Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings
von Endothelzellen als Grundlage für eine neuartige
antiinflammatorische Therapie
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt der
Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät
(mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich)
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von
Herrn Apotheker Stephan Kessner
geb. am: 25.01.1976 in Staßfurt
Gutachter
1. Prof. Dr. G. Bendas
2. Prof. Dr. P. Nuhn
3. Prof. Dr. A. Fahr
Halle (Saale), 29.Oktober 2004
urn:nbn:de:gbv:3-000007444
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung... 7
2. Theoretischer Teil ... 9
2.1. Das Endothel... 9
2.1.1. Physiologische Barriere, Transportmöglichkeiten ... 9
2.1.2. Besonderheiten im Entzündungsprozess ... 12
2.2. Selektine als Targetstruktur ... 13
2.2.1. Adhäsionskaskade der Leukozyten ... 13
2.2.2. Expression der Selektine ... 16
2.3. Liposomales Targeting ... 19
2.3.1. Liposomen als Arzneistoffträger ... 19
2.3.2. Immunoliposomen / Stealth®-Modifikation / pH-Sensitivität... 22
2.3.3. Zelluläre Aufnahmemechanismen für Liposomen ... 26
2.4. Ziele dieser Arbeit ... 29
3. Materialien und Methoden ... 30
3.1. Verwendete Substanzen... 30
3.1.1. Chemikalien und Lipide ... 30
3.1.2. Präparative Darstellung der Lipidanker... 31
3.1.2.1. N-Glut-PE (N-Glutaryl-DPPE) ... 31
3.1.2.2. Cyanur-PEG-PE (Cyanur-PEG-DPPE) ... 31
3.1.3. Präparative Isolierung bakterieller Plasmid-DNA... 32
3.2. Liposomen ... 34
3.2.1. Liposomenpräparationen ... 34
3.2.1.1. Hydratationsmethode... 34
3.2.1.2. Phasenumkehrmethode... 34
3.2.1.3. Detergenzmethode... 35
3.2.2. Kopplung von Antikörpern an Liposomen... 35
3.2.2.1. N-Glut-PE als Lipidanker... 36
3.2.2.2. Cyanur-PEG-PE als Lipidanker ... 36
3.2.3. Charakterisierung... 36
3.2.3.1. Partikelgrößenbestimmung... 36
3.2.3.2. Proteinquantifizierung ... 37
3.2.3.3. Phosphatquantifizierung ... 38
3.2.3.4. Bestimmung der Einschlussrate ... 38
3.2.4. Fluoreszenzmarkierung ... 39
3.2.4.1. Symmetrische Verteilung ... 39
3.2.4.2. Asymmetrische Verteilung... 39
3.3. Zellkultivierung ... 40
3.3.1. Gewinnung humaner Nabelschnurendothelzellen ... 40
3.3.2. SRB-Assay zur Bestimmung der Wachstumsraten ... 41
3.4. Bindungsuntersuchungen... 42
3.5. Internalisierungsuntersuchungen ... 43
3.5.1. Dithionit-Technik ... 43
3.5.2. Aufklärung der Internalisierungsmechanismen... 44
3.5.2.1. Passive Aufnahmemechanismen ... 44
3.5.2.2. Aktive Aufnahmemechanismen ... 45
3.6. pH-sensitive Immunoliposomen ... 45
3.6.1. pH-abhängiges Freisetzungsverhalten... 45
3.6.2. Serumstabilität ... 46
3.6.3. Fusionsnachweis mit endosomalen Vesikeln ... 46
3.6.4. In-vitro-Studien ... 47
3.6.4.1. Targetierung und fluoreszenzmikroskopische Auswertung ... 47
3.6.4.2. Auswirkung von Äquilibrierungsreagenzien... 48
3.6.4.3. Einschluss von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid... 48
3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen... 48
3.7.1. Lipsomenpräparationen ... 49 3.7.2. Liposomencharakterisierung ... 50 3.7.2.1. DNA-Quantifizierung... 50 3.7.2.2. Elektronenmikroskopische Aufnahmen ... 51 3.7.2.3. Serumstabilität... 51 3.7.2.4. pH-abhängiges Freisetzungsverhalten... 51 3.7.3. Transfektionsversuche an E. coli... 52 3.7.4. Transfektionsversuche an HUVEC ... 52
4. Ergebnisse und Diskussion... 54
4.1. Charakterisierung der Liposomen... 55
4.2. In-vitro-Studien von Liposomen an Endothelzellen... 58
4.2.1. Bindungsuntersuchungen... 59
4.2.2. Internalisierungsuntersuchungen ... 64
4.2.2.1. Quantitative Studien ... 65
4.2.2.2. Qualitative Studien ... 69
4.2.3. pH-sensitive Immunoliposomen... 75
4.2.3.1. Serumstabilität, pH-abhängige Freigabe, FRET ... 75
4.2.3.2. Einfluss von Äquilibrierungsreagenzien ... 81
4.2.3.3. Umsetzung von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid... 83
4.2.3.4. Mikroskopische Aufnahmen ... 84
4.3. Sterisch stabilisierte pH-sen. Immunoliposomen als Transfektionssystem... 86
4.3.1. Herstellung und Charakterisierung plasmidhaltiger Liposomen ... 86
4.3.2. Transfektionsfähigkeit von E. coli... 90
4.3.3. Transfektionfähigkeit humaner Endothelzellen... 92
5. Zusammenfassung ... 94
6. Literaturverzeichnis ... 96
Abkürzungen
BCA Bicinchoninic Acid
BSA Bovine Serum Albumine
CCL Cationic Coated Liposomes
CHEMS Cholesteryl Hemisuccinat Morpholino Salz
Chol Cholesterol
Cyanur-PEG-PE
N-[3-Chlor-5-(ω-(3,5-dichloro-2,4,6-triazoxyl)-poly(ethylenglykol)-α-amino)-2,4,6-triazyl]-PE
DDS Drug Delivery System
DiO 3,3‘-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat DMPE 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin DNA Desoyxribonucleinsäure DOPA 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-phosphatidsäure DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin DOTAP N-(1-[2,3-Dioleoyloxy]propyl)-N,N,N-trimethylammonium DPPE 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-phosphocholin DSPE 1,2-Distearoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid EDTA Ethylendiamintetraacetic acid
EGF Epidermal Growth Factor
EPS Ei-phosphatidyl-serine
ESL-1 E-Selectin-Ligand-1
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
GFP Green Fluorescent Proteine
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N‘-2-ethansulfonsäure HPTS 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (Pyranin) HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells ICAM Intercellular Adhesion Molecules
IgG Immunglobulin G
IL Immunoliposom
IL-1β Interleukin-1β
IgSF Immunglobulin-Superfamilie
LDL Low Density Lipoproteine
LFA-1 Lymphozyte Function associated Antigen-1
LSM Laser Scanning Mikroskop
LPS Lipopolysaccharid
LUV Large Unilamellar Vesicle
LY Lucifer Yellow
MAC-1 Membrane Attack Complex-1
MLV Multilamellar Vesicle
MPB-PE N-(4‘-(4‘‘-Maleimidophenyl)butyryl)-phosphatidylethanolamin mPEG-PE Methoxypolyethylenglykol- phosphatidylethanolamin
4-MU-β-D-Glykosid 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid
NBD-PE 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4yl)
NFκB Nuclear factor kappa B
N-Glut-PE N-Glutaryl-Phosphatidylethanolamin
NHS N-Hydroxysulfosuccinimid
NSAP Nichtsteroidale Antiphlogistika
OG Oktylglykosid
PAF Plättchenaggregierender Faktor
PBS Phosphate buffered saline/ Phosphatpuffer PCS Photon Correlation Spectroscopy
PE Phosphatidylethanolamin
PDP-PE N-(3‘-(Pyridyldithio)-propionyl)-phosphatidylethanolamin PECAM-1 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1
PEG Polyethylenglykol
PL Phospholipid
POPC 1-Palmitoyl, 2-oleoyl- sn-glycero-phosphocholin
PSGL-1 P-Selectin Glycoprotein Ligand-1
RES Retikuloendotheliales System
REV reverse phase evaporation
RNA Ribonucleinsäure
SCR Short Consensus Repeats
SDS Sodium dodecyl sulfate
sLex Sialyl Lewisx
SMPB N-Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrat SPDP N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
SPC Soja-Phosphatidylcholin
SPLP Stabilized Plasmid Lipid Particles
SRB Sulphorhodamin B
SUV Small unilamellar vesicle
TCA Trichloressigsäure TE-Puffer TRIS-EDTA-Puffer TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha TRIS 2-Amino-(hydroxymethyl)-aminomethan Triton-X-100 Octylphenoxypolyethoxyethanol Abkürzungen 4
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Ablauf der rezeptorgesteuerten Leukozytenadhäsion am Endothel und der Leukozytenemigration unter Entzündungsbedingungen
Abb. 2: HUVEC, 3 Tage nach Präparation
Abb. 3: Schematische Darstellung und Vergleich der Antikörper-Kopplung an Liposomen
Abb. 4: Abhängigkeit der Kopplungsausbeute in Anwesenheit von PEG-PE Abb. 5: Abhängigkeit der Liposomengröße von der Herstellungsmethode Abb. 6: Abhängigkeit der Bindungsereignisse zw. Liposomen und stimulierten
HUVEC von der Art des eingesetzten Kopplungsankers und Antikörpers Abb. 7: Abhängigkeit der Bindungsereignisse zw. Liposomen und unstimulierten HUVEC von der Art des eingesetzten Kopplungsankers und Antikörpers Abb. 8: Abhängigkeit der Liposomenbindung von der Anwesenheit freier Antikörper Abb. 9: Abhängigkeit der Bindung von der zugesetzten Liposomenmenge
Abb. 10: Abhängigkeit der Liposomenbindung vom FKS-Status der Endothelzellen Abb. 11: Dithionit-vermittelte Reduktion des Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl zum
7-Amino-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl
Abb. 12: Unterscheidung zwischen gebundenen und internalisierten Liposomen durch Dithionit-Technik
Abb. 13: Zeitabhängigkeit der NBD-Fluoreszenzlöschung durch Dithionit
Abb. 14: Abhängigkeit der Internalisierung von Kopplungsanker und Antikörper Abb. 15: Fusionsnachweis zw. Immunoliposomen und stimulierten HUVEC nach 60
Minuten bei 4°C
Abb. 16: Fusionsnachweis zw. Immunoliposomen und stimulierten HUVEC nach 60 Minuten bei 4°C und weiteren 60 Minuten bei 37°C
Abb. 17: Hauptaufnahmemechanismen der Zelle
Abb. 18: Abnahme der zellulären Internalisierung durch Inhibitoren Abb. 19: Stabilität pH-sensitiver Liposomen (Typ1) in 40% Serum
Abb. 20: Freisetzungsverhalten pH-sensitiver Immunoliposomen nach 15-minütiger Inkubation
Abb. 21: Veränderung des FRET während des Fusionsprozesses
Abb. 22: Fusion zwischen pH-sensitiven Immunoliposomen und endosomalen Vehikeln Abb. 23: Veränderung der pH-sensitiven Freigabe in HUVEC durch NH4CL
Abb. 24: Fluoreszenzentwicklung durch freies 4-Methylumbelliferon
Abb. 25: z-Scan durch eine Endothelzelle nach Internalisierung pH-insensitiver Immunoliposomen (NBD-PE)
Abb. 26: z-Scan durch eine Endothelzelle nach Internalisierung pH-sensitiver Immunoliposomen (Calcein)
Abb. 27: pH-abhängiges Freisetzungsverhalten von CCL und SPLP in Bezug auf Plasmidstatus
Abb. 28: cryo-TEM-Aufnahmen gefüllter bzw. ungefüllter SPLP Abb. 29: Transfektion von E. coli durch CCL und SPLP
Abb. 30: GFP-Transfektion von HUVEC
1. Einleitung
Der Anteil chronisch verlaufender Entzündungsprozesse nimmt innerhalb medikamentös therapierbaren Erkrankungen immer mehr zu. Die gegenwärtige Therapie chronisch entzündlicher Erkrankungen ist zum Teil mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden, da hochwirksame Arzneimittelgruppen wie z.B. Glucocorticoide in vielen Fällen die einzige Lösung zur Verbesserung des Krankheitsgeschehens darstellen, diese aber mit ihren bekannten Nebenwirkungsprofilen häufig an Grenzen der Einsetzbarkeit stoßen. So wurde in den letzten Jahren verstärkt nach neuartigen Wirkstoffen im Bereich der antiinflammatorischen Therapie gesucht. 1999 wurde Rofecoxib als erster Vertreter der selektiven COX-2-Inhibitoren für die Behandlung von Symptomen bei Reizzuständen degenerativer Gelenkerkrankungen (Arthrosen) zugelassen. Mit Leflunomid als Hemmer des Enzyms Dihydroorotatdehydrogenase wurde ein völlig neuer Wirkmechanismus in die Therapie der rheumatoiden Arthritis eingeführt. Die Blockade der Wirkung des Tumor-nekrosefaktors durch den chimären Antikörper Infliximab bzw. das Abfangen des frei zirkulierenden Trimers durch Etanercept vervollständigten die Ansatzmöglichkeiten für die Therapie der chronischen Verlaufsform der Entzündung erheblich. Die derzeitigen Erfolge bei Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis, Asthma bronchiale und Morbus Crohn zeigen aber, dass der Bedarf neuer Therapieansätze weiterhin vorhanden ist. So kann neben der Anwendung völlig neuer Arzneistoffe auch der Einsatz neuartiger Transportsysteme die Wirkung der entsprechenden Arzneimittel erhöhen. So genannte Drug Delivery Systeme (DDS) können die Wirkstoffe im Rahmen einer antiinflammatorischen Therapie direkt an den Ort des Krankheitsgeschehens heranbringen. Dadurch ist der erzielte Effekt deutlich verbessert und die Nebenwirkungen auf gesunde Zellen des Organismus werden dadurch verringert.
Als Wirkstoff-Transportvehikel dieser DDS haben sich die in den 60er Jahren von Bangham entwickelten Liposomen etabliert [Bangham et al. (1965)]. Da diese als Vehikel für sowohl hydrophile als auch lipophile Arzneistoffe dienen können, wurden große Hoffnungen auf die Liposomen gesetzt. Problematisch gestaltete sich jedoch das gezielte Heranbringen der Liposomen an den Wirkort. Durch die Bindung unterschiedlichster Liganden auf der Liposomenoberfläche konnte eine gewisse Zielspezifität erreicht werden. Als besonders geeignet erschienen deshalb die in den 80er Jahren entwickelten Immunoliposomen, die Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächenstrukturen enthielten. Durch die hohe Spezifität sowie Affinität der Antikörper zu ihren jeweiligen Antigenen sollte ein ortsspezifischer Arzneistofftransport möglich werden.
In vielfältigen Untersuchungen der chronischen Entzündungsprozesse konnte durch Entdeckung und Charakterisierung verschiedenster am Prozess beteiligter Entzün-dungsrezeptoren und –mediatoren die Aufklärung der molekularbiologischen Mechanismen erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Leukozyten rezeptorgesteuert am Endothel von entzündetem Gewebe binden und dort ins Gewebe emigrieren. Ein Meilenstein in dieser Entwicklung stellte die Identifizierung der Adhäsionsrezeptor-Familie der Selektine dar [Springer (1995)]. Sie vermitteln den initialen Kontakt zwischen Leukozyten und Gefäßendothel innerhalb des Entzündungsgebietes. Auf der Grundlage von Protein-Kohlenhydrat-Bindungen kommt es dadurch zur rollenden Verlangsamung der Leukozyten. Dies ist der Beginn der komplexen Adhäsionskaskade der Leukozyten am aktivierten Endothel.
Aufgrund dieser initialen und zentralen Funktion innerhalb des Entzündungsgeschehens stellen die vaskulären Selektine hervorragende Zielstrukturen für Drug Delivery Systeme im entzündeten Gewebe dar. Ihre Exprimierung erfolgt ausschließlich unter Entzündungs-bedingungen am Gefäßendothel. Aus diesen Gründen bieten sich als Vehikel für einen
selektingerichteten Arzneistofftransport Immunoliposomen mit funktionalisierten Anti-E-Selektin-Antikörpern an. Die therapeutische Wirkung setzt jedoch erst nach Freigabe des Arzneistoffes innerhalb der Zelle ein. Vorherige Bindungs- und Aufnahmeprozesse müssen deshalb quantitativ erfolgreich verlaufen. Die Stabilität der Transportvehikel muss bis dahin gewährleistet sein. Im Inneren der Zelle hingegen müssen die Immunoliposomen einem gewissen Zerfall unterliegen, da sonst ein intrazellulärer Abbau innerhalb der Lysosomen stattfindet. Dies würde einem Wirkverlust gleichkommen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Untersuchung der Wechselwirkungen von E-Selektin-gerichteten Immunoliposomen mit aktivierten Endothelzellen unter in vitro-Bedingungen. Die aktivierten Endothelzellen repräsentieren hierbei den zellulär veränderten Zustand in einer Entzündungsphase. Die Bindungsfähigkeit als erster Schritt für ein erfolgreiches Drug Delivery System, sowie die Internalisierung der Immunoliposomen sollten quantitativ ermittelt werden. Eine sterische Stabilisierung der Liposomen durch Polyethylenglykoleinheiten sollte während dieser Arbeiten berücksichtigt werden. Durch sie können effizient die Halbwertszeiten der Liposomen und damit die von ihnen ausgehende Wirkung enorm gesteigert werden. Anschließend sollte durch die pH-Sensitivität als liposomale Eigenschaft der Freigabeprozess im Zellinneren deutlich erhöht werden. Dadurch würde der Liposomeninhalt dem Zellmetabolismus zur Verfügung stehen und somit seine Wirkung entfalten können. Stabile Vehikelsysteme würden an dieser Stelle einen Therapieverlust verursachen, da der Inhalt der internalisierten Liposomen einem Abbau durch lysosomale Enzyme unterliegen würde. Die im Zytosol freigesetzten Arzneistoffe dürfen bis zur intrazellulären Freigabe keinerlei Veränderung erfahren haben. Der Beweis dafür sollte abschließend mittels Gentransfektion der aktivierten Gefäßendothelzellen durch sterisch stabilisierte pH-sensitive Immunoliposomen erbracht werden.
Eine Umsetzung dieser Vorhaben würde die komplette Wirkung eines Drug Delivery Systems von der Anreicherung der Liposomen am Zielort bis hin zur intrazellulären Wirkung des Wirkstoffs simulieren und belegen.
2. Theoretischer Teil
2.1. Das Endothel
2.1.1. Physiologische Barriere, Transportmöglichkeiten
Das Endothel stellt die Grenzschicht zwischen Gewebe und Gefäßen dar und bildet einen geschlossenen Zellverband. Es kleidet sowohl die Blutgefäße und die Gefäße des Lymphsystems als auch die Herzinnenräume aus. Charakteristisch ist der Aufbau aus dem nur einschichtigen Oberflächenplattenepithel. Die Grenze zur Gewebeseite hin wird von einer Basalmembran gebildet. Die luminale Seite steht im ständigen Kontakt mit dem zirkulierenden Blut. Der Kontakt der Endothelzellen untereinander findet durch so genannte „junctional complexes“ statt. Hierbei unterscheidet man zwischen communicating (gap) junctions und dicht schließenden occluding (tight) junctions. Fast alle Gewebe sind von der Blutversorgung abhängig. Diese wiederum hängt von den Endothelzellen ab. Gäbe es nicht die Endothelzellen, die das Netz der Blutgefäße erweitern und aufbauen, wären Wachstum und Reparatur von Geweben unmöglich. Neben der Funktion der Versorgung der darunter-liegenden Gewebeschichten mit Nährstoffen, ist die Barrierefunktion eine weitere Hauptaufgabe des Endothels. Durch diese Zellschicht hindurch ist ein kontrollierter Transport von Stoffen aus dem Gefäß in Richtung Gewebe möglich. Der Endothelzelle stehen sowohl für Endozytoseprozesse in das Zellinnere als auch für Transzytosevorgänge durch die Zelle hindurch in tiefere Gewebeschichten verschiedenste Mechanismen und dafür notwendige Zellorganellen zur Verfügung: Caveolen (Plasmalemmavesikel), transendotheliale Kanäle, Fenestrae, interzelluläre Verbindungskomplexe (junctions) und der Apparat für die rezeptor-vermittelte Endozytose bestehend aus „clathrin-coated-pits“, „clathrin-coated-vesicles“, Endosomen, multivesikulären Körpern und Lysosomen [Simionescu et al. (1991)].
Das Gefäßendothel ist mit Kapazitäten ausgestattet, die es erlauben frei im Gefäß zirkulierende bioaktive Stoffe (Peptide, Amine, Hormone: LDL, Transferrin) in das umgebende Gewebe zu transportieren. Diese Plasmakomponenten können durch Endothel-zellen über nichtspezifische und spezifische Prozesse aufgenommen werden. Hormone, Peptide und biogene Amine interagieren mit auf der Zellmembran verankerten Rezeptoren. Endotheliale Rezeptoren sind für viele vasoaktive Stoffe (Histamin, Serotonin, Bradykinin, Leukotriene), für Lipoproteine, Insulin und Metalloproteine (Transferrin) beschrieben. Das Andocken dieser Stoffe an ihre spezifischen Rezeptoren führt zur Auslösung unterschiedlich biologischer Effekte. Die Erhöhung der Endothelpermeabilität durch Histamin beruht z.B. auf den Bindungsvorgang zwischen Ligand und Rezeptor und der damit verbundenen Zytoskelettkontraktion und Öffnung interzellulärer junctions [Heltianu et al. (1982)].
Die Ausstattung der endothelialen Zellmembran mit Rezeptoren variiert stark nach Gefäßtyp. So sind Mannoserezeptoren und Scavanger-Rezeptoren zur Endozytose polyanionischer Makromoleküle (modifiziertes LDL, Albumin) vorrangig auf dem Endothel von Lebersinusoidalzellen zu finden [Kamps et al. (1997]. Verschiedene Venenendothelzellen (HUVEC) besitzen Fc-IgG-Rezeptoren [Pan et al. (1999)]. Der endotheliale Transport von Molekülen wird durch drei verschiedene Faktoren bestimmt. Dies ist zum einen die Plasmaantriebskraft, welche das Verhältnis zwischen hydrostatischen und onkotischen Druck (durch Makromoleküle verursachter Druck auf die Kapillarwand) widerspiegelt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der permeierenden Moleküle wie z.B. Größe, Ladung, sterische Verhältnisse, chemische Struktur und Konzentration können ebenfalls den
Transport am Endothel beeinflussen. Auch zelluläre Faktoren spielen eine Rolle. So stellen der metabolische Zustand des Gefäßendothels und die Oberflächeneigenschaften der luminalen Zellmembran gleichsam wichtige Aspekte dar. Sie entscheiden mit darüber, auf welche Art und Weise und in welcher Menge der Stoff aufgenommen wird. Die Moleküle können dann entweder in die Zelle aufgenommen werden (Endozytose) bzw. durchqueren diese, um ins Interstitium zu gelangen (Transzytose). An der Transzytose beteiligte Strukturen sind Plasmalemmavesikel, die zwischen beiden Zellfronten hin und her pendeln. Weiterhin sind für Transzytoseprozesse auch Kanäle von Bedeutung, die nur kurze Lebenszeiten aufweisen und sich aus fusionierten Vehikeln gebildet haben. Innerhalb der Endozytose bestehen die am Prozess beteiligten Hauptstrukturen aus coated-pits“, „clathrin-coated-vesicles“, Endosomen (frühe, späte), multivesikulären Körpern und Lysosomen. Es kann zwischen mehreren Aufnahmemechanismen unterschieden werden. Dabei ist eine Einteilung in unspezifische und spezifische Prozesse sinnvoll. Zu den unspezifischen Mechanismen zählen Flüssigphasenendozytose, Flüssigphasentranszytose und die adsorptive Endozytose. Rezeptorvermittelte Endozytose und rezeptorvermittelte Transzytose stellen die spezifischen Internalisierungsmechanismen dar.
Die Flüssigphasenendozytose (Pinozytose) wird als Prozess beschrieben, durch den die Zelle flüssige und gelöste Stoffe aufnehmen kann. Daran sind hauptsächlich Plasmalemmavesikel beteiligt. Die so internalisierten Moleküle gelangen später zu Endosomen, multivesikulären Körpern und Lysosomen, wo sie dem weiteren Abbau unterliegen. Die Menge des aufgenommenen Stoffes hängt von der Plasmakonzentration ab. Die Beziehung zwischen Aufnahme und Plasmakonzentration beschrieb Williams an isolierten Kapillaren [Williams (1983)].
Die Flüssigphasentranszytose wird auch über Plasmalemmavesikel betrieben, wobei diese dann durch das Zytosol hindurch zur abluminalen Seite reichen und dort ihren Inhalt freigeben. Quantitativ betrachtet stellt dieser Prozess den Hauptmechanismus des trans-endothelialen Austausches dar.
Die adsorptive Endozytose als dritte Möglichkeit des unspezifischen Transports ist durch die Aufnahme von Feststoffen charakterisiert und wird häufig auch als Phagozytose bezeichnet. Die Aufnahmemenge ist auch hier von der Plasmakonzentration abhängig. Umfangreiche Partikel, z.B. Mikroorganismen und Zelltrümmer, werden durch große Endozytose-Vesikel aufgenommen, die man als Phagosomen bezeichnet. Der Durchmesser der Phagosomen wird von der Größe der aufgenommenen Partikel bestimmt. Die Phagosomen verschmelzen später mit den Lysosomen, in denen der Abbau stattfindet. Hierbei wurde auch erstmals das Auftreten früher und später Endosomen beobachtet, die auf dem Weg zum Lysosom Vorstufen darstellen [Park et al. (1988)]. Der Unterschied zur Pinozytose besteht auch in der vorherigen unspezifischen Adsorption an der Zelloberfläche, wodurch neben der Stoffkonzentration als limitierender Faktor noch die Anzahl der Bindungsstellen und die Höhe der Dissoziationskonstanten dazu kommen. Bei Protozoen dient dieser Mechanismus in erster Linie der Nahrungsaufnahme, während er in vielzelligen Organismen hauptsächlich durch spezialisierte Zellen wie z.B. Monozyten, Gewebemakrophagen oder polymorphkernige neutrophile Granulozyten (zusammengefasst: Phagozyten) erfolgt und vor allem der Infektabwehr und der Beseitigung alter Zellen bzw. ihrer Überreste dient. Die Haftung der Fremdpartikel am Phagozyten kann unspezifisch sein. Sie kann aber auch durch Rezeptoren zustande kommen. Solche Rezeptoren können z.B. den Fc-Teil von Immuno-globulinen erkennen, die im Rahmen einer Immunantwort als Antikörper an der Oberfläche von Fremdpartikeln gebunden werden. Dieses Markieren der Fremdoberfläche für die Phagozytose wird als Opsonisierung bezeichnet. Auch für Endothelzellen wird gelegentlich die Phagozytose als potentieller Aufnahmeweg beschrieben [Simionescu et al. (1991)].
Als spezifischer Prozess ist die rezeptorvermittelte Endozytose bekannt. Dabei kommt es nur zur Aufnahme von Stoffen, die spezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche der
luminalen Seite besitzen. Diese Rezeptoren bzw. „specific binding sites“ (SBS) existieren für verschiedene Plasmabestandteile wie z.B. vasoaktive Stoffe, Hormone, Antikoagulantien, Prokoagulantien, fibrinolytische Faktoren und Lipoproteine (LDL). Die Plasmamembran-Rezeptoren sammeln sich in kleinen Einbuchtungen auf der Zelloberfläche. Mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen konnte an diesen Stellen auf der zytoplasmatischen Seite ein Proteinsaum gezeigt werden. Der Stachelsaum besteht aus dem Protein Clathrin. In diesen spezialisierten Bereichen der Plasmamembran, den Clathrin-coated Pits beginnt der endozytotische Zyklusteil. Die Hauptproteinkomponente eines Clathrin-coated Pits ist Clathrin selbst. Der Proteinkomplex besteht aus drei großen (schweren) und drei kleinen (leichten) Polypeptidketten, die zusammen eine dreibeinige Struktur aufweisen. Diese Form wird auch als ein Clathrin-Triskelion bezeichnet und besitzt die Gestalt eines Mercedes-Sternes. Clathrin-Triskelions lagern sich zu einem käfigähnlichen, konvexen Netz aus Fünf- und Sechsecken zusammen und bilden so auf den dem Zytoplasma zugewandten Membran-oberflächen „coated pits“. Sie nehmen in der Regel 2% der Gesamtoberfläche der Plasmamembran ein. Die Clathrin-coated Pits besitzen nur eine kurze Lebensdauer. Vom Augenblick ihrer Entstehung bis zur typischen Einstülpung vergehen nur wenige Minuten. Auf der Außenseite der Membran befinden sich an den Einstülpungen die Rezeptoren für spezifische Makromoleküle in angereicherter Form. Die Moleküle binden an komplementären Zelloberflächenrezeptoren, sammeln sich in Coated Pits und gelangen als „Rezeptor-Makromolekül-Komplexe“ in den clathrinbedeckten Vehikeln in die Zelle.
Durch die rezeptorvermittelte Endozytose werden bestimmte Moleküle selektiv angereichert. Daher steigert sie auch den Wirkungsgrad, mit der einzelne Liganden aufgenommen werden können um das bis zu das 1000-fache. Die Hülle der Clathrin-coated Pits besteht neben Clathrin zusätzlich noch aus Adaptin. Dieses zweitwichtigste Hüllprotein setzt sich aus mehreren Untereinheiten zusammen. Es liefert die mechanische Kraft, die die Membran in eine „Knospe“ zieht (Einstülpung) und ist hauptsächlich am Erkennungsvorgang spezifischer Transmembranproteine und der Verknüpfung dieser mit dem „Clathrin-Käfig“ beteiligt. Die Adaptine binden sozusagen von innen die „Clathrin-Triskelions“ und nach außen die Frachtrezeptoren mit ihren entsprechenden Liganden (Cholersterol, Transferrin etc.). Nach der Einstülpung (Knospung) der Coated pits kommt es zur Vesikelbildung und der Entstehung der Coated Vesicles. Diese Stachelsaumbläschen verlieren nach wenigen Sekunden ihre Beschichtung. Der Hüllenzerfall bzw. Häutungsmechanismus ist noch nicht vollends aufgeklärt. Bewiesen ist bisher nur, dass die Auflösung der Clathrinschicht unter ATP-Verbrauch durch ein konstitutives Hitzeschockprotein geschieht. Dieses Protein arbeitet als eine „Belag-ablösende ATP-ase“. Die Vesikel fusionieren mit Endosomen und stellen die so genannten frühen Endosomen dar. Im sauren Milieu eines frühen Endosoms verändern viele der aufgenommenen Rezeptorproteine ihre Konformation und lassen dadurch ihre Liganden frei. Die meisten Rezeptoren dissoziieren danach ab und kehren zur selben Plasmamembran-Domäne zurück (z.B. LDL-Rezeptoren). Andere Rezeptortypen werden aber auch über späte Endosomen zu den Lysosomen transportiert und dort mit dem Vesikelinhalt abgebaut. Dies ist z.B. beim Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) der Fall. Eine EGF-Bindung führt deshalb zur Abnahme der Anzahl der EGF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Diesen Vorgang bezeichnet man als Rezeptor-Herunterregelung. Hier reguliert die Konzentration des signalauslösenden Liganden in der extrazellulären Flüssigkeit die Zahl der zugehörigen Rezeptormoleküle auf der Oberfläche der Zielzelle.
Die Beziehung zwischen frühen bzw. späten Endosomen und Lysosomen ist unsicher. Festgestellt werden konnten jedoch unterschiedliche pH-Werte innerhalb dieser Kompartimente. In frühen Endosomen, die knapp unter der Plasmamembran liegen, beträgt der pH-Wert ca. 6,0. In Markierungsexperimenten mit Meerrettich-Peroxidase [Machy et al. (1987), Derksen et al. (1987)] bzw. Ferritin [Trudel et al. (1985), Vargas et al. (1990)] konnte
ein Zeitabstand von knapp 5 Minuten bestimmt werden, der zwischen Inkubation und Auftreten der Indikatoren in frühen Endosomen lag.
Der Transport von den frühen zu den späten Endosomen wird von endosomalen Carrier-vehikeln vermittelt, die große Mengen eingestülpter Membran beinhalten. Man ist sich bisher nicht sicher, ob man diese multivesikulären Körper als mittelalte Endosomen, die während ihrer Reifung zum Zellinneren hin wandern, oder als getrennte Transport-Kompartimente betrachten soll. Als gesichert gilt, dass dieser Transport entlang der Mikrotubuli verläuft und einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten nach Adsorption in Anspruch nehmen kann. Die späten Endosomen fusionieren nach zusätzlicher Ansäuerung auf einen pH-Wert von 5,0 mit Hydrolase gefüllten Transportvehikeln des trans-Golgi-Netzes und stellen die Lysosomen dar. In ihnen findet die kontrollierte intrazelluläre Verdauung von Makromolekülen statt. Lysosomen enthalten ca. 40 verschiedene Arten hydrolysierender Enzyme, darunter Proteasen, Glykosidasen, Lipasen und Phosphatasen. Sie gehören alle zu der Gruppe der sauren Hydrolasen. Ihr Aktivitätsoptimum ist in saurer Umgebung erreicht. Membranständige ATP-betriebene Protonenpumpen sorgen für den entsprechenden Gradienten zwischen Endosom und Zytosol bzw. Lysosom und Zytosol.
Als rezeptorvermittelte Transzytose bezeichnet man den Prozess, in welchem spezi-fische Rezeptoren auf der Oberfläche von Epithelzellen spezispezi-fische Makromoleküle von einem extrazellulären Raum zum anderen transportieren. Die Rezeptoren haben die Eigen-schaft, dass der normale Endozytosezyklus auf der Ebene der frühen Endosomen abgebrochen wird. Die Rezeptor-Ligand-Komplexe bleiben intakt und werden in Transportvehikeln verpackt, die sich von frühen Endosomen abschnüren. Diese bewegen sich dann in die Nähe der basolateralen Plasmamembran. Dort verschmelzen sie mit einer basolateralen Domäne der dortigen Plasmamembran und geben so den Inhalt auf der gegenüberliegenden Seite frei.
2.1.2. Besonderheiten im Entzündungsprozess
Im Rahmen einer Entzündung kommt es am Endothel zu verschiedensten morphologischen Veränderungen. Zellschädigungen finden immer im Gewebeverband statt und sind daher mit einer Vielzahl von Reaktionen verbunden. Diese Prozesse werden durch Mediatoren gesteuert, die entweder aus den Speichergranula bestimmter Zellen freigesetzt bzw. neu synthetisiert werden. Stoffe wie z.B. Stickstoffmonoxid und Bradykinin führen als vasoaktive Substanzen zur Relaxation glatter Muskelzellen in den Gefäßen. Es resultiert eine Vasodilatation der Gefäße. Die physiologische Autoregulation verursacht eine verstärkte Mikrozirkulation der Kapillaren. Auf Dauer führt die Vasodilatation aber zu einer Abnahme der Strömungsgeschwindigkeit des Blutes (Stase).
Der Vasodilatation zeitlich nachgeordnet kommt es dann zum Austritt von Plasma und höhermolekularen Stoffen, wie Proteinen in das Interstitium, was sich in einer Schwellung der betroffenen Bereiche äußert. Ursache ist die Entstehung von Lücken (gaps) zwischen den Endothelzellen infolge Kontraktion dieser Zellen unter Mitwirkung von Aktin- und Myosinfilamenten. Diese sind mit den Zell-Zell-Verbindungen (junctions) eng assoziiert [Schmittler et al. (1990)]. Ort des ersten Plasmaaustritts sind Venolen. Mit steigender Reizintensität sind aber auch Kapillaren und Arteriolen betroffen. Ein typischer Mediator, der die Gefäßpermeabilität direkt steigert, ist Histamin. Dieses biogene Amin befindet sich in Speichergranula von Mastzellen, die im lockeren Bindegewebe um kleine Gefäße herum angeordnet sind und übt seine Wirkung über membranäre Rezeptoren aus [Heltianu et al. (1982)]. Leukotrien B4 ist ein weiterer Mediatorstoff bei Entzündungsreaktionen, der die Permeabilität der Kapillaren steigern kann. Die Ödembildung wurde schon von Celsus als eines der fünf Kardinalsymptome der Entzündung beschrieben.
Der Exsudatphase in den kleinen Gefäßen mit Vasodilatation und Zunahme der Gefäß-permeabilität folgt die Infiltrationsphase mit der Einwanderung weißer Blutzellen. Infolge der Freisetzung chemotaktisch wirksamer Stoffe im entzündeten Gewebe akkumulieren dabei zunächst neutrophile Granulozyten und später Monozyten innerhalb der Kapillaren des geschädigten Gebietes und adhärieren an den Endothelzellen der Gefäßwand. Dieser Vorgang wird als Margination bezeichnet. Durch die Wirkung der freien Mediatoren kommt es zusätzlich zu einer Verlangsamung des Blutstromes durch Querschnittsvergrößerung der Gefäße nach Vasodilatation. Weiterhin wird die Fließgeschwindigkeit durch eine Viskositäts-zunahme des Blutes infolge des erhöhten Abstroms von intravasaler Flüssigkeit in den extravasalen Raum gesenkt. Durch die verlangsamte Fließbewegung gelangen vermehrt Granulozyten in den Bereich des Randstromes. Dieser Vorgang ist eine Sonderform und wird als hydrodynamische Margination bezeichnet. Die Granulozyten kommen dabei häufiger in Kontakt mit den Endothelzellen, die die Gefäße auskleiden.
Im Zuge einer Schädigung wird vom Endothel die Einwanderung von Granulozyten in den Entzündungsherd gefördert. Chemotaktische Stoffe sind in diesem Fall für das gezielte Heranführen von Entzündungszellen an den geschädigten Gewebebezirk verantwortlich. Hierzu zählen Faktoren des Komplementsystems (C3a, C5a) und Sekretionsprodukte norma-ler und geschädigter Zellen, sowie bakterielle Peptide. Weiterhin werden von den aktivierten Endothelzellen auch verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren abgegeben, wodurch erneut Makrophagen stimuliert werden. Durch Chemotaxis in das entzündete Gebiet gelockte Granulozyten und Makrophagen nehmen vermehrt Zelltrümmer und Fremdpartikel durch Phagozytose in den Intrazellularraum auf und bauen sie durch lysosomale Enzyme ab. Durch vorherige Opsonisierung der Bakterien, Zelltrümmer und Fremdpartikel kann die Phagozy-toseaktivität der Phagozyten gesteigert werden. Zu den so genannten Opsoninen zählen einige Faktoren des Komplementsystems (C3b), das C-reaktive Protein und an Zellen gebundenes IgG. Als Folge entzündlicher Prozesse werden auf der Endotheloberfläche vermehrt Adhä-sionsmoleküle exprimiert. Diese können mit Membranproteinen der Leukozyten reagieren und für diese als Leit- und Erkennungsstrukturen dienen. Man kennt drei große Familien von beteiligten Adhäsionsmolekülen. Dieses sind Selektine, Integrine und Adhäsine der Immun-globulin-Superfamilie. Die Leukozyten wandern durch die Endothellücken unter partieller Auflösung der Basalmembran in das Interstitium. Der Prozess wird als Diapedese bezeichnet.
Die Selektine sind für den ersten Schritt der Wanderung von weißen Blutzellen, also das primäre Anhaften an der Gefäßwand verantwortlich. Nachfolgend bewirken Integrine eine stabile Adhäsion. Durch PECAM wird anschließend die eigentliche Transmigration durch kleine Lücken zwischen den Endothelzellen vermittelt. Der gesamte Prozess beginnend mit der verlangsamten Bewegung der Leukozyten, über die feste Anhaftung an der Gefäßwand bis hin zur Migration wird als Adhäsionskaskade der Leukozyten bezeichnet. Der Hintergrund dieser Prozesse, sowie die herausragende Stellung der Selektine als Targetstruktur im Rahmen einer antiinflammatorischen Therapie sollen im nächsten Kapitel beschrieben werden.
2.2. Selektine als Targetstruktur
2.2.1. Adhäsionskaskade der Leukozyten
Die zelluläre Immunabwehr während einer Entzündung geht immer mit einer Aktivierung und Mobilisierung phagozytosebefähigter Leukozyten (neutrophile Granulozyten und Monozyten), sowie deren Infiltration in das betroffene Gebiet einher. Die Extravasation
2.2. Selektine als Targetstruktur 14 findet dabei hauptsächlich in kleinen venösen Gefäßen, den postkapillaren Venolen statt. Voraussetzung für die Extravasation der Leukozyten ist deren rezeptorvermittelte Adhäsion an der Gefäßwand, die als Adhäsionskaskade bezeichnet wird [Springer (1995)]. Der Prozess wird von einer Vielzahl von Zelladhäsionsmolekülen (CAM´s) vermittelt und setzt sich aus drei großen Teilabschnitten zusammen. Nach einer initialen Kontaktaufnahme zwischen fließenden Leukozyten und den Endothelzellen der Gefäßwand, dem sog. Tethering, findet ein Prozess des Zellrollens entlang des Endothels statt. Aus dieser Rollbewegung heraus entwickelt sich später eine feste Adhäsion der Leukozyten am Endothel. Die Prozesse des Tetherings und der festen Adhäsion sind Voraussetzungen für das Stattfinden der abschlie-ßenden Emigration der Leukozyten in subendotheliales Gewebe. Die Rezeptoren der Zelladhäsionsmoleküle können im Rahmen der Kaskade entweder von den beteiligten Endothelzellen bzw. von den Entzündungszellen exprimiert werden. Sie gehören zu den Rezeptorfamilien der Selektine (E-, L-, P-Selektin), der Integrine (z.B. LFA-1, MAC-1) und der Immunglobulinsuperfamilie (z.B. ICAM-1 und PECAM-1).
In der Abbildung 1 sind die Teilschritte der Adhäsionskaskade dargestellt:
Feste
Adhäsion
Initialer Kontakt
Tethering und Rollen
Emigration
P-Selektin Neutrophile Granulozyten ESL-1 Mucin -Ligand L-Selektin PSGL-1 -E-Selektin Endothelzelle PECAM-1 -ICAM-1 MAC-1 LFA-1Abb. 1: Ablauf der rezeptorgesteuerten Leukozytenadhäsion am Endothel und der Leukozytenemigration unter Entzündungsbedingungen
Obwohl die Akkumulation der Leukozyten schon vor 100 Jahren mit Hilfe intra-vitalmikroskopischer Experimente betrachtet werden konnte [Cohnhein (1889)], kam es erst in den 90er Jahren durch Entdeckung der Rezeptoren der Selektinfamilie zur Aufklärung der molekularbiologischen Prozesse innerhalb der Adhäsionskaskade. In der Frühphase der Entzündungsreaktion kommt es zu der erwähnten Freisetzung von verschiedenen Entzündungsmediatoren. Diese können einerseits zur Gefäßdilatation führen (Histamin, Bradykinin, Stickstoffmonoxid) anderseits aber auch die Expression der Adhäsionsrezeptoren auf der Endotheloberfläche einleiten (Interleukin-1). Der initiale Kontakt der fließenden Leukozyten mit der Gefäßwand ist Voraussetzung für den ersten Teilprozess der Adhäsionskaskade, der auch als Tethering bezeichnet wird. Die Blutzellen besitzen zu diesem Zeitpunkt noch eine Fließgeschwindigkeit von 2 mm/sec. Anschließend kommt es durch die
Ausbildung schwach affiner Bindungen zu Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Rezeptoren der Endothelzellen der Gefäße. Dies führt zu einer verlangsamten Bewegung der Blutzellen am Endothel, wobei Geschwindigkeiten von 20µm/sec. auftreten. Das Tethering und der erwähnte Rollprozess werden von der Rezeptorfamilie der Selektine gesteuert. Die Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptoren sind hierbei so schwach, dass ein ständiges Abreißen und Neubilden von Bindungsprozessen zu beobachten ist. Ein festes Anhaften der Leukozyten am Endothel findet in dieser Phase noch nicht statt.
Die verlangsamten Leukozyten werden in einer zweiten Phase durch den Einfluss endothelialer Mediatoren (Chemokine, PAF) in einen aktivierten Zustand versetzt [Zimmermann et al. (1997)]. In Folge dessen kommt es zur verstärkten Aktivierung von Integrinen auf der Oberfläche der Leukozyten. Sie bewirken die feste Adhäsion und Extravasation der Leukozyten im Rahmen der Adhäsionskaskade. Zu den Integrinen gehören z.B. LFA-1 und MAC-1. Sie kommen auf den meisten Leukozyten-Subtypen vor und sind Dimere mit identischen β-Ketten und unterschiedlichen (aber Homologien aufweisenden) α-Ketten. Die wichtigsten Liganden der Integrine sind die Intercellular Adhesion Molecules (ICAM) auf den Endothelzellen. Sie können wie ICAM-2 und ICAM-3 konstitutiv vorhanden sein, bzw. wie ICAM-1 durch Zytokine (Interleukin-1, Tumor-Nekrose-Faktor) in ihrer Expression aktiviert werden [Arnaout et al. (1988)]. Durch die Bindung der aktivierten Integrine an ihre endothelialen Rezeptoren wird eine feste Adhäsion der zuvor abgebremsten, rollenden Leukozyten am Endothel vermittelt. Die Leukozyten flachen daraufhin ab, wodurch die resultierende Vergrößerung der Kontaktfläche eine weitere Bindungsverstärkung verursacht. Der nun folgende Prozess der Leukozytenextravasation ins subendotheliale Gewebe wird wiederum durch Integrin-Ligand-Wechselwirkungen gesteuert [Smith et al. (1989)]. Die Endothelzellen besitzen durch homogene Bindungen von „Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecules“ (PECAM) interzelluläre Kontakte. Durch Bindung der leukozytären Integrine an diese Rezeptoren werden die homogenen PECAM-Bindungen gelöst, was sich im Auftreten interzellulärer Zwischenräume äußert. Durch diese Zwischenräume können anschließend die Leukozyten integrinvermittelt hindurchwandern.
Die Immunabwehr als Zeichen einer Entzündungsreaktion ist von den komplexen und ineinander greifenden Adhäsionsprozessen der Selektine und Integrine abhängig. Die universelle Bedeutung dieser Proteine für die Initiierung der Immunabwehr konnte in vielen in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen nachgewiesen werden [Lasky (1995)]. Dabei wird klar, dass ein funktioneller Ausfall einzelner Schritte der Adhäsionskaskade zu einer Störung der Leukozytenextravasation und damit zu einer verminderten Immunabwehr führt. Bei der Leukozyten-Adhäsions-Defizienz II (LAD II) handelt es sich um einen bis vor kurzem noch ungeklärten Gendefekt. Durch Mutationen im Kohlenhydrat-Stoffwechsel können keine funktionsfähigen Selektinliganden gebildet werden [Etzioni et al. (1997)]. Diese Krankheit prägt sich auf Grund des Fehlens von Selektinliganden als Immundefizienz aus. Die betroffenen Personen leiden trotz dramatischer Anstiege ihrer Leukozytenzahlen im Blut ständig an Infektionen und Fieberschüben. Außer bei diesem Defekt findet eine stark verminderte Chemotaxis auch bei einem erworbenen Mangel an sekundärer Granula innerhalb der Entzündungszellen statt (Verbrennungen). Während das Integrin LFA-1 offenbar nur in der Plasmamembran vorkommt, sind MAC-1 und p150,95 nämlich zusätzlich noch in weit höherer Dichte in den Membranen der intrazellulären sekundären Granula der Leukozyten lokalisiert. Bei großflächigen Verbrennungen können diese Speicherorte zerstört werden, was sich wiederum in einer fehlenden Emigration von Entzündungszellen innerhalb der notwendigen Immunabwehr äußert.
Da die Rezeptorfamilie der Selektine vorrangig am Prozess der entzündungsbedingten Leukozyten-Endothel-Wechselwirkung beteiligt ist und im Rahmen einer Entzündungsreaktion zur Expression gebracht wird, stellt sie durch ihre initiale Rolle
innerhalb der Adhäsionskaskade einen Erfolg versprechenden Angriffspunkt für eine antiinflammatorische Therapie dar.
2.2.2. Expression der Selektine
Bei den Selektinen handelt es sich um lang gestreckte membrangebundene Glykoproteine. Entsprechend ihrer Ursprungszellen werden sie in E-Selektin (Endothelzellen), L-Selektin (Leukozyten) und P-Selektin (Plättchen und Endothelzellen) eingeteilt. Die Bezeichnung Selektin leitet sich von „Lektin“ ab. Lektin steht als eine Art Sammelbezeichnung für alle kohlenhydratbindenden Proteine. Die drei Selektine haben eine homologe Struktur und bestehen aus 5 Domänen. Einem kleinen C-terminalen zytoplasmatischen Rest folgt eine transmembranäre Domäne. Die extrazelluläre Ausdehnung wird durch eine bei den einzelnen Selektinen unterschiedliche Anzahl von „short consensus repeats“ geprägt, die nachfolgend der transmembranären Domäne angeschlossen sind. Im Anschluss daran folgt eine dem „Epidermalen Wachstumsfaktor“ (EGF) ähnliche Domäne. Sie unterstützt durch Konformationsänderung des Rezeptors die Liganderkennung und Ligandbindung der nachfolgenden Lektin-Domäne. Diese befindet sich als abschließende Domäne am N-Terminus und stellt die eigentliche Kohlenhydrat-Bindungsstelle dar. Trotz ihrer strukturellen Homologien weisen die drei Selektine im Rahmen ihrer Aktivierung, Expression und Teilaufgaben im Bindungsvorgang große Differenzen auf.
L-Selektin kommt konstitutiv auf fast allen Leukozyten-Subtypen vor. Für eine bessere Zugänglichkeit befindet es sich auf den Mikrovilli der Entzündungszellen [Bruehl et al. (1996)]. Die exponierte Lage ermöglicht später trotz der relativ kleinen Molekülstruktur einen erleichterten Kontakt mit den verschiedenen Endothelliganden sog. Mucin-Liganden (GlyCAM-1= Glycosilation-dependent cell adhesion molecule-1 und MadCAM-1= Mucosal addressin cell adhesion molecule-1). Die L-Selektineinheiten werden wenige Minuten nach der Aktivierung der Leukozyten von der Zelloberfläche proteolytisch abgespalten. Der zugrunde liegende Mechanismus für diesen als „Shedding“ beschriebenen Prozess ist noch nicht aufgeklärt. Es wird aber von einer aktivierungs- und adhäsionsmodulierenden Funktion ausgegangen [Baca et al. (1997)]. Innerhalb der letzten beiden Jahre konnte jedoch die Abspaltung näher charakterisiert werden. Eine Metalloprotease ist für diesen Vorgang verantwortlich. Deren Aktivität wiederum wird durch intrazelluläre Signalwege reguliert, die Tyrosinkinaseabhängigkeiten aufweisen. Der gesamte Prozess findet außerdem nur an solchen L-Selektinen statt, die innerhalb der Membran als Cluster vorliegen [Phong et al. (2003)].
P-Selektin befindet sich in funktionsfähiger Form in speziellen Speichergranula der Zellen (Weibel-Palade-bodies der Endothelzellen und α-Granula der Thrombozyten) [Bonfanti et al. (1989)]. Nach anfänglicher Stimulation der Zellen mit Entzündungsmediatoren (Histamin, Thrombin) gelangt das P-Selektin innerhalb von 10 Minuten aus diesen Depots an die Zelloberfläche. Des Weiteren wird P-Selektin nach Zellaktivierung durch Zytokine oder Lipopolysaccharide (LPS) neu synthetisiert [McEver (1997)]. Als korrespondierender P-Selektin-Ligand auf den Leukozyten fungiert PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1). Nach Exprimierung des P-Selektins auf der Zelloberfläche wird es durch Endozytose über Clathrin-coated Pits in die Speicher zurückgeführt bzw. lysosomal abgebaut. [Setiadi et al. 1995)].
E-Selektin wird ausschließlich von den Endothelzellen nach Aktivierung mit Zytokinen, insbesondere Interleukin-1β und TNF-α exprimiert. Da dieses Glykoprotein immer wieder neu hergestellt werden muss, erfolgt die Exprimierung zur Präsentation des P-Selektins zeitlich versetzt. Die Konzentration des E-Selektins auf der Endothelzelloberfläche erreicht
deshalb erst nach vier bis acht Stunden ihr Maximum und geht innerhalb der nächsten 24 Stunden auf ihr Ausgangsniveau zurück [Bevilaqua et al. (1989)]. E-Selektin wird durch die Liganden ESL-1 (E-selectin ligand-1) und PSGL-1 auf den Leukozyten erkannt. Höchste Expressionslevel der Gene für E- und P-Selektin werden durch die Steuerung über den Transkriptionsfaktor NF-κB erzielt [Collins et al. (1995)]. Dieser wird von reaktiven Sauerstoffspezies aktiviert, die in normalen Zellen durch eine Vielzahl von Radikalfängern unterdrückt werden [Rünegeler et al. (1999)]. Diese Abhängigkeit zeigt, dass oxidativer Stress innerhalb der Endothelzellen zu einer verstärkten Exprimierung von Selektinen führt. Auch E-Selektin wird nach Aktivierung endozytotisch von der Zelloberfläche entfernt und im Lysosom abgebaut.
Die Abhängigkeit der Selektinexpression durch Entzündungsmediatoren steuert somit Dauer und Intensität des Leukozytenrollens. Gleichzeitig werden den Selektin-Subtypen dadurch unterschiedliche Funktionen zugeordnet. Das P-Selektin mit seiner lang gestreckten Struktur und das räumlich sehr exponierte L-Selektin auf den Mikrovilli der Leukozyten vermitteln in der Frühphase der Entzündung das Zellrollen. Durch die entsprechende de-novo-Synthese nach Aktivierung ist das E-Selektin für die Überleitung zur festen Adhäsion der Leukozyten an der Gefäßwand verantwortlich. Die Selektine sind demnach an einer sehr frühen Phase der Entzündung beteiligt. Ihr lokales und speziell beim E-Selektin temporäres Auftreten innerhalb der Adhäsionskaskade der Leukozyten macht sie zu interessanten Zielstrukturen in der antiinflammatorischen Therapie. Im Rahmen vielfältiger Untersuchungen konnten diese Aussagen erhärtet werden (selektindefiziente Mäuse, Bindungsexperimente mit Selektinen innerhalb künstlicher Membranen).
Für die Selektine sind bisher nur einzelne hoch affine Liganden bekannt. Es sind lang gestreckte Glykoproteine, an deren Proteingrundgerüst eine Vielzahl von Kohlenhydratseiten-ketten als Bindungsepitope glykosidisch verknüpft ist. Das so vermittelte Zellrollen entsteht durch Ausbildung und Dissoziation der Rezeptorbindungsstellen mit den hoch flexiblen Liganden. Bei den Kohlenhydrat-Bindungsepitopen handelt es sich um „N-Acetyl-laktosamin“-basierende Oligosaccharide. Sie sind in einer speziellen Art und Weise mit Fucose und einer Sialinsäure verknüpft. Eine große Bedeutung als Bindungsepitop besitzt das Tetrasaccharid Sialyl LewisX (sLeX). Es besteht aus Sialinsäure, Galaktose, Fucose und Glucosamin, wobei die Lektin-Domäne des Selektins mit der Carboxylgruppe der Sialinsäure und über Ca2+ mit den OH-Gruppen der Fucose in Wechselwirkung tritt [Patel et al. (1994)]. Im Rahmen von Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass nach Zugabe von mono-klonalen sLeX-gerichteten Antikörpern, die adhäsionsvermittelte Bedeutung aller drei Selektine deutlich nachließ [Phillips et al. (1990)]. Trotz der relativ niedrigen Bindungsaffinität zwischen den Selektinen und sLeX (1mM) konnten bisher keine besseren Bindungsepitope gefunden werden. Die ermittelte hohe Bindungsstärke zu den natürlichen Mucinliganden (100nM) kann bis heute strukturell nicht erklärt werden. Vor diesem Hintergrund wurde das sLeX als Standardligand bei der Suche nach Selektininhibitoren herangezogen.
Eine lokal überschießende Leukozytenansammlung kann zur Pathogenese der Entzündung beitragen. Eine Dysregulation der Selektine wurde beispielsweise bei entzündlichen Erkrankungen wie der myokardialen Ischämie (verstärkte P-Selektin-Expression) oder der rheumatoiden Arthritis (verstärkte E-Selektin-P-Selektin-Expression) beobachtet. Im Rahmen der Reperfusionsmaßnahmen als Sofortmaßnahme bei der myokardialen Ischämie kommt es häufig zu akuten Entzündungen infolge einer Leukozytenanreicherung in den zuvor verschlossenen Gefäßen. Es konnte gezeigt werden, dass in diesen Endothelzellen durch freie Sauerstoffradikale verstärkt P-Selektin exprimiert wird. Weiterhin werden diese Selektine durch Einwirkung der Radikale auch verzögert abgebaut [Weyrich et al. (1993)]. Des Weiteren besitzen die Selektine bei der Atherosklerose, die als entzündlich fibrotische
Antwort auf die Akkumulation von cholesterolhaltigen Lipoproteinen in der Gefäßwand anzusehen ist, eine wichtige Rolle [Vora et al. (1997)]. Bei Patienten mit tiefen Venenthrombosen werden erhöhte Spiegel an löslichem P-Selektin gefunden. Im Rahmen neuerer Untersuchungen am Rattenmodell konnte eine Abnahme der Häufigkeit dieser Gefäßverschlüsse nach vorheriger Inhibierung von P-Selektin gezeigt werden [Thanaporn et al. (2003)]. Bei Knieoperationen konnte P-Selektin als Marker für das Risiko von tiefen Venenthrombosen eingesetzt werden. Radiologisch detektierte Venenthrombosen gehen eng mit einer erhöhten Anzahl an aktivierten Plättchen einher. Diagnostische Untersuchungen an Patienten, die kurz zuvor ein künstliches Kniegelenk erhielten, konnten dies bestätigen [Yang et al. (2002)]. Selektine sind weiterhin auch an diabetischen Gefäßschäden (Angiopathie) beteiligt. Durch die dauerhaft erhöhten Glukosekonzentrationen kommt es innerhalb der Endothelzellen zu oxidativem Stress. Dieser führt zur verstärkten Exprimierung von E-Selektin. Dadurch werden vermehrt Monozyten und andere Entzündungszellen in diese Regionen transportiert, die im Rahmen der Adhäsionskaskade dort binden und emigrieren. Im molekularen Mechanismus spielen hier vorrangig sog. „Advanced Glycation Endproducts“ (AGE) eine Rolle. Diese Moleküle entstehen bei der Reaktion zwischen Glukose und den Aminogruppen von Proteinen. Je höher die Konzentration an freier Glukose ist, desto stärker finden diese Nebenreaktionen statt. AGE´s binden an spezielle Oberflächenrezeptoren und aktivieren dadurch den Transkriptionsfaktor κB. Die vermehrte Bildung von Selektinen ist die Folge dieser Prozesse [Morigi et al. (1998)]. Des Weiteren vermitteln die Selektine auch die Bindung metastasierender Krebszellen aus dem Blutstrom an das Gefäßendothel mit anschließender Invasion in subendotheliale Bereiche [Biancone et al (1996)].
Die nachgewiesene Beteiligung der Selektine an der Entstehung verschiedener entzündlicher Prozesse lässt die gezielte Beeinflussung der Selektine als hoffnungsvollen Ansatzpunkt für eine neuartige antiinflammatorische Therapie erscheinen. Wegen ihrer zentralen Rolle im Entzündungsgeschehen stellen sie bei der Suche nach modernen Antiphlogistika attraktive Targetstrukturen dar. Im Gegensatz zur bisherigen sympto-matischen Therapie könnte dadurch erstmals ein kausaler Angriff erfolgen. Prinzipiell ergeben sich mehrere Möglichkeiten für den antiinflammatorischen Ansatz auf Selektinbasis. Die direkte Inhibierung der Selektinfunktion ist durch den Einsatz von Anti-Selektin-Antikörpern möglich. So gelang es bisher mit Anti-P- und Anti-L-Selektin-Anti-Selektin-Antikörpern im Tierversuch eine protektive Wirkung bezüglich Ischämie und Reperfusionsverletzung mit Neutrophilenakkumulation am Myokard nachzuweisen. Weiterhin konnte durch den Einsatz monoklonaler Antikörpern gegen E- und L-Selektin die bedrohliche Leukozyteninfiltration nach Herztransplantationen enorm reduziert werden [Carter et al. (2002)]. Die Inhibierung der Selektine mit spezifischen Antikörpern wurde u. a. auch von Elangham et al. untersucht, und dabei beobachtet, dass Anti-E-Selektin-Antikörper erfolgreich die Akkumulation von Neutrophilen in hypersensitivierter Primatenhaut inhibieren können [Elangham et al. (1997)].
Ein weiterer Ansatzpunkt wäre der Einsatz von kompetitiv wirkenden löslichen Selektininhibitoren. Bei der Suche nach neuen Inhibitoren gilt sLeX immer noch als Leitstruktur. Dabei werden durch Reduktion und Modifikation der räumlichen Molekülstruktur neue Formen erhalten, die vereinzelt bessere Bindungsaffinitäten aufweisen [Ohmoto et al (1996)]. Als Nachteil beim Vergleich vieler neuer Selektininhibitoren kommt hinzu, dass die unterschiedlichen Testsysteme einzelner Arbeitsgruppen nur geringfügig vergleichende Aussagen zulassen. Als aussichtsreiche Klasse konnte innerhalb der Arbeitsgruppe um Bendas sulfatierte heparinoide Verbindungen als Inhibitoren ermittelt werden [Höpfner et al. (2003)]. Bisher befindet sich aber lediglich eine einzige Struktur in der klinischen Testung. Die Substanz TBC 12-69 (Revotar AG) befindet sich in der klinischen Testung Phase II zur Therapie des Asthma Bronchiale bzw. der Psoriasis [Aydt et al. (2003)].
Eine ganz neue Möglichkeit ergäbe sich, wenn Selektine als molekulare Ziele im Sinne eines ortsspezifischen Drug Delivery benutzt werden würden. Der große Vorteil der P- und
Selektine besteht in der direkten Bindung an den Entzündungsort. Im Gegensatz zu anderen Adhäsionsrezeptoren weisen sie unter physiologischen Bedingungen keinen Grundlevel im Expressionsverhalten auf. Sie besitzen somit ideale Voraussetzungen für die gezielte Beeinflussung des Entzündungsgeschehens mit hoher Spezifität. Vorteilhaft ist auch, dass die Vehikel für ein Erreichen des Zielortes das Gefäßsystem nicht verlassen müssen. Der Einsatz selektingerichteter Liposomen würde eine Kombination der positiven Transporteigenschaften der Liposomen mit den hervorragenden Targeteigenschaften der vaskulären Selektine bedeuten. Durch die längere Aktivität gegenüber P-Selektin erscheint das E-Selektin als die am besten geeignete Zielstruktur für ein antiinflammatorisches Drug Targeting. Durch die spezifisch zum Entzündungsort transportierten Liposomen könnten direkt im Entzündungs-herd Arzneistoffe in hochkonzentrierter Form zur Verfügung stehen.
2.3. Liposomales Targeting
2.3.1. Liposomen als Arzneistoffträger
Neue Herausforderungen innerhalb der Therapie von bisher nur unzureichend bzw. nicht therapierbaren Krankheitsbildern treibt die Entwicklung neuer Arzneistoffe und neuer Arzneimittelträgersysteme ständig voran. Letzteres besitzt als Zielvorstellung, dass die Wirkstoffe direkt zu ihrem Wirkort transportiert werden. Sog. zielgerichtete Drug Delivery Systeme erfüllen diese Anforderungen [Forssen et al. (1998)]. Ortsspezifisches Targeting kann dabei als spezifisch entweder für ein Organ oder ein Gewebe, eine bestimmte Zelle oder auch ein intrazelluläres Kompartiment definiert werden. Damit kann die therapeutische Effizienz erhöht und die Beeinflussung gesunder Zellen und damit die Entstehung unerwünschter Nebenwirkungen reduziert werden. Schon Anfang unseres Jahrhunderts wurde die Idee des gezielten Arzneistofftransports als „Konzept der magischen Kugeln“ von Paul Ehrlich vorgestellt. Er erkannte schon 1906 das enorme Potential dieses Konzeptes [Ehrlich,P. (1906)]. Trotz der enormen Entwicklung in den Bereichen Molekulargenetik, Immunologie und Zellbiologie konnten bisher nur wenige Lösungsansätze für ein erfolgreiches Drug Targeting gezeigt werden.
Die Verwendung der von Bangham in den 60er Jahren entdeckten Liposomen als Transportsysteme im Rahmen eines Drug Delivery Systems wurde in den frühen 70er Jahren von Gregoriadis vorgeschlagen [Bangham et al. (1965), Gregoriadis,G. (1976)]. Liposomen, die aufgrund ihrer Phospholipidbilayerstruktur den natürlichen Zellmembranen sehr ähnlich sind, können als Modell für Zellmembranuntersuchungen genutzt werden. Die Vesikel aus konzentrisch angeordneten Lipiddoppelschichten besitzen jedoch eine weitaus bedeutendere Anwendungsmöglichkeit als Arzneistoffträger. In ihnen können sowohl hydrophile Arzneistoffe in der wässrigen Innenphase als auch lipophile Arzneistoffe innerhalb der Membran der Liposomen eingebaut werden. Liposomen sind durch die Art der am Aufbau beteiligten Lipide und der Anzahl ihrer Bilayerschichten charakterisiert. Entsprechend ihrer Morphologie kann man sie in kleine (SUV), große (LUV), einschichtige (unilamellar) und mehrschichtige (MLV) Vesikel einteilen. Sie entstehen durch Selbstassoziationsvorgänge von Amphiphilen (häufig Phospholipiden) innerhalb einer wässrigen Phase. Liposomen aus Phospholipiden weisen entsprechend ihres analogen Aufbaus zu Zellmembranen eine gute Biokompatibilität, Bioabbaubarkeit und eine relativ geringe Toxizität auf. Innerhalb ihrer physikalischen Eigenschaften besitzen sie eine enorme Vielfalt (Lipidzusammensetzung,
Membranfluidität, Größe, Ladung der Oberfläche etc.). Der liposomal applizierte Arzneistoff ist dabei von einer schützenden Lipidhülle umgeben. Die entsprechende Verteilung im Mehrkomponentensystem des Organismus ist damit unabhängig von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des verkapselten Arzneistoffes. Aufgrund dieser Vorteile wurden große Hoffnungen in die Liposomen als Arzneistoffvehikel gesetzt, da man in ihnen eine gute Möglichkeit für die Realisierung eines Drug Delivery Konzeptes sah. Innerhalb der ersten systemischen Applikationen zeigte sich aber eine Reihe von Problemen. Liposomen treten nach ihrer systemischen Applikation sehr schnell mit Organen des Retikulo-Endothelialen-Systems (RES: Leber, Milz und Lunge) in Wechselwirkung [Kimelberg (1976), Segal et al. (1976)]. Innerhalb dieser Organe werden körperfremde Stoffe als solche erkannt und ständig aus dem Blutkreislauf eliminiert. Durch den Entzug unbekannter Stoffe aus dem Körperkreislauf stellt das RES einen bedeutenden Grundpfeiler des körpereigenen Immunsystems dar. Die Liposomen werden innerhalb weniger Minuten phagozytiert, erreichen nur sehr geringe Zirkulationshalbwertszeiten und stehen als Vehikelsysteme so nicht mehr zur Verfügung. Eine Reduzierung dieses Abbaus erreichte man teilweise durch Modifizierung der Liposomen, indem man z.B. sehr kleine Vehikel einsetzte [Juliano et al. (1975)] und den Gehalt an Cholesterol innerhalb der Lipidzusammensetzung steigerte [Kirba et al. (1980)]. Eine weitere Blockade des RES wurde durch eine Prädosierung mit Dextransulfat und unfunktionalisierten Liposomen zur Sättigung der Makrophagen und damit der Erschöpfung ihrer Aufnahmekapazitäten erreicht [Aragnol et al. (1986), Patel et al. (1983)]. Da durch diese Maßnahmen die Verbesserungen nur geringfügig waren, stand die körpereigene Abwehrfunktion letztendlich einem erfolgreichen Drug-Targeting noch immer entgegen. Eine bedeutend effektivere Variante zur Verminderung der Aufnahme durch das RES und damit eine Möglichkeit zur Realisierung des Targeting stellten so genannte „Stealth®“-Liposomen dar. Diese Liposomen erhalten durch den Einbau von Lipiden mit voluminösen hydrophilen Kopfgruppen eine sterische Barriere, welche die Anheftung der Opsonine und damit die darauf folgende Phagozytose vermindert [Blume et al. (1990)]. Der genaue Mechanismus dieses zirkulationsverlängernden Effekts wird im nächsten Kapitel ausführlicher beschrieben.
Ein weiteres Problem nach systemischer Applikation bestand in der geringen Serum-stabilität der Vehikel. Es existiert eine Vielzahl von Interaktionsmöglichkeiten zwischen Liposomen und Blutkomponenten. Dabei besitzen neben Immunoglobulinen und Lipoproteinen auch Komplementfaktoren starken Einfluss auf die Stabilität der Liposomen [Bonte et al. (1987)]. Hierbei sind die stabilitätsverringernden Merkmale der Serumlipoproteine am stärksten ausgeprägt. Man spricht sogar von einer durch Lipoproteine herbeigeführten „Serum-induzierten“ Lyse der Liposomen. Speziell das HDL führt auf der Liposomenoberfläche zu Adhäsions- und Anlagerungsprozessen, die z. T. von Penetrations-vorgängen in die Bilayermembran begleitet sind [Black et al. (1976)]. Lipidaustausch zwischen Bilayerkomponenten und HDL sind auch in Studien erwähnt worden [Bonte et al. (1986)]. Dies führt zum Ausfluss eingeschlossenen Materials durch die in ihrer Struktur gestörte Membran hindurch. Durch eine Erhöhung des Cholesterolanteils können Interaktionen mit Serumproteinen verringert werden. Das Cholesterol in der Liposomenmembran bedingt eine höhere Packungsdichte und erhöht somit die Serumstabilität [Kirby et al. (1980)]. Des Weiteren sollten zur Herstellung serumstabiler Liposomen nur hochgradig reine, rigide und gesättigte Lipide Verwendung finden [Huang et al. (1980)].
Bei den verschiedenen Versuchen, Liposomen als Arzneistoffvehikel gezielt am Wirkort anzureichern, kann man zwischen einem indirekten (passiven) und einem direkten (aktiven) Targeting unterscheiden. Ein indirektes Targeting ergibt sich aus der Natur der Liposomen als körperfremde Strukturen und der daraus resultierenden Anreicherung in Organen des RES. Ausgenutzt wird dies bei der Behandlung von besonders
wiegendem Befall von Leber und Milz mit Leishmaniose-Erregern [Gilbreath et al. (1985)]. Ein weiteres indirektes Targeting wurde durch die Ausnutzung der sich ständig veränderbaren Gefäßsysteme einiger solider Tumore möglich. Die neu gebildeten Gefäßabschnitte weisen zum Teil noch Lücken zwischen den Endothelzellen auf. Den Endothelzellen in diesen Gebieten fehlt zusätzlich dazu noch die Basalmembran. Dies erleichtert ein Eindringen der Liposomen [Roberts et al. (1997)] erheblich. Beim direkten Targeting erhalten die Liposomen durch Bindung an spezifische Oberflächenstrukturen des Zielgewebes ihre Spezifität. Dafür müssen die Liposomen mit spezifisch bindenden Strukturen an ihrer Oberfläche funktionalisiert werden. In den letzten Jahren wurden schon verschiedenste Liganden erprobt und an Liposomen gekoppelt. Dazu gehört z.B. Sialyl-LewisX, Transferrin und eine Vielzahl unterschiedlicher Immunoglobuline. Eine äußerst viel versprechende Möglichkeit bot sich dabei in der Verwendung von Antikörpern als Oberflächenstruktur von Liposomen. Die Reaktion zwischen Antikörper und Antigen zeichnet sich durch hohe Spezifität und starke Bindungsaffinität aus. Durch die Anwendung einheitlicher und einfacher Kopplungsmethoden konnte die Funktionalisierung der Liposomenoberfläche erheblich erleichtert werden. Der erste erfolgreich durchgeführte Versuch eines „Antikörper-vermittelten“ Targetings wurde 1975 von Gregoriadis vorgestellt [Gregoriadis et al. (1975)]. In heutiger Zeit existieren viele erfolgreiche Modelle der Anwendung von Immunoliposomen. Gerade im Bereich der Krebstherapie wird durch Einsatz tumorspezifischer monoklonaler Antikörper eine gezielte Behandlung erst möglich [Koning et al. (1999)]. Bei der Verwendung in-vivo stellt jedoch auch bei Immunoliposomen die Aufnahme durch das RES ein schwieriges Hindernis dar. Deshalb konnten viel versprechende Resultate von in-vitro-Versuchen mit Zellen in-vivo nicht reproduziert werden.
Ein weiteres Problem besteht in der gezielten Freigabe des liposomalen Inhaltes im Zellinneren. Stabile Liposomen würden im Inneren der Zelle nach einer erfolgreichen Internalisierung der lysosomalen Degradation zum Opfer fallen und damit wirkungslos sein. Durch die Ankopplung von Peptiden und Proteinen an die Liposomenoberfläche konnten targetspezifische Vehikel erreicht werden [Vidal et al. (1987)]. Die Freigabe der Inhaltsstoffe in das Zytosol erfolgte dadurch immer noch nicht. Eine gezielte Wirkstofffreisetzung musste geschaffen werden. Dabei sollte eine hinreichende Stabilität für das Targeting zum Wirkort mit einer gewissen Destabilität der Liposomen am Wirkort im Einklang stehen. Es kam zur Entwicklung so genannter targetsensitiver Immunoliposomen [Ho et al. (1986)]. Hierbei werden einem Phospholipid, welches allein nicht zur Bilayerausbildung befähigt ist, Stabilisatoren in Form lipidassoziierter Antikörper zugesetzt. Die nun gebildeten target-sensitiven Liposomen werden nach erfolgter Antikörperbindung am Wirkort instabil und geben dort ihren Inhalt frei [Pinnaduwage et al. (1992)]. Die Freigabe des Inhaltes erfolgte aber immer noch extrazellulär. Ein therapeutischer Effekt könnte demnach erst nach erfolgreicher Aufnahme der Stoffe durch die Zelle erzielt werden. Demgegenüber steht die zelluläre Aufnahme kompletter Liposomen. In diesem Fall würde der gesamte Liposomen-inhalt das Zellinnere erreichen und seine Wirkung ausüben können.
Um eine intrazelluläre Freigabe des Liposomeninhaltes garantieren zu können, musste man sich den zytosolischen Gegebenheiten anpassen. Unterschiedliche Bedingungen innerhalb der Kompartimente galt es auszunutzen. Mit der Entwicklung pH-sensitiver Liposomen keimte neue Hoffnung auf [Ellens et al. (1984), Connor et al. (1984), Straubinger et al. (1985)]. Hierbei kommt es zu einer pH-abhängig gesteuerten Instabilität der Lipidbilayer. Das Prinzip der pH-abhängigen Freigabe wird in einem der nächsten Kapitel genauer vorgestellt.
2.3.2. Immunoliposomen/Stealth
®-Modifikation/pH-Sensitivität
Um die Targetspezifität liposomaler Wirkstoffcarrier zu erhöhen, ist die Kopplung von Antikörpern an deren Oberfläche eine viel versprechende Möglichkeit. Die dabei entstehenden Immunoliposomen zeichnen sich durch ihre hervorragenden Zielspezifitäten aus. Dabei sind für den Erfolg des Targetings entsprechende zelluläre Oberflächenstrukturen essentiell. Auf den Zielzellen müssen sich diese Determinanten sowohl quantitativ als auch qualitativ von den umliegenden Geweben abheben. Ideal wäre eine Ausbildung dieser Strukturen nur unter pathologischen Bedingungen. Adhäsionsmoleküle zeigen eine solche temporäre Exprimierung während des Verlaufs einer Entzündung. Die Bindungsstellen für Immunoliposomen wären demnach nur unter Entzündungsbedingungen im Entzündungsgebiet vorhanden. Innerhalb dieser Arbeit stehen die zeitlich und lokal limitiert exprimierten Adhäsionsmoleküle der Rezeptorfamilie der Selektine im Mittelpunkt.
Immunoliposomen wurden seit den achtziger Jahren beschrieben. Für die Kopplung von Antikörpern an die Oberfläche von Liposomen wurden verschiedene Kopplungstechniken entwickelt. Idealerweise sollten sie einfach und schnell durchführbar sein und eine stabile Verbindung ergeben (kovalente Methoden). Die Kopplungsprozedur muss mit wenigen Reaktionsschritten sowie ohne großen präparativen Aufwand und Verlust an Antikörpern durchführbar sein. Während der Konjugation sollte der Antikörper die Fähigkeit zur Antigenerkennung behalten. Um die Bindung der Immunoliposomen an ihren Zielzellen zu optimieren, sollte ein möglichst großer Anteil der gebundenen Antikörper an der Liposomenoberfläche für die Zielzellen zugänglich sein. Die Liposomen dürfen weiterhin durch die Kopplungsmethode in ihrer strukturellen Integrität nicht beeinflusst werden.
Von den verschiedenen Methoden der kovalenten Bindung von Antikörpern an die Oberfläche von Liposomen erscheint die Kopplungsprozedur unter Ausbildung einer Carbon-säureamidbindung besonders erstrebenswert. Hierbei werden unter relativ milden Bedingungen im wässrigen Medium effektive Kopplungsraten erzielt. Durch den Wegfall einer vorherigen Antikörperderivatisierung weist diese Methode eine sehr elegante Verfahrensweise auf. Bei der Kopplungsmethode dient N-Glutaryl-Phosphatidylethanolamin als Lipidanker in den Liposomen. Durch Aktivierung der Carboxylgruppe mit einem Carbodiimid (EDC) bei pH 3,5 in wässrigem Milieu entsteht ein reaktives O-Acyl-Intermediat, welches bei pH 8 mit dem entsprechenden Aminogruppen-tragenden Antikörper unter Ausbildung einer Carbonsäureamidbindung umgesetzt wird [Weissig (1991)]. Der Nachteil hierbei ist jedoch die anfängliche Kopplungsbedingung im Sauren. Die pH-sensitiven Liposomen würden bei dieser Prozedur zerstört werden. Eine gewisse Modifikation hat die Kopplungsvariante unter Verwendung von N-Glut-PE durch Ezpeleta erfahren [Ezpeleta et al. (1996)]. Hierbei wird die Antikörperanbindung zwar unter Verwendung analoger Reagenzien, jedoch bei neutralem pH-Wert und veränderter Reaktionszeit durchgeführt. Als Begründung für die Wahl des neutralen pH-Wertes wurde eine schnelle Abnahme der Aktivität des Carbodiimids im sauren Milieu angegeben.
Stark limitierend auf den systemischen Einsatz von Immunoliposomen wirkt sich die Tatsache aus, dass Liposomen nach ihrer Applikation schnell von Zellen des retikulo-endothelialen Systems (Makrophagen von Leber/Milz) als körperfremd erkannt und eliminiert werden. Die Funktionalisierung mittels Antikörper bewirkt offensichtlich eine zusätzliche Elimination. Dadurch werden nur kurze Zirkulationshalbwertszeiten erreicht. Therapeutisch notwendige Wirkstoffspiegel am Wirkort sind unter normalen Bedingungen mit konventionellen Immunoliposomen deshalb nicht zu erhalten. Richtungsweisende Strategien zur Zirkulationszeitverlängerung wurden zu Beginn der 90er Jahre entwickelt. 1987 entdeckten Allen et al. die zirkulationsverlängernde Wirkung des Gangliosids GM1. Der Effekt wird durch die voluminösen und flexiblen Kopfgruppen des GM1 hervorgerufen.
