Untersuchung von Lungentoxizität in vitro mittels verschiedener Alternativmethoden und einer auf dem Cultex®-Modul basierenden In-Vitro-Aerosol-Testapparatur

verschiedener Alternativmethoden und einer auf dem Cultex

-Modul basierenden In-Vitro-Aerosol-

Testapparatur

Diplomarbeit

Zur Erlangung des akademischen Grades Diplom Biologe

angefertigt bei Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Abteilung Nichtklinische Arzneimittelsicherheit

angefertigt von Florian Matt

Begutachtung durch:

Prof. Dr. M. Leist und Prof. Dr. A. Bürkle

Konstanz, März 2008

Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-125136

URL: http://kops.ub.uni-konstanz.de/volltexte/2010/12513/

A) Zusammenfassung: _____________________________________________________ 1 B) Einleitung und Zielsetzung _______________________________________________ 4 C) Theoretischer Teil_______________________________________________________ 8 1. Anatomie und Physiologie des Respirationstraktes _______________________________ 8

2. Organspezifische Toxizität und humane Lungenepithelzelllinien___________________ 10 2.1 Humane Alveolarepithelzelllinie A549 ______________________________________________ 12 2.2 Humane Bronchialepithelzelllinie 16HBE14o- ________________________________________ 13

3. Pulmonale Applikation von Pharmaka ________________________________________ 14

3.1 Aerosole ______________________________________________________________________ 14 3.1.1 Aerodynamischer Durchmesser ________________________________________________ 14 3.1.2 Partikelgrößenverteilung _____________________________________________________ 15 3.1.3 Massenmedian des aerodynamischen Durchmessers ________________________________ 16 3.2 Depositionsmechanismen von Partikeln im Respirationstrakt und in der IVAT _______________ 16 3.2.1 Impaktion _________________________________________________________________ 17 3.2.2 Sedimentation______________________________________________________________ 18 3.2.3 Diffusion _________________________________________________________________ 19 3.3 Hygroskopisches Wachstum und Verdunstung ________________________________________ 20

4. Direktexpositionsmethoden__________________________________________________ 20 4.1 Problematik ___________________________________________________________________ 20 4.2 Voraussetzungen _______________________________________________________________ 21 4.3 Expositionsverfahren ____________________________________________________________ 22 4.4 „Air-liquid“ Kultivierung von Zellen _______________________________________________ 24

5. Substanzklassen ___________________________________________________________ 25

5.1 Neurokinin 1-Rezeptor-Antagonisten _______________________________________________ 25 5.2 2-Adrenozeptor Agonist _________________________________________________________ 27

6. Theoretische Grundlagen der Endpunktmessungen _____________________________ 29

6.1 Tetrazoliumsalzassays ___________________________________________________________ 29 6.2 Alamar Blue-Assay _____________________________________________________________ 30 6.3 Sulforhodamin B-Assay__________________________________________________________ 31 6.4 ATP-Lumineszenz-Assay ________________________________________________________ 31 6.5 Enzymfreisetzungsassay _________________________________________________________ 32 6.6 Multiparameterassay ____________________________________________________________ 32 6.7 Transepithelialer elektrischer Widerstand und parazelluläre Permeabilität ___________________ 33

D) Material und Methoden _________________________________________________ 35

2. Reagentien und Kits _______________________________________________________ 36

3. Hergestellte Reagentien _____________________________________________________ 37 3.1 Reagentien für die A549 Zellenkultur _______________________________________________ 37 3.2 Reagentien für die 16HBE14o- Zellenkultur __________________________________________ 37 3.3 Reagentien für die U-937 Zellkultur ________________________________________________ 38 3.4 Reagentien für die Gewinnung und Kultivierung primärer Hepatozyten ____________________ 38

4. Grundkonzept der verschiedenen in vitro Toxizitätstests _________________________ 38

5. Methoden der Zellkultur____________________________________________________ 39

5.1 Auftauen von Zellen ____________________________________________________________ 40 5.2 Zellzahlbestimmung_____________________________________________________________ 40

6. Zellen und Kulturbedingungen ______________________________________________ 41

6.1 Humane Alveolarepithelzelllinie A549 ______________________________________________ 41 6.1.1 Dauerkultivierung __________________________________________________________ 41 6.1.2 Kultivierung in Mikrotiterplatten _______________________________________________ 41 6.1.3 Kultivierung in 24-Well-Zellkulturplatten ________________________________________ 41 6.1.4 Adaptation der A549 Zellen an „air-liquid“ Bedingungen____________________________ 42 6.1.5 Zelltitration________________________________________________________________ 43 6.2 Humane Bronchialepithelzelllinie 16HBE14o- ________________________________________ 43 6.2.1 Dauerkultivierung __________________________________________________________ 43 6.2.2 Kultivierung auf mikroporösen Membranen ______________________________________ 44 6.3 Humane Lymphoma Zelllinie U-937 ________________________________________________ 44 6.3.1 Dauerkultivierung __________________________________________________________ 44 6.3.2 Kultivierung in Mikrotiterplatten _______________________________________________ 45 6.4 Primäre Hepatozyten der Ratte ____________________________________________________ 45 6.4.1 Leberperfusion und Isolierung der Hepatozyten ___________________________________ 45 6.4.2 Kultivierung in 6-Well-Zellkulturplatten _________________________________________ 46

7. Submerse Expositionsmethode _______________________________________________ 46 7.1 Exposition in Mikrotiterplatten ____________________________________________________ 47 7.2 Exposition in 6-Well- und 24-Well-Zellkulturplatten ___________________________________ 47 7.3 Exposition der 16HBE14o- Zellen auf mikroporösen Membranen _________________________ 48

8. Direktexpositionsmethode___________________________________________________ 48

8.1 Aerosolgenerierungseinheit _______________________________________________________ 49 8.2 Expositionseinheit ______________________________________________________________ 49 8.3 Physikochemische Messungen_____________________________________________________ 51 8.3.1 Bestimmung der relativen Luftfeuchte und des Taupunktes __________________________ 51 8.3.2 Quantifizierung der Partikeldeposition __________________________________________ 52 8.3.3 Charakterisierung der Aerosole mittels Aerodynamischem Partikelgrößenspektrometer ____ 53

8.4.1 Verhalten der Zellvitalität am Expositionstag _____________________________________ 55 8.4.2 Volumenstrom- und Expositionszeitstresstests ____________________________________ 55 8.5 Expositionsablauf_______________________________________________________________ 56

9. Charakterisierung der Zellen und Endpunktmessungen__________________________ 57

9.1 Parazelluläre Integrität ___________________________________________________________ 57 9.1.1 Parazelluläre Permeabilität____________________________________________________ 57 9.1.2 Transepithelialer elektrischer Widerstand ________________________________________ 57 9.2 Tetrazoliumsalzassays ___________________________________________________________ 58 9.3 Sulforhodamin B-Assay__________________________________________________________ 59 9.4 Alamar Blue-Assay _____________________________________________________________ 59 9.5 ATP-Lumineszenz-Assay ________________________________________________________ 60 9.6 Enzymfreisetzungsassay _________________________________________________________ 60 9.7 Multiparameterassay ____________________________________________________________ 61

10. Auswertung und Statistik __________________________________________________ 62 E) Ergebnisse: Submerse Exposition _________________________________________ 66

1. Linearer dynamischer Bereich der Assays _____________________________________ 66

2. Effekt auf die Zellvitalität ___________________________________________________ 69

2.1 Tetrazoliumsalzassay ____________________________________________________________ 69 2.1.1 MTT-Assay mit A549 Zellen nach Substanzbehandlung_____________________________ 69 2.1.2 XTT-Assay mit A549 und U-937 Zellen _________________________________________ 71 2.1.3 WST-1-Assay mit A549 Zellen ________________________________________________ 73 2.1.4 Alamar Blue-Assay mit A549 Zellen ____________________________________________ 74 2.2 Sulforhodamin B-Assay__________________________________________________________ 75 2.3 ATP-Lumineszenz-Assay mit A549 Zellen nach Substanzbehandlung______________________ 77 2.4 Enzymfreisetzung der A549 Zellen nach Substanzbehandlung ____________________________ 78 2.5 Multiparameterassay ____________________________________________________________ 79

3. Effekt auf die parazelluläre Integrität der 16HBE14o- Zellen _____________________ 82 4. Effekt auf die Membranintegrität primärer Hepatozyten _________________________ 84 F) Ergebnisse: Direktexposition _____________________________________________ 87

1. Charakterisierung der A549 Monolayer am Expositionstag _______________________ 87 2. Expositionsbedingungen ____________________________________________________ 88

3. Charakterisierung der Aerosole ______________________________________________ 89 3.1 Partikelgrößenverteilung _________________________________________________________ 89 3.2 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen _________________________________________ 90

5. Effekt des Volumenstroms und der Expositionszeit auf die Zellvitalität _____________ 92 6. Effekt unterschiedlicher Substanzexpositionszeiten auf die Zellvitalität _____________ 93 G) Diskussion ___________________________________________________________ 97 H) Abkürzungsverzeichnis ________________________________________________ 104 I) Danksagung __________________________________________________________ 106 J) Literatur_____________________________________________________________ 107

A) Zusammenfassung:

Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene in vitro Methoden für die Untersuchung von Lungentoxizität zu etablieren und zu evaluieren. Die durchgeführten Methoden unterschieden sich durch den verwendeten Zelltyp, die gewählten Kulturbedingungen, die Art der Substanzexposition und den gemessenen Endpunkt.

Mittels der verschiedenen Methoden wurde die Toxizität der beiden NK1-Rezeptor- Antagonisten BIIF 1149 und BIIM 1310 quantifiziert. Beide NK1-Rezeptor-Antagonisten waren für die Indikation COPD vorgesehen. Die Entwicklung der Substanzen wurde jedoch aufgrund von Sicherheitsbedenken eingestellt. Bei in vivo Toxizitätsuntersuchungen ergab sich für die beiden Substanzen ein unterschiedliches Toxizitätsprofil. Im Gegensatz zu BIIF 1149 zeigte BIIM 1310 lokale, irritative Effekte in der Lunge. Zusätzlich wurde die Toxizität von Terbutalin untersucht. Dabei handelt es sich um einen 2-Adrenozeptor-Agonisten, der bereits für die inhalative Pharmakotherapie bei Asthma und COPD zur Verfügung steht.

Unter submersen Kulturbedingungen wurden die Substanzen in Kulturmedium gelöst. Die humane Lungenepithelzellline A549 wurde verwendet, um die Zytotoxizität der Substanzen mittels MTT-, XTT-, WST-1-, SRB-, Alamar Blue-, ATP-, Enzymfreisetzungs- und Multiparameterassay zu untersuchen. Zusätzlich wurde die humane Lungenepithelzelllinie 16HBE14o- verwendet, um die Wirkung der Substanzen auf den TEER von 16HBE14o- Monolayern zu untersuchen.

Die Assays unterschieden sich unter anderem in Bezug auf Sensitivität, Variabilität, Linearität, Arbeitsaufwand, Kosten und Automatisierbarkeit. Die beiden NK1-Rezeptor- Antagonisten zeigten im Gegensatz zu Terbutalin bei allen Assays eine dosisabhängige Toxizität. Anhand der ermittelten IC₅₀-Werte ergab sich bei allen Assays das gleich Toxizitätsranking, mit BIIM 1149 < BIIM 1310 << Terbutalin. Bereits etablierte in vitro Toxizitätsassays mit primären Hepatozyten bzw. U-937 Zellen lieferten dasselbe Ranking und vergleichbare IC50-Werte. Die Toxizität der beiden NK1-Rezeptor-Antagonisten lässt sich daher als basale Toxizität klassifizieren. Der in vivo auftretende Unterschied bezüglich der Lungentoxizität der beiden Substanzen konnte mit den submersen in vitro Methoden nicht reproduziert werden.

Die Direktexposition mittels IVAT ermöglichte im Gegensatz zu den submersen Methoden eine angemessene Untersuchung der Substanzen in Form eines Aersols. Bei der

Direktexposition „air-liquid“ kultivierter A549 Zellen zeigten die beiden NK1-Rezeptor- Antagonisten ebenfalls eine dosisabhängige Toxizität.

Im Vergleich zu den submersen Assays ergab sich für die beiden NK1-Rezeptor-Antagonisten jedoch ein umgekehrtes Toxizitätsranking, welches die in vivo Lungentoxizität der Substanzen besser wiedergibt. Es ist allerdings nicht klar, ob das umgekehrte Toxizitätsranking tatsächlich auf die verbesserte Repräsentation der in vivo Situation bei der Direktexposition zurückzuführen ist oder auf eine unterschiedliche Partikelgrößenverteilung der Aerosole zum Expositionszeitpunkt und damit eine unterschiedliche Depositionseffizienz der Aerosole. Demzufolge müssen die Inputbedingungen der Direktexpositionsmethode optimiert werden, so dass die tatsächliche Dosierung eines Aerosols bekannt ist, wodurch es möglich wird, ein fundiertes Toxizitätsranking zu erstellen.

Summary:

The aim of this work was to establish and evaluate various in vitro methods to examine lung toxicity. The methods differed in the used cell type, the chosen culture conditions, the kind of compound exposure and the measured end point. The methods were employed to quantify the toxicity of the two NK1 receptor antagonists BIIF 1149 and BIIM 1310, which have been intended for the indication COPD. However, the development of the compounds was stopped due to saftey issues. In an in vivo toxicity study the two compounds showed a different toxicity profile. In contrast to the administration of BIIF 1149, the administration of BIIM 1310 led to local irritative effects in the lung. In addition, the toxicity of terbutaline, a 2- adrenergic receptor agonist, which is actually used for the pulmonary pharmacotherapy of COPD and Asthma, was assessed.

Under submerged culture conditions the compounds were dissolved in the culture medium.

The human epithelial lung cell line A549 was used to investigate the cytotoxicity of the compounds via MTT, XTT, WST-1, SRB, Alamar Blue, ATP, enzyme leakage and multiparameter assay. In addition, the human epithelial lung cell line 16HBE14o- was used to assess the effect of the compounds on the TEER of 16HBE14o- monolayers.

Amongst other things, the methods differed in terms of sensitivity, variability, linearity, labour costs, financial expense and automatability. Unlike terbutaline, the two NK1 receptor antagonists showed a dose-dependent toxictiy in all assays. On the basis of the IC50 values, all assays led to the same toxicity ranking, which was BIIF 1149 < BIIM 1310 << terbutaline.

Already established in vitro toxicity assays with primary hepataocytes and U-937 cells

respectively, led to the same ranking and compareable IC₅₀ values. Therefore the toxicity of the two NK1 receptor antagonists can be classified as basal toxicity. The in vivo difference in lung toxicity for the two compounds couldn’t be reproduced with the in vitro methods which used submerged culture conditions.

The direct exposure via IVAT made it possible to examine the aerosols of the compounds appropriately. The direct exposure of air-liquid cultured A549 cells also showed a dose- dependency of toxic effects of the two NK1 receptor antagonists. However, in contrast to the methods with submerged culture conditions, the direct exposure led to an inverse toxicity ranking of the two NK1 receptor antagonists. This ranking better depicts the observed in vivo lung toxicity of the compounds. However, it’s not clear, whether the inverse toxicity ranking is actually due to the better representation of the in vivo situation via the direct exposure or if it’s due to a different particle size distribution of the aerosols at the exposure moment and therefore due to a different deposition efficiency of the aerosols. Because of that, the input conditions of the direct exposure method would have to be optimized, so that the actual dose of an aerosol is known, which allows one to make a reasonable toxicity ranking.

B) Einleitung und Zielsetzung

Der Arzneimittelmarkt für respiratorische Erkrankungen ist zwischen 2002 und 2006 mit einer durchschnittlichen Jahreswachstumsrate von 15.4% auf 12.5 Milliarden Euro angewachsen [1]. Die häufigsten Indikationen für eine pulmonale Applikation von Pharmaka sind Asthma bronchiale und die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Obwohl beide Leiden teilweise mit den gleichen Arzneimitteln behandelt werden, unterscheiden sie sich in ihrer zugrunde liegenden Ätiologie deutlich. Charakteristisch für beide Erkrankungen ist eine Entzündung der Lunge. Patienten mit Asthma bronchiale leiden jedoch größtenteils unter einer reversiblen Verengung der Atemwege, wohingegen bei Patienten mit COPD die Lungenfunktion mit dem Fortschreiten der Krankheit kontinuierlich abnimmt. Die inhalative Pharmakotherapie findet bei beiden Leiden mit dem Ziel statt, eine lokale Wirkung in der Lunge zu erreichen. Vorwiegend wird eine akute und/oder anhaltende Bronchiodilatation angestrebt oder es wird versucht, den Krankheitsverlauf, beispielsweise durch eine antiinflammatorische Wirkung, positiv zu beeinflussen.

Entscheidende Fortschritte in der Inhalationstechnologie, zusammen mit den einzigartigen Absorptionseigenschaften der Lunge haben außerdem zu einem gesteigerten Interesse geführt, Pharmaka per Inhalation systemisch zu verabreichen. Niedermolekulare Substanzen werden schnell und mit einer hohen Bioverfügbarkeit systemisch resorbiert und für zahlreiche Makromoleküle wurde bereits gezeigt, dass sie per Inhalation „injektonsfrei“ und mit einer höheren Bioverfügbarkeit als über jeden anderen nicht-invasiven Verabreichungsweg in den systemischen Kreislauf gelangen [2]. Die steigende Bedeutung der pulmonalen Applikationsroute für die systemische Therapie wird durch das erste, seit 2006 von der FDA und EMEA zugelassene, inhalierbare Insulin, dokumentiert [3, 4].

Die Entwicklung neuer Pharmakotherapien für respiratorische Erkrankungen umfasst die Formulierung sinnvoller Kombinationstherapien sowie die Weiterentwicklung bereits vermarkteter Arzneimittelklassen, zu denen inhalierbare Glucocorticoide, 2-Adrenozeptor- Agonisten, Muskarinrezeptor-Antagonisten und Leukotrienrezeptor-Antagonisten gehören.

Neben der Entwicklung von Arzneimitteln, die auf bereits für die Atemwegstherapie genutzte körpereigenen Zielmoleküle, so genannte Targets, abzielen, werden auch solche entwickelt, die gegen neue gerichtet sind wie etwa Neurokininrezeptor-Antagonisten und Chemokinrezeptor-Antagonisten.

Die Entwicklung eines neuen Arzneimittels beginnt meist mit der Suche nach einem Target, an dem ein Pharmaka ansetzten kann und über das man so den Krankheitsverlauf beeinflussen kann. Nach der Identifizierung eines potentiellen Targets wird ein biochemisches Testsystem entwickelt, das es erlaubt, Wechselwirkungen zwischen dem Target und den Substanzen einer zu durchsuchenden Bibliothek zu erkennen. Nur wenige Substanzen, die in einem solchen High-Throughput-Screening eine Wechselwirkung zeigen, werden schließlich als Leitstruktur klassifiziert. Diese werden anschließend durch systematische chemische Modifikation und begleitende biologische Untersuchungen weiter optimiert. Die anfänglichen biologischen Untersuchungen umfassen dabei sowohl pharmakologische als auch toxikologische in vitro Screens, die idealerweise parallel zueinander durchgeführt werden. Die Ergebnisse dieser Screens können dann für die Auswahl geeigneter Kandidaten und als Orientierungshilfe für weitere Modifikationen verwendet werden, noch bevor irgendein Tierversuch durchgeführt werden muss. In dieser Hinsicht ist es vor allem wichtig, dass die genutzten in vitro Screens eine hohe Voraussagekraft für in vivo zu erwartende Effekte haben.

In vitro Methoden zeichnen sich meist dadurch aus, dass sie relativ einfach, billig und oft automatisiert durchgeführt werden können, im Vergleich zum Tierversuch wesentlich geringere Substanzmengen benötigt werden, sie eine gute Quantifizierung erlauben, die Ergebnisse schnell vorliegen und sie sich ohne weiteres reproduzieren lassen. Außerdem werden meist humane Zelllinien verwendet, wodurch mögliche interspezifische Wirkdifferenzen einer Substanz, die bei einem Tierversuch akzeptiert werden, wegfallen.

Diese Eigenschaften, zusammen mit der durch das 3R-Prinzip geforderten Reduzierung und Ersetzung von Tierversuchen, haben zu einer starken Zunahme von in vitro Methoden im pharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsprozess geführt und erklären die hohe Bereitschaft der Pharmaindustrie neue in vitro Methoden in den Forschungs- und Entwicklungsprozess zu integrieren [5].

Für die toxikologische Beurteilung von Substanzbibliotheken wurden eine Vielzahl von in vitro Screens zur Untersuchung von Zytotoxizität und organspezifischer Toxizität entwickelt.

So können beispielsweise mögliche hepatotoxische, nephrotoxische und neurotoxische Effekte durch relativ einfache in vitro Systeme anhand unterschiedlicher Endpunkte quantifiziert werden.

Während in vitro Methoden für das Screening von Substanzbibliotheken in die verschiedenen Disziplinen der Toxikologie verstärkt mit einbezogen werden, ist die Anwendung in der Inhalationstoxikologie noch begrenzt. Konventionelle Toxizitätstests an Tieren stellen aufgrund wissenschaftlicher, ökonomischer und ethischer Bedenken aber keine akzeptable

Basis für das Screening von Substanzen dar. Es besteht daher großer Bedarf an einer standardisierten und reproduzierbaren Methode, die es ermöglicht, die Lungentoxizität von Aerosolen und gasförmigen Substanzen in vitro zu untersuchen.

Bei den meisten in vitro Methoden zur Untersuchung von Toxizität werden Zellen mit Medium überschichtet kultiviert. Die zu untersuchenden Substanzen werden im Medium gelöst und können so ihre potentiell toxische Wirkung entfalten. Bei den verwendeten Zelllinien handelt es sich meist um kontinuierliche Zelllinien, die durch Transformation aus Zellen des interessierenden Zielorgans entstanden sind. Bei der Lunge als Zielorgan für eine Substanz entspricht die submerse Kultivierung der Zellen und die Lösung der Substanz im Zellkulturmedium allerdings nicht der physiologischen Situation. Außerdem können Gase, volatile Substanzen und Aerosole unter submersen Bedingungen nicht angemessen untersucht werden.

Die Kultivierung von Zellen in einem Zwei-Kammern-System auf mikroporösen Membranen ist eine weit verbreitete Zellkulturtechnik, die hauptsächlich für in vitro Permeabilitäts- und Absorptionsstudien verschiedener Epithelien verwendet wird. Diese Zellkulturtechnik erlaubt außerdem die Direktexposition von Epithelzellen des humanen Respirationstraktes gegenüber inhalierbaren Testatmosphären. Dazu werden die Zellen unter „air-liquid“ Bedingungen auf der mikroporösen Membran kultiviert. Unter „air-liquid“ Kultivierung versteht man dabei die biphasische Kultivierung der Zellen an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht. Die Zellen werden dazu basal von der unteren Kammer aus mit Kulturmedium versorgt und stehen apikal direkt mit der Umgebungsatmosphäre in Kontakt. Auf dieser Zellkulturtechnik basierend, sind verschiedene Expositionssysteme entwickelt worden, die es ermöglichen, die Zellen apikal, direkt und unter kontrollierten Bedingungen gegenüber einer Testatmosphäre zu exponieren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine neu entwickelte, auf dem Cultex^®-Modul basierende In-Vitro-Aerosol-Testapparatur (IVAT) als Expositionssystem für therapeutische Aerosole erprobt. Vor der Verwendung der IVAT für die Direktexposition von Zellen wurden zunächst verschiedene physikochemische Messungen und Vorversuche mit Zellen durchgeführt um die für die Direktexposition geeigneten Expositions- und Kulturbedingungen der IVAT zu ermitteln und eine entsprechende Auswertung der späteren Direktexposition zu ermöglichen.

Als Modellsubstanzen wurden die beiden Neurokinin-1-Rezeptor Antagonisten BIIF 1149 und BIIM 1310 verwendet, die für eine inhalative Applikation bei COPD vorgesehen waren, deren Entwicklung allerdings aufgrund von Sicherheitsbedenken eingestellt wurde. Zusätzlich

wurde der 2-Adrenozeptor-Agonist Terbutalin verwendet, der bereits für die inhalative Pharmakotherapie bei Asthma und COPD zur Verfügung steht.

Ziel dieser Arbeit war es, die Toxizität der drei Modellsubstanzen durch verschiedene in vitro Methoden zu untersuchen und die Ergebnisse und die Aussagefähigkeit der Methoden untereinander zu vergleichen. Die verwendeten Methoden unterschieden sich dabei durch den verwendeten Zelltyp, die Kulturbedingungen, die Expositionsart und den gemessenen Endpunkt.

Die humane Alveolarepithelzelllinie A549 wurde ausgewählt, da sie sich aufgrund ihrer Differenzierungsmerkmale besonders für die Untersuchung lungenspezifischer Toxizität eignet und sie unter „air-liquid“ Kulturbedingungen zusätzlich den Vorteil bietet, dass sich die von den Zellen sekretierten Surfactantkomponenten apikal, direkt über den Zellen anreichern.

Die drei Modellsubstanzen wurden sowohl in gelöster Form unter submersen Kulturbedingungen, als auch in Form eines therapeutischen Aerosols unter „air-liquid“

Kulturbedingungen untersucht. Für die Untersuchung der therapeutischen Aerosole wurde die IVAT verwendet, um die Zellen direkt an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht mit dem Aerosol zu beaufschlagen.

Die Toxizität wurde anhand verschiedener Endpunkte bewertet. Es wurden letztlich so unterschiedliche zellbiologische Parameter wie Membranintegrität, metabolische Aktivität, Zellmasse oder ATP-Gehalt gemessen.

Als weitere Zelllinie wurde die humane Bronchialepithelzellinie 16HBE14o- verwendet, diese bildet bei der submersen Kultivierung auf mikroporösen Membranen entsprechende Zell-Zell Verbindungen aus, wodurch es möglich wird, die parazelluläre Integrität als Endpunkt zu verwenden. Zunächst wurde nach geeigneten Kulturbedingungen gesucht, die die Ausbildung einer entsprechenden parazellulären Integrität erlauben, und anschließend wurde der Effekt der drei Modellsubstanzen auf die parazelluläre Integrität untersucht.

Zusätzlich wurde die Zytotoxizität bzw. Hepatotoxizität der Substanzen über bereits etablierte Assays mit der Lymphomazelllinie U-937 bzw. mit primären Hepatozyten der Ratte untersucht.

C) Theoretischer Teil

1. Anatomie und Physiologie des Respirationstraktes

Entsprechend einem Vorschlag der „International Standards Organisation“ (ISO) kann der Respirationstrakt in die drei Hauptkompartimente extrathorakal, tracheobronchial und alveolär aufgeteilt werden.

Der extrathorakale Bereich umfasst die extrathorakalen luftleitenden Atemwege zu denen Nase, Mund, Nasopharynx, Oropharynx und Larynx gehören. Der tracheobronchiale Bereich umfasst die intrathorakalen luftleitenden Atemwege zu denen Trachea, Bronchien und die terminalen Bronchiolen gehören. Der alveoläre Bereich umfasst die respiratorischen Bronchiolen, die Alveolargänge und die Alveolen.

Im extrathorakalen Bereich, der häufig auch als nasopharyngealer Bereich bezeichnet wird, findet die Erwärmung und Befeuchtung der eingeatmeten Luft und eine erste Filtrierung grober Partikel statt, wodurch die respiratorischen Membranen der nachfolgenden Atemwege vor einer Schädigung geschützt werden. Die Filtrierung wird dabei hauptsächlich durch die Abscheidung von Partikel erreicht. Da die Abscheidung von Partikeln unter anderem von der Anatomie des nasopharyngealen Bereichs abhängig ist, kann sich das abfiltrierte Partikelspektrum intraspezifisch und vor allem interspezifisch stark unterscheiden.

Die Trachea verbindet den nasopharyngealen Bereich mit dem unteren Respirationstrakt und eine Bifurkation teilt sie in die beiden Hauptbronchien auf, die zum Lungenparenchymgewebe führen. Von der Trachea bis zu den Alveolen zweigen sich die Atemwege in insgesamt 23 Generationen auf. Aus jeder Generation entstehen zwei neue Zweige. Durchmesser und Länge eines einzelnen Atemweges nehmen mit zunehmender Aufteilung ab, die Gesamtquerschnittsfläche hingegen nimmt zu. Dementsprechend nimmt die Strömungsgeschwindigkeit der Atmungsluft von den oberen zu den unteren Atemwegen stark ab. Die ersten 16 Generationen, die den tracheobronchialen Bereich des Respirationstraktes bilden, führen die Luft den Gasaustauschregionen zu. Die verbleibenden sieben Generationen umfassen den alveolären Bereich und dienen neben der Konduktion primär dem diffusiven Gasautausch. Die Epitheloberfläche der luftleitenden Atemwege beträgt nur wenige Quadratmeter. Für den diffusiven Gasaustausch im alveolären Bereich

stehen bei einem Erwachsenen hingegen mehr als 100 m² Epitheloberfläche zur Verfügung [6].

Der Respirationstrakt ist nicht nur anatomisch, sondern auch auf zellulärer Ebene sehr komplex aufgebaut. So sind beispielsweise allein in der Lunge über 60 verschiedene Zelltypen vorzufinden [6].

Die luftleitenden Atemwege werden von verschiedenen Epithelzelltypen ausgekleidet.

Darunter befinden sich insbesondere Zilien tragende Zellen, Mukus sezernierenden Becherzellen, Basalzellen, seröse Zellen, neuroendokrine Zellen und Clara Zellen. Die verschiedenen Zelltypen bilden ein pseudostratifiziertes Epithel aus, das mit zunehmender Aufzweigung der Atemwege flacher wird. Im Bereich der Bronchiolen wird das zunehmend dünner werdende Epithel durch einschichtiges Zylinderepithel abgelöst, das in den respiratorischen Bronchiolen in ein kubisches Epithel übergeht.

Gegen das Lumen ist das Epithel der luftleitenden Atemwege von einer unterschiedlich viskösen Flüssigkeitsschicht bedeckt. Diese besteht aus einer den Epithelzellen anliegenden, niederviskösen Sol- oder Hypophase und einer höherviskösen Gel- oder Epiphase bzw. dem Mukus. Die beiden Phasen sind dabei vermutlich nicht klar voneinander getrennt. Es ist auch möglich, dass der Mukus als diskontinuierliche Phase, d.h. in Form von Inseln oder Strassen, vorkommt [7].

Die Oberflächenspannung der viskösen Flüssigkeitsschicht wird, analog dem Alveolarraum, durch einen sich an der Luft/Flüssigkeitsgrenze befindenden, kontinuierlichen Surfactant Film reguliert. Es ist bekannt, dass Surfactant in den Alveolen von Typ II Alveolarepithelzellen sezerniert wird. Es gibt aber auch Hinweise, dass der Surfactant in den luftleitenden Atemwegen von Epithel- und Drüsenzellen in den luftleitenden Atemwegen produziert wird und nur zum Teil aus den Alveolen stammt [8].

Die Zilien tragenden Zellen, die mukösen Becherzellen und weitere sekretorische Zelltypen des Epithels bilden zusammen den mukoziliären Apparat der Lunge aus. Dabei handelt es sich um ein Selbstreinigungssystem, das dazu dient, in den luftleitenden Atemwegen abgeschiedene Partikel rachenwärts zu transportieren [9]. Der mukoziliäre Apparat reicht bis in die respiratorischen Bronchiolen. Die Zilien tragenden Zellen nehmen mit zunehmender Aufzweigung der Atemwege zwar ab, werden allerdings bis in die Nähe der alveolären Eingangsringe beobachtet, wo das Alveolarepithel beginnt.

Das Alveolarepithel wird vorwiegend aus zwei Epithelzelltypen gebildet, den ausdifferenzierten und sehr dünnen Typ I Alveolarepithelzellen und den kuboiden Surfactant sekretierenden Typ II Alveolarepithelzellen. Die Typ I Zellen weisen eine glatte Oberfläche

auf und trotz dessen, dass sie der Anazahl nach nur für etwa 33% der Alveolarepithelzellen verantwortlich sind, bilden sie ungefähr 93% der Epitheloberfläche aus. Die Typ II Zellen bilden die restlichen 7% der Epitheloberfläche aus, dominieren hingegen der Anzahl nach mit 67% [10]. Typ II Zellen haben Stammzellfunktion und können Typ I Zellen bei deren Tod durch Änderung ihrer zellulären Morphologie ersetzen [11].

Das Alveolarepithel ist nur von einer niederviskosen Hypophase bedeckt, die höherviskose Epiphase bzw. der Mukus hingegen fehlt. An der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht der Hypophase befindet sich ebenfalls ein Surfactantfilm, der eine Reduktion der Oberflächenspannung bewirkt. Der Surfactant in den Alveolen stammt, wie bereits erwähnt, von den Typ II Alveolarepithelzellen. Er besteht zu 85-90% aus Phospholipiden, zu 4-7% aus Neutrallipiden und zu 6-8% aus Proteinen, wobei der überwiegende Proteinanteil von den biophysikalisch aktiven Surfactant Apoproteinen SP-A, -B, -C und -D gebildet wird [12].

Nach ihrer Synthese werden die Surfactantkomponenten in den für Typ II Alveolarepithelzellen charakteristischen Lamellarkörperchen gespeichert. Die Lamellarkörperchen werden exozytotisch in die Hypophase freigesetzt, wo ihre Umwandlung in tubuläres Myelin und andere phospholipidreiche Aggregate stattfindet. Von diesen Aggregaten aus werden die Surfactantkomponenten in den oberflächenaktiven Surfactantfilm an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht absorbiert, wo sie die Oberflächenspannung reduzieren und so einen Kollaps der peripheren Lufträume verhindern.

2. Organspezifische Toxizität und humane Lungenepithelzelllinien

Die Untersuchung von Lungentoxizität in vitro gestaltet sich aufgrund der Komplexität der Lunge, mit ihren über 60 verschiedenen Zelltypen und der Vielfalt an unterschiedlichen Zellfunktionen, als äußerst schwierig. Jeder Zelltyp und die Funktion, die er ausübt, stellen einen potentiellen Angriffspunkt für einen toxischen Wirkmechanismus dar.

Bei der Auswahl einer geeigneten Zelllinie für in vitro Untersuchungen von Lungentoxizität stellt sich also zunächst die Frage, auf welche Faktoren die Suszeptibilität der Lunge zurückzuführen ist und welche davon, durch Auswahl einer entsprechenden Zelllinie, in vitro ädaquat reproduziert werden können. Ein weiterer Punkt, der bei der Auswahl zu beachten ist, ist der interessierende Endpunkt und ob dieser mit der Zelllinie unter den gewählten

Kulturbedingungen gemessen werden kann. Bei der Untersuchung eines therapeutischen Aerosols kann zusätzlich noch die bevorzugte Abscheidungsregion des Aerosols in der Lunge bei der Auswahl der Zelllinie eine Rolle spielen.

Laut Cohen et al. kann die chemisch induzierte, organspezifische Toxizität einer Substanz auf folgenden, nicht klar voneinander trennbaren, Faktoren basieren [13]:

- der spezifischen Verteilung einer Substanz im Gewebe,

- dem lokalen, gewebespezifischen Metabolismus einer Substanz, - oder auf der speziellen Biochemie oder Physiologie eines Organs.

So kommt beispielsweise die lungenspezifische Toxizität des Herbizides Paraquat durch eine selektive Anreicherung in Clara Zellen und Typ I und Typ II Alveolarepithelzellen zustande.

Es wird aufgrund struktureller Ähnlichkeit zu endogenen Polyaminen aktiv in die Zellen transportiert [14, 15]. Dieses Polyamin-Transportsystem kann für die lungenspezifische Toxizität von Substanzen von Bedeutung sein [16].

Für die gewebespezifische Metabolisierung einer Substanz ist vor allem die für ein bestimmtes Organ charakteristische Ausstattung mit fremstoffmetabolisierenden Enzymen verantwortlich. Verschiedene Zelltypen in der Lunge expremieren solche Enzyme, woraus das Potential der Lunge, zahlreicher Xenobiotika zu metabolisieren, resultiert. Der Fremdstoffmetabolismus besitzt eine besondere Bedeutung für die Toxizität chemischer Verbindungen, da die Toxizität vieler Substanzen durch metabolische Inaktivierung terminiert wird. Andererseits kann die metabolische Modifikation einer Substanz auch zu einem reaktiveren bzw. toxischeren Produkt führen. Ein Prozess, der als Bioaktivierung bezeichnet wird. Die Untersuchung potentieller Lungentoxizität inhalierbarer Substanzen basiert größtenteils immer noch auf Tierversuchen. Die bekannten Speziesunterschiede an fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, gerade in der Lunge, lassen allerdings Zweifel an der Vorhersagekapazität der Tierversuchsdaten für die Lungentoxizität im Menschen zu. Die Entwicklung alternativer in vitro Methoden mit kontinuierlichen, humanen Zelllinien pulmonalen Ursprungs erscheint demzufolge erstrebenswert, und wichtig bei der Auswahl der Zelllinie ist demnach, dass das Expressionsmuster an fremdstoffmetabolisierenden Enzymen der Zelllinie für die humane Lunge repräsentativ ist.

Aufgrund der speziellen physiologischen Funktion des Gasaustausches ist die Lunge außerdem primäres Zielorgan für die Toxizität von gasförmigen Substanzen und Aerosolen.

In vivo sind Lungenepithelzellen nur durch eine dünne visköse Flüssigkeitsschicht (Epi- und/oder Hypophase) von der inhalierten Testatmosphäre getrennt. Um diese Verhältnisse in vitro zu erfassen und eine angemessene Untersuchung inhalierbarer Testatmosphären zu

ermöglichen, sind eine entsprechende Zellkulturtechnik und die Auswahl einer geeigneten Zelllinie nötig.

Es steht eine begrenzte Anzahl an kontinuierlichen, humanen Lungenepithelzelllinien zur Verfügung. Dazu gehören die Bronchialepithelzelllinien 16HBE14o-, Calu-3 und BEAS-2B und die Alveolarepithelzelllinie A549 [17]. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten, werden im Folgenden ausführlicher beschrieben.

2.1 Humane Alveolarepithelzelllinie A549

Bei den A549 Zellen handelt es sich um eine kontinuierliche, humane Alveolarepithelzelllinie, die aus einem Adenokarzinom der Lunge isoliert wurde [18]. A549 Zellen weisen zahlreiche für Typ II Alveolarepithelzellen charakteristische Eigenschaften auf.

Sie besitzen die typischen Lamellarkörperchen, zeigen ein für Zellen, von denen angenommen wird, dass sie Lungensurfactant sekretieren, erwartetes Phosopholipidsynthesemuster und zeigen die gleiche Phospholipidzusammensetzung wie Typ II Primärzellen [18-20]. Zusätzlich weisen sie ein qualitativ mit in vivo Werten übereinstimmendes Expressionsmuster für die, für den Fremdstoffmetabolismus wesentlichen, Cytochrom P450 Isoenzyme auf und zeigen mit Typ II Alveolarepithelzellen vergleichbare Transporteigenschaften [21]. In Kultur haben sie ausgedehnte cytoplasmatische Erweiterungen und weisen eine ausgeprägte Polarität auf [22]. Die Expression und typische Lokalisation von E-Cadherin, einem Protein, das an Zell-Zell-Kontakten expremiert wird und für die Ausbildung eines polarisierten Epithels wichtig ist, belegt den polaren Charakter von A549 Monolayern [23]. Von verschiedenen Forschungsgruppen konnte außerdem gezeigt werden, dass die Zellen die Tight Junction Proteine Occludin, Claudin-2 und das intrazelluläre Tight Junction Protein Zonula Occludens 3 (ZO-3) expremieren [22-24]. Der Nachweis von ZO-1, ein weiteres intrazelluläres Protein des Tight Junction Komplexes, ist trotz verschiedener Versuche [23, 25] bisher nur Winton et al. gelungen. Dabei zeigte sich allerdings nur eine vereinzelte und unzusammenhängende Expression an den Zell-Zell- Grenzen [26].

Trotz ihrer starken Differenzierung und den zahlreichen nachgewiesenen funktionellen Markern, eignen sich A549 Zellen nicht uneingeschränkt zur Untersuchung von Lungentoxizität in vitro. Die Zellen erfassen nicht alle Zytotoxizitätsmechanismen, die in vivo auftreten können. Dies zeigt z.B. die Tatsache, dass es mit A549 Zellen nicht gelungen ist, die organspezifische Lungentoxizität des Herbizids Paraquat in vitro zu reproduzieren. Die

organspezifische Toxizität von Paraquat kommt, wie bereits erwähnt, durch eine selektive Anreicherung über einen aktiven Polyamintransporter in verschiedenen lungenspezifischen Zelltypen wie z.B Typ I und Typ II Alveolarepithelzellen zustande. Die Unterscheidung zwischen Paraquat und Diquat, einem Herbizid aus der gleichen Strukturklasse wie Paraquat, das aber keine lungenspezifische Toxizität zeigt, ist bei in vitro Toxizitätsstudien mit A549 Zellen nicht gelungen [14, 27].

Weitere Einschränkungen betreffen den Fremdstoffmetabolismus. Das Aktivitätsprofil der A549 Zellen für die wichtigsten CYP-Isoenzyme stimmt qualitativ zwar weitgehend mit in vivo Werten überein, die Aktivität der Enzyme liegt quantitativ aber deutlich unter den Aktivitäten, die in der humanen Lunge erreicht werden. Zusätzlich reagieren die verschiedenen CYP-Isoenzyme zwar auf verschiedene Induktoren des Fremdstoffmetabolismus, jedoch nicht in dem Ausmaß wie das in vivo System. Im Gegensatz zu den Aktivitätslevels der Phase-I-Enzyme liegen die Aktivitätslevels der Phase-II-Enzyme bei A549 Zellen in einem mit Lungengewebe vergleichbaren Bereich [28, 29]. Trotz der Einschränkungen bezüglich des Fremdstoffmetabolismus stellen A549 Zellen laut Castell et al. bisher die geeigneteste Zelllinie für die Untersuchung von chemisch induzierter lungenspezifischer Toxizität dar. Für Substanzen deren Toxizität einer vorherigen Bioaktivierung bedarf, ist die Vorhersagekapazität allerdings eingeschränkt [28].

2.2 Humane Bronchialepithelzelllinie 16HBE14o-

Die 16HBE14o- Zelllinie wurde durch Transformation primärer Bronchialepithelzellen eines einjährigen Herz-Lungen-Patienten mit dem großen SV40 T-Antigen etabliert. Die Zelllinie wurde ursprünglich entwickelt um die Chlorid-Kanal Aktivität des ABC-Transporter „Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator“ zu untersuchen, dessen fehlende oder eingeschränkte Funktion die Ursache der Mukoviszidose ist [30].

Die transformierten Zellen haben zahlreiche Eigenschaften differenzierter Bronchialepithelzellen beibehalten. Die Zellen bilden einen polarisierten Zelllayer mit Zilien und Mikrovilli aus und haben die Stimulierung des aktiven Chloridionen Transportes durch - adrenerge Stimuli, Bradykinin und Calcium Ionophore beibehalten.

Submers kultivierte Monolayer der Zellen bilden funktionell Tight Junctions und weitere Zell-Zell-Verbindungen aus und damit verbunden einen messbaren transepithelialen Widerstand [31]. Die Messung des transepithelialen Widerstandes, der mit der „Dichtheit“ der

Tight Juctions ansteigt, ermöglicht dadurch die Untersuchung der parazellulären Integrität und den Einfluss einer Substanzwirkung darauf.

3. Pulmonale Applikation von Pharmaka

Die pulmonale Applikation von Pharmaka beschränkt sich nicht nur auf anästhesierende Gase, auch feste und flüssige Stoffe können über die Lunge verabreicht werden, wenn sie in Form eines Aerosols vorliegen. Die Eigenschaften des Aerosols spielen dabei neben anatomischen und atemphysiologischen Faktoren eine wesentliche Rolle, wo und in welcher Dosis sich die Aerosolpartikel im Respirationstrakt abscheiden.

3.1 Aerosole

Nach einer Definition von Baron et al. beschreibt der Begriff Aerosol flüssige oder feste Partikel, die lange genug in einem gasförmigen Medium suspendiert bleiben, um beobachtet oder gemessen zu werden [32]. Es handelt sich demnach um ein Zweiphasengemisch, das in eine Gasphase und eine Partikelphase aufgeteilt werden kann. Die Größe der in der Gasphase dispergierten Partikel liegt dabei im Allgemeinen zwischen 1 nm und 100 m. Eine Größe von 100 m wird konventionell als das obere Limit betrachtet, da größere Partikel aufgrund ihrer hohen Sedimentationsgeschwindigkeit nicht mehr für angemessene Zeit in Suspension bleiben. Je nach Art der Suspension unterscheidet man Staubaerosole (fest/gasförmig) und Nebelaerosole (flüssig/gasförmig).

Die beiden Phasen eines Aerosols unterliegen einer ständigen Dynamik. So können beispielsweise flüssige Bestandteile der Partikel verdampfen, Stoffe aus der Gasphase an bereits vorhandenen Partikeln kondensieren oder kleine Partikel durch Koagulation zu großen anwachsen. Außerdem können sich Partikel an umgebenden Oberflächen abscheiden.

3.1.1 Aerodynamischer Durchmesser

Sphärische Partikel mit einer einheitlichen Dichte können relativ einfach durch ihren geometrischen Durchmesser charakterisiert werden. Bei nicht-sphärischen Partikeln unterschiedlicher Dichte ist dies jedoch nicht möglich. Um das aerodynamische Verhalten von Partikeln trotz unterschiedlicher Form und Dichte allgemein beschreiben zu können,

werden deshalb Äquivalenzdurchmesser benutzt. Ein häufig verwendeter Äquivalenzdurchmesser ist der aerodynamische Durchmesser d_ae. Dieser ist definiert als der Durchmesser eines sphärischen Partikels mit der Einheitsdichte 0 = 1 g cm^-3, der die gleiche terminale Sedimentationsgeschwindigkeit hat wie der betrachtete Partikel.

3.1.2 Partikelgrößenverteilung

Die Partikel eines Aerosols sind selten von einheitlicher Größe. Aerosole mit einheitlicher Partikelgröße würde man als monodispers bezeichnen. Die meisten Aerosole sind jedoch polydispers, d.h. sie bestehen aus einem Gemisch von Partikeln unterschiedlicher Größe. Die Partikelgrößenverteilung eines Aerosols ist wichtig, da Partikel unterschiedlicher Größe verschiedene physikalische Eigenschaften aufweisen und sich deshalb aerodynamisch unterschiedlich verhalten.

Um die Größenverteilung eines Aerosols entsprechend der physikalischen Eigenschaften der Partikel darzustellen, wird deshalb der aerodynamische Äquivalenzdurchmesser d_ae und nicht der geometrische Durchmesser gemessen, um die unterschiedlichen Größen der Partikel zu unterscheiden und zu ordnen. Für die grafische Darstellung einer Partikelgrößenverteilung wird die Partikelgröße auf der Abszisse aufgetragen. Auf der Ordinate kann dann entweder die Massenkonzentration, die Anzahlkonzentration oder die Oberflächenkonzentration aller Partikel eines Partikelgrößenkanals aufgetragen werden. Man kann demzufolge zwischen verschiedenen Partikelgrößenverteilungen unterscheiden, je nachdem welche Quantifizierungsart gewählt wird. Wird beispielsweise die Masse gewählt, spricht man von der Partikelmassenverteilung und bei der Anzahl von der Partikelanzahlverteilung. Da die verschiedenen Partikelgrößenkanäle messtechnisch bedingt meist unterschiedliche Intervallsbreiten aufweisen, wird die gemessene Konzentration korrigiert, indem sie durch die Breite des Kanals oder den Logarithmus der Kanalbreite dividiert wird.

Für die meisten Aerosole wurde festgestellt, dass die Partikelanzahlverteilung durch eine log- normale Funktion angenähert werden kann. Ist die Partikelanzahl eines Aerosols log-normal verteilt, so weisen auch die anderen Partikelgrößenverteilungen des Aerosols eine Log- Normalverteilung auf. Eine Log-Normalverteilung weist die Eigenschaft auf, dass sie bei logarithmischer Auftragung der Abszisse einer Normalverteilung gleicht. Die Log- Normalverteilung eines Aerosols und damit die aerodynamischen Eigenschaften eines Aerosols können also, wie auch bei der Normalverteilung, vollständig durch ein Lagemaß, ein Streuungsmaß und die „Fläche unter der Kurve“ beschrieben werden.

3.1.3 Massenmedian des aerodynamischen Durchmessers

Bei einem therapeutischen Aerosol stellen die Partikelmassenverteilung und die Partikelmassenkonzentration wichtige Größen für die Charakterisierung des Aerosols dar, da diese beiden Größen die regionale und absolute Dosis im Respirationstrakt beeinflusst wird.

Ein häufig verwendetes Lagemaß für die Charakterisierung eines therapeutischen Aerosols ist daher der Massenmedian des aerodynamischen Durchmessers (MMAD). Der MMAD bezeichnet den aerodynamischen Durchmesser, der die Partikelmassenverteilung so aufteilt, dass die Hälfte der gesamten Aerosolmasse in größeren Partikeln und die Hälfte in kleineren Partikeln enthalten ist. Das Äquivalent bei der Partikelanzahlverteilung bzw. der Partikeloberflächenverteilung ist der CMAD bzw. der SMAD.

Als Streuungsmaß wird meist die geometrische Standardabweichung verwendet. Sie kann über eine kumulative Partikelgrößenverteilung ermittelt werden:

= d

d

Wird eine kumulative Partikelanzahlverteilung betrachtet, dann entspricht d16% bzw. d84% dem aerodynamischen Durchmesser, unterhalb dessen sich 16% bzw. 84% der Gesamtanzahl an Partikeln eines gemessenen Aerosols befinden. Bei den anderen beiden Partikelgrößenverteilungen gilt das gleiche entsprechend für die Masse bzw. die Oberfläche.

Die Partikelanzahl-, die Partikelmassen- und die Partikeloberflächenverteilung eines Aerosols haben alle die gleiche geometrische Standardabweichung, und für die verschiedenen Mediane gilt, dass der CMAD deutlich kleiner als der MMAD ist und der SMAD zwischen beiden liegt.

Ein Aerosol, das ausschließlich aus Partikeln gleicher Größe besteht, hat eine geometrische Standardabweichung von 1. Da in der Realität keine perfekt monodispersen Aerosole vorkommen, werden Aerosole mit einer geometrischen Standardabweichung von kleiner 1.22 auch noch als monodispers bezeichnet.

3.2 Depositionsmechanismen von Partikeln im Respirationstrakt und in der IVAT

Mit dem Begriff „Deposition“ wird im Allgemeinen die Ablagerung von Aerosolpartikeln auf Oberflächen beschrieben. In der Inhalationstoxikologie versteht man darunter die Ablagerung von Aerosolpartikeln in den Atemwegen. Die Deposition von Partikeln basiert grundsätzlich

auf den fünf Mechanismen Impaktion, Sedimentation, Diffusion, Interzeption und elektrostatische Abscheidung. Diese kommen auch für die Deposition von Partikeln in der IVAT in Frage.

Welche Mechanismen zur Deposition von Partikeln beitragen, hängt von den aerodynamischen und physikochemischen Eigenschaften der Partikel, dem Atemmuster und der Geometrie des Respirationstraktes ab. Bei der IVAT werden anstatt dem Atemmuster und der Geometrie des Respirationstraktes, die gewählten Expositionsbedingungen, wie beispielsweise Volumenstrom und relative Luftfeuchtigkeit, eine Rolle spielen.

Für die meisten Aerosole kommen hauptsächlich die Meachanismen Impaktion, Sedimentation und Diffusion zum Tragen, während Interzeption und elektrostatische Abscheidung eine untergeordnete Rolle spielen.

3.2.1 Impaktion

Trägheit ist das Bestreben einer sich bewegender Masse, Geschwindigkeit und Richtung beizubehalten. Die Trägheit eines Partikels ist nicht nur von der Dichte und dem Durchmesser des Partikels, sondern auch von seiner Strömungsgeschwindigkeit abhängig. Sie kann bewirken, dass eingeatmete Partikel, bei Änderungen der Strömungsrichtung an Gabelungen und Biegungen der Atemwege, nicht den Strömungslinien der eingeatmeten Atmosphäre folgen, sondern ihre ursprüngliche Richtung beibehalten und sich durch Impaktion an der Atemwegswand abscheiden. Impaktion wird daher häufig auch als Trägheitsabscheidung bezeichnet.

Die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein sphärischer Partikel, mit einem geometrischen Durchmesser d und einer Dichte , der sich in einer Strömung mit einer linearen Geschwindigkeit von u bewegt, die Strömungslinien bei einer Richtungsänderung verlässt, wird durch die dimensionslose Stokes-Zahl charakterisiert:

Stk = d

u 18 G

dabei entspricht der dynamischen Viskosität der Gasphase und G charakterisiert die Geometrie der zu durchströmenden Struktur. Je größer die Stokes Zahl, desto leichter verlässt ein Partikel die Strömungslinien und desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass er sich durch Impaktion abscheidet.

Die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein bestimmtes Partikel durch Impaktion abscheidet, erhöht sich demzufolge mit steigender Atemstromstärke und Partikeldichte, steigendem Partikeldurchmesser und mit zunehmendem Winkel der Stromlinienrichtungsänderung.

3.2.2 Sedimentation

Partikel sind kontinuierlich der Schwerkraft ausgesetzt. Diese ist für das Absinken eines Partikels verantwortlich. Dabei erreicht ein Partikel seine terminale Sedimentationsgeschwindigkeit v, wenn die Schwerkraft dem entgegengesetzten, viskösen Luftwiderstand entspricht. Dies wird durch das Stokes’sche Gesetzt beschrieben, das hier für einen sphärischen Partikel mit einem geometrischen Durchmesser d und einer Dichte gegeben ist:

6 d

g = 3 dv

Die Gravitationskraft auf den Partikel wird durch die linke Seite der Gleichung gegeben, wobei g die Gravitationskonstante ist. Die rechte Seite beschreibt die entgegengesetzte Kraft des Lufwiderstandes, wobei die dynamische Viskosität der Gasphase ist. Bei Partikeln mit einem Durchmesser kleiner als 1 m muss zusätzlich noch der „Cunningham slip“

Korrekturfaktor Cc eingeführt werden. Dieser wird eingeführt, da die den Partikel umgebende Gasphase, kein kontinuierliches Medium ist, sondern aus diskreten Molekülen besteht. Die Annahme, dass es sich um ein kontinuierliches Medium handelt, würde bei Partikeln unter 1 m zu Fehlern führen. Damit ergibt sich für die terminale Sedimentationsgeschwindigkeit v eines sphärischen Partikels:

v = d

gC

18

m s

Die Sedimentationsgeschwindigkeit ist demzufolge umso größer, je größer Durchmesser und Dichte des Partikels sind und je geringer die Viskosität des Dispersionsmediums bzw. der Gasphase ist.

Je länger sich ein Partikel im Respirationstrakt befindet und je größer seine Sedimentationsgeschwindigkeit ist, desto größer ist die Distanz, um die der Partikel absinkt und demzufolge auch die Wahrscheinlichkeit, dass er sich durch Sedimentation abscheidet.

Die relativ lange Verweildauer der eingeatmeten Atmosphäre in den kleineren luftleitenden

Atemwegen und im alveolären Bereich begünstigt demnach die Deposition durch Sedimentation in diesem Bereich.

3.2.3 Diffusion

Partikel mit Durchmessern unterhalb eines Mikrometers unterliegen der Brownschen Molekularbewegung der sie umgebenden Gasmoleküle. Die Kollisionen zwischen Gasmolekülen und Partikeln verursachen zahlreiche zufällige Verschiebungen der Partikel.

Die Verschiebung eines Partikels reduziert sich mit steigendem Partikeldurchmesser, da die Anzahl der Kollisionen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt, aus verschiedenen Richtungen auftreten, ansteigen, so dass sich der verursachte Nettoimpuls reduziert. Die maximale mittlere Nettoverschiebung x, die ein Partikel innerhalb einer bestimmten Zeit t erfahren kann, ist dabei von dem Diffusionskoeffizient D des Partikels in der gegebenen Gasphase abhängig:

x = 2Dt [ ] m

Der Diffusionskoeffizient ergibt sich aus:

D = kTC

3 d

m

s

wobei k die Bolzmann Konstante, T die Temperatur, C_c der „Cunningham slip“

Korrekturfaktor, die dynamische Viskosität der Gasphase und d_p der Partikeldurchmesser ist. Aus den beiden Gleichungen ergibt sich, dass die mittlere Nettoverschiebung eines Partikels, bei gegebener Temperatur und Viskosität der Gasphase, mit abnehmendem Partikeldurchmesser d_p und über die Zeit t ansteigt. Die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Partikel im Respirationstrakt durch Diffusion abscheidet, steigt mit zunehmender mittlerer Nettoverschiebung des Partikels. Demzufolge steigt diese Wahrscheinlichkeit mit zunehmender Verweildauer im Respirationstrakt an. Die Abscheidung durch Diffusion ist also, wie auch die Sedimentation, vor allem in den peripheren Atemwegen und den Alveolen von Bedeutung. Die Verweildauer eines Partikels ist dort relativ lang und die Distanz, die ein Partikel zurücklegen muss, bevor er auf eine Oberfläche trifft, relativ kurz.

3.3 Hygroskopisches Wachstum und Verdunstung

Die Partikelgrößenverteilung eines Aerosols ist Änderungen unterworfen, die von den physikochemischen Eigenschaften der Partikel beeinflusst werden. Kleine, wässrige Partikel verdampfen je nach relativer Luftfeuchtigkeit rasch zu festen Partikeln, so dass die Konzentration der gelösten Substanz bei völliger Verdampfung 100% beträgt.

Umgekehrt können Partikel in feuchter Umgebung wachsen. Dieses Wachstum ist besonders abhängig von der Hygroskopizität des Partikels. Zahlreiche therapeutische Aerosole besitzen einen hygroskopischen Charakter, der aus der Affinität der Aerosolpartikel für Wasserdampf resultiert. Der Begriff „hygroskopisches Wachstum“ beschreibt dabei das Anwachsen des Partikeldurchmessers durch die Kondensation von Wasserdampf am Partikel [33].

Durch hygroskopisches Wachstum und Verdunstung von Wasser aus der Partikelphase kann sich die Form, Größe und Dichte von Aerosolpartikeln verändern, was sich wiederum auf die Depositionseffizienz eines Aerosols im Respirationstrakt oder in anderen Systemen wie beispielsweise der IVAT auswirken kann.

Hygroskopisches Wachstum von therapeutischen Aerosolen wurde bisher vorwiegend für Salze untersucht. Dabei hat sich gezeigt, dass das Wachstum hauptsächlich von der relativen Luftfeuchte der Gasphase, der Temperatur und der Teilchenzahl eines Partikels abhängig ist [34].

4. Direktexpositionsmethoden

4.1 Problematik

Bei in vitro Toxizitätsuntersuchungen von inhalierbaren Substanzen ist man aufgrund der Schwierigkeit, kultivierte Zellen des Respirationstraktes direkt gegenüber einer Testatmosphäre zu exponieren, verschiedenen Problemen gegenübergestellt.

Bei gasförmigen Substanzen sind dies laut Ritter et al. folgende [35]:

- Die relative Luftfeuchtigkeit verschiedener Testatmosphären liegt bei 25°C zwischen 20 und 90%, sollte für Standardzellkulturbedingungen bei 37°C aber zwischen 90 und 100% liegen.

- Der pH Wert von Standardzellkulturmedium wird in der Regel durch 5% CO2 in der Atmosphäre des Brutschrankes eingestellt. Der CO2-Gehalt der Testatmosphäre kann davon abweichen und liegt für Umgebungsluft beispielsweise bei nur 0.03%.

- Um eine geeignete Sensitivität des Testsystems zu erreichen, ist ein möglichst direkter Kontakt zwischen Testatmosphäre und Zellen entscheidend. Dies ist allerdings nur möglich wenn sich zwischen Zellen und Testatmosphäre eine minimale, als physikalische und chemische Barriere wirkende Flüssigkeitsschicht befindet.

Gleichzeitig ist aber der Kontakt zwischen Zellen und Kulturmedium nötig, um eine Nährstoffversorgung der Zellen zu gewährleisten.

- Eine ausreichende Reproduzierbarkeit der Exposition kann nur gewährleistet werden, wenn die Testatmosphäre kontinuierlich über die Zellen geströmt wird. Da Zellen aber gegenüber physikalischem Stress empfindlich reagieren, kann sich der Volumenstrom schädigend auf die Zellkultur auswirken.

Bei der Untersuchung von Aerosolen treten weitere Probleme aufgrund der Dynamik der Partikel- und Gasphase auf. Vor allem komplexe Aerosole, wie beispielsweise Tabakrauch oder Dieselabgase, die aus hunderten von Substanzen bestehen, einschließlich kurz- und langlebiger Radikale, sind bekannt dafür, dass sich ihre Gas- und Partikelphase innerhalb kurzer Zeit nach der Generierung qualitativ und quantitativ verändert [36, 37]. Aber auch von therapeutischen Aerosolen ist bekannt, dass sich nach ihrer Generierung vor allem die Partikelphase qualitativ und quantitativ verändert [38]. So können beispielsweise generierte Tröpfchen je nach Umgebungsbedingungen hygroskopisch anwachsen bzw. durch Verdunstung schrumpfen. Dadurch verändert sich nicht nur die Lösungskonzentration der Tröpfchen, sondern auch die Partikelgrößenverteilung und damit der Depositionsort und die Depositionseffizienz des Aerosols in der Lunge bzw. im Expositionssystem. Da sich die Partikelphase eines Aerosols auch beim Durchströmen eines in vitro Testsystems verändern wird, ist es daher wichtig, die Eigenschaften des Aerosols zum Expositionszeitpunkt bzw. die Depositionseffizienz des Aerosols auf den exponierten Zellen zu kennen. Nur dann ist es möglich, die Effekte verschiedener Aerosole sinnvoll miteinander zu vergleichen.

4.2 Voraussetzungen

Bei der Entwicklung von in vitro Methoden für die Exposition von Lungenzellen müssen laut Rasmussen et al. bestimmte Grundsätze befolgt werden [39]:

- Um dosisabhängige Effekte zu untersuchen, muss eine kontrollierte Generierung und ein Monitoring der Testatmosphäre stattfinden.

- Der Kontakt zwischen der Testatmosphäre und den Zellen sollte so nah wie möglich stattfinden, um beispielsweise die Interaktionen von Oxidationsmitteln der

Testatmosphäre mit Mediumbestandteilen zu verhindern und um, im Fall eines Aerosols, die Deposition von Partikeln auf den Zellen und den direkten Kontakt der Gasphase mit den Zellen zu ermöglichen.

- Das Expositionssystem sollte so gestaltet sein, dass es signifikante Expositionszeiten erlaubt. Im Allgemeinen führt die Exposition von Zellen gegenüber der Umgebungsluft zu einem rapiden Austrocknen der Zellen. Die Methode muss deshalb so gestaltet sein, dass die Testatmosphäre vor der Exposition befeuchtet wird oder dass durch kontinuierliches Anfeuchten der Zellen das Austrocknen dieser verhindert wird.

- Nach beendeter Exposition sollten Endpunkte untersucht werden, die eine Aussage über die toxische Wirkung ermöglichen und von denen aufgrund von in vivo Studien angenommen wird, dass sie für die Wirkung repräsentativ sind.

4.3 Expositionsverfahren

Für die Exposition von Zellen gegenüber gasförmigen Substanzen oder Aerosolen sind verschiedene Verfahren entwickelt worden. Sie können gemäß des ihnen zugrunde liegenden Prinzips in drei Gruppen eingeteilt werden:

- Verfahren mit kontinuierlich submersen Kulturbedingungen,

- Verfahren mit periodischem Wechsel zwischen submersen Kulturbedingungen und der Direktexposition gegenüber einer Testatmosphäre und

- Verfahren, bei denen die Zellen kontinuierlich einer Testatmosphäre ausgesetzt sind.

Durch die Verwendung einer Zellsuspension kann die submerse Exposition von Zellen gegenüber gasförmigen Substanzen relativ einfach erreicht werden, indem die Suspension mit dem Testgas durchsprudelt wird. Diese Technik wurde beispielsweise für eine Studie mit Alveolarmakrophagen des Meerschweinchens verwendet, bei der Stickstoffdioxid kontinuierlich durch die sich in einer Waschflasche befindende Zellsuspension gezogen wurde [40]. In einer anderen experimentellen Untersuchung wurden humane mononukleäre Blutzellen submers kultiviert und gegenüber Ozon exponiert, indem das Testgas einmalig dem Kulturmedium zugefügt wurde [41]. In einer weiteren Studie mit humanen Erythrozyten wurde die Exposition mit Ozon einfach dadurch erreicht, dass die Zellsuspension mit dem Testgas überströmt und gleichzeitig umgerührt wurde [42].

Verfahren mit einem periodischen Wechsel zwischen submersen Kulturbedingungen und Direktexpositionsbedingungen werden ebenfalls seit längerer Zeit angewandet. Es wurde

1969 von Pace et al. entwickelt. Das Kulturmedium einer Zellkulturflasche wurde periodisch gewechselt und zwischen den Wechseln wurden die Zellen gegenüber Ozon exponiert [43].

Variationen dieses Verfahren sind das kontinuierliche Rollen von Zellkulturflaschen oder das kontinuierliche Drehen und Schütteln von Kulturgefäßen in bestimmten Winkel bei gleichzeitiger Überströmung mit der Testatmosphäre.

Um Zellen kontinuierliche gegenüber einer Testatmosphäre zu exponieren, ist es nötig, die Nährstoffversorgung der Zellen über die Expositionsdauer zu gewährleisten. Bei der kontinuierlichen Exposition fand die Kultivierung der Zellen deshalb auf Kollagengelen [44, 45] oder mikroporösen Membranen [39, 46] statt, die eine Nährstoffversorgung der Zellen von der basalen Seite erlaubten, während die Zellen apikal der Testatmosphäre ausgesetzt waren. In den ersten Studien wurden die Membranen in speziell dafür angefertigten Aufbauten positioniert. Mittlerweile sind spezielle, als Transwells bezeichnete Membranen, die in Standardzellkulturplatten eingehängt werden können, kommerziell erhältlich. Die Transwells sind dabei mit Membranen unterschiedlicher Wachstumsfläche, Porengröße und Porendichte erhältlich.

Ein Vergleich der drei verschiedenen Verfahren zeigt, dass die Exposition an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht den am besten reproduzierbaren Kontakt zwischen Zellen und Testatmosphäre schafft. Eine submerse Exposition hingegen schafft eine sehr große Grenzfläche zwischen Testatmosphäre und Kulturmedium und eine kleine zwischen Testatmosphäre und Zellen. Die Ergebnisse einer submersen Expositionsstudie werden deshalb stark von den physikalischen Eigenschaften der Testatmosphäre, wie beispielsweise Löslichkeit im Zellkulturmedium und den chemischen Eigenschaften der Testatmosphäre, wie beispielsweise der Reaktionsfähigkeit mit Mediumsbestandteilen, abhängig sein.

Die intermittierende Exposition schafft zwar eine größere Grenzfläche zwischen Zellen und Testatmosphäre, die Interaktionen zwischen Testatmosphäre und Mediumbestandteilen ist aber immer noch gegeben und physikalische Effekte wie Adsorption sind für eine permanente Flüssigkeitsschicht über den Zellen verantwortlich. Außerdem ist die Grenzfläche aufgrund der periodischen Änderung des Mediumslevels schwer zu definieren und quantifizieren.

Nur die dynamische Exposition an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht schafft einen quantifizierbaren und reproduzierbaren Kontakt zwischen den Zellen. Es ist allerdings ein speziell dafür angefertigtes Kultur- und Expositionssystem nötig.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals ein neu entwickeltes Kultur- und Expositionssystem, die In-Vitro-Aerosol-Testapperatur (IVAT), die unter C.7 ausführlicher

beschrieben wird, verwendet. Ziel dieser Arbeit war die Qualifizierung und Optimierung der Apparatur für die Direktexposition von A549 Zellen gegenüber therapeutischen Aerosolen.

Die IVAT stellt eine Weiterentwicklung des von U. Mohr und M. Aufderheide entwickelten Cultex-Systems dar, das für die Kultivierung und Exposition von Zellen an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht verwendet wird [47, 48]. Das Cultex-System erlaubt die Exposition von Zellen gegenüber komplexen Testatmosphären. Die Testatmosphären werden dabei über einen vertikalen, dynamischen Strom direkt auf die Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht von „air-liquid“ kultivierten Zellen geleitet. Es wurde bisher erfolgreich für die Exposition von humanen Zelllinien gegenüber Nebenstrom und Hauptstrom Zigarettenrauch, Autoabgasen, gasförmigen und volatilen Verbindungen eingesetzt [35, 49-56]. Außerdem wurde für die Direktexposition von Bakterien des Stamms Salmonella typhimurium eine adaptierte Version des Systems entwickelt, mit der in einem modifizierten Ames-Assay die Genotoxizität von gasförmigen Substanzen oder komplexen Atmosphären wie z.B.

Zigarettenrauch untersucht werden kann [52].

4.4 „Air-liquid“ Kultivierung von Zellen

Unter „air-liquid“ Kultivierung versteht man die biphasische Kultivierung von Zellen an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht, wobei die Zellen basal mit Nährmedium versorgt werden und apikal mit der Umgebungsatmosphäre in Kontakt stehen. Die „air-liquid“ Kulturtechnik wurde bereits für zahlreiche in vitro Untersuchungen mit Lungenepithelzelllinien verwendet.

So wurden beispielsweise „air-liquid“ exponierte A549 Zellen für Partikel-Lungenepithel Interaktionsstudien [24] und für die Toxizitätsuntersuchung verschiedener gasförmiger Substanzen und Aerosole verwendet [50, 55, 57, 58].

Von der Kultivierung unter „air-liquid“ Bedingungen ist bekannt, dass sie sich auf den differenzierten Phänotyp verschiedener Zelllinien, unter anderem Lungenepithelzelllinien, auswirkt [24, 31].

Von submers kultivierten A549 Zellen ist bekannt, dass sie Surfactant Komponenten synthetisieren, in Lamellarkörperchen speichern und schließlich sekretieren [18]. Die „air- liquid“ Kultivierung der A549 Monolayern führt dazu, dass die Surfactant Komponenten apikal in die Hypophase freigesetzt werden und den Monolayer bedecken, wodurch sich an der Luft-Flüssigkeitsgrenzschicht ein oberflächenaktiver Surfactantfilm ausbildet [24].

Bisher finden sich keine Hinweise dafür, dass der von A549 Zellen gebildete Surfactant eines der bekannten Surfactantproteine enthält. Eine Ausnahme stellt die Expression von SP-C dar,