Universität für Bodenkultur Wien Department für Chemie. WAHL (falls Wahlmöglichkeit besteht!) Universität für Bodenkultur Wien Department für Chemie

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18.10.2004 1 Universität für Bodenkultur Wien Department für Chemie

Biochemische Arbeitsmethodik und Analytikdesign I Erika Staudacher

Unit 4

Proteinreinigung:

Ausgangsmaterial Homogenisierung Fällung

Zentrifugation Volumsverringerung Pufferwechsel Stabilisierung

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Universität für Bodenkultur Wien Department für Chemie

Ausgangsmaterial zur Proteinreinigung

WAHL(falls Wahlmöglichkeit besteht !)

* SPEZIES

* ZELLKULTUR

* ORGAN (Blut/Bindegewebsanteil, Wurzel/Blatt/Stamm/Blüte)

* ORGANELLEN (Leberzellen enthalten viele Mitochondrien)

* ENTWICKLUNGSZEITPUNKT (Zellkultur, Keimling)

* SAISON (Pflanzen, Insekten)

* immer in ausreichender Menge verfügbar

* gleichbleibende Qualität

* wie lagern ?

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EINFRIEREN(Geschwindigkeit und Temperatur)

-) zuerst friert Wasser, Eiskristalle wachsen, zerstören Membranen und Organellen, Inhaltsstoffe werden freigesetzt, restliche Flüssigkeit wird konzentrierter (Salze, Proteine)

-) Frieren der verschiedenen hochkonzentrierten Salze nach ihrer Löslichkeit pH kann sich ändern

-) bei – 25°C: nicht gefrorene Areale möglich (Proteasen wirksam !) so schnell wie möglich unter -25°C abkühlen, bei – 80°C lagern

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tierische Zellen: relativ leicht aufschließbar, pflanzliche Zellen: relativ schwer, Mikroorganismen: sehr unterschiedlich !

* enzymatischer Verdau: Zellulasen, Chitinase, Lipasen, Proteasen (Kollagenase, Trypsin) Lysozym für E.coli

* osmotischer Schock: hypotonische Bedingungen

* Einfrieren/Auftauen

* (Lösungsmittel: Toluol)

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für: umweltrelevante Verbindungen aus Boden, Sedimenten, Schlamm und festen Abfällen (Pestizide +chloriert, Herbizide, Organophosphor-Pestizide), Kohlenwasserstoffe und Dioxine aus festen Proben, Fette und Vitamine aus Lebensmitteln;

SFE : supercritical fluid extraction hoher Druck (bis 70 MPa), hohe Temperatur (bis 150 C), CO₂unter He,

- geringerer Lösungsmittelverbrauch - Co-Lösungsmittel möglich (leichter aus der

Matrix zu lösen - kurze Extraktionszeiten - reproduzierbarer, weil automatisiert

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Homogenisierung

Zugabe von Flüssigkeit (Puffer ?) KONZENTRATION

-) zu konzentriert: Aggregate, Wechselwirkungen, Störung von Nachweisen

-) zu verdünnt: großes Probevolumen, Enzymaktivität ?

• Ultraschall

• Bad

• Sonde

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•Scherkräfte

- Glaskugeln (Adsorption ?) in einem Schüttler (Mickle-Schüttler)

- durch kleine Öffnung pressen (tiefgefrorene Zellpaste, Zellen) - French-Druckzelle (mehrere Hundert Atm. Druck !!): Probe und

Luft in die Zelle, Druck anlegen, Nadelventil öffnen: nur für sehr geringe Probenmengen (Hughes, Eton-Presse)

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- rotierende Messer (Mixer, Blender):

geeignet für pflanzliche und tierische Zellen, Bakterien und Hefen: schlechte Ergebnisse

- mehrfaches Pipettieren

- Auf- und Abbewegung ("Homogenisatoren") Handbetrieb: Dounce, Tenbroeck Motor: Potter-Elvejham, Mörser, Pistill: für trockene

(lyophilisierte) Proben - Mühlen

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Probleme:

* (lokale) Hitzeentwicklung (30"-45" +10°C !!) dagegen: Kühlung, Trockeneiszugabe (??)

* Wahl der Methode rein empirisch

* Kompartimentierung aufgehoben sofort Abbauvorgänge, Inhibierungen (Pflanzenzellen, Leber)

* Menge (Scale up)

* Detergenzienzusatz ( Schaum)

Lösen aus/von subzellulären Komponenten (Membranen, Ribosomen, Nukleinsäuren):

a: hohe Ionenstärke (0.5 - 5.0 M KCl): NICHT wenn katalytische Funktion b: Detergenzien

nicht ionische: Tween 80, Triton X-100, Triton X-114, Emulgens, Lubrol, Digitonin, Octylglucoside

Zwitterionische: Lysolecithin, CHAPS, CHAPSO, Zwittergents ionische: Cholat, Deoxycholat, Dodecylsulfat

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Spezielle Probleme:

* phenolische Komponenten (bei Pflanzen) oxidieren (Phenoloxidasen) dunkle Pigmente, die kovalente Bindungen mit Proteinen eingehen Inhibierung (irreversibel)

dagegen: ß-Mercaptoethanol (minimiert Phenoloxidasen) Polyvinylpyrrolidon-Pulver ( bindet phenol. Komponenten) schnell abzentrifugieren: Phenole im Überstand

* Ionenaustauscherwirkung: Ionenstärke in vivo in der Zelle: 0.15 - 0.2 M ; wenn sie durch Verdünnen bei der Extraktion sinkt, können geladene größere Partikel als Ionenaustauscher fungieren und Proteine

adsorbieren.

dagegen: höhere Ionenstärke im Extraktionspuffer

* Fette: in Kälte abheben (filtrieren) in Kälte zentrifugieren

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* Nukleinsäuren (Mikroorganismen, Zellteilung)

dagegen: - Streptomycin (Antibiotikum): Interaktion mit Ribosomen - Protamin (natürliches, DNA-bindendes Protein aus

Spermien): bildet mit DNA und RNA Komplexe - Polyethylenimin (synthet. pos. geladenes Polymer):

reagiert mit Nukleinsäuren

typischer Extraktionspuffer:

20 - 50 mM Tris oder Phosphat pH 7.0 - 7.5 0.1 M KCl

1 - 5 mM EDTA

5 - 20 mM -Mercaptoethanol oder Cystein

spezielle Stabilisierungskomponenten (Zn⁺⁺für Zn-hältige Proteine, etc.) weitere Vorgangsweise nach dem Homogenisieren:

- Filtration - Fällung - Zentrifugation

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Fällung

Historische Art der Proteintrennung

"Globuline" : unlöslich bei niedriger Salzkonzentration (Serum + Wasser ergibt Niederschlag)

"Albumine": bleiben bei niedriger Salzkonzentration in Lösung

* Verteilung der hydrophilen und hydrophoben Reste im Protein

* pH-abhängig (IEP : minimale Löslichkeit)

* Temperatur Salzfällung

(NH4)2SO4, Na2SO4 (Verunreinigungen durch Schwermetalle ?) Angabe: % Salzsättigung; Struktur bleibt erhalten

danach: Dialyse, Gelfiltration Strategie: 1. Fällung (unspezifisch)

2. Rückextraktion (wesentlich spezifischer), Kombination mit HIC

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Säurefällung

Trichloressigsäure, Sulfosalicylsäure : 7.5 - 10 % kalt (4°C) Niederschlag abzentrifugieren, in kleinem Volumen alkalischer

Lösung aufnehmen.

Denaturierung ! Antigendeterminanten bleiben manchmal erhalten;

Laufeigenschaften bei der SDS-PAGE können sich ändern.

danach: Dialyse, Gelfiltration Fällung mit organischen Lösungsmitteln

Lösungsmittel muß mit Wasser mischbar sein und darf nicht mit den Proteinen reagieren: Methanol, Ethanol, Aceton (bis 80 %) Verunreinigungen mit Peroxidasen ?

Temperaturabhängigkeit: > 10°C: Denaturierung !

< 0°C : weniger Denaturierung, weniger Lösungsmittel nötig.

Ionenstärke-Abhängigkeit:

Niedere Ionenstärke: Proteine fallen schneller aus, sind aber weniger stabil Hohe Ionenstärke: Gefahr der Salzkristallisation

danach: Evaporation bei 25-30°C, Gelchromatographie

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Polyethylenglycolfällung

durchschnittliche relative Molekülmasse ???????

(Angaben: 6000, 10 000 - 20 000, 400) Konzentration - 15 %, filtrierbar

danach: sehr schwer zu enfernen, da inhomogen und ähnliches Molekulargewicht wie viele

Probenbestandteile : Dialyse, Gelchromatographie gehen nicht;

möglich: Ionenaustauschchromatolgraphie, Affinitätschromatographie;

Affinitätspräzipitation

Ligand an Matrix gebunden, ... entspricht Affinitätschromatographie im Batchverfahren.

Spezialfälle

DNA adsorbiert an Kieselgeloberflächen,

neues Produkt: paramagnetische Silikapartikel und Magnet KEINE Zentrifugation nötig;

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Löslichkeitsverhalten abhängig von:

- Proteinstruktur (Sequenz, Faltung, Modifikationen) - Probenmatrix

verschiedene Reinheitsgrade = unterschiedliches Verhalten - pH

- Temperatur

- organische Lösungsmittel, Detergenzien

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Zentrifugation

Dichte / Größe / Form Einsatz in der Biochemie:

Qualität der Zentrifugation leicht überprüfbar:

* Partikel abzentrifugieren (Probenvorbereitung HPLC)

* "Tröpfchen zusammenführen" (Enzymaktivitätsbestimmungen, Proben- vorbereitung Elektrophorese)

* Phasentrennung (Probenvorbereitung GC) Hohe Reproduzierbarkeit wichtig:

* Proteinreinigung (Differentialzentrifugation von Homogenaten; Fällungen, Fette)

* Zellfraktionierung (Gradientenzentrifugation)

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Ein Objekt, das mit konstanter Winkelgeschwindigkeit kreisförmig bewegt wird ist einer nach außen gerichteten Beschleunigung F ausgesetzt.

F = ω².r

ω= Winkelgeschwindigkeit r = Radius

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Zentrifugalbeschleunigung (Vielfaches von g) RZB:

RZB=

Zentrifugentypen:

Tischzentrifuge (13 000 rpm) Standzentrifuge (25 000 rpm)

Kapazität (Durchflußzentrifugen, Laborzentrifugen) Kühlung

Bremse

Ultrazentrifugen (75 000 rpm, bis 500 000 g) Vakuum erforderlich

ω

²

r 980

Beispiel: 12 000 rpm, r1 = 4.8 cm 7 734 g r2 = 8.0 cm 12 891 g

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Rotoren: aus Alu-Legierungen (beschichtet), Titan Festwinkel ( 10 - 45 zur Rotationsachse) Ausschwingrotor

Sedimentations-Koeffizient:

= Sedimentations-Geschwindigkeit im Einheits-Zentrifugalfeld der Stärke 1 dyn = 10^-5N

abhängig von:

* Dichte des Mediums

* Viskosität des Mediums

* Temperatur

Differentialzentrifugation:

Trennung durch verschiedene Geschwindigkeiten/(Zeiten)

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Dichtegradientenzentrifugation:

für Zellfraktionierung, "Mikrosomenpräparation"

Saccharose, Glycerin, CsCl₂, Ficoll, Percoll

Gradient: kontinuierlich - gestuft händisch oder mit Pumpe

Teilchen bewegen sich so lange durch den Gradienten, bis sie den Punkt erreichen, an dem ihre Dichte mit der des Gradienten übereinstimmt.

- "passenden" Gradienten suchen (zuerst grober, dann feiner) - Geschwindigkeit - Zeit

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Fraktionen trennen:

- abheben - mit dichterer Lösung

nach oben drücken - auslaufen lassen

(fraktionieren)

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Proteinverteilung nach isopyknischer Zentrifugation des Rohextrakts aus Rizinuskeimlingen

(A) linearer Saccharosegradient (B) Stufen-Saccharosegradient

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Probleme:

* Homogenität des Ausgangsmaterials

* Wahl des Dichtegradienten

* Technische Schwierigkeiten bei der Herstellung und Fraktionierung des Dichtegradienten

* Markerenzyme

* MENGE !!

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Volumsverringerung

* Einrotieren am Rotavapor:

- Temperatur

- Probenumgebung ändert sich (Aufkonzentrierung, pH-Wert) - Zugabe von Butanol gegen Schäumen

für Enzyme nicht geeignet !

* Fällung

- Säurefällung und Fällung mit org. Lösungsmitteln: denaturierend - Salzfällung: gut verträglich

Salzfällung für Enzyme gut geeignet, allerdings dann hohe Salzkonzentration !!

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* Lyophilisation (Gefriertrocknung) sublimiert im Ölpumpenvakuum Probe einfrieren

(im Eisbad: an den Wänden eines Kolbens) - Salze werden aufkonzentriert

- hoher Anteil an organischem Lösungsmittel: friert nicht sehr unterschiedliche Verträglichkeit, stark abhängig von der Umgebung

* Zentrifugen-Vakuumkonzentrator (Speed-Vac) für kleine Probenmengen, aber große Probenzahl da keine Kühlung, nicht empfehlenswert

* Probe in Dialyseschlauch (definierte Porengröße) auf trockenes Polydextrangel (Sephadex S 200) legen oder in hochkonzentriertes Polyethylenglycol 20000 hängen möglich, aber teuer !

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* Dialyseschlauch ins Vakuum hängen:

Wasser und kleine Moleküle treten aus möglich, aber technisch schwierig

* Ultrafiltration

Membran aus synthetischen Polymeren definierter Porengröße Druck (N₂) wird angelegt: kleine Teilchen passieren die Membran, große nicht.

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Probleme:

- Adsorption der Probe an der Membran

dagegen: in 5 % Tween 20 (w/v) einweichen - Poren-Größenverteilung:

Kleine, unerwünschte Bestandteile bleiben in der Lösung Probe kommt ins Eluat

Proteinverteilung:

(a) vor Ultrafiltration (b) nach Ultrafiltration

(cutoff 200 000 dalton)

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Pufferwechsel

• Ultrafiltration

• Gelfiltration (geringe Probenmenge, detektierbar)

• Dialyse: Schlauch mit definierten Poren (homogen ???) Nachteil:

- nicht nur Salz, auch andere kleine Substanzen gehen verloren:

ATP, Co-enzyme, ...

- Schläuche manchmal mit Schwermetallen, Proteasen, Nucleasen kontaminiert

dagegen: + EDTA 30´min. kochen,

8 x (!!!) 30´min mit dest H2O kochen.

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RE CH EN BE IS PI EL E !

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Stabilisierung von Proteinen

"Endlagerung":

- lyophilisiert

- in hoher Salzkonzentration (gekühlt/eingefroren) - Glycerinzugabe (gekühlt/eingefroren)

- Zugabe eines Stabilisierungsproteins (eingefroren) Nicht zu oft auftauen, in kleinen Portionen einfrieren !

Stabilisierung während der Reinigung:

NACH JEDEM SCHRITT ÜBERDENKEN !

Anforderungen können sich im Laufe der Reinigung ändern:

Zerstörung von Aggregaten, dann empfindlicher gegen Denaturierung und Abbau

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* Temperatur

* Puffer (Art, pH, Ionenstärke)

* Zusätze (Zweiwertige Ionen, EDTA, Detergenz, organische Lösungsmittel)

* Matrixbestandteile

Enzyme: Proteasen, Lipasen, Glykanasen, Pyrophosphatasen Schwermetalle

SH-Gruppen

* Luft (Oxidation)

* Chromatographiemedien und Gefäße (Schwermetalle)

* Mikrobielle Infektion Denken an:

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