C y t o c h r o m P 4 5 0 1 A 1 ( G e n o t y p i s i e r u n g )
Anwendbarkeit Analyt. Messprinzip
Bestimmung aus genomischer DNA aus Blutzellen PCR-RFLP
Zusammenfassung
Das Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) ist ein Phase-I-Enzym, dessen Bedeutung im Fremdstofimetabolismus auch in Teil I, Kapitel 12 dieses Werkes besprochen wur- de. Beim das CYP1A1 kodierenden Gen ist das Vorkommen mehrerer Varianten bekannt, bei denen jeweils einzelne Nukleotide der DNA-Sequenz verändert sind.
Mit der vorliegenden Genotypisierungsmethodik unter Anwendung der Polymera- sekettenreaktion (PCR) lässt sich feststellen, ob im Genom der Probanden solche Varianten des CYP1A1-Gens vorliegen. Zunächst wird aus Blutzellen genomische DNA isoliert. In zwei getrennten PCR-Ansätzen werden ausgehend von je ca. 104
Kopien des diploiden Genoms als Matrize mit Hilfe der PCR definierte Sequenzbe- reiche stark vervielfältigt. Die 334 bp bzw. 312 bp langen Sequenzbereiche aus dem 3�-nicht translatierten Bereich und dem Exon 7 des CYP1A1-Gens werden mit Restriktionsendonucleasen gespalten. Nach anschließender Gelelektrophorese un- ter Zusatz von Ethidiumbromid werden die verschiedenen DNA-Fragmente im UV- Licht nachgewiesen. Die Dokumentation erfolgt fotografisch bzw. digital.
Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1)
Cytochrome P450 (E.C. 1.14.14.1) sind Häm enthaltende mikrosomale Proteine, die eine wichtige Rolle bei der Oxidation toxischer und carcinogener Chemikalien im Phase-I-Metabolismus von Xenobiotika und Endobiotika spielen [1-3]. Das zurzeit bevorzugte System der Nomenklatur und Symbolisierung von P450-Enzy- Analytische Methoden Band 2
Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft - Arbeltsgruppe �Analytische Chemie�
men und ihrer Gene benutzt das Symbol CYP gefolgt von einer Zahl für die Familie und einem Buchstaben für die Unterfamilie. CYP1 ist die Bezeichnung für eine Fa- milie von P450-Genen [4], die beim Menschen auf dem Chromosom 15 und bei der Maus auf dem Chromosom 9 liegen. Die Expression von Cytochrom-P450-Genen der Klasse 1 wird durch Vermittlung des Ah-Rezeptors induziert.
Etwa 10% der Weltbevölkerung besitzt eine hoch induzierbare Form des Enzyms, was mit einer etwa siebenfachen Erhöhung des Lungenkrebsrisikos bei leichten Rauchern in Zusammenhang gebracht wurde [5]. Auf genetischer Ebene wurde un- ter den CYP1A1-Allelen eine bei Kaukasiern und anderen Ethnien besonders häufi- ge Form und seltene Abweichungen davon in je einem Nukleotid an bislang vier Stellen festgestellt [6]. Diese Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNP) wurden in der Reihenfolge ihrer Entdeckung nummeriert (Tabelle 1). Der Msp I-Polymorphismus im 3'-nicht-transkribierten Bereich (ml) wurde bei Japanern mit einer Erhöhung des Krebsrisikos in Verbindung gebracht [7], die sich auf verstärkte CYP1A1-Expression und Aktivität zurückführen ließ [8]. In der japanischen Bevölkerung wurde die als m2 bezeichnete Missense-Muta- tion im Exon 7 gefunden, die zum 1462V-Austausch führt und an den Msp I-Poly- morphismus gekoppelt ist [9]. In stimulierten Lymphozyten war die Induzierbarkeit der CYP1A1-mRNA-Expression und Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)-Akti- vität durch 1 µM 3-Methylcholanthren bei Trägern eines Va1462-Allels (m2) er- Tab. 1. Bekannte Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im CYP1A1-Gen in der Reihenfolge ihrer Beschreibung.
SNP wt ml m2 m3 m4
CYP1A1-Alleld
[6]
*1 *2A
*2B *3
*4
[ 1 4 ]
*1 *2
*3 *4
*5
Mutationa
T6235C (T3801C) A4889G (A2455G)c
T5639C(T3205C) C4887A(C2455A)
Auswirkung
Ile462Val Thr 461Asn
Nachweisb
+ Msp I
� BsrD I + Msp I
� Bsa I
Referenz
[6] [9]
[11]
[6]
a Nukleotidpositionen nach [6]. In Klammern ist die in [13] verwendete Nummerierung ange- geben.
b Durch die Basenaustausch-Mutationen entstandene (+) oder verlorene (-) Erkennungsse- quenzen für Restriktionsenzyme.
c Genetisch gekoppelt an Msp I-Polymorphismus (ml). Wenn die ml- und m2-Varianten gleichzeitig vorliegen handelt es sich nach [13] um das *2B-Allel.
d Unter den teilweise unterschiedlichen Nomenklatursystemen gilt das aus [6] hervorgegange- ne auf der Website des CYP-Nomenklatursystems [13] publizierte als verbindlich. Nach [15]
besteht außer bei Asiaten keine Kopplung zwischen ml und m2, so dass das als Untergruppe der Träger des Msp I-Polymorphismus (ml) aufgefasste CYP1A1 *2B-Allel [6] als eigenstän- diges Allel geführt wird.
höht, während der Msp I-Polymorphismus (ml) allein keine Auswirkung hatte [10]. Die Auswirkung des I462V-Polgmorphismus auf die CYP1A1-Induzierbar- keit ist in den Lymphozyten von Rauchern erheblich verstärkt. Ein weiterer Msp I- Polymorphismus im 3'-nicht translatierten Bereich (m3) kommt hauptsächlich bei Afrikanern vor [11]. Der Thr461Asn-Austausch (m4) ist an keinen der anderen SNP im CYP1A1-Gen genetisch gekoppelt und scheint für das Lungenkrebsrisiko keine Bedeutung zu haben [6].
Mit Hilfe der Angaben in Tabelle 3, nämlich der EMBL-Zugangsnummern und der durch die Primer abgedeckten Sequenzbereiche, lassen sich die DNA-Sequenzen der erzeugten PCR-Produkte rekonstruieren. Die Zählung der Nukleotidpositionen für die Lage der Nukleotidaustausche beginnt am Nukleotid 1931 der EMBL- DNA-Sequenz Nr. X02612 [6, 12]. Im Gegensatz dazu wird im Kommentar der Da- tenbank-Sequenz der Transkriptionsstart und Beginn des Exons 1 bei Nukleotid 1599 angegeben. Um die in Tabelle 1 wiedergegebene Nummerierung [6, 10] zu erhalten, wurden die Basen 1-1931 aus der genomischen CYP1A1-DNA-Sequenz (EMBL #X02612) entfernt (d.h. Basen Nr. 1931�8030 übernommen) und die Ba- sen 264�650 aus EMBL #D12525 am Ende eingefügt, so dass eine Sequenz mit 6485 bp entstand, die alle hier untersuchten Polymorphismen enthält. Im Gegensatz dazu wird auf dem Website des CYP-Nomenklatur-Komitees [13] eine Zählweise mit Bezug auf das erste Nukleotid des Startcodons verwendet, das nach der hier ver- wendeten Nummerierung an Position 2434 liegt.
Die Allelfrequenzen der häufigsten CYP1A1-Allele bei verschiedenen Ethnien sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tab. 2. Nomenklatur und Häufigkeit (%) der wichtigsten CYP1A1-Allele bei verschiedenen Ethnien.
CYP1A1-Allela
[6]
*1 *2A
*2B *3
*4
[15]
*1 *2
*3 *4
*5
SNP
ml (ml), m2 m3 m4
Kaukasier (n = 880) [6]
89,2 5,1 (-2,7) 2,7 0,0 3,0
Japaner (n=240) [14]
79,8 k.A.b
20,2 k.A.
k.A.
Afrikaner (n = 59) [11]
61,0 25,5 13,6 0,0 k.A.
a Nach [15] besteht außer bei Asiaten keine Kopplung zwischen ml und m2, so dass das als Untergruppe der Träger des Msp 1-Polymorphismus (ml) aufgefasste CYP1A1*2B-Allel [6]
als eigenständiges Allel geführt wird.
b k.A.: keine Angaben. Die nicht bestimmten Allele konnten für die Häufigkeiten nicht berück- sichtigt werden.
Die anfänglich mit dem ml-Polymorphismus assoziierte Risikoerhöhung für Lun- genkrebs wurde funktionell auf den bei ca. 50% der Kaukasier und Japaner daran gekoppelten m2-Polymorphismus zurückgeführt. Zur Ermittlung von Probanden, bei denen CYP1A1 hoch induzierbar ist, reicht deshalb die Bestimmung des I462V- Polymorphismus aus. Da der m2-Polymorphismus eine Aktivitätserhöhung be- wirkt, stellt die Valin-Form das dominante Allel dar, so dass sich die erhöhte Indu- zierbarkeit auch bei heterozygoten Trägern zeigt. Homozygote zeigen die erhöhte Induzierbarkeit noch deutlicher, sind bei Kaukasiern auf Grund der Allelfrequenz jedoch nur zu 0,07% der Bevölkerung zur erwarten. Die Rolle des m4-Polymor- phismus ist noch nicht geklärt. Für das Risiko, an akuter lymphatischer Leukämie (ALL) zu erkranken, haben die Allele *2A und * 4 gegensätzliche Effekte, nämlich ein erhöhtes ALL-Risiko, bzw. Schutz vor ALL bei Mädchen [16].
Für die Ermittlung des Krebsrisikos ist unter Umständen die Feststellung ungünsti- ger Genotypkombinationen interessant, z.B. die Kombination des hochinduzierba- ren CYP1A1-Genotyps mit der homozygoten Deletion von Glutathion-S-Transfera- sen. Dies ist auch mit der in diesem Werk beschriebenen Methode zur Multiplex- PCR von GST-, GST- und CYP1A1-Sequenzen möglich, wenn anschließend, wie im vorliegenden Kapitel beschrieben, zwei bekannte Punktmutationen im Exon 7 des CYP1A1-Gens durch Restriktionsanalyse der Multiplex-PCR-Produkte ermittelt werden.
Autoren: G. Krause, G. Scherer Prüfer: H.-P. Rihs, T. Schulz
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1 Grundlage des Verfahrens
Aus einer Human-Blutprobe wird die Lymphozyten-DNA isoliert. Mittels PCR (polymerase-chain-reaction) erfolgt die Amplifikation der DNA für zwei Fragmen- te mit 312 und 334 bp (Basenpaare) (Abbildung 1). Das Amplifikat der PCR wird mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten. Nach anschließender Gelelektrophorese unter Zusatz von Ethidiumbromid werden die verschiedenen DNA-Fragmente im UV-Licht nachgewiesen. Die Dokumentation erfolgt fotogra- fisch (Abbildung 3), die Zuordnung der Allele anhand des Vorhandenseins von Restriktionsfragmenten.
Abb. 1. Amplifikations- und Restriktionsschritte zur CYP1A1-Genotypisierung. Die Längenan- gaben in bp beziehen sich auf das erste Nukleotid des Startcodons. Die Restriktionsmuster der Referenzsequenz sind über den Amplifikaten dargestellt, die der seltenen Varianten darunter.
2 Geräte, Chemikalien, Lösungen, Gele 2.1 Geräte
Horizontal-Elektrophorese und Stromversorgung, (z. B. Subcell Model 192 und Po- wer Pac 300, Biorad)
Horizontal-Elektrophorese-Apparatur (z. B. peqlab Biotechnologie, Erlangen) und Stromversorger (z.B. EPS-301, Amersham Biosciences)
500-µL-PCR-Röhrchen mit Deckel (z. B. peqlab Biotechnologie) Becherglas, 50 mL
Eisbad
Gewindeflasche, 500 mL aus Duranglas Magnetrührer mit Heizung
Messkolben, 200 mL
Mikroliterpipetten: 2-20 µL, 20-200 µL (z.B. Gilson) Mikrowelle, 600 Watt (z. B. Sharp)
Pipettenspitzen, steril, mit Aerosol dichten Filtern (z. B. peqlab Biotechnologie) Reaktionsgefäße mit Deckel, 1,5 und 2,0 mL (z.B. Eppendorf safe-lock) Schüttelgerät Vortex (z. B. Heidolph)
Spektralphotometer (z. B. Hewlett-Packard 8452A) mit Ultramikro-Quarküvette Thermocycler (z. B. ProGene, Techne)
UV-Transilluminator und Dokumentationssystem, Film zur Geldokumentation Wasserbad (z. B. mge; Lauda CS20)
Zentrifuge für 0,5-mL- oder 1,5-mL-Reaktionsgefäße Zentrifuge für Reaktionsgefäße (z.B. Eppendorf 5415C)
2.2 Chemikalien 2.2.1 DNA-Isolierung
Die DNA-Isolierung erfolgt mittels kommerzieller Kits für 5 mL oder 2 mL Blut (z. B. QIAamp-Blood-Kit der Firma Qiagen)
2.2.2 Reagenzien für die PCR
10-fach konzentrierter PCR-Puffer inklusive Magnesiumchlorid (15 mM MgCl2; wird vom Hersteller der DNA-Taq-Polymerase mitgeliefert (z.B. Perkin-Elmer, Sigma)
bidestilliertes Wasser (autoklaviert, DNAse-frei)
Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) (100 mM, z.B. Amersham-Biosciences) Restriktionsenzyme Msp I, Bsa I, BsrD I (20000, 5000, 2000 U/mL, z.B. New England Biolabs)
Restriktionsenzym-Puffer, 10-fach konzentriert, wird vom Hersteller der Restrikti- onsenzyme mitgeliefert
Rinderserumalbumin (BSA), 100 µg/mL, wird, wenn erforderlich, vom Hersteller der Restriktionsenzyme mitgeliefert
steriles Wasser für die Amplifikation, 10-mL-Ampullen (z. B. aus der Apotheke) Thermostabile Taq-DNA-Polymerase (5 U/µL z. B. Perkin-Elmer, Sigma) 2.2.3 Primer
Tabelle 3 zeigt die Sequenzen der in der vorliegenden Genotypisierungsmethode als PCR-Primer eingesetzten Oligonukleotide. Auftragssynthesen von Oligonu- kleotiden werden von zahlreichen Firmen und Instituten durchgeführt. Ein 50- nmol-Synthesemaßstab ist ausreichend auch für größere Genotypisierungsprojekte mit einigen hundert Probanden. Für einfache PCR-Anwendungen wie die vorlie- Tab. 3. Verwendete Primer-Oligonukleotide.
Bezeichnunga
1A1Msp I-fw 1A1Msp I-re 1A1x7-fw 1A1x7-re
Sequenz (5' � 3')
(Bereich in Referenzsequenz) AAG AGG TGT AGC CGC TGC ACT (271-291)
TAG GAG TCT TGT CTC ATG CCT (605-585)
GAA CTG CCA CTT CAG CTG TCT (6654-6674)
CAG CTG CAT TTG GAA GTG CTC (6965-6945)
Länge (Nukleotide) 21
21 21 21
MW 6455 6391 6343 6423
EBI- Nr. (bp)b
D12525 (650) X02612 (8018)
a Die hier gewählten Primernamen nennen das Zielgen und die Orientierung bezüglich der Transkriptionsrichtung. Fw: �forward�, Sinnstrang; re: �revers komplementär�, Antisense- Strang.
b Zugangsnummer in der DNA-Sequenz-Bank des �European Molecular Biology Laboratory (EMBL)� über das �European Bioinformatics Institute (EBI)�. Die Quellensequenzen sind z. B. über http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/emblfetch kostenlos im Internet zugänglich.
gende Genotypisierung ist die Verwendung �standard-entsalzter� Oligonukleotide ausreichend, d.h. eine HPLC-Reinigung oder besondere Entsalzung ist nicht erfor- derlich.
Die Primer werden in sterilem Wasser so gelöst, dass Konzentrationen von 5 pmol/
µL (5 µM) zur Verfügung stehen. Die Lagerung erfolgt bei -20 °C. Unter diesen Bedingungen sind die Primer ca. 1 bis 2 Jahre haltbar.
2.2.4 Reagenzien für die Agarose-Gelelektrophorese Agarose (z. B. Invitrogen, Karlsruhe)
Bromphenolblau, Natriumsalz (z. B. Sigma)
DNA-Standards: quantifizierte 200-, 500-, 1000-bp-Fragmente bzw. 100-bp-Leiter (z. B. Roth, MBI Fermentas)
Eisessig (z. B. Merck)
Ethidiumbromidlösung (10 mg/mL, z.B. Roth, Karlsruhe). Dunkel lagern! Muta- gen!
Na2-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat) p. a. (z. B.
Merck)
Saccharose (z. B. Merck)
TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), p. a. (z. B. Merck) Xylencyanol (z. B. Sigma)
2.3 Lösungen
Die nachfolgend genannten Einwaagen, Ansätze und Volumina wurden, wenn nicht anders angegeben, abgestimmt auf die gleichzeitige Amplifikation von 20 PCR- Ansätzen mit einem Volumen von jeweils 50 µL pro Ansatz. Diese Angaben sind ggf. auf die jeweiligen Gerätegegebenheiten im Labor des Anwenders anzupassen.
Lösungen, die für die Spaltung der PCR-Amplifikate mit den angegebenen Restrik- tionsenzymen sowie der sich anschließenden gelelektrophoretischen Auftrennung benötigt werden, wurden so ausgelegt, dass jeweils eine Doppelbestimmung der verschiedenen Polymorphismen möglich ist.
50-fach konzentrierter TAE-Puffer (TRIS-Acetat-Elektrophorese-Puffer) In einen 200-mL-Messkolben werden 48,5 g (2 mol) TRIS eingewogen. Man fügt etwa 100 mL bidestilliertes Wasser hinzu und schwenkt den Kolben bis eine klare Lösung entstanden ist. Anschließend fügt man 11,5 mL (0,2 mol) Eisessig und 7,4 g EDTA-Dinatriumsalz (0,02 mol) hinzu und schwenkt erneut um bis eine klare Lösung entstanden ist. Anschließend den Messkolben mit bidestilliertem Wasser bis zu Marke auf. Diese Lösung ist mehrere Monate haltbar.
1-fach konzentrierter TAE-Puffer
4 mL des 50-fach konzentrierten TAE-Puffers (s.o.) werden in einen 200-mL- Messkolben gegeben. Der Kolben wird unter gelegentlichem Umschwenken mit bi- destilliertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Dieser Puffer ist mehrere Monate haltbar.
Saccharose-Gelladepuffer mit Bromphenolblau und Xylencyanol
In ein 50-mL-Becherglas werden 8 g Saccharose eingewogen. Man fügt 10 mL ste- riles, bidestilliertes Wasser hinzu und löst die Saccharose unter leichtem Rühren (Magnetrührer). Anschließend werden der Lösung 250 mg Bromphenolblau und 250 mg Xylencyanol zugesetzt und unter leichtem Umschwenken gelöst. Von die- sem Material werden 0,5 mL Aliquote (ausreichend für jeweils 100 elektrophoreti- sche Trennungen) in verschließbare Reaktionsgefäße pipettiert und bei ca. -18°C im Tiefkühlschrank aufbewahrt.
DNA-Längenstandards
Zur Kalibrierung der Gelelektrophorese werden Gemische von DNA-Molekülen bekannter Länge (z.B. 200, 500 und 1000 bp) und Menge verwendet (s. Abbildung 2). Bei Verwendung von drei separat gelieferten Fragmentgrößen (z.B. von Roth) werden zunächst pro Fragmentgröße je 10 µg der DNA-Fragmente in je 50 µL ste- rilem bidestilliertem Wasser gelöst, so dass DNA-Stammlösungen mit Konzentra- tionen von je 0,2 mg/mL entstehen.
Zur Herstellung einer DNA-Kalibrierlösung werden in ein PCR-Röhrchen mit De- ckel 112 µL Wasser und 50 µL Saccharose-Gelladepuffer pipettiert. Anschließend werden 50 µL, 25 µL und 12,5 µL der Stammlösungen der Fragmente von 1000, 500 und 200 bp Länge hinzupipettiert.
Die DNA-Kalibrierlösungen wie auch die DNA-Stammlösungen sind eingefroren bei etwa -20°C und sind unter diesen Bedingungen mehrere Monate haltbar. Von
der DNA-Kalibrierlösung werden pro gelelektrophoretischer Auftrennung 5 µL in die äußere Geltasche geladen.
Alternativ dazu kann auch eine 100-bp-Leiter eingesetzt werden (z.B. von MBI:
ergibt 11 DNA-Banden in der Größe von 80 bis 1000 bp. Die Gesamt-DNA-Kon- zentration beträgt hier 500 ng/µL). Zur Herstellung einer DNA-Kalibrierlösung werden in ein PCR-Röhrchen mit Deckel 400 µL Wasser, 50 µ L Saccharose-Gella- depuffer sowie 50 µL DNA-Leiter (von MBI) pipettiert. Diese DNA-Kalibrierlö- sung wird in 50 µL Aliquoten tiefgefroren bei ca. -20°C gelagert und ist unter die- sen Bedingungen mehrere Monate haltbar. Von dieser DNA-Kalibrierlösung wer- den pro gelelektrophoretischer Auftrennung 5 µL in die äußere Geltasche geladen.
Desoxynucleosidtriphosphat(dNTP)-Mix (1 mM)
In ein 500-µL-Reaktionsgefäß mit Deckel werden jeweils 5 µL dATP, dCTP, dGTP und dTTP sowie 480 µL Wasser pipettiert. Das Reaktionsgefäß wird verschlossen und intensiv geschüttelt. Dieser dNTP-Mix ist analysentäglich frisch herzustellen.
Taq-Enzymmix
In ein 500-µL-PCR-Röhrchen mit Deckel werden 25 µL Wasser, 50 µL 10-fach konzentrierter Reaktionspuffer und 25 µL DNA Taq-Polymerase-Lösung (5 U/µL) pipettiert. Das Reaktionsgefäß wird verschlossen und intensiv geschüttelt. Dieser Enzymmix ist analysentäglich frisch herzustellen.
2.3.1 Lösungen zur Bestimmung der Sequenzvariation g.3801T � C auf Intron 7
PCR-Mastermix für 20 Proben in 50-µL-Ansätzen zur Bestimmung des in den
*2A- und *2B-Allelen vorliegenden Msp I-Polymorphismus (Sequenzvariation g.3801T � C in der 3'-flankierenden Region)
Im Mastermix werden mit Ausnahme der Taq-Polymerase all diejenigen Lösungen und Chemikalien vereinigt, die für die Amplifikation eines Nukleinsäureabschnitts aus der 3'-flankierenden Region benötigt werden, aus dem die Sequenzvariation g.3801T � C mittels Msp I-RFLP bestimmt wird. Das Volumen des Mastermixes ist so ausgelegt, dass mit ihm etwa 20 DNA-Proben amplifiziert werden können.
Ein solcher Mastermix ist analysentäglich frisch herzustellen.
In ein 1,5-mL-Reaktionsgefäß mit Deckel werden dazu die in Tabelle 4 aufgeführ- ten Reagenzienvolumina pipettiert. Anschließend wird das Ganze durch intensives Schütteln gut vermischt.
Tab. 4. Ansatz des PCR-Mastermix zur Bestimmung der Allele *2A und *2B (Sequenzvariation g.3801T � C im 3'-flankierenden Bereich).
Reagenzien
10-fach-PCR-Puffer (inkl. MgCl2) 1 mM dNTP-Mix
5 uM Primer lAlMsp I-fw 5 µM Primer 1A1Msp I-re H2O bidest. (steril!)
Reagenzienvolumina 96 µL
200 µL 60 µL 60 µL 244 µL
Endkonzentration*
1-fach PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) 200 µM pro dNTP 0,30 µM 0,30 µM
* Die hier angegebene Endkonzentration bezieht sich auf das Volumen nach zusätzlicher Zu- gabe von jeweils 5 µL DNA-Probe zu 43 µL Mastermix und 2 µL Taq-Enzymmix in einer Einzelprobe.
Mastermix Restriktionsenzym Msp I
In ein 500-µL-PCR-Röhrchen mit Deckel werden 70 µL bidestilliertes, steriles Wasser, 75 µL 10-fach Restriktionsenzym-Puffer und 5 µL Msp 1 (20.000 U/mL), pipettiert. Das Gefäß wird verschlossen und intensiv geschüttelt. Dieser Mastermix ist analysentäglich frisch herzustellen und bis zur Verwendung im Eisbad aufzube- wahren. Die Menge dieses Mastermixes ist für 50 Ansätze ausgelegt und aus- reichend, um aus 20 PCR-Ansätzen die Msp 1-Restriktionsschnitte jeweils getrennt voneinander doppelt vorzunehmen.
2.3.2 Lösungen zur Bestimmung der Sequenzvariationen g.2453C � A bzw.
g.2455G � A auf Exon 7
Nachfolgend wird das Ansetzen der Mastermixes zur Amplifikation des CYP1A1- Exon Nr. 7 und anschließender RFLP-Analyse beschrieben. Alternativ können auch kommerziell erhältliche Ready-to-go-Beads eingesetzt werden. Bei Verwen- dung solcher Beads (lyophilisierte Perlen) kann die Herstellung von Mastermix und Taq-Enzymmix entfallen. Eine Vorschrift zur Bestimmung der Sequenzvariationen g.2453C � A bzw. g.2455G � A unter Verwendung von Ready-to-go-Beads findet sich im Addendum im Anschluss an diese Vorschrift.
PCR-Mastermix für 20 Proben in 50-µL-Ansätzen zur Bestimmung des 1462V- Polymorphismus (Sequenzvariation g.2453C � A und g.2455G � A auf Exon 7) Im Mastermix werden mit Ausnahme der Taq-Polymerase all diejenigen Lösungen und Chemikalien vereinigt, die für die Amplifikation eines Bereichs aus dem Exon
7 benötigt werden, in dem die Sequenzvariationen g.2453C � A bzw. g.2455G � A mittels BsrD I- bzw. Bsa I-RFLP bestimmt werden können. Das Volumen des Mastermixes ist so ausgelegt, dass mit ihm etwa 20 DNA-Proben amplifiziert wer- den können. Ein solcher Mastermix ist analysentäglich frisch herzustellen.
In ein 1,5-mL-Reaktionsgefäß mit Deckel werden dazu die in Tabelle 5 aufgeführ- ten Reagenzienvolumina pipettiert. Anschließend wird das Ganze durch intensives Schütteln gut vermischt.
Tab. 5. Ansatz des PCR-Mastermixes zur Bestimmung der *2B und *2V-Allele (Sequenzvaria- tion g.2453C � A und g.2455G � A auf Exon 7).
Reagenzien
10-fach-PCR-Puffer (inkl. MgCl2) 1 mM dNTP-Mix
5 µM Primer 1A1x7-fw 5 µM Primer 1A1x7-re H2O bidest. (steril!)
Reagenzienvolumina 96 µL
200 µL 60 µL 60 µL 244 µL
Endkonzentrarion*
1-fach PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) 200 µM pro dNTP 0,30 µM 0,30 µM
* Die hier angegebene Endkonzentration bezieht sich auf das Volumen nach zusätzlicher Zu- gabe von jeweils 5 µL DNA-Probe zu 43 µL Mastermix und 2 µL Taq-Enzymmix in einer Einzelprobe.
Mastermix Restriktionsenzym BsrD I
In ein 500-µL-PCR-Röhrchen mit Deckel werden 375 µL bidestilliertes, steriles Wasser, 75 µL 10-fach Restriktionsenzym-Puffer und 50 µL BsrD I (2000 U/mL).
Das Gefäß wird verschlossen und intensiv geschüttelt. Dieser Mastermix ist analy- sentäglich frisch herzustellen und bis zur Verwendung im Eisbad aufzubewahren.
Die Menge dieses Mastermixes ist für 50 Ansätze ausgelegt und ausreichend, um aus 20 PCR-Ansätzen die BsrD I-Restriktionsschnitte jeweils getrennt voneinander doppelt vorzunehmen.
Mastermix Restriktionsenzym Bsa I
In ein 500-µL-PCR-Röhrchen mit Deckel werden 420 µL bidestilliertes, steriles Wasser, 75 µL 10-fach Restriktionsenzym-Puffer und 5 µL Bsa I (5000 U/mL), pi- pettiert. Das Gefäß wird verschlossen und intensiv geschüttelt. Dieser Mastermix ist analysentäglich frisch herzustellen und bis zur Verwendung im Eisbad aufzube- wahren. Die Menge dieses Mastermixes ist für 50 Ansätze ausgelegt und aus- reichend, um aus 20 PCR-Ansätzen die Bsa I-Restriktionsschnitte jeweils getrennt voneinander doppelt vorzunehmen.
2.4 Gele
Agarose-Gel (1,5%)
1,5 g Agarose werden in 100 mL 1-fach TAE-Puffer durch Erhitzen bis zum Siede- punkt gelöst (Mikrowelle 600 Watt, 500 mL Gewindeflasche aus z. B. Duranglas verwenden). Dabei ist auf Siedeverzüge zu achten (zwischendurch schwenken).
Anschließend werden 5 µL (10 mg/mL) Ethidiumbromid-Lösung (Vinylhandschu- he tragen, Vorsicht: mutagen!) pro 100 mL Gesamtvolumen zugesetzt. Die herge- stellte Agaroselösung wird unter leichtem Rühren auf etwa 60�80°C abgekühlt und in den vorher vorbereiteten Gelgießstand (Einsetzen des Geltabletts und der Gel- kämme) gegossen. Das Gel steht für zwei Stunden bei Raumtemperatur zum Er- starren. Für die angegebenen Mengen kann ein Gel von 25 cm Breite und 7,5 cm Höhe mit 50 Taschen hergestellt werden. Zur Aufbewahrung kann es in Frischhalte- folie für Lebensmittel verpackt und bis zu 5 Tage im Kühlschrank gelagert werden.
3 Probenaufarbeitung 3.1 Lagerung
EDTA-Vollblutproben können zunächst ohne weitere Aufarbeitung bei -20 °C ein- gefroren werden. Sie sind so über mehrere Monate stabil. Nach dem Auftauen muss die Probe zur Homogenisierung gründlich geschwenkt werden.
3.2 DNA-Isolierung
Die DNA-Isolierung erfolgt mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des je- weiligen Herstellers.
Bei dem hier von den Autoren eingesetzten, kommerziellen System wird Vollblut mit einem Puffer lysiert und zur Denaturierung der Proteine mit Protease inkubiert.
Das Lysat wird mit Ethanol versetzt und auf ein zentrifugierbares Silica-Säulchen gegeben. Dort bindet die DNA an der Silica-Matrix unter Anwesenheit von hohen Salzkonzentrationen und Ethanol sowie bei niedrigem pH-Wert. Nach dem Wa- schen der Säule (Entfernung der Proteine und Auswaschung der hohen Salzkonzen- tration) wird die DNA mit dem Elutionspuffer, der einen pH-Wert von 7,0-9,0 hat, von der Säule eluiert. In diesem Puffer kann die DNA 1-2 Jahre im Kühlschrank aufbewahrt werden. Ein Aliquot des Eluats kann direkt für die PCR eingesetzt wer- den.
3.3 Bestimmung der Reinheit und Konzentration der DNA
Die Reinheit und Konzentration der DNA kann durch Messung der optischen Dich- te (OD) der DNA-Probe erfolgen. Dazu werden 20 µL der DNA in Elutionspuffer mit 680 µL Wasser (autoklaviert) für die Messung verdünnt. Nukleinsäuren haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, Proteine bei 280 nm; der Quotient dieser beiden Messwerte ist daher ein Maß für die Reinheit der Nukleinsäure. Das Verhält- nis OD260/OD280 sollte für doppelsträngige (ds) DNA 1,6-2,0 betragen.
Zucker absorbieren bei 230 nm, so dass das Verhältnis OD230/OD260 ebenfalls ein Maß für die Reinheit ist (Soll: 0,3-0,9).
Mit der Extinktion bei 260 nm lässt sich die Konzentration der DNA berechnen:
A260 = OD260 = 1 für eine 50 µg/mL Lösung.
4 Vorbereitung und Durchführung der PCR
Allgemeine Hinweise für die PCR-Technik finden sich in Teil II, Kapitel 15 zu die- ser Lieferung.
Alle Reagenzien werden, sofern nicht anders beschrieben, in Aliquoten bei -20 °C eingefroren, benötigte Mengen werden vor der PCR aufgetaut und im Kühlblock für PCR-Reagenzien bzw. in einem Eisbad bis zum Pipettieren aufbewahrt. Beim Ansetzen der PCR sind Handschuhe zu tragen, um eine Kontamination der Probe mit Fremd-DNA und DNAsen, die zum Abbau von DNA führen, zu vermeiden.
Es ist zu beachten, dass die Amplifikation der DNA-Proben zur Analyse des ml- SNP im 3'-flankierendem Bereich mit anderen Primern erfolgt, als im Falle der m2- und m4-SNPs auf Exon 7. Es ist also nötig, die gewonnene DNA in zwei PCR-An- sätzen getrennt voneinander mit unterschiedlichen Primern zu amplifizieren. In ei- nem Ansatz wird ein DNA-Abschnitt (334 bp-Amplifikat) auf Intron 7 amplifiziert, der weiterbehandelt wird mit dem Restriktionsenzym Msp I. Aus dem anderen An- satz (312 bp-Amplifikat) erfolgt die Ermittlung der beiden auf Exon 7 lokalisierten SNPs. Hier muss jedoch wegen unterschiedlicher Inkubationstemperaturen die Be- handlung mit Restriktionsenzymen (BsrD I und Bsa I) getrennt erfolgen.
4.1 PCR
Sämtliche einzusetzende Lösungen werden vor ihrem Gebrauch in einem Eisbad gekühlt. In für den Thermocycler geeignete PCR-Röhrchen legt man 43 µL des je- weiligen PCR-Mastermix (getrennt arbeiten für die Analyse der SNPs auf Exon 7 und Intron 7) vor und kühlt die Proben in einem Eisbad. Anschließend pipettiert
man 5 µL DNA-Probe (ca. 100 ng DNA) hinzu und homogenisiert, indem man mit einer Pipette die Proben mehrfach aufsaugt und zurück pipettiert.
Nach dem Pipettieren und Mischen aller Reagenzien werden die Probengefäße ver- schlossen. Die PCR-Röhrchen werden kurz zentrifugiert (800 U/min), um even- tuelle Luftblasen zu beseitigen und die Flüssigkeitsvolumina im Boden der Röhr- chen zu sammeln. Anschließend werden die Ansätze in das PCR-Gerät gestellt.
Nach Erhitzen auf 94 °C werden zu den Ansätzen jeweils 2 µL Taq-Enzym-Mix hinzupipettiert. Das zuvor gemäß der nachfolgenden Tabelle 6 programmierte Ge- rät wird unmittelbar gestartet. Bei Verwendung einer hitzeaktivierbaren Taq-Poly- merase (z. B. AmpliTaq Gold, Perkin-Elmer) wird der erste Denaturierungsschritt auf 10 Minuten verlängert. Im letzten Schritt wird das Amplifikat bis zur Weiter- verarbeitung im Gerät gekühlt aufbewahrt.
Falls der im Labor des Anwenders vorhandenen Thermocycler über eine entspre- chende Programmiermöglichkeit verfügt, kann alternativ mit einem sog. �Touch- down�-PCR-Protokoll gearbeitet werden. Im Addendum zu dieser Vorschrift findet sich ein entsprechendes Thermocyclerprogramm.
Tab. 6. Thermocycler-Programm für die Amplifikationen zur CYP1A1-Genotypisierung.
Denaturierung Denaturierung Annealing Extension
Abschließende Extension Kühlung
94 °C 94 °C 64 °C 72 °C 72 °C 4°C
5 min 1 min 1 min 1 min 7 min
�
35 Zyklen
4.2 Spaltung der PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen
Nach erfolgreicher Amplifikation können pro Probe mehrere Aliquote der PCR- Produkte (z. B. zur Mehrfachanalyse) getrennt voneinander (entsprechend Tabelle 7) weiterverarbeitet und den Restriktionsschnitten unterzogen werden.
Dazu versetzt man jeweils 5 µL des Produkts der jeweiligen PCR mit jeweils 10 µL des entsprechenden Restriktionsenzym-Mastermixes und inkubiert die Proben in einem thermostatisierbaren Wasserbad mit den in Tabelle 7 angegebenen Bedin- gungen. Diese Zeiten ergeben sich aus den Angaben der Enzym-Hersteller und den Erfahrungen der Autoren.
Tab. 7. Restriktionsschnitte für die Amplifikate der PCR.
Produkt PCR
Restriktionsenzym-Mastermix Inkubationszeit
Inkubationstemp.
Agarose-Gel
Erkennungsstellea (5' � 3')
Volumina für eine Probe Msp I
5 µL 3'-flankierend 10 µL (2U) 2h 37°C 1,5% Agarose C!CGG
BsrD I 5 µL Exon 7 10 µL (2U) 2 h 65 °C 1,5% Agarose GCAATGNN!, NN!CATTGC
Bsa I 5 µL Exon 7 10 µL(2U) 2h 50 °C
1,5% Agarose GGTCTCGN!
!NNNNNCGAGACC
a Die Schnittstellen sind innerhalb der Erkennungssequenz durch ��! gekennzeichnet 4.3 Elektrophorese
Die Produkte der Restriktionsschnitte werden in der Regel unmittelbar der Gelelek- trophorese zugeführt. Ist dies nicht möglich, so können die Proben im Kühlschrank bei 4-6 °C etwa eine Woche lang gelagert werden.
Es sind die in Tabelle 7 angegebenen Agarose-Gele zu verwenden. Vor dem Auf- tragen der Proben wird das Gel mit dem Geltablett in die Elektrophorese-Einheit gelegt, die mit 1-fach TAE-Puffer gefüllt ist. Das Gel muss mit Puffer bedeckt sein.
Zur Probenauftragung werden in ein PCR-Röhrchen 3 µ l Saccharose-Gelladepuf- fer mit 15 µL Produkt der Restriktionsschnitte gemischt und der gesamte Inhalt in die Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese wird beim hier verwendeten Gerät mit 100 V (konstant, entspricht 5 V pro cm Elektrodenabstand) in ca. 70 min durch- geführt. Die Trennung ist beendet, wenn die Farbstoff-Front die Gelgrenze beinahe erreicht hat. Pro Gelelektrophorese ist eine Geltasche mit 5 µL der DNA Kalibirier- lösung zu beladen.
Diese Bedingungen sind ggf. an die im Labor des Anwenders vorhandene Elektro- phoreseeinheit anzupassen.
5 Kalibrierung
Für die Fragmentlängen-Kalibrierung werden �DNA-Leitern� verwendet. Dies sind Mischungen von DNA-Fragmenten mit definierter Basenpaarzahl. In jeder Gelelektrophorese werden diese Standards in den äußeren Taschen jeder Reihe mit- analysiert.
6 Auswertung
Nach Beendigung der Elektrophorese wird das feuchte Gel auf den UV- Transillu- minator gelegt (Vinyl-Handschuhe tragen!). Bei 320 nm wird das in die DNA inter- kalierte Ethidiumbromid zur Fluoreszenz angeregt. Das erscheinende Banden- muster wird mit der Kamera des Auswertegeräts fotografiert und ausgedruckt, bzw.
digital festgehalten (Beispiel siehe Abbildung 2).
Anhand von Tabelle 8 ordnet man die Fragment-Banden den einzelnen SNPs zu.
Bei homozygoten Trägern sind dabei jeweils nur die Fragmente der Referenzse- quenz oder diejenigen der Sequenzvariation auf den Gel-Dokumentationen zu fin- den. Bei heterozygoten Trägern sind die Fragment-Banden sowohl der Referenzse- quenz als auch der jeweiligen Sequenzvariation zu erkennen.
Abbildung 2 zeigt beispielhaft die mit dem hier beschriebenen Verfahren erhalte- nen Aufnahmen der Restriktionsschnitte nach Elektrophorese.
Zum Nachweis des 1462V-Austauschs (*3; m2) wurde das 312 bp große CYP1A1- Exon7-Amplifikat mit BsrD I behandelt (Abbildung 2 (A)). In der Abbildung fal- len die Fragmente 164 und 148 beim heterozygoten Träger des m2-SNPs (A mitte) sowie beim homozygoten Referenztyp (A links) zusammen.
Abbildung 2 (B) zeigt die Gel-Dokumentation zur Untersuchung des *2-Allels nach Msp-I-Behandlung des 334 bp großen Intron 7-Amplifikats. Beim homozygo- ten Referenztyp (B Mitte) ist lediglich das Amplifikat 334 zu erkennen, ein Restrik- tionsschnitt hat nicht stattgefunden. Im Gegensatz dazu sind beim heterozygoten m2-SNP-Träer (B rechts) zusätzlich noch die Fragmente 205 und 129 nachweisbar.
Ein homozygoter Träger des m2-SNP (nicht abgebildet) zeigt nach vollständiger Restriktion lediglich die Fragmente 205 und 129. In beiden abgebildeten Fällen wurden die Ansätze zusammen mit Längenstandards (M) in einem 1,5%igen Aga- rosegel aufgetrennt.
Tab. 8. DNA-Fragmentlängen aus den Restriktionsschnitten.
Restriktions- schnitt Msp I BsrD I Bsa I
SNP ml;*2 m2;*3 m4;*5
Amplifikat 334 334 312 312 312 312
Sequenz Referenzsequenz Sequenzvariation Referenzsequenz Sequenzvariation Referenzsequenz Sequenzvariation
Fragmentlängen (bp) 334
164 158
205 148 154
129 312 312
Abb. 2. Gel-Dokumentation der DNA-Fragmente nach Amplifikation und Restriktionsschnitten (bp = Basenpaare, M = DNA-Längenstandards).
7 Qualitätskontrolle
Zur Qualitätssicherung wird ausdrücklich auf das entsprechende allgemeine Kapi- tel in diesem Werk (Teil I, Kapitel 12) verwiesen.
Laborseitig sollte folgenderweise verfahren werden:
Zur Prüfung auf DNA-Kontaminationen wird ein Leerwert mitgeführt. Dazu wird das Volumen der eigentlichen DNA-Probe durch steriles Wasser ersetzt.
Es ist zu empfehlen, bei jeder neuen PCR zur Kontrolle einige Proben mit bekann- tem unterschiedlichen Genotyp als Positivkontrolle mitzuanalysieren. Zur Verifi- zierung der PCR-Ergebnisse sollten in derselben Analyse eine willkürlich gewählte Probe in einer Doppelbestimmung analysiert werden. Dies sichert das Typisie- rungsergebnis ab und kann helfen, ein Vertauschen von Proben durch Pipettierfeh- ler aufzudecken.
8 Störeinflüsse
Grundsätzlich besteht bei allen Arbeiten zur PCR-Technik die Gefahr der Kontami- nation der Probe durch Fremd-DNA und DNAsen. Dadurch sind in dieser Methode die Amplifikationsschritte besonders kritisch. Bei allen Operationen ist deshalb auf größte Sauberkeit, Verwendung steriler Materialien und Tragen von Handschuhen zu achten, denn die größte Kontaminationsgefahr geht von den Operateuren selbst aus.
Die in der Methode verwendete DNA wird aus Blut isoliert. Blutproben können ohne Kühlung auf dem Postweg verschickt werden. Wird die DNA nicht sofort iso- liert, kann die Probe bei -20 °C eingefroren werden und ist so mehrere Monate sta- bil. Die isolierte DNA wird im Kühlschrank bei 4-6 °C gelagert. Diese Proben sind so mehrere Jahre stabil.
Bei Proben mit geringerer DNA-Konzentration als in der Methode vorgesehen kann das Volumen der DNA-Probe in der PCR erhöht werden. Dann muss jedoch unbedingt das H2O-Volumen im Mastermix entsprechend reduziert werden. Die Konzentration der anderen Reagenzien muss zwingend konstant gehalten werden.
Das hat zur Folge, dass derartige Proben in der PCR zusammengefasst analysiert werden müssen, da für sie ein eigener Mastermix hergestellt werden muss. Wenn die Amplifikation für solche Proben erfolgreich war, können sie zusammen mit an- deren den Restriktionsschnitten zugeführt werden. Bei Blutproben, die teilweise koaguliert sind, kann die DNA aus ca. 200 µL des noch flüssigen Teils mit einem Mini-Aufarbeitungs-Kit (z.B. Qiagen) isoliert werden. Die Ausbeuten sind zwar geringer, reichen jedoch aus, um einige PCR durchzuführen. Üblicherweise werden EDTA-Blutproben verwendet. Erfahrungen mit anderen Gerinnungshemmern wie Heparin oder Citrat liegen bei den Autoren nicht vor. Soll eine Genotypisierung aus histologischen Probenmaterialien, z. B. aus Gewebeschnitten, durchgeführt werden, eignet sich eine Aufarbeitung mit speziellen DNA-Isolierungs-Kits (z. B. Qiagen, Hilden, oder TaKaRa DEXPAT�, Takara Shuzo über MoBiTec GmbH, Göttingen, oder Puregene® Gentra Systems über BIOzym DIAGNOSTIK GmbH Hessisch-Ol- dendorf).
Zur Frage von Störungen durch Medikamente, z. B. Cytostatika, liegen keine sys- tematischen Untersuchungen vor. Einzelne Hinweise, dass trotz erfolgreicher DNA-Isolierung aus Blutproben von Patienten mit Medikamenteneinnahme mitun- ter keine Amplifikation in der PCR erfolgte, könnten auf solche Störungen hinwei- sen. Diese sind jedoch nicht belegt.
Störungen können auch auftreten durch unvollständige Restriktionsschnitte. Dies ist daran erkennbar, dass im Gel neben den Zielbanden weitere Banden sichtbar sind, z. B. die Bande des Amplifikats oder Banden in der Größe zwischen Amplifi- kat und Zielbanden. Abhilfe kann in diesen Fällen oft durch eine Verlängerung der
Inkubationszeit geschaffen werden. Hierzu wird auf das Informationsmaterial der Enzym-Hersteller, das mitgeliefert wird, verwiesen.
9 Diskussion der Methode
Neben dem hier beschriebenen Verfahren können zur Feststellung des I462V-Aus- tauschs im CYP1A1-Gen auch die Multiplex-PCR-Produkte zur GSTM1/T1-Ge- notypisierung [19] mit BsrD I behandelt werden (siehe Methode GSTM1/T1-Ge- notypisierung in diesem Werk). Das als Amplifikationskontrolle verwendete CYP1A1-Exon 7-Amplifikat wird in seiner Ile-Form durch BsrD I gespalten, ohne dass die ggf. mitamplifizierten GST-Amplifikate den gelelektrophoretischen Nach- weis der Spaltprodukte stören. Der durch Verlust der BsrD I-Schnittstelle nachge- wiesene Nukleotidaustausch (m2) führt zur erhöhten Induzierbarkeit der CYP1A1- Expression [10] und stellt unter den bisher bekannten vier SNP im menschlichen CYP1A1-Gen den funktionell wesentlichen Polymorphismus dar. In derselben Am- plifikatmischung lässt sich analog dazu durch Bsa I-Behandlung der T461N-Aus- tausch nachweisen, dessen funktionelle und epidemiologische Bedeutung noch weitgehend ungeklärt ist.
Der 3' nicht codierende Bereich des CYP1A1-Gens wurde ebenfalls in einer Multi- plex-PCR zur GSTM1/T1-Genotypisierung als interner Standard mitamplifiziert [17]. Die in vielen Proben zusätzlich vorliegenden GSTM1 - und GSTT1-Amplifika- te erschwerten jedoch die Restriktionsanalyse des 335 bp großen CYP1A1-Pro- dukts, das im Falle des Msp I-Polymorphismus in Fragmente von 206 und 129 bp gespalten wird. Das größere Spaltprodukt konnte in der Routine-Elektrophorese nur schwer vom 215 bp großen GSTM1-Produkt getrennt werden. Die nach Msp I- Spaltung bei mehr als 80% der Probanden vorliegenden GSTT1-Fragmente haben Größen von 316 bp und 138 bp und stören in der Auflösung der Agarose-Gelelek- trophorese sowohl den Nachweis des ungeschnittenen CYP1A1-Produkts als auch des kleinen Msp 1-Fragments.
Bei der Amplifikation von CYP1A1-Sequenzen, bewährte sich auch die Anwen- dung eines Thermocyclerprogramms mit zyklenweise fallender Annealing-Tempe- ratur. Diese als Touchdown-PCR [20, 21] bezeichnete Methode wurde entwickelt um in den frühen PCR-Zyklen eine möglichst spezifische Amplifikation und im weiteren Verlauf eine starke Vervielfältigung der spezifischen Amplifikate zu er- halten. Weil eine definierte Annealing-Temperatur durch einen 5 °C breiten Bereich ersetzt wird, kann man außerdem davon ausgehen, dass die Verwendung des Touch- down-PCR-Protokolls die Anpassung der vorliegenden Methode an die jeweils in den Anwenderlabors vorhandenen Thermocycler-Geräte erleichtert (siehe Adden- dum).
Die drei untersuchten Einzelnukleotid-Polymorphismen lassen sich durch Restrik- tionsanalyse zweier Amplifikate einfach und mit hoher Sicherheit nachweisen. Vor der Verfügbarkeit der Restriktionsenzyme BsrD I und Bsa I wurde die zum 1462V- Austausch führende m2 durch allelspezifische PCR [12, 22] oder mit Hilfe einer über einen PCR-Primer künstlich geschaffene Hinc II-Stelle nachgewiesen [14].
Der m2 Polymorphismus kann außerdem auch als Einzelstrang-Konformationspo- lymorphismus (SSCP) nachgewiesen werden [23]. Die hier beschriebene Methodik zeichnen sich gegenüber den erwähnten Ansätzen durch einfachere Amplifikati- onsbedingungen bzw. eine weniger anspruchsvolle und sehr robuste Analyse der Amplifikate aus. Die drei hier beschriebenen SNP lassen sich auch in einer Multi- plex-PCR mit anschließender allelspezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung nachweisen [24].
Die Identität der Amplifikate kann zusätzlich über die Größe der Amplifikate und Restriktionsmuster bei der Untersuchung von Polymorphismen durch Behandlung mit weiteren Restriktionsenzymen, z. B. mit Ban II und Taq I bestätigt werden (Ta- belle 9).
Tab. 9. Überprüfung der amplifizierten CYP1A1-Sequenzen durch Restriktionsanalyse.
Spaltung keine BanII Taq I
Erkennungs-Sequenz
GRGCY!C T!CGA
Intron 7-Amplifikat
[ b p ]
334 136; 136; 62 334
Exon 7-Amplifikat
[ b p ]
312 312 213;98
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Autoren: G. Krause, G. Scherer Prüfer: H.-P. Rihs, T. Schulz
Addendum
CYP1A1-Exon 7-Amplifikation mittels PCR-Perlen (Ready-To-Go-Beads für 25-VL-Ansätze)
Bei Verwendung vorgefertigter, lyophilisierter PCR-Perlen (Ready-To-Go-Beads, z.B. Amersham Biosciences, Freiburg, Best. Nr. 27-9555-01) kann die Herstellung von Master- und Taq-Enzymmix entfallen. Es muss den PCR-Perlen neben den Ma- trizen lediglich eine Primer-Mischung zugesetzt werden. Die Ansätze mit lyophili- sierten PCR-Perlen müssen zu einem definierten Flüssigkeitsvolumen (hier 25 VL) ergänzt werden, wobei jeder Ansatz 100 ng Matrizen-DNA enthalten sollte (enthal- ten in 5 VL mittels Kit isolierter DNA-Lösung). Die Primermischung (für 25 VL- Ready-To-Go-Bead-Ansätze) hat ein Volumen von 20 VL pro Ansatz (Tabelle 10) und ist analysentäglich frisch herzustellen.
Tab.10. Zusammensetzung der Primermischung für einen einzelnen 25-VL-Ansatz zur Amplifi- kation des CYP1A1-Exons Nr. 7 mit PCR-Beads (Amersham Biosciences).
VL pro Ansatz 17 1,5
1,5
Komponente (5 VM Primer) Wasser lAlx7-fw 1A1x7-re
Primer-Konzen- tration (nM) 300 300
Amplifiziertes Gen
CYP1A1, Exon 7
Amplifikat- G r ö ß e (bp)
312
Zu jeweils einer PCR-Perle werden 20 VL der Primermischung (Tabelle 10) und 5 VL der jeweiligen Matritzen-DNA-Lösung hinzupipettiert. Durch mehrfaches Auf- saugen der Mischung mit der Pipette wird der Ansatz homogenisiert.
In solchen 25-VL-Ansätzen ergeben sich die nachfolgenden Komponentenkonzen- trationen: 10 mM Tris-HCl, pH 9,0; 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, je 200 VM dGTP, dATP, dTTP, dCTP und 60 mU/VL Taq-DNA-Polymerase.
Die so vorbereiteten Proben werden gemäß den Abschnitten 4 und 5 der PCR, den Restriktionsschnitten und der Gelelektrophorese unterworfen und ausgewertet.
Alternatives Thermocyclerprogramm (Touchdown)
Falls der eingesetzte Thermocycler über eine entsprechende Programmiermöglich- keit verfügt, empfiehlt sich die Anwendung des in Tabelle 11 beschriebenen
�Touchdown�-PCR-Protokolls, bei dem die Temperatur für die Primer-Anlage- rungsphase zyklusweise herabgesetzt wird.
Tab. 11. Touchdown-Thermocycier-Programm für die CYP1A1-Genotypisierung.
Stufe
Anfangs-Denaturierung
�Touch-Down� Amplifikation
Abschließende Extension
Schritt Denaturierung Denaturierung Annealing Synthese Denaturierung Annealing Synthese Synthese
°C 94 94 67-(n-1) 72 94 62 72 72
t (min) 5 1 1 1 1 1 7 1
Z y k l e n N=5 1
30 1
