Der mikrobiologisch-hygienische Status eingesandter Futtermittel für Pferde

Tierärztliche Hochschule Hannover

Der mikrobiologisch-hygienische Status eingesandter Futtermittel für Pferde — standardisierte Befundung

und epidemiologische Bewertung

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Peter Klötzer Steinheidel-Erlabrunn

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Josef Kamphues Institut für Tierernährung Prof. Dr. Lothar Kreienbrock

Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung

1. Gutachter: Prof. Dr. Josef Kamphues Prof. Dr. Lothar Kreienbrock 2. Gutachter: Prof. Dr. Jörg Hartung

Tag der mündlichen Prüfung: 24. Mai 2013

Ich fragte Hanna, wieso sie nicht an Statistik glaubt, statt dessen aber an Schicksal und Derartiges.

»Du mit Deiner Statistik!« sagte sie.

»Wenn ich hundert Töchter hätte, alle von einer Viper gebissen, dann ja!

Dann würde ich nur drei bis zehn Töch- ter verlieren. Erstaunlich wenig! Du hast vollkommen recht.«

»Ich habe nur ein einziges Kind!« sag- te sie.

Max Frisch in „Homo Faber“

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis vii

Abkürzungsverzeichnis ix

Tabellenverzeichnis xi

1 Einleitung 1

2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht 3

2.1 Futtermittelkundliche Aspekte . . . 3

2.2 Retrospektive Auswertung von Daten . . . 15

3 Untersuchungsgut und Methodik 19 3.1 Datengrundlage . . . 19

3.2 Aufbereitung der erhobenen Daten für die statistische Auswertung . . . 21

3.3 Spezifische Verfahrensweise bei den unterschiedlichen Merkmalen . . . 28

3.4 Statistische Auswertung . . . 34

4 Ergebnisse 39 4.1 Überblick . . . 39

4.2 Auswertung einzelner Merkmale . . . 39

4.3 Untersuchung möglicher Beziehungen zwischen Merkmalen . . . 48

5 Diskussion 63 5.1 Überblick . . . 63

5.2 Erhebung der Daten . . . 63

5.3 Aufbereitung der Daten . . . 65

5.4 Auswertung einzelner Merkmale . . . 67

5.5 Untersuchung möglicher Beziehungen zwischen Merkmalen . . . 70

Zusammenfassung 75 Summary 77 Literaturverzeichnis 79 A Datenbanktabellen 85 A.1 Überblick . . . 85

A.2 Auflistung der Datenbanktabellen . . . 85

B Regelwerke, mit deren Hilfe die Daten katalogisiert werden 95 B.1 Erläuterungen zu den Regelwerken . . . 95

v

Inhaltsverzeichnis

B.2 Regeln für die Daten von Mikroorganismen . . . 96 B.3 Regeln für die Daten der Probenmaterialien . . . 106 B.4 Regeln für die Daten der vorberichtlichen Informationen . . . 113

C Vordefinierte SQL-Abfragen 123

C.1 SQL-Abfragen für die Aufbereitung der Daten . . . 123 C.2 SQL-Abfragen für die Datenauswertung . . . 127 D SAS Skripte für die Auswertung der Daten 143 D.1 Die zentrale Steuerung der Auswertung . . . 143 D.2 Auswertung einzelner Merkmale . . . 148 D.3 Untersuchung möglicher Beziehungen zwischen Merkmalen . . . 152

vi

Abbildungsverzeichnis

2.1 Keimzahlstufen I bis IV . . . 10

3.1 Struktur der Falldaten . . . 20

3.2 Suchen und Ersetzen von Textmustern mit Hilfe regulärer Ausdrücke . . . 24

3.3 Formular, mit dem die Regelwerke erstellt und bearbeitet werden können. . 25

3.4 Katalogisierte Probenmaterialien — ausgewählte Datensätze zu „Einstreu“ 29 3.5 Katalogisierte Probenmaterialien — alle Datensätze zu „Einstreu“ . . . 30

3.6 Katalogisierte vorberichtliche Informationen . . . 32

3.7 Katalogisierte Mikroorganismen . . . 35

4.1 Einfache Häufigkeiten der eingesandten Probenmaterialien . . . 40

4.2 Einfache Häufigkeiten des Einsendezeitpunktes nach Jahreszeit . . . 41

4.3 Einfache Häufigkeiten vorberichtlicher Informationen . . . 43

4.4 Einfache Häufigkeiten der Mikroorganismen . . . 45

4.5 Einfache Häufigkeiten der maximalen Gesamtkeimzahl je Fall . . . 46

4.6 Aufteilung der häufigsten Probenmaterialien auf die Jahreszeiten . . . 50

4.7 Aufteilung der Probenmaterialien mit Vorbericht auf die Jahreszeiten . . . 50

4.8 Zum Vorkommen von Bakterien in den Probenmaterialien . . . 52

4.9 Zum Vorkommen von Schimmelpilzen und Hefen in den Probenmaterialien 53 4.10 Verteilung der Gesamtkeimzahlen der Bakterien je Material . . . 55

4.11 Verteilung der Gesamtkeimzahlen der Schimmelpilze je Material . . . 56

4.12 Verteilung der Gesamtkeimzahlen der Hefen je Material . . . 57

4.13 Verteilung der Gesamtkeimzahlen über die Jahreszeiten . . . 58

4.14 Verteilung vorberichtlicher Informationen über die Jahreszeiten . . . 59

4.15 Häufigkeiten von Bakterien je vorberichtlicher Information . . . 61 4.16 Häufigkeiten von Schimmelpilzen und Hefen je vorberichtlicher Information 62

vii

Abkürzungsverzeichnis

aw-Wert Wasseraktivität

BALF bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit — englisch: broncho alveolar lavage fluid

COPD chronisch-obstruktive Lungenerkrankung — englisch: chronic obstructive pulmonary disease

DDL Daten-Definitions-Sprache (Teilmenge von SQL) — englisch: data definition language

DON Deoxynivalenol (Vomitoxin, 12,13-Epoxy-3,4,15-trihydroxy-

trichothec-9-en-8-on) — Mykotoxin der Gruppe der Trichothecene GPS Gute Praxis Sekundärdatenanalyse

KbE/g Kolonie bildende Einheiten je Gramm Probe LPS Lipopolysaccharide

SAS^® statistisches Auswertesystem SAS^®

SQL SQL-Datenbanksprache, mit der Datenstrukturen in relationalen Datenbanken definiert und die darin enthaltenen Daten bearbeitet und abgefragt werden können

TTC 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid VBA Visual Basic for Applications

VDLUFA Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten

ix

Tabellenverzeichnis

2.1 Die Keimgruppen des Orientierungswertschemas . . . 9

2.2 Orientierungswerte für Keimgehalte nach Keimgruppen . . . 9

2.3 Die mikrobiologisch-hygienische Beschaffenheit des Tränkwassers . . . 10

2.4 Vergleich der Herstellungsverfahren für die Ausgangssuspension . . . 11

2.5 Vergleich der Verfahren zur Keimzahlbestimmung . . . 13

3.1 Anzahl der Fälle pro Jahr . . . 20

3.2 Zeichen und Zeichenfolgen für reguläre Ausdrücke . . . 22

3.3 Abarbeitungsreihenfolge der Regeln für Mikroorganismen . . . 34

4.1 Einfache Häufigkeiten vorberichtlicher Informationen . . . 41

4.2 Einfache Häufigkeiten vorberichtlicher Informationen — Einzelnennungen . 43 4.3 Statistische Kennzahlen der Gesamtkeimzahl . . . 47

4.4 χ²-Tests auf Gleichverteilung unterschiedlicher Materialien . . . 49

4.5 χ²-Tests auf Gleichverteilung unterschiedlicher Materialien (Erkrankungen) 49 B.1 Regelwerk für das Merkmal Mikroorganismen . . . 96

B.2 Regelwerk für das Merkmal Material . . . 106

B.3 Regelwerk für das Merkmal vorberichtliche Information . . . 113

xi

Kapitel 1 Einleitung

Die Hygiene wird als die „Wissenschaft von den Gesetzmäßigkeiten der Wechselwirkungen zwischen lebendem Organismus und Umwelt mit dem Ziel der Bewahrung und Kräftigung der Gesundheit des Organismus durch Ausschaltung der schädigenden und durch Förde- rung der nützlichen Umweltfaktoren“ bezeichnet (Lektorat Deutsche Sprache, 1980).

In der vorliegenden Arbeit wird der mikrobiologisch-hygienische Status von Futtermit- telproben, also deren Besatz mit Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen, gemeinsam mit den vorberichtlichen Informationen des Einsenders betrachtet. Diese veterinärmedizini- sche Bewertung soll erfolgen, indem Sekundärdaten für eine solche Auswertung aufbe- reitet werden. Dazu sind verschiedene Maßnahmen wie etwa eine Standardisierung der jeweiligen Merkmalswerte erforderlich.

Eine sekundärstatistische Auswertung von Daten aus der tierärztlichen Routine ist in vielerlei Hinsicht ein gebotenes Ziel, denn es ist davon auszugehen, dass diese Daten wert- volle Informationen beinhalten, deren Erschließung sinnvoll ist. Da in der Laborroutine, zumal über längere Zeiträume, wechselnde Bedingungen herrschen — die Erhebung von Daten orientiert sich primär am Untersuchungsauftrag des Einsenders — ist nicht zu erwarten, dass die Daten per se für eine Auswertung geeignet sind.

Folglich werden hier zwei verschiedene Zielrichtungen behandelt. Zuerst stellt sich die eher technische Frage, ob und wie sich die anlässlich von Futtermitteluntersuchungen ge- sammelten Daten möglichst effizient für eine statistische Auswertung aufbereiten lassen.

Mit Hilfe spezieller Regelwerke, welche auf der Anwendung sogenannter „regulärer Aus- drücke“ (englisch: regular expression) basieren, ist die Möglichkeit gegeben, mit geringem Aufwand große Teile der Daten in ein einheitliches Format zu überführen.

Durch einen für diese Auswertung geschaffenen Prototyp eines einfachen Regeleditors wird der Tierarzt befähigt, die Daten selbst zu transformieren. Mit tierärztlichem Sach- verstand können in den Ausgangsdaten Kategorien gebildet oder Fehler korrigiert werden.

Das setzt jedoch voraus, dass man sich vorher mit den Vorschriften für die Bildung regu- lärer Ausdrücke vertraut macht.

Ein entscheidender Vorteil dieses Vorgehens ist, dass alle Änderungen an den Ausgangs- daten durch das Regelwerk dokumentiert sind. Die aufbereiteten Daten bilden dann die

1

Kapitel 1 Einleitung

Basis für die statistische Auswertung.

Darauf aufbauend ist ein weiteres Ziel, mögliche Beziehungen zwischen dem mikrobio- logisch-hygienischen Status und den berichteten Erkrankungen aufzudecken. Motiviert durch die „besondere Empfindlichkeit des Verdauungs- und Atmungstraktes des Pferdes gegenüber Mängeln im Hygienestatus“ (Kamphues, 2001) hat die Beschäftigung mit der mikrobiologisch-hygienischen Beschaffenheit von Futtermitteln für Pferde am Institut für Tierernährung eine besondere Bedeutung (Kamphues, 1996, 2005b; Wolf et al., 2005).

Der Schwerpunkt dieser Auswertung liegt daher vor allem auf der Beschreibung von möglichen Beziehungen zwischen den vorberichtlichen Informationen über den Anlass der Einsendung (beispielsweise Erkrankungen) und den unterschiedlichen weiteren Merkmalen des Falles (Jahreszeit) oder der Proben (Probenmaterial, kulturell nachgewiesene Mikro- organismen, Gesamtkeimzahl).

Die mit Hilfe des statistischen Auswertesystems SAS^® gewonnenen und in diese Arbeit direkt übernom- menen Ergebnisse enthalten den Punkt als Dezimaltrennzeichen, deswegen wird der Punkt auch an allen anderen Stellen als Dezimaltrennzeichen verwendet.

2

Kapitel 2

Aufgabenstellung und Literaturübersicht

2.1 Futtermittelkundliche Aspekte

2.1.1 Futtermittel für Pferde

Die traditionellen Futtermittel für die Ernährung des Pferdes sind Heu, Hafer und Stroh (Meyer u. Coenen, 2002). Je nach Vegetationsperiode wird die Ernährung auch zum großen Teil durch frisches Grünfutter oder Weidegang abgedeckt. Weiterhin kommen Silagen, Hackfrüchte und deren Nachprodukte, weitere Körner und Samen, Nebenprodukte der Getreide- und Ölsamenverarbeitung, Trester, Pflanzenöle sowie unterschiedliche Misch- futter zum Einsatz, entweder pelletiert oder als sogenanntes „Müsli“ aus originären und bearbeiteten Komponenten (Kamphues et al., 2009).

Um die körperliche Entwicklung, Gesundheit und Leistungsfähigkeit der Tiere zu si- chern, müssen diese Futtermittel in bedarfsgerechten Rationen und in ausreichend guter Qualität zur Verfügung stehen.

Die Qualität des Futters hängt in hohem Maße von seiner mikrobiologisch-hygienischen Beschaffenheit ab (Kamphues, 2007). Bei den drei oben zuerst genannten Futtermitteln handelt es sich um allgemein durch Trocknung konservierte Futtermittel. Um zu verhin- dern, dass sich unerwünschte Mikroorganismen vermehren, müssen getrocknete Futter- mittel einen ausreichend hohen Trockensubstanzgehalt und eine entsprechend niedrige Wasseraktivität (aw-Wert) aufweisen. Für Silagen sind ein ausreichend niedriger pH-Wert und anaerobe Bedingungen essentiell (Meyer u. Coenen, 2002). Risiken für konservierte Futtermittel entstehen vor allem dadurch, dass diese nicht ausreichend haltbar gemacht wurden oder bei nicht sachgerechter Lagerung (Kamphues et al., 2009).

Beispielsweise benötigt ein 600 kg schweres Warmblutpferd bei leichter Arbeit ca. 1.5 kg Kraftfutter und mindestens 9 kg Heu am Tag. Ein Futtervorrat für 100 Tage für dieses Tier würde dann 150 kg Kraftfutter und 900 kg Heu beinhalten (Kamphues et al., 2009).

Je nach Anzahl der gehaltenen Pferde können das beträchtliche Volumina sein. Entspre- chend groß ist die Herausforderung, die hygienische Qualität der gelagerten Futtermittel bis zum Verbrauch zu erhalten. Die Futtermittel sind vor Feuchtigkeit zu schützen — bei

3

Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

wechselnden Temperaturen (Kondenswasserbildung), weiterer Feuchtigkeitsabgabe und trotz hygroskopischer Eigenschaften (Kleien und Quetschgetreide) der Futtermittel. Zu- sätzlich können Futtervorräte durch Vorratsschädlinge (Milben, Insekten, Nager) in ihrer hygienischen Qualität beeinträchtigt werden (Kamphues, 2007; Kamphues et al., 2009;

Kamphues u. Schulze-Becking, 1992).

2.1.2 Mikrobiologisch-hygienische Beschaffenheit von Futtermitteln für Pferde

Grundsätzlich sind Futtermittel nicht steril, sondern jedem der oben genannten Futter- mittel haften Mikroorganismen an. Dabei lässt sich zwischen

• einem produktspezifischen Keimbesatz (Primärflora),

• einer produktionsbeeinflussten Sekundärflora (Keimeliminierung bzw. sekundäre Verunreinigung) und

• einem Verderb anzeigenden Keimbesatz (hinweisend auf mikrobielle Umsetzung) unterscheiden (Gedek, 1995).

Zur Primärflora gehören saprophytisch oder schwach parasitisch lebende Mikroorga- nismen (Adler, 2009). Bei den Schimmelpilzen fasst man diese zur Gruppe der Feldpil- ze zusammen, zu denen beispielsweise die Gattungen Alternaria und Fusarium gehö- ren. Diese benötigen einen Feuchtegehalt von über 20 % für Wachstum und Toxigenese (Logrieco et al., 2003).

Die Gruppe der Lagerpilze, hier findet man häufig die GattungenAspergillus undPeni- cillium, kann auch bei geringerem Feuchtegehalt wachsen. Sie entwickeln sich aus ubiqui- tär, in geringer Zahl im geernteten Futter vorhandenen Sporen (Adler, 2009) und zeigen bei massivem Vorkommen einen Verderb an.

Als Verderb werden „Veränderungen der Futtermittel durch Mikroorganismen und / oder Vorratsschädlinge, seltener durch abiotische Vorgänge“ bezeichnet (Kamphues et al., 2009). Der Verderb ist ein selbstunterhaltender und selbstbeschleunigender Prozess. Durch die Tätigkeit von Mikroorganismen werden Wasser und Wärme gebildet, welche das Mi- lieu für die Entwicklung der Bakterien, Hefen und Schimmelpilze „verbessern“. Nach völ- ligem Verderb sind die Nährstoffe aufgebraucht, so dass am Ende oft nur noch ein gerin- ger Keimgehalt nachweisbar ist (Meyer u. Coenen, 2002). In der Regel wird der Verderb durch osmotolerante Hefearten und xerophile Schimmelpilze eingeleitet. „Erst bei höheren aw-Werten treten andere Pilzarten sowie Bakterien auf“ (Gedek, 1995).

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2.1 Futtermittelkundliche Aspekte

Der aw-Wert ist dabei ein Maß für frei verfügbares Wasser in einem Material und ist definiert als

aw = p

p₀ (2.1)

mit

p Wasserdampfdruck über einem Material p0 Wasserdampfdruck über reinem Wasser

Der aw-Wert ist stark temperaturabhängig, so dass die Temperatur bei der Bestimmung mit angegeben werden muss. Das frei verfügbare Wasser steht den Mikroorganismen für den eigenen Stoffwechsel direkt zur Verfügung, woraus sich die Bedeutung dieser Größe für den mikrobiellen Verderb ableitet (Fennema, 1996).

Um die mikrobiologisch-hygienische Beschaffenheit von Futtermitteln zu prüfen, wer- den die Mikroorganismen üblicherweise kulturell nachgewiesen und die Keimgehalte als Kolonie bildende Einheiten je Gramm Probe (KbE/g) bestimmt (VDLUFA, 2012).

Nicht originär in Futtermitteln vorkommende Mikroorganismen können auch als Kon- taminationen, beispielsweise über Nager- oder Vogelkot, in das Futter gelangen und dann ein Risiko darstellen, wenn sie in höheren Gehalten überleben können (Kamphues, 2005a).

Neben den Mikroorganismen selbst sind bakterielle Endotoxine (LPS), Mykotoxine und Allergene sehr bedeutsam — auch dann, wenn sich aktuell nur (noch) wenige der ursäch- lichen Mikroorganismen kulturell nachweisen lassen. Andererseits sind nachgewiesene, als Toxin produzierend bekannte Mikroorganismen nicht zwangsläufig toxigenetisch (Toxin synthetisierend) aktiv (Buckley et al., 2007; Sacchi et al., 2009).

2.1.3 Folgen hygienischer Mängel von Futtermitteln beim Pferd

Die Ursachen für die im folgenden aufgeführten Erkrankungen von Pferden infolge hygie- nischer Mängel von Futtermitteln lassen sich grob wie folgt einteilen (Adler, 2009; Gedek, 1995; Meyer u. Coenen, 2002):

• Mangelerscheinungen infolge von Akzeptanzproblemen oder Nährstoffabbau bei ver- dorbenen Futtermitteln

• Infektionen mit bestimmten für das Pferd pathogenen beziehungsweise opportunis- tischen Mikroorganismen

• Schadwirkungen durch diverse von Mikroorganismen gebildete Toxine

• allergische Reaktionen auf Bestandteile oder Stoffwechselprodukte der Mikroorga- nismen

5

Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

Häufig sind mehrere Tiere eines Bestandes betroffen, auch wenn keine Übertragung von Tier zu Tier im Sinne einer Infektion stattgefunden hat (Buckley et al., 2007).

Mangelerscheinungen treten auf, wenn das Futter infolge mangelnder Schmackhaftig- keit nicht mehr in ausreichender Menge aufgenommen wird oder wenn ein verminderter Nährstoffgehalt nicht durch vermehrte Futteraufnahme kompensiert werden kann. Nicht primär pathogene Mikroorganismen können Veränderungen an der Darmschleimhaut her- vorrufen, was zu sinkender Verdauungs- und Resorptionsleistung sowie Störungen der autochthonen Darmflora führen kann (Hudson et al., 2001; Küstermann, 1989), wodurch die Tiere im Vergleich zu klassischen Infektionserregern indirekt geschädigt werden.

Als Infektion bezeichnet man die Übertragung, das Eindringen und das Haftenbleiben von Mikroorganismen in einen Makroorganismus, in dem sie sich anschließend vermehren (Rolle u. Mayr, 2002).

Eine Diarrhö kann durch Infektionserreger wie beispielsweise solche der GattungenSal- monella und Clostridium sowie durch Enterotoxine vonClostridium perfringens, Clostri- dium difficile oder Escherichia coli, welche zytotoxisch auf die Zellen des Darmepithels wirken, hervorgerufen werden. Als weitere relevante Keime bei einer Diarrhö werden Rhodococcus equi und Erreger der Gattungen Klebsiella und Campylobacter angesehen (Meyer u. Coenen, 2002; Rolle u. Mayr, 2002).

Insbesondere Hefen können zur Ansammlung von Gasen im Magen oder in Darmab- schnitten, das heißt zu sogenannten Tympanien führen (Kamphues et al., 2009).

Infektionserreger für Atemwegserkrankungen können Bakterien (beispielsweise Arten der GattungenStreptococcus und Staphylococcus) oder Schimmelpilze (Mykosen) sein. Im Gegensatz zum Menschen ist der Gastrointestinaltrakt eine übliche Eintrittspforte für viele Pilzinfektionen beim Tier (Blomme et al., 1998; Buckley et al., 2007). Bei der Rau- futteraufnahme, der sich das Pferd täglich mehrere Stunden widmet, können große Mengen Pilzsporen inhaliert werden, so dass auch dem Atmungstrakt eine bedeutende Rolle als Eintrittspforte zukommt (Mair u. Derksen, 2000; Rade u. Kamphues, 1999). Allerdings finden sich auch bei gesunden Tieren in trachealen Aspiraten und in der bronchoalveolä- ren Lavage-Flüssigkeit (BALF) Hyphen und Sporen; zudem werden Schimmelpilzsporen aus Spülungen gesunder Luftsäcke isoliert, ohne dass diese dort wachsen oder das Gewebe infiltrieren (Blomme et al., 1998).

Im Futter sind vor allem Umweltkeime anzutreffen, was opportunistischen Infektionen in diesem Kontext eine besondere Rolle zukommen lässt. So wird die Anwendung von An- tibiotika und Kortikosteroiden als prädisponierend für Mykosen angesehen. Bei Pilzinfek- tionen bildet die zelluläre Abwehr den Hauptwiderstand gegen den Befall (Blomme et al., 1998).

6

2.1 Futtermittelkundliche Aspekte

Bestimmte Mykotoxine, beispielsweise Aflatoxine, Citrinin, DON und Ochratoxin kön- nen selbst immunsuppressiv wirken (Buckley et al., 2007; Caloni u. Cortinovis, 2011).

Pferde gelten als relativ sensibel gegenüber Ergotalkaloiden, Aflatoxinen und Fumo- nisinen (Caloni u. Cortinovis, 2010; Liesener et al., 2010; Simonen-Jokinen et al., 2005).

Teilweise wird von einer gewissen Toleranz gegenüber Aflatoxinen, Trichothecenen und Zearalenon berichtet (Caloni u. Cortinovis, 2010; Liesener et al., 2010). Typischerweise sind bei Toxikosen Veränderungen im Profil der Leberenzyme zu beobachten. Aflato- xin B1 ist das potenteste Hepato-Karzinogen und gleichzeitig das häufigste Aflatoxin: es wirkt akut und chronisch toxisch, karzinogen, terratogen, genotoxisch und immunotoxisch (Caloni u. Cortinovis, 2011).

Toxine der Serotypen B und C von Clostridium botulinum oder ein Endotoxinschock können zu Todesfällen führen (Dietz u. Huskamp, 1999).

Die in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien enthaltenen Lipopolysacchari- de (LPS) spielen, wenn sie mit dem Futter aufgenommen werden, nur bei gleichzeitig anderen Schadwirkungen und Störungen der Schleimhautintegrität eine Rolle. Außer in den Gastrointestinaltrakt gelangen LPS über Staub und als lösliches Agens bis in die tiefen Atemwege (Pirie et al., 2003).

Von einer hohen Inzidenz der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung wird in der nördlichen Hemisphäre berichtet, wo Pferde mit Heu gefüttert werden, das bei feuchtem Sommerwetter produziert wurde, wohingegen die Inzidenz in Australien praktisch null ist (Mair u. Derksen, 2000; Ward u. Couëtil, 2005). Die chronisch-obstruktive Lungenerkran- kung — englisch: chronic obstructive pulmonary disease (COPD) — wird als multifak- torielle Erkrankung mit verschiedenen Ausprägungen charakterisiert. Husten und insbe- sondere die COPD lassen sich gewöhnlich beobachten, wenn Pferde Heu- und Strohstaub ausgesetzt sind (Mair u. Derksen, 2000; Pirie et al., 2003, 2001, 2002; Ward u. Couëtil, 2005), wohingegen Pferde in ganzjähriger Offenstallhaltung weniger häufig an COPD er- kranken (Mair u. Derksen, 2000).

Organische Staubpartikel (vor allem Schimmelpilzsporen) und auch LPS werden als Al- lergene angesehen (Mair u. Derksen, 2000; Pirie et al., 2003; Rade u. Kamphues, 1999).

Es konnte gezeigt werden, dass organische Staubpartikel und LPS synergistische proin- flammatorische Effekte haben (Pirie et al., 2003; Simonen-Jokinen et al., 2005).

Viele Sporen sind klein genug, Bronchioli zu erreichen (Mair u. Derksen, 2000). Der Durchmesser der Konidien von 2–3 µm bei Aspergillus fumigatus ist ideal, um eingeat- met und in den tieferen Atemwegen abgelegt zu werden. Weniger häufig vorkommende pathogene Keime (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) haben Konidiendurchmesser von 4–5 µm, was sie nur bis in die oberen Atemwege mit schnellerer mucoziliärer Clearance vordringen lässt (Blomme et al., 1998).

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Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

2.1.4 Das Orientierungswertschema des VDLUFA für die Beurteilung der mikrobiologischen Qualität von Futtermitteln

Das Pferd gilt als besonders empfindlich gegenüber verdorbenen und kontaminierten Fut- termitteln. Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, die hygienische Qualität von Futter- mitteln beurteilen zu können. Um einheitliche Kriterien für diese Qualitätsbeurteilung zu erreichen, hat der Arbeitskreis „Futtermittelmikrobiologie“ der Fachgruppe VI (Futter- mittel) im Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsan- stalten (VDLUFA) ein „Orientierungswertschema zur Auswertung der Ergebnisse mikro- biologischer Untersuchungen zwecks Beurteilung von Futtermitteln nach §7(3) des Fut- termittelgesetzes“ erarbeitet (VDLUFA, 2002). Dazu wurden zahlreiche Futtermittelpro- ben auf ihre Gehalte an Mikroorganismen untersucht und die Keimgehalte den einzelnen Qualitätsstufen zugeordnet (Bucher u. Thalmann, 2006). Die endgültigen Orientierungs- werte und die dabei zu verwendenden Bestimmungsverfahren sind im Methodenbuch des VDLUFA zusammengestellt und finden sich als Methoden Nummer 28.1.1 bis 28.1.4 im Band III – „Die Untersuchung von Futtermitteln“ (VDLUFA, 2012):

28.1.1 Allgemeine Verfahrensanweisung zur Bestimmung von Keimzahlen mittels fester Nährmedien

28.1.2 Bestimmung der Keimgehalte an Bakterien, Hefen, Schimmel- und Schwär- zepilzen

28.1.3 Verfahrensanweisung zur Identifizierung von Bakterien, Hefen, Schimmel- und Schwärzepilzen als produkttypische oder verderbanzeigende Indika- torkeime

28.1.4 Verfahrensanweisung zur mikrobiologischen Qualitätsbeurteilung

Das Orientierungswertschema soll hier kurz vorgestellt werden. Der mikrobiologisch- hygienische Status von Futtermitteln wird hierbei qualitativ mit 19 sogenannten Indika- torkeimen (siehe Tabelle 2.1) und quantitativ als Keimgehalt in KbE/g Probenmaterial bestimmt. Bei den Indikatorkeimen handelt es sich jeweils um eine Gattung, Ordnung oder auch um eine Gruppe von Mikroorganismen mit gleichartiger Koloniemorphologie oder gleichen biochemischen Leistungen. Als Indikatorkeime kommen insbesondere solche Mikroorganismen in Frage, die häufig in den zu untersuchenden Futtermitteln in ausrei- chend großer Anzahl anzutreffen sind und einfach isoliert, identifiziert und gezählt werden können (Manafi, 2002). Diese Indikatorkeime sind je einer von sieben Keimgruppen zu- geordnet. Die Keimgruppen 1 und 4 enthalten die produkttypischen Mikroorganismen.

Von den verderbanzeigenden Mikroorganismen wurden nochmals die Keimgruppen 3 und 6 abgetrennt. Die Streptomyceten (KG 3) bilden eine eigene Keimgruppe, weil sie „nur

8

2.1 Futtermittelkundliche Aspekte

Tabelle 2.1: Einteilung der Indikatorkeime des Orientierungswertschemas des VDLUFA in Keimgruppen (siehe Bucher u. Thalmann, 2006; VDLUFA, 2012)

Gruppe Bedeutung Keim-

gruppe

Indikatorkeime

innerhalb der Keimgruppe Nr.

aerobe mesophile Bakterien

produkttypisch KG 1

Gelbkeime (Bakterien der Gattungen

Erwinia, Enterobacter und Pantoea) 1 Pseudomonas / Enterobacteriaceae 2 sonstige produkttypische Bakterien 3

verderbanzeigend KG 2 Bacillus 4

Staphylococcus / Micrococcus 5

KG 3 Streptomyceten 6

Schimmel- und Schwärze- pilze

produkttypisch KG 4

Schwärzepilze 7

Verticillium 8

Acremonium 9

Fusarium 10

Aureobasidium 11

sonstige produkttypische Pilze 12

verderbanzeigend KG 5

Aspergillus 13

Penicillium 14

Scopulariopsis 15

Wallemia 16

sonstige verderbanzeigende Pilze 17

KG 6 Mucorales (Mucoraceen) 18

Hefen verderbanzeigend KG 7 alle Gattungen 19

Tabelle 2.2: Orientierungswerte fürKeimgehalte in KbE/g nach Keimgruppen für unterschied- liche Futtermittel (Auszug aus VDLUFA, 2012, alphabetisch sortiert; gepresste Mischfuttermittel für Pferde werden hier als Pellets aufgeführt)

aerobe mesophile Bakterien Schimmel-/Schwärzepilze Hefen

×10⁶ KbE/g ×10³ KbE/g ×10³ KbE/g

Futtermittel KG 1 KG 2 KG 3 KG 4 KG 5 KG 6 KG 7

Grassilage 0.2 0.2 0.01 5 5 5 200

Hafer 50 1 0.05 200 50 2 200

Heu 30 2 0.15 200 100 5 150

Kleie 8 1 0.1 50 50 2 80

Pellets 0.5 0.5 0.01 2 6 1 5

Stroh 100 2 0.15 200 100 5 400

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Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

KZS I < KZS II ≤ < KZS III ≤ < KZS IV

i i i i i i i i i i i

0 OW 5 × OW 10 × OW

Abbildung 2.1: Keimzahlstufen I bis IV (OW: Orientierungswert)

für bestimmte Verderbvorgänge charakteristisch sind und in unverdorbenen Proben in deutlich geringeren Keimdichten vorkommen als die verderbanzeigenden Bakterien der Keimgruppe 2“. Bei den verderbanzeigenden Pilzen bildet die OrdnungMucorales eine ei- gene Keimgruppe, da ein niedrigerer Keimgehalt (Sporen) einen höheren Anteil an Myzel (Biomasse) als bei anderen verderbanzeigenden Pilzen erfasst (VDLUFA, 2012).

Für jede der sieben Keimgruppen wurden Keimgehalte für die unterschiedlichen Futter- mittel als Orientierungswerte (siehe Tabelle 2.2) für mikrobiologisch-hygienisch einwand- freies Futter ermittelt. Aus diesen Orientierungswerten lassen sich Keimzahlstufen für die Qualitätsbeurteilung (siehe Abbildung 2.1) ableiten. Anhand der Keimzahlstufen aller sieben Keimgruppen werden vier Qualitätsstufen (I–IV) festgelegt. Die höchste Keim- zahlstufe aus allen sieben Keimgruppen bestimmt die Qualitätsstufe eines Futtermittels.

Das bedeutet, dass ein Futtermittel nur dann in Qualitätsstufe I vorliegt, wenn in keiner der sieben Keimgruppen der Orientierungswert überschritten wird.

Während der sechs bis acht Wochen nach der Ernte andauernden sogenannten „Schwitz- phase“ vermehren sich die Mikroorganismen im Heu intensiv. Die dabei auftretenden Keimzahlen können die Orientierungswerte durchaus deutlich überschreiten und nach die- ser Phase wieder unterhalb der Orientierungswerte liegen. Die Orientierungswerte dürfen also nicht starr angewendet werden, sondern es müssen alle Beurteilungsfaktoren (im obi- gen Beispiel vor allem die bisherige Lagerdauer), durch Experten gewichtet, mit einfließen (Bucher u. Thalmann, 2006).

Nach Kamphues et al. (2009) sollten für das eingespeiste Tränkwasser die Werte aus der Tabelle 2.3 gelten.

Tabelle 2.3: Anforderungen an die mikrobiologisch-hygienische Beschaffenheit des Tränkwassers für Nutztiere (siehe Kamphues et al., 2009)

Parameter Orientierungswert

Gesamtkeimzahl aerober Bakterien bei 37 ^◦C max. 1 000 KbE/ml bei 20 ^◦C max. 10 000 KbE/ml frei von Escherichia coli und coliformen Keimen in 10 ml 0 KbE/10 ml frei von Salmonella und Campylobacter in 100 ml 0 KbE/100 ml

10

2.1 Futtermittelkundliche Aspekte

2.1.5 Vergleich der Bestimmungsmethoden für Keimgehalte

Die im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Orientierungswerte können nur bei An- wendung der zugehörigen Verbandsmethoden aus dem Methodenbuch des VDLUFA gelten (VDLUFA, 2012). Die meisten Proben wurden im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untersucht. Als akkreditiertes Prüflabor verfügt es ebenfalls über eine verbindliche Untersuchungsanweisung — „Anlegen von Futtermitteln“

(hier: Version 7 vom 8.6.2010). Das dort verwendete Verfahren unterscheidet sich jedoch von dem des Methodenbuches des VDLUFA. Hier sollen die technischen Parameter ver- glichen und die Unterschiede zwischen beiden Verfahren benannt werden.

In der Tabelle 2.4 sind die Parameter für die Herstellung der Ausgangssuspension ge- genübergestellt. Das Institut für Mikrobiologie verwendet immer diese Ausgangssuspensi- on für den Nachweis von Mikroorganismen bei sehr geringen Keimgehalten, indem diese niedrigste Verdünnungsstufe direkt auf die Keimzählplatten ausgebracht wird. Für die bakteriologische Untersuchung wird die Ausgangssuspension zusätzlich für 24 h bei 37 ^◦C inkubiert und dann auf Blutagar- und Gassner-Keimzählplatten isoliert und für weitere 24 h bei 37^◦C inkubiert. Für die mykologische Untersuchung werden insgesamt drei Keim- zählplatten direkt mit der Ausgangssuspension beimpft und bei 30 ^◦C beziehungsweise Raumtemperatur inkubiert. Im Fall von Heu und Stroh als Probenmaterial wird bei der niedrigsten Verdünnungsstufe die fünffache Menge für die Inokulation verwendet, da es hier keine Verdünnungsstufe 10⁻¹ gibt.

Soweit nicht schon in der Ausgangssuspension vorliegend, wird im folgenden Schritt die Verdünnung 10⁻² angelegt und davon ausgehend alle weiteren Verdünnungen in Zehner-

Tabelle 2.4: Vergleich der Herstellungsverfahren für die Ausgangssuspension

Art des Futtermittels

Masse des Proben- materials

Volumen der

Nährlösung Verdünnung

Behandlung der Ausgangs- suspension Institut für Mikrobiologie

Heu und Stroh 2.5 g 247.5 ml 10⁻² Schüttelverfahren,

30 min bei 37^◦C

andere Futtermittel 25 g 225 ml 10⁻¹

VDLUFA Einzel- und

Mischfuttermittel 20 g 180 ml 10⁻¹

Schüttelverfahren, 20 min bei

120 – 180 min⁻¹ stark quellende

Futtermittel 20 g 380 ml 5×10⁻²

Gärfutter,

Heu und Stroh 20 g 380 ml 5×10⁻²

11

Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

schritten. In der Untersuchungsanweisung des Instituts für Mikrobiologie wird für weitere Verdünnungen phosphatgepufferte Salzlösung verwendet. Bei der Methode 28.1.2 verwen- det man die Nährlösung, mit der die Suspension hergestellt wird, auch zum Verdün- nen und sieht vom vermuteten Keimgehalt abhängige Verdünnungsstufen für das Beimp- fen von Keimzählplatten vor. Je nach Futtermittel sind das die Stufen von 10⁻². . .10⁻³ bis 10⁻⁴. . .10⁻⁶ für aerobe Bakterien und von 10⁻¹. . .10⁻² bis 10⁻³. . .10⁻⁵ für Hefen, Schimmel- und Schwärzepilze.

Am Institut für Mikrobiologie werden jeweils eine Blutagar- und eine Keimzählplatte nach Gassner mit den Verdünnungsstufen von 10⁻⁴ bis 10⁻⁸ für aerobe Bakterien sowie Hamburger Testagar-Keimzählplatten mit den Verdünnungsstufen von 10⁻² bis 10⁻⁵ für Hefen und Schimmelpilze beimpft.

In der Tabelle 2.5 wird beschrieben, welche Verdünnungen auf welchen Nährmedien wie lange inkubiert werden. Bei der Verbandsmethode des VDLUFA werden zur Auswer- tung dann die Keimzählplatten mit mindestens 20 Kolonien bei der bakteriologischen Untersuchung, beziehungsweise mindestens zehn Kolonien bei der mykologischen Un- tersuchung herangezogen. Es werden möglichst zwei Verdünnungsstufen berücksichtigt.

Keimzählplatten, die um mehr als ±40 % vom Mittelwert abweichen, werden von der Berechnung der Keimzahl ausgeschlossen. Bei der bakteriologischen Untersuchung wer- den Kolonien probiotischer Mikroorganismen und Kolonien ohne Reduktion von 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) nicht mitgezählt. Bei Kolonien von Schimmel- und Schwärzepilzen ohne ausreichende Differenzierungsmerkmale wird eine verlängerte Bebrü- tung und Subkultivierung auf anderen Nährmedien versucht. Die Kolonien mit auch dann noch nicht sporulierenden Pilzen werden als „sonstige produkttypische Pilze“ der Keim- gruppe 4 zugeordnet. Am Institut für Mikrobiologie wird diejenige Keimzählplatte berück- sichtigt, auf welcher ungefähr 50 Kolonien wachsen. Üblicherweise wird bei der bakterio- logischen Untersuchung nur die Blutagarplatte ausgezählt. Die Gassner-Keimzählplatte wird grundsätzlich herangezogen, wenn nach Enterobacteriaceae gefragt wird. Sind auf den Keimzählplatten mit höheren Verdünnungsstufen Kolonien gewachsen, erfolgt die Angabe des Keimgehaltes in KbE/g Probenmaterial. Für die bakteriologische Untersuchung wer- den die Leitkeime angegeben und für die mykologische Untersuchung die Keimzahl mit Angabe der Gattungen bzw. „Schimmelpilze, wegen fehlender Fruchtformen nicht differen- zierbar“. Wachsen nur Kolonien auf den Keimzählplatten, die mit der Ausgangssuspension beimpft wurden, wird als Keimzahl < 10⁵ KbE/g (bakteriologische Untersuchung) bzw.

< 10³ KbE/g (mykologische Untersuchung) angegeben. „Kulturell nicht nachweisbar“

wird diagnostiziert, wenn auf keiner der Keimzählplatten Kolonien gewachsen sind.

Die Formel für die Berechnung der Keimzahlen ist für beide Verfahren identisch und

12

2.1FuttermittelkundlicheAspekte Tabelle 2.5: Vergleich der zu verwendenden Kulturmedien, der Verdünnungsstufen und der Kulturbedingungen

Unter- Keimzähl-

platten^a Probenmaterial^b aus Ausgangssuspension aus Verdünnung^c

Kulturbedingungen

suchung Verd. direkt weitere von bis Menge

Institut für Mikrobiologie aerobe Blutagar & Heu und Stroh 10⁻²

0.2 ml frakt.

10⁻⁴ 10⁻⁸ 0.2 ml 2 d bei 37 ^◦C Bakterien Gassner andere Futtermittel 10⁻¹ Ausstr.^d

Hefen und Schimmel- pilze

Hamburger Testagar

Heu und Stroh 10⁻² 2 × 1 ml 0.2 ml 10⁻³ 10⁻⁵ 0.2 ml 5–7 d bei 30^◦C

1 ml^e 5–7 d bei Raumtemperatur

andere Futtermittel 10⁻¹ 2 × 0.2 ml 10⁻² 10⁻⁵ 0.2 ml 5–7 d bei 30^◦C

0.2 ml 5–7 d bei Raumtemperatur

VDLUFA

aerobe 3.2.1 oder vermutlich „keimarm“ 10^{−2 . . .}10⁻⁵ 2 × 2 d bei 30 ^◦C anschließend Bakterien 3.2.2 vermutlich „belastet“ 10⁻³ . . .10⁻⁶ 0.1 ml^f 4 d bei Raumtemperatur

Hefen und 3.3.1 oder vermutlich „keimarm“ ggf. 2 × 0.1 ml aus 10⁻¹ 10⁻² . . .10⁻⁴ 2 × 3 d bei 25 ^◦C anschließend Schimmelp. 3.3.2 vermutlich „belastet“ 10⁻² 10⁻⁵ 0.1 ml 4 d bei Raumtemperatur

a VDLUFA: eine der aufgeführten Keimzählplatten aus der Methode Nummer 28.1.2 /Institut für Mikrobiologie: Blutagar- und Gassner-Keimzählplatte werden parallel verwendet

b VDLUFA: je nach erwarteter Keimzahl werden 3-4 Verdünnungsstufen im entsprechenden Bereich angelegt

c VDLUFA: Verdünnung mit Nährlösung /Institut für Mikrobiologie: Verdünnung mit phosphatgepufferter Salzlösung

d die Ausgangssuspension wird 1 d bei 37^◦C und anschließend ein fraktionierter Ausstrich 1 d auf Blutagar- und Gassner-Keimzählplatten bei 37 ^◦C inkubiert

e drei Keimzählplatten werden beimpft, davon zwei bei 30^◦C inkubiert und eine bei Raumtemperatur

f je 2 Keimzählplatten werden beimpft und inkubiert

13

Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

lautet für den allgemeinen Fall:

N =

PC

V · [n1+ (0.1 ·n2)] ·d (2.2) mit

N Kolonie bildende Einheiten je Gramm Probe (KbE/g)

PC Summe aller Kolonien der Keimzählplatten von zwei aufeinander folgen- den Verdünnungen

V Volumen der in Keimzählplatten pipettierten Verdünnungen in ml n₁ Anzahl der Keimzählplatten der niedrigeren Verdünnung

n2 Anzahl der Keimzählplatten der höheren Verdünnung d Verdünnungsfaktor der niedrigeren Verdünnung

Für die Untersuchung am Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hoch- schule lässt sich die Keimzahl durch Einsetzen in die Gleichung 2.2 mit einer vereinfachten Formel wie folgt berechnen:

N = C· 5

d (2.3)

mit

N Kolonie bildende Einheiten je Gramm Probe (KbE/g) C ermittelte Anzahl der Kolonien auf der Keimzählplatte

d Verdünnungsfaktor

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sich die Verfahren in mehreren De- tails unterscheiden. Am Institut für Mikrobiologie kommt ein auch für andere Fragestel- lungen genutztes Routineverfahren zum Einsatz. Durch die eingeübte Routine sollte die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hoch sein. Es werden immer alle Verdünnungsstufen angelegt, so dass es keine Irrtümer beim vermuteten Keimgehalt geben kann und eine Aus- wertung immer möglich ist. Jede Kolonie der niedrigsten Verdünnungsstufe repräsentiert 0.05×10⁶ KbE/g mesophiler aerober Bakterien und 0.05×10⁴ KbE/g (beziehungsweise 0.5×10⁴ KbE/g für die Probenmaterialien Heu und Stroh) bei Hefen und Schimmelpil- zen. Die niedrigsten Orientierungswerte sind hier nicht verlässlich darstellbar. Die nach dem Methodenbuch des VDLUFA niedrigeren Temperaturen beim Bebrüten spiegeln die Verhältnisse im Futter (außerhalb des tierischen Körpers) wider.

14

2.2 Retrospektive Auswertung von Daten

2.2 Retrospektive Auswertung von Daten

2.2.1 Allgemeines und Epidemiologie

Werden Daten für eine geplante Auswertung eigens erhoben und ausgewertet, spricht man von einer Primärdatenanalyse. Wenn eine Vollerhebung nicht durchführbar ist, kommt dem Ziehen einer geeigneten Stichprobe dabei eine besondere Bedeutung zu. „Eine Stich- probe heißtrepräsentativ, wenn aus ihr der Schluss auf die zugrunde gelegte Grundgesamt- heit erlaubt ist“ (Kreienbrock, 1993). Dabei sollen sich Werte wichtiger auszuwertender Merkmale zwischen der Stichprobe und der Grundgesamtheit möglichst wenig unterschei- den.

Als Sekundärdatenanalyse wird „die Analyse von Daten im Rahmen wissenschaftli- cher Untersuchungen ohne direkten Bezug zum primären Erhebungsanlass“ bezeichnet (Swart u. Ihle, 2005). Spezielle Rahmenbedingungen und Vorgaben für die Erhebung der Daten können bei der Sekundärdatenanalyse nicht in die Auswahl der Stichprobe ein- fließen, was bei den auszuwertenden Merkmalen zu größeren Differenzen zwischen der Stichprobe und der Grundgesamtheit führen kann.

Bei Einsendungen in ein Untersuchungslabor handelt es sich um eine speziell selektierte Stichprobe, deren Kenngrößen von denen der Grundgesamtheit stark abweichen können.

Einerseits werden wegen eines vorliegenden (Krankheits-)Problems Proben eingesandt, wodurch beispielsweise die Prävalenz systematisch überschätzt werden würde. Werden andererseits durch gut geführte Betriebe Proben hauptsächlich zur Qualitätssicherung eingesandt, ohne dass ein konkretes Problem vorliegt, würde die Prävalenz wahrscheinlich unterschätzt werden.

Eine Beschreibung der Grundgesamtheit auf Basis der ausschließlich aus den Einsen- dungen erhobenen Daten wäre höchstwahrscheinlich verzerrt. Auswertungen der aus den Einsendungen gewonnenen Daten können durchaus sinnvoll sein, wenn diese besonderen Eigenschaften der Stichprobe Berücksichtigung finden.

In der Humanmedizin gibt es neben der Dokumentation beim Arzt und in Untersu- chungslaboren eine ganze Reihe von Datensammlungen durch die Versicherungsträger und gesetzliche Vorgaben, die für Auswertungen interessant sind. Personenbezogene Da- ten dürfen jedoch nur zweckgebunden erhoben und verarbeitet werden und unterliegen einem strikten Datenschutz. Werden ethische Prinzipien berücksichtigt und personenbe- zogene Daten hinreichend geschützt, beispielsweise indem die Daten anonymisiert werden, sind diese Datensammlungen für Auswertungen sehr attraktiv, weil sie kostengünstig und schnell verfügbar sind.

Die „Gute Praxis Sekundärdatenanalyse (GPS)“ formuliert daher eine „Richtschnur bei der Planung, Durchführung und Analyse von Studien auf der Basis von Sekundärdaten“

15

Kapitel 2 Aufgabenstellung und Literaturübersicht

(AGENS, 2012). Neben den spezifischen Erfordernissen in der Humanmedizin (beispiels- weise aus dem Datenschutz resultierend) widmet sich die GPS den spezifischen Problemen, wenn bei der Datenaufbereitung und -analyse auf Sekundärdaten zurückgegriffen werden muss.

Nach GPS sollen „sämtliche der Datenanalyse vorgeschalteten Prozesse bis zur Gene- rierung eines Auswertedatensatzes“ dokumentiert werden. Um das sicherzustellen

• soll der Ausgangsdatensatz in unveränderter Form für den gesamten Zeitraum der Sekundäranalyse verfügbar sein,

• soll der Verwendungszweck der Datensammlung dargestellt werden,

• sollen die Erfassungsregeln und deren Konstanz überprüft werden,

• sollen der Umfang und die Struktur der bereitgestellten und verwendeten Daten dokumentiert werden (fehlende oder redundante Datensätze und deren Häufigkeit),

• soll die Datenqualität auf Basis verfügbarer Informationen überprüft werden,

• soll eine Plausibilitätskontrolle auf Grundlage des Ausgangsdatensatzes durchge- führt werden,

• soll jede Ergänzung und Änderung von Variablenwerten vollständig und schriftlich dokumentiert werden und es

• soll die Bildung neuer Variablen vollständig dokumentiert werden.

Somit stellt die Auswertung von Sekundärdaten eine besondere Herausforderung dar. Bei fehlenden oder widersprüchlichen Informationen lässt es sich nachträglich meist nicht ver- wirklichen, die Daten ohne Informationsverlust so zu transformieren, als ob diese für den gewünschten Zweck erhoben wurden. Es bleibt dann nur die Möglichkeit, die betreffenden Daten von der Auswertung auszuschließen oder jeweils sehr inhomogene Kategorien wie beispielsweise „sonst“ zu schaffen.

2.2.2 Labordaten aus der Futtermitteluntersuchung

Das Laborprogramm des Instituts für Tierernährung basiert auf der proprietären Software Microsoft Access. Damit sich die Daten mit identischer Struktur aus der Labordatenbank in die Auswertedatenbank überführen lassen, wurde dafür ebenfalls Microsoft Access ver- wendet. Wenn Änderungen an den Daten von Hand durchgeführt würden, wäre es schwer durchzusetzen, dass alle Änderungen dokumentiert werden. Microsoft Access bietet die Möglichkeit, sämtliche Transformationen der Daten, die üblicherweise von Hand ausge- führt werden, zu programmieren.

Besonders wenn keine vordefinierten Wertekataloge bei der primären Erfassung von Daten verwendet werden, sind Fehler bei der Eingabe unvermeidlich. Außerdem können

16

2.2 Retrospektive Auswertung von Daten

unterschiedliche Schreibweisen identischer Sachverhalte vorkommen. Mit Hilfe sogenann- ter „regulärer Ausdrücke“ lässt sich effizient nach solchen Textstücken suchen, so dass sie korrigiert werden können. Die lückenlose Dokumentation soll sicherstellen, dass Fehler in der Analyse auffindbar sind und korrigiert werden können. Als Resultat sollen die Da- ten in einer Form zur Verfügung stehen, als ob sie in einem einheitlichen Format mit je Merkmal hinterlegten Wertekatalogen erhoben worden wären.

17

Kapitel 3

Untersuchungsgut und Methodik

3.1 Datengrundlage

Von den Mitarbeitern im Einsendungsbereich des Institut für Tierernährung werden nach der sensorischen Prüfung üblicherweise repräsentative Teilmengen der eintreffenden Pro- ben von Futtermitteln zur mikrobiologischen Untersuchung an das Labor des Institutes für Mikrobiologie weitergegeben. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Proben weiter- gesendet werden, bei denen durch zu lange Transportzeiten eine Vermehrung der Mikro- organismen in unerwünschten Größenordnungen auf dem Transportweg erfolgen konnte.

Das ist beispielsweise der Fall, wenn eine übermäßige Gasbildung festzustellen ist.

Den folgenden Auswertungen liegen die bei der Untersuchung im Labor des Instituts für Tierernährung routinemäßig erhobenen Daten zu eingesandten Futtermittelproben für Pferde zu Grunde. Bei dieser Futtermitteluntersuchung bekommt der Einsender einen Bericht über die erhobenen Befunde gemeinsam mit einem tierärztlichen Gutachten in Textform zugestellt. Eine über Freitexte hinausgehende strukturierte Datenerfassung ist dafür nicht notwendig. Für die statistische Auswertung sind Freitexte allerdings weniger geeignet. Es war deswegen unerlässlich, die Daten vorher aufzubereiten.

Als Ausgangsdaten standen die Datenbanken aus den Jahren 2000–2003 und 2006–

2008 zur Verfügung. Die Datenbankanwendung ist in „Microsoft Access“ realisiert, einem proprietären Datenbankmanagementsystem der Firma Microsoft. Aufbereitet wurden die Daten ebenfalls mit Hilfe von Microsoft Access und anschließend über eine direkte An- bindung mit dem statistischen Auswertesystem SAS^® analysiert.

Um die jährlich geführten Datenbanken Jahr-übergreifend auswerten zu können, war es notwendig, die Untersuchungsdaten aus den einzelnen Datenbanken in eine zentrale Datenbank zu importieren. Dazu wurden sämtliche Einträge der Datenbanktabelle Be- funde aus den Datenbanken der einzelnen Jahre, mit einer zusätzlichen Tabellenspalte Jahr versehen und in der Datenbanktabelle Befunde_Gesamt (siehe Listing A.1) zusam- mengefasst. Die Datenbanktabelle Befunde_Gesamt bildet damit den Ausgangspunkt für alle Auswertungen. In einem ersten Schritt wurden alle Datensätze zu Futtermittelproben

19

Kapitel 3 Untersuchungsgut und Methodik

Tabelle 3.1:Anzahl der Fälle pro Jahr

Jahr 2000 2001 2002 2003 2006 2007 2008 Summe Anzahl Fälle 93 105 111 105 96 95 77 682

für die Tierart Pferd aus der Datenbank herausgefiltert (siehe Listing C.1). Nachfolgend wurde die Menge der gefundenen Datensätze auf diejenigen eingeschränkt, die Ergebnisse von Untersuchungen zur Hygiene der Futtermittel enthielten (siehe Listing C.2).

Aus der sogenannten „flachen“ Datenbanktabelle Befunde_Gesamt lässt sich eine hier- archische Struktur ableiten (siehe Abbildung 3.1). Diese Struktur lässt sich nur indirekt herleiten, indem alle eingesandten Proben eines Einsenders vom gleichen Tag als zu ei- nem Fall gehörend zusammengefasst werden. Anhand der vorliegenden Daten kann nicht unterschieden werden, ob es sich bei einem Fall um ein einzelnes Individuum oder um mehrere Tiere bzw. einen Bestand handelt. Außerdem können für ein und denselben Fall wiederholt eingesandte Proben nicht als solche erkannt werden. Die Fallzahlen der einzel- nen Jahre sind in der Tabelle 3.1 aufgeführt.

vorberichtliche Information Kolik, Rehe

tabVorbericht Fall

FallId:

2002-0750-0753

Die Inhalte der Datenfelder

`Adreßkarteinummer, Einsender`

`Besitzer`

`eingetroffen`

müssen identisch sein und die Werte von

`Einsendungsnummer`

müssen aufsteigend durchnummeriert sein, um zum selben Fall zugehörig zu gelten.

Aus der Jahreszahl 2002 und den Einsendungsnummern 750–753 wurde im Beispiel die einmalig vergebene Fall- Identifikationsnummer (FallId) 2002-0750-0753 erzeugt.

Probenmaterial 750: Stroh 751: Heu 752: Heu 753: Hafer

tabMaterial

Mikroorganismen in Probe 750 Pantoea agglomerans

Bacillus subtilis Gruppe ...

Alternaria sp.

Penicillium sp.

...

Hefen nicht nachweisbar

tabMikroorganismenArten

Mikroorganismen in Probe 751 Bacillus subtilis Gruppe

coliforme Bakterien ...

Aspergillus sp.

Penicillium sp.

...

Hefen

Mikroorganismen in Probe 752 Pantoea agglomerans

...

Aspergillus sp.

Schimmel, nicht differenzierbar ...

Hefen nicht nachweisbar Mikroorganismen in Probe 753 Pantoea agglomerans

coliforme Bakterien ...

Aspergillus sp.

Fusarium sp.

...

Hefen

Abbildung 3.1: Die Struktur der Falldaten einer konkreten, vier Proben (750–753) umfassenden Einsendung aus dem Jahr 2002, exemplarisch anhand von Fall 2002-0750-0753 dargestellt

20

3.2 Aufbereitung der erhobenen Daten für die statistische Auswertung

Jeder Fall kann keinen, einen oder mehrere Einträge in den Tabellenspalten Vorbe- richt und Problem-Stichwort der Ursprungstabelle Befunde_Gesamt enthalten. Für diese Auswertung wird diese Information als vorberichtliche Information bezeichnet.

Zu jedem Fall liegen ein oder mehrere Probenmaterialien vor, zu welchen wiederum Ergebnisse einer mikrobiologischen Untersuchung gehören. In der Datenbankanwendung wurden die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung getrennt nach den folgenden Kategorien erfasst:

• aerobe Bakterien

• Clostridien

• Salmonellen

• Schimmelpilze

• Hefen

In den aus der Tabelle Befunde_Gesamt abgeleiteten Datenbanktabellen tabMateri- al (Probenmaterialien; Listing A.3), tabMikroorganismenArten (Ergebnisse der mikrobio- logischen Untersuchung; Listing A.5) und tabVorbericht (vorberichtliche Informationen;

Listing A.11) wurde die implizit vorhandene hierarchische Struktur der Ausgangsdaten berücksichtigt. Die als Freitexte eingegebenen Daten waren jedoch vor einer Auswertung aufzubereiten.

3.2 Aufbereitung der erhobenen Daten für die statistische Auswertung

3.2.1 Durchmustern der Daten mit Hilfe regulärer Ausdrücke

Wenn Daten als Freitexte erfasst werden, ergeben sich über einen langen Zeitraum von neun Jahren zwangsläufig unterschiedliche Notationen gleicher Sachverhalte. Grundsätz- lich resultiert dies einerseits aus den Eigenarten unterschiedlicher Untersucher, welche beispielsweise von deren Erfahrung und Routine abhängen. Auch neue Erkenntnisse kön- nen sich in Daten aus verschiedenen Jahren widerspiegeln. So war beispielsweise die in den Proben vorkommende Bakterienart Pseudomonas luteola taxonomisch ursprünglich der Gattung Chryseomonas als Chryseomonas luteola zugeordnet. Ein weiterer Grund für unterschiedliche Notationen sind Tippfehler. In vielen Fällen lässt sich ein entstelltes Wort oder eine entstellte Zahl durch die Kenntnis der Nachbarschaft von Tasten auf einer Standardtastatur leicht rekonstruieren. Vom Auswertungsprogramm werden jedoch nur völlig identische Schreibweisen als zusammengehörend erkannt. Bevor diese Daten pro- grammtechnisch auswertbar sind, müssen sie daher erst harmonisiert (katalogisiert) und

21

Kapitel 3 Untersuchungsgut und Methodik

mehrere Proben und gegebenenfalls auch mehrere vorberichtliche Informationen einem Fall eindeutig zugeordnet werden.

Da neben synonymen Begriffen auch nach Zeichenfolgen gesucht wird, die durch Tipp- fehler sinnentstellt sind, wird im Folgenden verallgemeinernd von der Suche nach Text- mustern gesprochen. Diese Textmuster können mit Hilfe eines sogenannten „regular ex- pression“ (deutsch: regulärer Ausdruck) in den Freitext enthaltenden Tabellenspalten der DatenbanktabelleBefunde_Gesamtgesucht werden. Formuliert werden die regulären Aus- drücke nach den in der Tabelle 3.2 dargestellten Regeln. (Eine verbindliche Spezifikation der hier verwendeten regulären Ausdrücke ist im Microsoft Developer Network (Microsoft, 2010) zu finden.)

Tabelle 3.2: Zeichen und Zeichenfolgen für reguläre Ausdrücke Zeichen Beschreibung

\ markiert das nächste Zeichen als spezielles Zeichen oder hebt dessen besondere Bedeutung ([ ] ( ) { } | ? + - * ˆ $ \ .) auf

Position ˆ passt auf den Anfang des Eingabetextes

$ passt auf das Ende des Eingabetextes

\b passt auf eine Wortgrenze (Wortanfang oder Wortende)

\B passt nicht auf eine Wortgrenze

einzelne Zeichen

. passt auf ein beliebiges Zeichen, außer auf das Zeilenende

[egh] passt auf ein einzelnes Zeichen aus der Menge der in eckigen Klammern aufge- führten Zeichen, also entweder „e“ oder „g“ oder „h“

[xyz] passt beispielsweise auf das „x“ in „Axt“

[A-Za-z0-9] passt auf einen beliebigen lateinischen Buchstaben A. . . Z,a. . . z oder jede arabi- sche Ziffer 0. . . 9 aus den angegebenen Bereichen (die Bindestriche kennzeichnen einen Bereich)

[u-z] passt beispielsweise auf das „x“ in „Axt“

[ˆabc] oder [ˆu-z]

passt auf jedes andere Zeichen, welches nicht unter den in den eckigen Klam- mern aufgeführten ist

[ˆxyz] passt beispielsweise auf das „A“ in „Axt“

\d passt auf eine arabische Ziffer 0. . . 9 (= [0-9])^∧

\D passt auf jedes Zeichen, welches keine Ziffer ist (= [ˆ0-9])^∧

\f passt auf das Seitenvorschubzeichen (nicht druckbares Zeichen)

\n passt auf das Zeilenvorschubzeichen (nicht druckbares Zeichen)

\r passt auf das Wagenrücklaufzeichen (nicht druckbares Zeichen)

\s passt auf einen Zwischenraum wie Leerzeichen, Tabulator, Seitenvorschub . . . (= [␣\f\n\r\t\v])^∧

\S passt auf jedes Zeichen, welches kein Zwischenraum ist (= [ˆ␣\f\n\r\t\v])^∧

\t passt auf das Tabulatorzeichen

\v passt auf das vertikale Tabulatorzeichen

(wird auf der folgenden Seite fortgesetzt)

22

3.2 Aufbereitung der erhobenen Daten für die statistische Auswertung

Tabelle 3.2: Zeichen und Zeichenfolgen für reguläre Ausdrücke (Fortsetzung) Zeichen Beschreibung

\w passt auf einen beliebigen lateinischen Buchstaben A. . . Z,a. . . z oder jede ara- bische Ziffer 0. . . 9 sowie den Unterstrich (= [A-Za-z0-9_] — nicht enthalten^∧ sind die deutschen Umlaute ÄäÖöÜü und ß)

\W passt auf jedes Zeichen, welches kein lateinischer Buchstabe, keine arabische Ziffer und kein Unterstrich ist (=^∧ [ˆA-Za-z0-9_])

Quantoren

* modifiziert das vorhergehende Zeichen dahin, dass es keinmal, einmal oder mehrmals im Eingabetext auftauchen kann (=^∧ {0,})

zo* passt auf „z“ und auch auf „zoo“

+ modifiziert das vorhergehende Zeichen dahin, dass es ein- oder mehrmals im Eingabetext auftauchen kann (=^∧ {1,})

zo+ passt nicht auf „z“, jedoch auf „zoo“

? modifiziert das vorhergehende Zeichen dahin, dass es fehlen (kein- oder einmal im Eingabetext vorkommen) kann (=^∧ {0,1})

n?immer passt auf „immer“ und auf „nimmer“

{n} modifiziert das vorangegangene Zeichen dahin, dass es exakt n-mal vorkommen muss

{n,} modifiziert das vorangegangene Zeichen dahin, dass es mindestens n-mal vor- kommen muss (siehe auch * und +)

{n,m} modifiziert das vorangegangene Zeichen dahin, dass es mindestens n-mal vor- kommen muss und höchstens m-mal vorkommen darf (siehe auch ?)

Gruppierung und Rückwärtsreferenz

(Text) wenn der reguläre Ausdruck Text passt, wird die gefundene Übereinstimmung abgespeichert; außerdem lassen sich Alternativen (exklusives Oder) zusammen- fassen sowie Quantoren hinzufügen

\n passt auf die Übereinstimmung der n-ten Gruppierung

beispielsweise passt (.)\1 auf zwei aufeinander folgende identische Zeichen exklusives Oder

links|rechts passt entweder auf den links von | formulierten regulären Ausdruck links oder auf den rechts von | formulierten regulären Ausdruck rechts

Alle Zeichen, die ohne eine der in der Tabelle 3.2 erläuterten speziellen Notation aufge- führt werden, stehen für sich selbst. Aufeinander folgende Zeichen müssen im Eingabetext genau in der angegebenen Reihenfolge auftreten, damit das Textmuster als passend er- kannt wird (implizite Und-Verknüpfung der einzelnen Zeichen und speziellen Zeichenfol- gen). Werden im Suchmuster Quantoren angegeben, ist es möglich, dass unterschiedliche, sich überlappende Textstücke zum regulären Ausdruck passen. Dann wird jenes verwen- det, welches auf das längste Textstück des analysierten Textes passt.

Komplexe reguläre Ausdrücke entstehen, indem man diese einzelnen Zeichen und Zei- chenfolgen in geeigneter Weise kombiniert.

23

Kapitel 3 Untersuchungsgut und Methodik

2,5*10h8; Leitkeime:Streptomyces spec., alpha-hämolysierende . . .

(\w+) sp(ecies|ec\.|p\.)

\1 sp.

2,5*10h8; Leitkeime:Streptomyces sp., alpha-hämolysierende . . .

Eingabetext

regulärer Ausdruck ersetzen mit

Ausgabetext

Abbildung 3.2: Suchen und Ersetzen von Textmustern mit Hilfe regulärer Ausdrücke

Für die Suche nach den Textmustern wurden reguläre Ausdrücke verwendet, da sich damit mehrere Varianten mit Hilfe eines einzigen regulären Ausdrucks suchen lassen.

Beispielsweise folgten den Gattungsnamen der Mikroorganismen die Bezeichnungen „spe- cies“, „spec.“, „sp.“ oder „spp.“. Damit bei der statistischen Auswertung die unterschiedli- chen Bezeichnungen als zu einer Kategorie gehörend behandelt werden, wird die Schreib- weise vereinheitlicht. Das kann durch den folgenden regulären Ausdruck beschrieben wer- den: (\w+) sp(ecies|ec\.|p\.) (siehe auch Abbildung 3.2). Dieser reguläre Ausdruck sucht nach allen Textmustern, welche aus einem Wort, gefolgt von einem ␣ (Leerzeichen) und den beiden Buchstaben sp bestehen, denen sich eine der Alternativen ecies, ec. oder p.

anschließt. Ein Wort wird hier durch\w+definiert, was bedeutet, dass ein ein- oder mehr- maliges Vorkommen (wegen +) eines Buchstabens oder einer Ziffer (wegen \w) gesucht wird. Demzufolge muss nicht für jede Gattungsbezeichnung eine separate Ersetzungsregel formuliert werden, sondern es kann eine beliebige Gattungsbezeichnung voranstehen.

Die umschließenden Klammern um \w+sorgen dafür, dass der durch diesen regulären Ausdruck erkannte Text zwischengespeichert wird. Ohne diese Klammern würden exakt die selben Textmuster erkannt werden. Die in einem konkreten Fall angegebene Gat- tungsbezeichnung kann jedoch nur in die Ausgabedaten übernommen werden, wenn sie zwischengespeichert wurde. Genau das wird hier durch die Klammersetzung veranlasst.

Das Gleiche geschieht beim zweiten Klammernpaar. Hier wird nicht auf den zwischen- gespeicherten Wert zurückgegriffen — die Klammern dienen hier dazu, unterschiedliche, durch „|“ getrennte Alternativen des Suchmusters anzugeben.

3.2.2 Ersetzung der mittels regulärer Ausdrücke gefundenen Textmuster

In der Abbildung 3.2 wird dargestellt, wie die erkannten Textmuster ersetzt werden. Mit Hilfe eines auf die Auswertung regulärer Ausdrücke spezialisierten Programms, welches in der verwendeten Programmierumgebung Visual Basic for Applications (VBA) über das sogenannte Regular Expression (RegExp)-Object (siehe Microsoft, 2010) aufgerufen wer- den kann, werden Übereinstimmungen der regulären Ausdrücke in den in der Datenbank

24

3.2AufbereitungdererhobenenDatenfürdiestatistischeAuswertung

Abbildung 3.3: Formular, mit dem die Regelwerke erstellt und bearbeitet werden können. Es werden nur die drei Regeln angezeigt, die die gefundenen Textmuster durch „Stroh“ (in der Liste links ausgewählt) ersetzten.

25

Kapitel 3 Untersuchungsgut und Methodik

gespeicherten Freitexten gesucht. Die regulären Ausdrücke an sich besitzen keinen Mecha- nismus, um die erkannten Textmuster durch einen anderen Text ersetzen zu können, so dass diese Funktionalität hinzu programmiert werden musste. Erst hierdurch lassen sich Ersetzungsregeln formulieren.

Jede Regel enthält einen regulären Ausdruck, mit dem in den Freitexten gesucht wird, sowie einen Ersetzungstext, durch den das mit dem regulären Ausdruck übereinstim- mende Textmuster ersetzt wird. Wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben, können mittels der Notation \1, \2, . . . abgespeicherte Textmuster aus Gruppierungen in den zu ersetzenden Text übernommen werden. Die Ziffer repräsentiert dabei die Position der Gruppierung im regulären Ausdruck. Im obigen Beispiel wird beispielsweise auf die als \1 zwischengespeicherte Gattungsbezeichnung zurückgegriffen

Für jede der verschiedenen Arten von Freitexten (Probenmaterial, vorberichtliche Infor- mationen, kulturell nachgewiesene Mikroorganismen) wurde jeweils ein bestimmtes For- mat der Daten festgelegt, welches später im Abschnitt 3.3 beschrieben wird.

Das Eingabeformular für die regulären Ausdrücke mit den zugehörigen Ersetzungstex- ten ist in der Abbildung 3.3 dargestellt. Im Kombinationsfeld mit dem Etikett „Katalog“

kann ausgewählt werden, ob die Ersetzungsregeln zu den Probenmaterialien, Mikroorga- nismen oder zu den vorberichtlichen Informationen bearbeitet werden sollen. Das weiß hinterlegte Listenfeld auf der linken Seite enthält die Katalogeinträge, für die Regeln for- muliert sind. Wenn man einen oder mehrere dieser Einträge auswählt, werden nur noch die zu diesen gehörende Regeln angezeigt. In der Abbildung 3.3 ist das Probenmaterial Stroh ausgewählt, so dass nur die drei hierfür vorhandenen Regeln zu sehen sind.

Die markierte Regel ist von der Anwendung ausgenommen (deaktiviert), um später zu demonstrieren, wie die Regeln schrittweise verfeinert werden können. Deaktivieren lassen sich Regeln, indem man das Häkchen am Zeilenanfang entfernt. Diese deaktivierten Regeln werden nicht angewendet.

Damit einmal formulierte Regeln auch wieder gelöscht werden können, müssen diese de- aktiviert und anschließend die Befehlsschaltfläche „deaktivierte Regeln löschen“ angeklickt werden. Nach der Rückfrage, ob das wirklich gewünscht ist, werden alledeaktivierten Re- geln gelöscht.

Beim Klicken auf die Befehlsschaltfläche „Transformation anwenden“ startet das Pro- gramm, welches das Regelwerk auf die Daten des gewählten Bereiches (Probenmaterial, vorberichtliche Informationen, kulturell nachgewiesene Mikroorganismen) anwendet. Sind alle Daten transformiert, wird das Ergebnis angezeigt. Die Daten können auch wiederholt angezeigt werden, wenn auf die Befehlsschaltfläche „zeige die Daten“ geklickt wird (siehe hierzu die Abbildungen 3.5, 3.6 und 3.7).

Damit sind alle Voraussetzungen vorhanden, die Freitexte mittels eines Regelwerkes so

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