterer µl der SAP zugefügt. Anschließend führt man für 15 min eine Hitzedeaktivierung bei 65°C durch. Hierdurch wird die alkalische Phosphatase denaturiert und unwirksam gemacht. Diese kann durch ein präparatives Agarosegel aus der Probe entfernt werden.
