Medizinische Fakultät der Charité- Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin
Aus dem Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Martin Paul Abteilung: Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. H. Peter Reusch
Diadenosinpolyphosphate induzieren über die Aktivierung von MAP-Kinasen Proliferation von neonatalen glatten Gefäßmuskelzellen
Inaugural-Dissertation zur
Erlangung der medizinischen Doktorwürde der Charité- Universitätsmedizin Berlin
Campus Benjamin Franklin
vorgelegt von Peter Bobbert aus Barcelona
Korreferent: PD Dr. med. U. Kintscher
Gedruckt mit der Genehmigung der Charité- Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin
Promoviert am: 17. März 2006
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Diadenosinpolyphosphate 1
1.1.1 Struktur der Diadenosinpolyphosphate 1 1.1.2 Vorkommen der Diadenosinpolyphosphate im
humanen Organismus
2
1.1.3 Physiologische Bedeutung der Diadenosin- polyphosphate
2
1.1.4 Diadenosinpolyphosphate und ihre mögliche Rolle bei vaskulären Erkrankungen
4
1.1.5 Metabolisierung der Diadenosinpolyphosphate 4
1.2 1.2.1 Purinorezeptoren 5
1.2.2 Ionotrope P2X-Rezeptoren 5
1.2.3 Metabotrope P2Y-Rezeptoren 6
1.2.4 G-Protein regulierte Effektoren 9 1.2.5 Induktion von Stressfasern über Aktivierung
der Gα12- Familie
10
1.3 Mitogen-aktivierte Proteinkinasen 11
1.4 Zielsetzung 12
2. Material und Methoden
2.1 Material 13
2.1.1 Chemikalien, Enzyme, Reagenzien 13
2.1.2 Puffer 15
2.1.3 Seren, Medien 16
2.2 Methoden 17
2.2.1 Protein-Gel-Elektrophorese und Westernblot 17
2.2.2 Zellkultur 18
2.2.3 Intrazelluläre Kalziummessung 19
2.2.4 Fluoreszenz-Mikroskopie 19
3. Ergebnisse
3.1 3.1.1 Einfluss der Diadenosinpolyphosphate auf die DNA-Synthese glatter Gefäßmuskelzellen
22
3.1.2 Ap4A induziert eine Proliferation von GMZ 23 3.1.3 Ap3A und Ap4A aktivieren die MAP-Kinasen
ERK1/2
24
3.2 Beschreibung eines möglichen Signaltrans- duktionsweges, der zur Aktivierung der MAP- Kinasen ERK1/2 führt
26
3.2.1 Die MAP-Kinase Kinase (MEK) ist essentieller Bestandteil des zur Aktivierung der Proteine ERK1/2 führenden Weges
26
3.2.2 Phospholipase Cβ und Proteinkinase C sind an der durch Ap4A induzierten Phospho- rylierung der MAP-Kinasen beteiligt
27
3.2.3 Die durch Ap4A induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 ist abhängig von der Kinase- Aktivität des EGF-Rezeptors
29
3.3 3.3.1 Ap3A und Ap4A induzieren intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhungen in GMZ
31
3.3.2 P2Y-Rezeptoren vermitteln die teilweise Pertussistoxin sensitive intrazelluläre Kalzium- konzentrationserhöhung durch Ap4A in GMZ
33
3.3.3 Die Entleerung intrazellulärer Kalziumspeicher führt zu der von Ap4A induzierten Kalzium- konzentrationserhöhung
34
3.3.4 P2Y1 vermittelt mit weiteren P2Y-Rezeptoren den durch Ap4A induzierten Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration
36
3.4 Ap4A induziert in glatten Gefäßmuskelzellen keine Differenzierung
38
3.5 Induktion von Stressfasern in Swiss 3T3- Fibroblasten
39
4. Diskussion
4.1 Diadenosinpolyphosphate aktivieren die MAP- Kinasen ERK1/2
43
4.2 Die Kinase- Aktivität des EGF-Rezeptors ist an der durch Ap4A induzierten Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 beteiligt
46
4.3 Diadenosinpolyphosphate induzieren keine Stressfasern in Swiss 3T3- Fibroblasten
48
4.4 A4pA induziert in glatten Gefäßmuskelzellen keine Differenzierung
49
4.5 Bedeutung der intrazellulären Kalziumkonzen- trationserhöhung
50
4.6 Unterschiedliche Wirkungen der einzelnen Diadenosinpolyphosphate
51
4.7 Diadenosinpolyphosphate und ihr Einfluss auf Gefäßerkrankungen
52
4.8 Ausblick 54
5. Zusammenfassung 55
6. Abkürzungsverzeichnis 56
7. Literaturverzeichnis 58
8. Danksagung 66
9. Lebenslauf 67
1. Einleitung
1.1 Diadenosinpolyphosphate
Diadenosinpolyphosphate wurden als Teil der großen Gruppe der Dinukleosidpoly- phosphate im Laufe der letzten 25 Jahre als eine Gruppe extrazellulär wirkender Hormone im humanen Organismus entdeckt. Sie vermitteln einer Zelle ihr hormonelles Signal über Purinorezeptoren. Über das Zusammenspiel der Sekretion der Diadenosinpolyphosphate, der unterschiedlichen Expression der beteiligten Rezeptoren und der Synthese von abbauenden Enzymen wie Ectohydrolasen und Nukleotidasen bilden sie ein komplexes Hormonsystem, dessen Bedeutung und dessen Funktionsweise bis heute nicht vollständig geklärt ist.
1.1.1 Struktur der Diadenosinpolyphosphate
Diadenosinpolyphosphate setzen sich aus zwei Adenosinanteilen zusammen, die über eine Phosphatbrücke miteinander verbunden sind. Das Purinnukleosid Adenosin besteht aus der Purinbase Adenin, die mittels einer N-glycosidischen Bindung mit der Pentose Ribose verbunden ist. Der Ribose ist eine Phosphatgruppe über eine Phosphoester-Bindung angehängt. Die einzelnen Phosphatgruppen der die zwei Adenosine verbindenden Phosphatbrücke hängen untereinander mit der energiereichen Phosphorsäureanhydrid-Bindung zusammen. Mindestens zwei Phosphatanteile müssen an dieser Brücke beteiligt sein. Je nach der Anzahl dieser Gruppen teilt man die Diadenosinpolyphosphate in Ap2A bis Ap7A ein.
N
N
N
N
OH OH O
O P O O
O P O O
O P O O
O P
O O
O
OH OH
O
N N
N
N NH2 NH2
Strukturformel des Diadenosintetraphosphates Ap4A
Einleitung - 2 -
1.1.2 Vorkommen der Diadenosinpolyphosphate im humanen Organismus
Im humanen Organismus kommen Diadenosinpolyphosphate in verschiedenen Geweben vor. So wurde zum Beispiel das Diadenosinpolyphosphat Ap4A in humanen Thrombozyten entdeckt (Flodgaard und Mitarbeiter, 1982). Auch Ap3A, Ap5A, Ap6A und Ap7A konnten im Laufe der Zeit in Thrombozyten isoliert und nachgewiesen werden (Lüthje und Mitarbeiter, 1983; Schlüter und Mitarbeiter, 1994).
Daneben spielt aber auch die Speicherung dieser Substanzen in Granula von Herzgewebe, Nebennieren und Nervenzellen eine wichtige Rolle.
1.1.3 Physiologische Bedeutung der Diadenosinpolyphosphate
Bis heute ist eine Vielzahl physiologischer Wirkungen der Diadenosinpolyphosphate in unterschiedlichen Zellarten beschrieben worden:
In glatten Muskelzellen aus renalen Widerstandsgefäßen der Ratte führt zum Beispiel die Einwirkung von Diadenosinpolyphosphaten zu Kontraktionen, die über die Aktivierung von ionotropen P2X-Rezeptoren erklärt werden (Tepel und Mitarbeiter, 1997). Darüber hinaus werden am gleichen Zellsystem dilatierende Effekte von Diadenosinpolyphosphaten beschrieben (van der Giet und Mitarbeiter, 1998), die durch die P2Y-Rezeptor vermittelte Synthese von Stickstoffmonoxid (NO) in Endothelzellen induziert werden. Die auf der einen Seite Gefäß verengende und auf der anderen Seite Gefäß erweiternde Wirkung der Diadenosinpolyphosphate unterliegt dabei einem äußerst komplexen Mechanismus, der von der Länge der oben beschriebenen Phosphatbrücke (van der Giet und Mitarbeiter, 1997), der Quelle der Diadenosinpolyphosphate (Plasma, Thrombozyten, Nervenzellen), der jeweiligen Expression der verschiedenen purinergen Rezeptoren auf den glatten Muskelzellen, dem Expressionsgrad der Ectohydrolasen und der Präsenz der die Diadenosinpolyphosphate abbauenden Nukleotidasen im extrazellulären Raum abhängig zu sein scheint. Des weiteren wird die Komplexität der Wirkungsweise dadurch erhöht, dass die entsprechenden glatten Gefäßmuskelzellen durchaus mehrere Subtypen purinerger Rezeptoren exprimieren können und dass die durch die abbauenden Enzyme entstehenden Metabolite wie Adenosintriphosphat (ATP), Adenosindiphosphat (ADP) und Adenosinmonophosphat (AMP) eigenständige
Wirkungen entfalten, die denen des ursprünglichen Diadenosinpolyphosphates durchaus entgegengesetzt sein können.
Weitere physiologische Wirkungen der Diadenosinpolyphosphate zeigen sich an β- Zellen des endokrinen Pankreas. Martin und Mitarbeiter (1998) zeigten, dass die Diadenosinpolyphosphate in den β-Zellen des endokrinen Pankreas zum Teil die ATP-sensitiven Kaliumkanäle blockieren, was das Membranpotential dieser Zellen herabsetzt und die Öffnungswahrscheinlichkeit von in der Zellmembran verankerten, spannungsabhängigen Kalziumkanälen erhöht, womit die untersuchten Diadenosin- polyphosphate Einfluss auf die Insulinsekretion nehmen.
Auch intrazelluläre Stoffwechselprozesse können durch Diadenosinpolyphosphate moduliert werden. Edgecombe und Mitarbeiter (1997) bewiesen, dass Diadenosinpolyphosphate eine Stimulation der Gluconeogenese in renalen Tubulusepithelzellen der Ratte induzieren können.
In humanen neuronalen Zellen wird dieser Stoffklasse eine Bedeutung bei der Informationsübertragung beigemessen (Pintor und Mitarbeiter, 1999), genauso wie in der Steuerung der Tränensekretion, da Diadenosinpolyphosphate vom Kornealepithel synthetisiert werden und darüber modulierend in die Sekretion der Tränenflüssigkeit eingreifen (Pintor und Mitarbeiter, 2002).
Eine ebenfalls komplexe Wirkungsweise der Diadenosinpolyphosphate zeigt sich bei der Mitogenese. Konnten auf der einen Seite Heidenreich und Mitarbeiter (1995) mitogene Eigenschaften dieser Stoffklasse auf renale Mesangiumzellen der Ratte demonstrieren, so scheinen auf der anderen Seite die Diadenosinpolyphosphate auch Funktionen im Bereich der Apoptose einzunehmen. Gröschel-Stewart und Mitarbeiter (1999) beschrieben den Weg dermaler Epithelzellen beginnend vom Stratum spinosum bis hin zum Stratum corneum, während dem über P2Y1- Rezeptoren proliferative und über P2X5-Rezeptoren differenzierende Effekte vermittelt werden, bis im Stratum corneum die Apoptose der Keratinozyten durch P2X7-Rezeptoren eingeleitet wird.
Einleitung - 4 -
1.1.4 Diadenosinpolyphosphate und ihre mögliche Rolle bei vaskulären Erkrankungen
Den Diadenosinpolyphosphaten wird bei der Entwicklung von vaskulären Erkrankungen eine noch nicht vollständig geklärte Rolle zugeteilt. Jankowski und Mitarbeiter (2001) konnten zeigen, dass Hämodialysepatienten eine gesteigerte Konzentration von Diadenosinpolyphosphaten in Thrombozyten aufweisen, woraus die Annahme resultierte, dass Diadenosinpolyphosphate einen Beitrag zur Entwicklung der Arteriosklerose leisten. Die Pathogenese der Arteriosklerose ist u.a.
gekennzeichnet durch die Veränderung glatter Gefäßmuskelzellen, die ihren Differenzierungsgrad und ihre Wachstumsraten wechseln und aus der Media des Gefäßes in die Intima wandern, wo sie durch eine gesteigerte Proliferation zu einer Einengung des Gefäßlumens beitragen (Ross und Mitarbeiter, 1976; Schwartz und Mitarbeiter, 1984). Gefördert wird dieser Prozess durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren, welche aus durch Endothelläsionen aktivierten Thrombozyten stammen. Aus diesem Grund besteht die Vermutung, dass Diadenosin- polyphosphate, deren Konzentration in Thrombozyten von Patienten mit erhöhten Arterioskleroserisiko gesteigert ist und die proliferative Effekte ausüben können (Heidenreich und Mitarbeiter, 1995), einen Beitrag zur Pathogenese von vaskulären Erkrankungen leisten. Gestärkt wird diese Hypothese durch die Erkenntnis, dass Substanzen wie das Nukleotid ATP, welches über die gleichen Rezeptoren wie die Diadenosinpolyphosphate seine Effekte vermittelt, auf glatte Gefäßmuskelzellen mitogene Signale induzieren.
1.1.5 Metabolisierung der Diadenosinpolyphosphate
Diadenosinpolyphosphate werden durch eine Vielzahl von extrazellulären Nukleotidasen und von auf der Zelloberfläche exprimierten Ectohydrolasen metabolisiert. Eine Ecto-Ap4A-Hydrolase konnte auf bovinen aortalen Endothelzellen (Mateo und Mitarbeiter, 1997) und auf Mesangiumzellen der Ratte (von Drygalski und Mitarbeiter, 2000) nachgewiesen werden. Auch wurde die humane zweifach phosphorylierte Inositol-Phosphat-Phosphohydrolase beschrieben, die besondere Affinität zu Ap5A und Ap6A zeigt (Safrany und Mitarbeiter, 1999).
Bei dem Abbau der Diadenosinpolyphosphate entstehen zum Teil sehr reaktive Metabolite, die wiederum eigene Wirkungen entfalten können. Zu diesen zählen Mononukleotide wie ATP und ADP und Nukleoside wie das Adenosin.
Untersuchungen der Halbwertzeiten der einzelnen Substanzen zeigten, dass die der Diadenosinpolyphosphate im menschlichen Blut bei ungefähr 17 Minuten liegt, wobei die von ATP nicht länger als eine Minute beträgt (Iwata und Mitarbeiter, 1995). Diese Erkenntnis ist für die Bewertung experimenteller Ergebnisse entscheidend, da nicht nur die untersuchte Substanz, sondern auch ihr Abbauprodukt eigenständige Wirkungen entfalten können.
1.2.1 Purinorezeptoren
Die Purinorezeptoren werden in die zwei großen Gruppen der P1- und P2- Rezeptoren eingeteilt. Diadenosinpolyphosphate aktivieren P2-Rezeptoren, die wiederum in die ionotropen P2X- und metabotropen P2Y-Rezeptoren unterteilt werden.
1.2.2 Ionotrope P2X-Rezeptoren
Zu der Familie der ionotropen P2X-Rezeptoren, die von humanen Zellen synthetisiert werden können, gehören derzeit fünf aktivierbare Ionenkanäle, wobei angenommen wird, dass weitere noch nicht klassifizierte Subtypen existieren. Als gemeinsames Merkmal zeichnen sie sich durch zwei hydrophobe transmembranäre Domänen aus, die mit einer großen extrazellulären Schleife verbunden sind. Nukleotide wie ATP, UTP und CTP aktivieren diese genauso wie die Dinukleosidpolyphosphate. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die einzelnen P2X-Subtypen und deren dazu gehörenden Agonisten.
Einleitung - 6 -
Rezeptor-Subtyp Potenz der Agonisten Literaturquelle P2X1 ATP 7,25 > Ap4A 6,74 >
Ap5A 6,65 > Ap6A 5,95
Bianchi und Mitarbeiter 1999
P2X2 ATP 5,99 Lynch und Mitarbeiter
1999 P2X3 ATP 6,47 > Ap4A 6,30 >
Ap5A 6,21 > Ap6A 6,20
Bianchi und Mitarbeiter 1999
P2X4 ATP 6,32 > Ap4A 6,20 >
Ap5A 5,91 > Ap6A 4,20
Bianchi und Mitarbeiter 1999
P2X7 ATP 4,02 ApnA ohne
Aktivität
Bianchi und Mitarbeiter 1999
Tabelle 1: Agonisten von im humanen Organismus exprimierten P2X-Rezeptoren in der Reihenfolge ihrer Potenz. Die Ziffern geben die pEC50-Werte (negativ dekadischer Logarithmus der Konzentration, bei der die halbmaximale Wirkung zu beobachten ist) wieder.
1.2.3 Metabotrope P2Y-Rezeptoren
Die metabotropen P2Y-Rezeptoren haben als charakterisierendes Zeichen sieben in der Plasmamembran verankerte Transmembrandomänen und sind immer mit heterotrimeren G-Proteinen verbunden (G-Protein gekoppelte Rezeptoren, GPCR).
Bis heute sind sechs Subtypen der P2Y-Rezeptoren beschrieben worden, die genau wie die P2X-Rezeptoren eine große Vielfalt von Agonisten aufweisen, was in Tabelle 2 dargestellt ist.
Rezeptor-Subtyp Potenz der Agonisten Literaturquelle P2Y1 ADP 6,59 > Ap4A 6,20 >
Ap2A 4,00 > Ap5A 3,00
Schachter und Mitarbeiter 1996
P2Y2 UTP 7,69 > ATP 7,09 >
Ap4A 6,58 > Ap3A 5,00
Janssens und Mitarbeiter 1999
P2Y4 UTP 6,26 ApnA ohne
Aktivität
Kennedy und Mitarbeiter 2000
P2Y6 UDP 8,23 > ATP 6,33
ApnA ohne Aktivität
Filippov und Mitarbeiter 1999
P2Y11 ATP 4,19 Communi und Mitarbeiter
1999
P2Y12 ADP Nicholas und Mitarbeiter
2001
Tabelle 2: Agonisten von im humanen Organismus exprimierten P2Y-Rezeptoren in der Reihenfolge ihrer Potenz. Die Ziffern geben die pEC50-Werte (negativ dekadischer Logarithmus der Konzentration, bei der die halbmaximale Wirkung zu beobachten ist) wieder.
An P2Y-Rezeptoren bindende G-Proteine bestehen aus einer α-Untereinheit, die GTP bindet und hydrolysiert, sowie je einer β- und γ-Untereinheit. Die β- und γ- Untereinheiten werden als funktionelle Einheit angesehen, da sie immer einen undissoziierbaren Komplex bilden. Kommt es zu einer Aktivierung des P2Y- Rezeptors, dann durchläuft das heterotrimere G-Protein einen Aktivierungs- Inaktivierungs-Zyklus, durch den nachfolgende Signaltransduktionswege moduliert werden: Im inaktiven Zustand ist der βγ-Komplex mit der α-Untereinheit, an die GDP gebunden ist, assoziiert. Kommt es zu einer Aktivierung des Rezeptors, dann dissoziiert das GDP von der α-Untereinheit und wird durch GTP ersetzt. Dies induziert eine Konformationsänderung der α-Untereinheit, die dazu führt, dass sie einerseits vom Rezeptor, andererseits vom βγ-Komplex dissoziiert, wobei sowohl die α-Untereinheit als auch der βγ-Komplex in diesem Moment in der Lage sind, intrazelluläre Effektorproteine zu aktivieren. Eine GTPase-Aktivität der α-Untereinheit terminiert die Stimulation des G-Proteins, indem durch eine Hydrolyse aus GTP wieder GDP entsteht, das an der α-Untereinheit gebunden bleibt und die Voraussetzung dazu bildet, dass der βγ -Komplex mit der α-Untereinheit
Einleitung - 8 -
reassoziieren kann. Diese durch die GTP-Hydrolyse induzierte Reassoziation stellt den entscheidenden Inaktivierungsmechanismus dar. Dabei kann die GTPase- Aktivität der α-Untereinheit durch unterschiedliche Effektorproteine beeinflusst werden. Dazu zählen auch die RGS-Proteine, die in der Lage sind, die GTPase- Aktivität der α-Untereinheit zu beschleunigen (Dohlman und Mitarbeiter, 1997;
Berman und Mitarbeiter, 1998).
G-Proteine werden in vier große Gruppen eingeteilt, wobei für deren Klassifizierung die α-Untereinheit die entscheidende Komponente darstellt: Gαs, Gαi/0, Gαq und
Gα12/13. Diese α-Untereinheit besteht aus zwei Domänen, wobei die eine ihre
Bedeutung durch Bindungsstellen für den βγ-Komplex, den Rezeptoren, den Guaninnukleotiden und den Effektoren gewinnt. Die Funktion der zweiten, helikal aufgebauten Domäne ist bis heute unbekannt.
Die Aktivierung unterschiedlicher G-Proteine entscheidet, welche intrazellulären Effektorproteine eines Signaltransduktionsweges nach Aktivierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren induziert werden. So aktiviert die Gαs-Familie alle Typen der Adenylatzyklase, wohingegen die Gαi-Familie diese zum größten Teil inhibiert.
Die Gαq-Familie stimuliert im Gegensatz dazu die Phospholipase Cβ.
Von der Gα12-Familie ist weitaus weniger bekannt, doch konnte bereits gezeigt werden, dass über diese Gruppe der α-Untereinheiten die kleine GTPase Rho aktiviert werden kann, durch die wiederum eine intrazelluläre Akkumulation von Aktinfasern, so genannten Stressfasern, induziert wird.
Welche Subtypen der G-Proteine genau mit den speziellen purinergen P2Y- Rezeptoren koppeln, ist bislang nur unvollständig beantwortet, da wegen der Flexibilität eines solchen Rezeptorsystems es durchaus möglich ist, dass ein Subtyp der P2Y-Klasse mit unterschiedlichen Familien der G-Proteine bindet und interagiert.
Die Tabelle 3 gibt Aufschluss über die bisherigen Erkenntnisse.
Rezeptorsubtyp G-Protein Effektorprotein
P2Y1 Gαq PLCβ ↑
P2Y2 Gαq + Gαi PLCβ ↑ + AC ↓
P2Y4 Gαq + Gαi PLCβ ↑ + AC ↓
P2Y6 Gαq PLCβ ↑
P2Y11 Gαq + Gαs PLCβ ↑ + AC ↑
P2Y12 Gαi AC ↓
Tabelle 3: Zusammenfassung der bisher beschriebenen P2Y-Subtypen, der mit diesen Subtypen gekoppelten G-Proteine und deren Effektorproteinen.
Der βγ-Komplex erlangt seine Bedeutung in der Regulation verschiedener Effektoren wie einzelner Adenylatzyklasen und der Phospholipase Cβ. In glatten Gefäßmuskelzellen ist er an der Vermittlung differenzierender und mitogener Signale beteiligt. Burnstock und Mitarbeiter (2002) beschreiben hierzu einen Signaltransduktionsweg, durch den proliferative Signale über den βγ-Komplex weitergeleitet werden, der einerseits die Phospholipase Cβ und andererseits nicht näher beschriebene Tyrosinkinasen aktiviert.
1.2.4 G-Protein regulierte Effektoren
Durch Klonierung einer Vielzahl von G-Protein regulierter Effektoren konnte demonstriert werden, dass Isoformen von Effektoren existieren, die sowohl eine spezifische Gewebeexpression aufweisen, als auch differentiell durch die α- Untereinheiten bzw. dem βγ-Komplex der G-Proteine reguliert werden können (Gohla und Mitarbeiter, 1998).
Ein wichtiger Effektor ist die Phospholipase C, welche die Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) katalysiert und die „second messenger“
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) generiert. Das durch die Hydrolyse von PIP2 entstandene IP3 verlässt die Plasmamembran und diffundiert ins Zytosol der Zelle. Dort bindet es an IP3-abhängige Kalziumkanäle der Membran des
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endoplasmatischen Retikulums und löst darüber die Freisetzung von Kalzium aus den intrazellulären Kalziumspeichern ins Zytosol aus.
Es gibt mindestens drei Familien von Enzymen (PLCβ, PLCγ und PLCδ), die eine Phospholipase C-Aktivität besitzen, wobei die PLCβ die Familie von Enzymen darstellt, deren vier Isoformen alle durch G-Proteine reguliert werden (Sternweis und Smrcka, 1992; Exton, 1996). Dabei werden alle bekannten Isoformen der PLCβ durch Mitglieder der Pertussistoxin-insensitiven Gαq-Familie stimuliert (Taylor und Mitarbeiter, 1991; Lee und Mitarbeiter, 1992; Jiang und Mitarbeiter, 1994). Dem gegenüber steht die Pertussistoxin-sensitive Aktivierung der PLCβ durch die βγ- Untereinheiten aus den Mitgliedern der Gαi/0-Familie (Camps und Mitarbeiter, 1992;
Katz und Mitarbeiter, 1992).
Gebildetes Diacylglycerol kann zwei Funktionen übernehmen: Einerseits kann es weiter in Arachidonsäure metabolisiert werden, die sowohl als Botenstoff fungieren als auch als Ausgangssubstanz für die Eicosanoidsynthese dienen kann.
Andererseits aktiviert DAG die Proteinkinase C, die wiederum weitere Effektorproteine innerhalb der Zelle durch Phosphorylierung aktivieren kann.
Die durch IP3 induzierte Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration kann zu einer Verlagerung der PKC vom Zytosol an die Innenseite der Zellmembran führen, wo sie durch den gemeinsamen Einfluss von Kalzium, Diacylglycerol und Phosphatidylserin aktiviert wird.
1.2.5 Induktion von Stressfasern über Aktivierung der Gα12-Familie
Humane Fibroblasten und glatte Gefäßmuskelzellen können auf extrazelluläre Stimuli mit einer schnellen Reorganisation ihres Aktin-Zytoskeletts reagieren, wobei eine solche Umstrukturierung von Aktinfasern besonders gut in Fibroblasten zu beobachten ist (Ridley und Mitarbeiter, 1992). Sowohl in Fibroblasten als auch in allen anderen eukaryoten Zellen kontrollieren kleine GTPasen der Rho-Familie, die eine Untergruppe der Ras-Superfamilie kleiner GTP-bindender Proteine bilden, ein solches Bündeln von Aktinfasern, die als Stressfasern bezeichnet werden. Darüber hinaus führt eine Aktivierung von Rho zu einer Akkumulation von Integrinen und assoziierten Proteinen in fokalen Adhäsionskomplexen, die über Integrine einen
Kontakt zwischen Stessfasern und der extrazellulären Matrix aufbauen. Gohla und Mitarbeiter (1998) konnten zeigen, dass die G-Proteine der Gα12-Familie, zu der sowohl Gα12 als auch Gα13 gehören, einen wesentlichen Anteil an einer möglichen Aktivierung von Rho tragen. Dabei zeigte sich, dass die beiden Subtypen der Familie einen unterschiedlichen Signaltransduktionsweg zur Induktion von Stressfasern aktivieren. Führt einerseits die Aktivierung von Gα12 zu einer annährend direkten Stimulation von Rho, zeigt andererseits der Weg über Gα13 eine Beteiligung des EGF-Rezeptors und eine mögliche inhibierende Beeinflussung durch aktiviertes Gα12.
Die G-Proteine G12 und G13 werden im humanen Organismus ubiquitär exprimiert, und für eine Reihe von Rezeptoren konnte in den letzten Jahren eine Kopplung an diese Familie der G-Proteine nachgewiesen werden. So wurde für Thromboxan-A2- und Thrombin-Rezeptoren in Thrombozyten und in der Schilddrüse für TSH- Rezeptoren eine direkte Verbindung zur Gα12-Familie bewiesen (Offermanns und Mitarbeiter, 1994; Laugwitz und Mitarbeiter, 1996). Eine Kopplung dieser G-Proteine mit purinergen Rezeptoren konnte bislang nicht gezeigt werden.
1.3 Mitogen-aktivierte Proteinkinasen
Die Familie der mitogen-aktivierten Protein-Kinasen (MAPK) beinhaltet derzeit mindestens drei Mitglieder: Die extrazellulären-signalregulierten Kinasen (ERK1/2), deren zwei Isoformen hinsichtlich ihrer Größe auch als p42/p44-MAP-Kinasen bezeichnet werden, die c-jun-Amino-Terminus Kinase (JNK) und die p38 Kinase. Bei kaskadenartig ablaufenden Signaltransduktionswegen, die Signale wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose von der Zelloberfläche in den Zellkern transportieren, können diese MAPK involviert sein.
Über eine Aktivierung sowohl von G-Protein gekoppelten Rezeptoren als auch von Thyrosinkinaserezeptoren kann es zu einer Stimulation der MAP-Kinasen ERK1/2 kommen: Die kleine GTPase Ras aktiviert durch direkte Interaktion die Serin/Threonin-Kinase Raf. Aktiviertes Raf phosphoryliert die multifunktionale Threonin/Tyrosin MAP-Kinase-Kinase MEK, die im nächsten Schritt durch Phosphorylierung die MAP-Kinasen ERK1/2 aktiviert (van Corven und Mitarbeiter, 1993; Vouret-Craviari, 1993). Durch Translokation der aktivierten MAP-Kinasen
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ERK1/2 vom Zytoplasma in den Zellkern können diese nukleäre Transkriptionsfaktoren regulieren, um proliferative oder differenzierende Signale zu übermitteln.
1.4 Zielsetzung
Glatte Gefäßmuskelzellen spielen im Rahmen der Entwicklung der Arteriosklerose eine entscheidende Rolle, da sie ihren Differenzierungsgrad und ihre Proliferationsrate verändern können, aus der Media in die Intima des Gefäßes wandern und somit zu Gefäßveränderungen beitragen. Der Substanzklasse der Diadenosinpolyphosphate wird bei der Entwicklung der Arteriosklerose eine Bedeutung beigemessen, da gezeigt werden konnte, dass Patienten mit einem erhöhten Arterioskleroserisiko eine gesteigerte Konzentration von Diadenosin- polyphosphaten in Thrombozyten aufweisen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirkungsweise der Diadenosin- polyphosphate auf aortale glatte Gefäßmuskelzellen der Ratte zu beschreiben.
Insbesondere sollte geklärt werden, ob und wie diese Substanzen die Entwicklung pathologischer Gefäßveränderungen beeinflussen können. Dazu wurden die Diadenosinpolyphosphate Ap3A – Ap6A an zwei Zellsystemen, den aortalen glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte und den Swiss 3T3-Fibroblasten, untersucht.
Im Einzelnen hatte die Arbeit folgende Ziele:
1) Untersuchung des Einflusses von Diadenosinpolyphosphaten auf die Proliferation und Differenzierung glatter Gefäßmuskelzellen
2) Identifizierung eines Signaltransduktionsweges, über den Diadenosinpoly- phosphate mitogene Signale in den Kern von glatten Gefäßmuskelzellen leiten.
3) Untersuchung purinerger P2Y-Rezeptoren auf ihre Kopplung mit G-Proteinen der Subtypen Gi/0, Gq und G12/13.
4) Beschreibung möglicher Gründe für die unterschiedlichen Wirkungen von den Diadenosinpolyphosphaten Ap3A, Ap4A, Ap5A und Ap6A auf glatte Gefäßmuskelzellen.
2. Material und Methoden 2.1 Material
2.1.1 Chemikalien, Enzyme, Reagenzien Acrylamid/Bisacrylamid
Agarose AG1295 AG1478
Albumin, bovines Ammoniumpersulfat Ampicillin
Ap5A
Bacto-Agar
Bisindolylmaleimid Bromphenolblau Coomassie EGF
ERK1/2-Antikörper Fura-2
Glucose Glycin Hepes
JNK1/2-Antikörper Kaliumchlorid Kalziumdichlorid L-Glutamin Lumiglo
Lysophosphatidsäure Magnesiumdichlorid MEM
β-Mercaptoethanol Methanol
Natriumchlorid
Bio-Rad Seakem Calbiochem Calbiochem Sigma Bio-Rad Sigma Sigma Difco
Calbiochem Sigma Serva Calbiochem
New England BioLabs Molecular Probes Merck
Gibco Roth
New England BioLabs Roth
Merck Invitrogen
New England BioLabs Calbiochem
Sigma Invitrogen Sigma Merck Roth
Material und Methoden - 14 -
Paraformaldehyd PBS-Dulbecco PD98059 PDGF BB p38-Antikörper Penicillin Pertussistoxin Phalloidin
Phospho-ERK1/2-Antikörper Phospho-JNK1/2-Antikörper Phospho-p38-Antikörper Szintilationsflüssigkeit SDS
TEMED
Trichloressigsäure Thapsigargin Thrombin
3H-Thymidin TMB8
Tris
Triton X-100
Trockenmilch, fettfrei Tryptose-Phosphat Tween 20
U73122
Sigma Seromed Calbiochem Calbiochem
New Englans BioLabs Seromed
Calbiochem Sigma
New England BioLabs New England BioLabs New England BioLabs Zinsser
Roth Serva Roth Sigma Sigma
Perkin-Elemer Calbiochem Invitrogen Sigma Bio-Rad Sigma Sigma Calbiochem
Nicht aufgeführte Standardchemikalien wurden von den Firmen Invitrogen (Eggenstein), Merck (Darmstadt), Sigma (Deisenhofen), Calbiochem (San Diego, CA, USA) und Roth (Karlsruhe) bezogen.
Die Diadenosinpolyphosphate, die in den in dieser Arbeit vorgestellten Experimenten zum Einsatz kamen, wurden von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Hartmut Schlüter,
Charité- Universitätsmedizin, Campus Benjamin Franklin, Med. Klinik IV Endokrinologie und Nephrologie, synthetisiert und zur Verfügung gestellt.
2.1.2 Puffer
Blockierungspuffer:
TBS (einfach), 0,1% Tween-20, 5% fettfreie Trockenmilch
Elektrophoresepuffer:
25 mM Tris-Base, 0,19 M Glycin, 0,1% SDS, H2O
Elektrophorese-Probenpuffer:
0,125 mM Tris (pH 6,8 , 2% SDS, 10% Glycerin, 0,75 mM β-Mercaptoethanol, 0,006% Bromphenolblau)
HBS-Puffer:
128 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5,5 mM Glucose, 10 mM Hepes, 1 mM CaCl2, 0,2% BSA
Phospatpuffer PBS:
140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4
Puffer A:
140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1 mM Na2HPO4, 25 mM Glucose, 25 mM Hepes, 0,05% BSA, 2 mM CaCl2 , pH 7,2
Material und Methoden - 16 -
TBS (zehnfach):
50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl
TTBS:
TBS (einfach), 0,1% Tween20
Transferpuffer:
25 nM Tris-Base, 0,2 M Glycin, 20% Methanol, pH 8,5
2.1.3 Seren, Medien
Komplettmedium (CM) für GMZ:
Minimum Essential Medium mit Earls Basal Salts (MEM-EBS, Invitrogen)
+ 10% fötales bovines Serum (Invitrogen) + 200 mM Glutamin (Invitrogen)
+ 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (Invitrogen) + 10 ml Tryptose Phosphate Broth Medium (Sigma)
Quiescence-Medium (QM) für GMZ:
Minimum Essential Medium mit Earls Basal Salts (MEM-EBS, Invitrogen)
+ 200 mM Glutamin (Invitrogen)
+ 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (Invitrogen) + 10 ml Tryptose Phosphate Broth Medium (Sigma) + Transferrin (25 µl einer 4 mg/ml Lösung)
+ 500 mg/l Rinderserumalbumin, BSA (Sigma)
Komplettmedium (CM) für Swiss-3T3:
Dulbecco`s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)
+ 10% fötales bovines Serum (Invitrogen) + 200 mM Glutamin (Invitrogen)
+ 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (Invitrogen)
Quiescence-Medium (QM) für Swiss-3T3:
Dulbecco`s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)
+ 200 mM Glutamin (Invitrogen)
+ 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (Invitrogen) + Transferrin (25 µl einer 4 mg/ml Lösung) + 500 mg/l Rinderserumalbumin, BSA (Sigma)
2.2 Methoden
2.2.1 Protein-Gel-Elektrophorese und Westernblot
Die zuvor über drei Tage unter serumfreien Bedingungen in 60 mm breiten Kulturschalen kultivierten GMZ wurden mit den zu untersuchenden Agonisten stimuliert und daraufhin mit PBS (4 °C) zweimalig gewaschen. Mittels Probenpuffer (200 µl) wurden die GMZ aus den Kulturschalen abgekratzt und eingefroren.
Zur Auftrennung von Proteinen hinsichtlich ihrer Größe wurden 10% Polyacrylamid- Gele in einer Mini-Protean-Elektrophoresekammer (Bio-Rad, Life Science Group, USA) verwendet. Diesem Trenngel war ein 4% Polyacrylamid-Sammelgel aufgeschichtet, dessen Taschen zur Auftragung der Proteinproben dienten. Bei einer Temperatur von 4 °C wurden unter einer konstanten Spannung von 60 V die Proteine in das Sammelgel transferiert, bevor die Auftrennung des Proteingemisches im Trenngel bei gleicher Temperatur unter einer Spannung von 120 V erfolgte.
Material und Methoden - 18 -
Die durch die Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine wurden bei 4 °C innerhalb von 90 Minuten unter einer konstanten Spannung von 110 V im Tanksystem (Bio- Rad) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Zur Überprüfung des vollständigen Transfers der Proteine während des Blottens wurden nach der Übertragung die Gele mit Coomassie Blue eingefärbt. Nachdem die Membranen zur Absättigung der freien Bindungsstellen für eine Stunde in einem Blockierungspuffer, der 5% fettfreie Trockenmilch enthielt, inkubiert wurden, erfolgte in einem zweiten Schritt über Nacht bei 4 °C die Inkubation mit dem primären Antikörper, der im Blockierungspuffer verdünnt war. Die Inkubation mit dem entsprechenden sekundären Antikörper wurde innerhalb einer Stunde durchgeführt, bevor sich die Lumiglo-Chemolumineszenz- Reaktion zur Darstellung der mit Meerettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper anschloss. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurden die Membranen dreimalig für jeweils 5 Minuten mit einem TTBS-Puffer gewaschen.
Je nach Abhängigkeit des Signals wurden Kodak X-OMAT-Filme mit den Membranen über 30 Sekunden bis hin zu maximal 5 Minuten in Filmkassetten exponiert.
2.2.2 Zellkultur
Die verwendeten Primärkulturen glatter Gefäßmuskelzellen von neugeborenen Ratten (bis zu fünf Tagen nach der Geburt) wurden nach der von Ives und Mitarbeiter publizierten Methode (1978) isoliert und in einem MEM-Komplettmedium bei einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre von 5% CO2 und einer Temperatur von 37 °C vermehrt. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte durch die Zugabe einer 1% Trypsin- EDTA-Lösung. Das Kulturmedium wurde alle zwei Tage gewechselt, bis die Zellen eine Konfluenz erreichten. Bei allen in dieser Arbeit beschriebenen Experimenten kamen Zellen der Passagen 12 bis 20 zum Einsatz.
Swiss 3T3-Zellen wurden in Dulbecco`s modifiziertem Eagle`s Medium (DMEM), das zusätzlich 10% fötales bovines Serum (FBS) beinhaltete, kultiviert. Um serumentzogene Swiss 3T3-Zellen zu erhalten, wurden die Zellkulturen nach Erreichen einer Konfluenz für 24 Stunden im modifizierten DMEM ohne FBS gezüchtet.
2.2.3 Intrazelluläre Kalziummessung
Die drei Tage unter serumfreien Bedingungen auf 24 mm breiten Glasplättchen kultivierten glatten Muskelzellen der neonatalen Ratte wurden unter Lichtschutz bei 37 °C mit dem in HBS-Puffer (Hepes-buffered saline) gelösten Kalziumsensitiven Farbstoff Fura-2 (2 µM) für 20 Minuten beladen. Nach einmaligem Waschen mit HBS-Puffer wurden die mit den Zellen bedeckten Glasplättchen in die Messkammer eines invertierten Mikroskops (Axiovert 100, Carl Zeiss, Oberkochen), an das ein Monochromator (TILL-Photonics) angeschlossen war, eingespannt. Alternierend wurde Fura-2 mit den Wellenlängen 340 nm und 380 nm angeregt, um das daraus resultierende Emmisionslicht über einen 505 nm-Langpassfilter zu filtern und um dies mit einer 12-bit CCD-Kamera aufzunehmen. Nach Abzug des Hintergrundsignales wurden die intrazellulären Kalziumkonzentrationen nach Grynkiewicz und Mitarbeiter (1985) berechnet.
Die für diese Berechnungen notwendigen Werte Rmax, Rmin und F380(max/min) wurden mittels Fura-2-beladenen Zellen nach Zugabe von 1 µM Ionomycin und 10 mM CaCl2 bzw. 10 mM EGTA bei einem pH von 7,8 ermittelt.
2.2.4 Fluoreszenz-Mikroskopie
Swiss 3T3 Zellen wurden auf 8-Lochplatten ausgesät und bis zum Erreichen einer Konfluenz in modifizierten DMEM mit 10% fötalen bovinen Serum kultiviert. 24 Stunden vor dem Beginn der Experimente wurden die jeweiligen Zellkulturen mit serumfreien modifizierten DMEM inkubiert.
Zur Stressfaserinduktion fand eine 30-minütige Stimulation mit den entsprechenden Agonisten statt, bevor sich ein dreimaliges Waschen mit dem PBS-Phosphatpuffer anschloss. Die gewaschenen und die durch diverse Stimuli aktivierten Zellen wurden daraufhin 20 Minuten mit 4% Paraformaldehyd/PBS fixiert und anschließend 5 Minuten lang durch den Zusatz von 0,1% Triton X-100/PBS permeabilisiert. Einem weiteren dreimaligen Waschen folgte eine 25-minütige Inkubation der Zellen mit 1%
BSA/PBS, um eine Absättigung freier Bindungsstellen zu erreichen. Dem wiederholten Waschvorgang schloss sich zur Lokalisation des polymerisierten Aktins unter Lichtausschluss eine 40-minütige Inkubation mit 5 U/ml ALEXA-Phalloidin an.
Material und Methoden - 20 -
Sämtliche Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Auswertung der Präparate erfolgte an einem Inversmikroskop (Axiovert 100, Carl Zeiss, Oberkochen).
2.2.5 3H-Thymidin-Einbau
Glatte Gefäßmuskelzellen (GMZ) wurden auf einer 24-Lochplatte kultiviert und vor Beginn des Experimentes drei Tage unter serumfreien Bedingungen subkultiviert. Die Aktivierung der Zellen erfolgte mit entsprechenden Agonisten über 24 Stunden.
Während der letzten 6 Stunden der eintägigen Aktivierung der Zellen durch die jeweiligen Agonisten wurden die Zellen zusätzlich mit radioaktiv markierten Thymidin (1 µCi/ml) exponiert. Das im Rahmen einer Proliferation der GMZ eingebaute radioaktiv markierte Thymidin diente bei dessen Quantifizierung im späteren Verlauf als Nachweis einer stimulierten DNA-Synthese der untersuchten Zellkulturen.
Nach der eintägigen Stimulation der GMZ wurden die Zellen drei Mal mit Puffer A gewaschen und darauf für 30 Minuten mit 15% Trichloressigsäure (TCA) behandelt.
Nach einem zweimaligen Waschen der GMZ mit destilliertem Wasser wurden sie für 20 Minuten getrocknet. Das Ablösen der Zellen erfolgte durch die Zugabe einer 1 M NaOH (0,5 ml), zu der nach weiteren 20 Minuten zusätzlich 0,5 ml 1 M HCl gegeben wurde.
Die nun in Wasser gelösten Zellen wurden mit einer Szintillationsflüssigkeit gemischt und die Radioaktivität mit Hilfe eines „Liquid Scintillation Analyzer“ gemessen.
2.2.6 Zellzählung
Die neonatalen GMZ der Ratte wurden über drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert und in den sich anschließenden acht Tagen mit den entsprechenden Agonisten stimuliert. Während der achttägigen Aktivierung erfolgte alle 24 Stunden ein Wechsel des Kulturmediums, in dem die untersuchten Agonisten mit definierten Konzentrationen gelöst waren. An jedem zweiten Tag wurden aus den entsprechenden Kulturschalen mittels Trypsin die GMZ gelöst und deren Zahl in einer Neubauer Zellzählkammer bestimmt. Dazu wurden jeweils vier Quadranten der
Zählkammer in doppelter Ausführung ausgezählt, um aus den sich daraus ergebenden acht Werten den Mittelwert mit den dazu gehörenden Standardabweichungen zu ermitteln.
Ergebnisse - 22 - 3. Ergebnisse
3.1.1 Einfluss der Diadenosinpolyphosphate auf die DNA-Synthese glatter Gefäßmuskelzellen
Zur Klärung der Frage, ob die Diadenosinpolyphosphate Ap3A, Ap4A, Ap5A und Ap6A einen Einfluss auf die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen nehmen, wurde der Einbau von radioaktiv markiertem 3H-Thymidin in die DNA der Zellkerne nach Stimulation durch die oben genannten Agonisten gemessen (Abbildung 1). Die Diadenosinpolyphosphate wurden in den Konzentrationen von 10-6 M bis 10-4 M eingesetzt. Es zeigte sich dabei eine konzentrationsabhängige Steigerung des Einbaus von radioaktiv markiertem 3H-Thymidin in die DNA der Zellkerne für Ap3A und Ap4A, wohingegen Ap5A und Ap6A keine Steigerung im Vergleich zu einer unstimulierten Kontrollgruppe induzierten. ATP bewirkte von allen eingesetzten Agonisten die stärkste Steigerung der DNA-Synthese. Keinen wesentlichen Einfluss auf die DNA-Synthese nahm Thrombin, das in glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte auch keinen mitogenen Effekt ausübt (Reusch und Mitarbeiter, 2001).
10 50 60
40 30 20
0
Ap3A
[ H]-Thymidin-Einbau (% über Kontrolle) 70 80
-5
-6 -4
Ap4A Ap5A Ap6A ATP Thrombin
-5
-6 -4 -6 -5 -4 -6 -5 -4 -5 -4 lgM 2 4 U/ml
3
Abbildung 1: Einfluss der Diadenosinpolyphosphate (Ap3A - Ap6A) auf den Einbau von radioaktiv markierten 3H-Thymidin in die DNAglatter Gefäßmuskelzellen. GMZ wurden, nachdem sie drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden, mit den entsprechenden Agonisten 24 Stunden stimuliert. Während der letzten sechs Stunden erfolgte die Zugabe des radioaktiv markierten
3H-Thymidins. Als Kontrolle dienten unstimulierte GMZ. Dargestellt sind für die jeweiligen Konzentrationen die Mittelwerte mit den dazu gehörenden Standardabweichungen von drei in gleicher Art ausgeführten Experimenten mit jeweils sechs Einzelmessungen.
3.1.2 Ap4A induziert eine Proliferation von GMZ
Der 3H-Thymidin-Einbau gibt nur Aufschlüsse über Veränderungen der DNA- Synthese. Um den Nachweis zu erbringen, dass nicht nur die DNA-Synthese durch Stimulation mit Ap3A und Ap4A verändert wurde, sondern auch die eigentliche Zellzahl, wurde diese per Zählung in einer Neubauer Zellzählkammer gemessen (Abbildung 2). Glatte Gefäßmuskelzellen wurden über acht Tage mit serumhaltigem Medium, Thrombin, serumfreiem Medium oder Ap4A exponiert und alle zwei Tage gezählt. Unter serumfreien Bedingungen und durch die Zugabe von Thrombin kam es zu keiner signifikanten Erhöhung der Zellzahl. Ap4A induzierte hingegen eine Steigerung von bis zu 50%. Die Positiv- Kontrolle, die Stimulation der Zellen mit serumhaltigen Medium, induzierte eine Steigerungsrate von 800%.
Ergebnisse - 24 -
100 200 700
150
0
Ap4A
4
Zellzahl (10 )
2 6 800
600
8 900
QM Thrombin CM
Zeit (Tage)
3
Abbildung 2: Induktion der Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen durch Ap4A. Glatte Gefäßmuskelzellen der Ratte wurden über drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert und dann bis zu acht Tagen mit Ap4A (10-5 M), Thrombin (2 U/ml), serumhaltigen CM oder serumfreien QM stimuliert. Die Zellzählung erfolgte jeden zweiten Tag mit Hilfe einer Neubauer Zellzählkammer.
Die Mittelwerte mit den jeweiligen Standardabweichungen wurden über die Auszählung von jeweils vier Quadranten der Neubauer Zellzählkammer in doppelter Ausführung berechnet.
3.1.3 Ap3A und Ap4A aktivieren die MAP-Kinasen ERK1/2
Es gibt mehrere Signaltransduktionswege in glatten Gefäßmuskelzellen, die mitogene Signale in den Zellkern weiterleiten. Eine Möglichkeit beinhaltet die Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1 und ERK2, die im aktivierten Zustand in den Zellkern translozieren und an der DNA-Synthese beteiligt sind. Um zu untersuchen, ob diese Kinasen an der durch Ap4A induzierten Zellproliferation beteiligt sind, wurde mittels Westernblot-Verfahrens der Phosphorylisierungsgrad der Proteine ERK1/2 nach 5-minütiger Aktivierung glatter Gefäßmuskelzellen durch die Diadenosinpolyphosphate Ap3A, Ap4A, Ap5A, Ap6A und dem Nukleotid ATP
untersucht (Abbildung 3). Es zeigte sich, dass Ap3A, Ap4A und ATP eine konzentrationsabhängige Phosphorylierung der Proteine ERK1/2 induzierten, während Ap5A und Ap6A auch bei hohen Konzentrationen keine Aktivierung der genannten Proteine bewirkten.
Ap3A
-7 -6 -5 -7 -6 -5 -6 -5 -6 -5 -7 -6 -5
Ap4A Ap5AAp6A ATP
pERK1/2 ERK1/2
- lg M
Abbildung 3: Ap3A, Ap4A und ATP induzieren im Gegensatz zu Ap5A und Ap6A eine Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2. Die für drei Tage von Serum entzogenen glatten Gefäßmuskelzellen wurden mit den Diadenosinpolyphosphaten Ap3A, Ap4A, Ap5A, Ap6A und dem Nukleotid ATP für 5 Minuten stimuliert. Die Gesamtzelllysate wurden in 10% SDS-Polyacrylamid- Gelen aufgetrennt und elektrogeblottet. Aktiviertes ERK1/2 wurde mit einem phosphospezifischen anti-ERK1/2 Antiserum detektiert. Zum Nachweis der gleichen Beladung wurden Aliquots der gleichen Probe mit einem anti-ERK1/2 Antiserum zusätzlich dargestellt. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis, das durch mindestens zwei weitere Versuche gleicher Art bestätigt wurde.
Zusätzlich wurden weitere Mitglieder der Familie der MAP-Kinasen, die c-jun-Amino- Terminus Kinase (JNK) und die p38 Kinase auf ihren Aktivitätsgrad nach Stimulation von glatten Gefäßmuskelzellen untersucht. Alle untersuchten Diadenosinpolyphosphate (Ap3A – Ap6A) aktivierten dabei nicht oder nur in einem sehr geringen Maße die MAP-Kinasen JNK und p38. ATP als Positiv- Kontrolle hingegen konnte eine Phosphorylierung dieser Kinasen induzieren.
Ergebnisse - 26 -
3.2 Beschreibung eines möglichen Signaltransduktionsweges, der zur Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 führt
Die Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Daher wurden verschiedene Signalmoleküle hinsichtlich ihrer Beteiligung an einem solchen Signaltransduktionsweg untersucht. Das Diadenosinpolyphosphat Ap4A wurde repräsentativ eingesetzt.
3.2.1 Die MAP-Kinase Kinase (MEK) ist essentieller Bestandteil des zur Aktivierung der Proteine ERK1/2 führenden Weges
Die MAP-Kinasen ERK1/2 können über eine Aktivierung der Ras/Raf/MEK-Kaskade phosphoryliert werden. Zur Klärung der Frage nach einer möglichen Beteiligung der MAP-Kinase Kinase (MEK) an der durch Ap4A induzierten ERK1/2-Phosphorylierung wurde der für MEK spezifische Inhibitor PD98059 eingesetzt. Untersucht wurde der Einfluss dieses Inhibitors auf die von Ap4A induzierte Steigerung der DNA-Synthese und der Phosphorylierung von ERK1/2 in glatten Gefäßmuskelzellen, die mittels Westernblot-Verfahrens gemessen wurde (Abbildung 4). Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Abnahme sowohl der durch Ap4A provozierten DNA- Synthese also auch der Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in glatten Gefäßmuskelzellen.
10 50 60
40 30 20
0 PD98059
Ap4A
10 1
[ H]-Thymidin-Einbau (% über Kontrolle)
- (µM) B
A
pERK-1/2 ERK-1/2
Ap4A: - + + + + PD98059: .1 1 10 µM
3
Abbildung 4: Der MEK spezifische Inhibitor PD98059 inhibiert die durch Ap4A induzierte Steigerung der DNA-Synthese und die Phosphorylierung von ERK1/2 in glatten Gefäßmuskelzellen. A) Die für drei Tage gehungerten glatten Gefäßmuskelzellen wurden für 30 Minuten mit PD98059 vorbehandelt und anschließend mit Ap4A (10-5 M) für 5 Minuten aktiviert. Die Auftrennung und die anschließende Darstellung der Proteine des Zelllysates erfolgten nach der Beschreibung im Methodenteil. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse aus mindestens drei gleich ausgeführten Experimenten. B) Die für drei Tage mit serumfreien Medium behandelten Zellen wurden, nachdem sie 30 Minuten vorher mit PD98059 inkubiert wurden, durch Ap4A (10-5 M) stimuliert. Die Messung des 3H-Thymidin-Einbaus erfolgte gemäß der Beschreibung im Methodenteil.
3.2.2 Phospholipase Cβ und Proteinkinase C sind an der durch Ap4A induzierten Phosphorylierung der MAP-Kinasen beteiligt
Der Frage nachgehend, ob die Phospholipase Cβ und die Proteinkinase C Einfluss auf die durch Ap4A induzierte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 nehmen, wurde eine Beteiligung dieser Signalmoleküle mit Hilfe der Inhibitoren U73122 bzw.
BIM untersucht (Abbildung 5). Es zeigte sich sowohl für die Phospholipase Cβ als auch für die Proteinkinase C, dass durch deren Inhibition mittels der obigen Antagonisten eine konzentrationsabhängige Abnahme der DNA-Synthese und der Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 erfolgte.
Ergebnisse - 28 -
10 50 60
40 30 20
0 U73122
Ap4A
10 1
[ H]-Thymidin-Einbau (% über Kontrolle)
- (µM)
A B
Ap4A: - + - + + +
pERK-1/2 ERK-1/2
U73122: 10 10 1 .1 µM
10 50 60
40 30 20
0 BIM
Ap4A
2 .2 [ H]-Thymidin-Einbau (% über Kontrolle)
- (µM)
C D
- + - + + + + 4 4 2 1 .5 BIM:
pERK-1/2 ERK-1/2
Ap4A:
µM
33
Abbildung 5: Phospholipase Cβ und Proteinkinase C sind an der Steigerung der DNA-Synthese und der Phosphorylierung der Proteine ERK1/2 in glatten Gefäßmuskelzellen beteiligt. A+C) Die für drei Tage gehungerten glatten Gefäßmuskelzellen wurden für 30 Minuten mit U73122 bzw. BIM vorbehandelt und anschließend mit Ap4A (10-5 M) für 5 Minuten aktiviert. Die Auftrennung und die anschließende Darstellung der Proteine des Zelllysates erfolgten nach der Beschreibung im Methodenteil. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse aus mindestens drei gleich ausgeführten Experimenten. B+D) Die Durchführung der Bestimmung der DNA-Synthese erfolgte nach der in Kapitel 2 und in Abbildung 4 beschriebenen Methode. Dargestellt sind die Mittelwerte mit den dazu gehörenden Standardabweichungen von mindestens drei Experimenten mit jeweils sechs Einzelmessungen.
3.2.3 Die durch Ap4A induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 ist abhängig von der Kinase- Aktivität des EGF-Rezeptors
Es ist beschrieben, dass bei der durch das Nukleotid ATP ausgelösten intrazellulären Signaltransduktion Thyrosinkinaserezeptoren beteiligt sind (Burnstock und Mitarbeiter 2002). Diese werden über einen noch nicht komplett beschriebenen Weg aktiviert, an dem die purinergen Rezeptoren, die Phospholipase Cβ und unterschiedliche Wachstumsfaktoren einen essentiellen Anteil haben sollen. Daher wurde eine Beteiligung des EGF-Rezeptors an dem Signaltransduktionsweg untersucht, durch den Ap4A in glatten Gefäßmuskelzellen eine Phosphorylierung der Proteine ERK1/2 und eine Steigerung der DNA-Synthese induziert. Es konnte mittels der Substanz AG1478, einem selektiven Inhibitor der EGF-Rezeptor- Autophosphorylierung, eine Beteiligung des EGF-Rezeptors nachgewiesen werden.
Zusätzlich konnte mittels AG1295, einem Inhibitor des PDGF-Rezeptors, eine Beteiligung dieses Tyrosinkinaserezeptors an dem untersuchten Signaltransduktionsweg weitgehend ausgeschlossen werden (Abbildung 6).
Ergebnisse - 30 -
10 50 60
40 30 20
0 AG1478
Ap4A
250 125 [ H]- Thymidin-Einbau (% über Kontrolle)
- (nM)
10 50 60
40 30 20
0 AG1295
Ap4A
250 125 [ H]- Thymidin-Einbau (% über Kontrolle)
- (nM) B
D EGF Ap4A PDGF
+ + - + - +
AG1478 (250nM) -
ERK-1/2
pERK-1/2
AG1295 (nM)
125 250 125 250
Thrombin Ap4A -
ERK-1/2
pERK-1/2 A
C
33
Abbildung 6: AG1478 inhibiert in glatten Gefäßmuskelzellen die durch Ap4A induzierte DNA- Synthese-Steigerung und die Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2. A+C) Mittels der oben beschriebenen Westernblot- Analyse wurde die Phosphorylierung der Proteine ERK1/2 bei Inhibition der genannten zwei Rezeptoren durch Aktivierung mit Ap4A in glatten Gefäßmuskelzellen untersucht.
Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von mindestens drei Experimenten. Bei allen Experimenten wurde eine Ap4A-Konzentration von 10-5 M eingesetzt. B+D) Nach der oben beschriebenen Methode wurde die DNA-Synthese in glatten Gefäßmuskelzellen bei Aktivierung durch Ap4A unter Inhibition des EGF- bzw. PDGF-Rezeptors untersucht. Dargestellt sind die dabei ermittelten Mittelwerte mit den Standardabweichungen aus drei Experimenten mit mindestens sechs Einzelmessungen.
3.3.1 Ap3A und Ap4A induzieren intrazelluläre Kalziumkonzentrations- erhöhungen in GMZ
Der Nachweis, dass das Diadenosinpolyphosphat Ap4A in GMZ eine Aktivierung der PLCβ induzieren kann, führte zu der Vermutung, dass auch die intrazelluläre Kalziumkonzentration durch diese Substanz verändert werden könnte, da die PLCβ über die Hydrolyse des Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat die „second messenger“
Inositol-1,4,5-trisphosphat und Diacylglycerol generiert und Inositol-1,4,5- trisphosphat aus intrazellulären Speichern Kalzium freisetzt. Außerdem konnte zusätzlich gezeigt werden, dass in hier nicht dargestellten Versuchen durch Einsatz des intrazellulären Kalziumchelators TMB8 eine Inhibition sowohl der durch Ap4A induzierten DNA-Synthese als auch der Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 induziert wurde. Aus diesem Grund wurden die Diadenosinpolyphosphate Ap3A, Ap4A, Ap5A und Ap6A auf ihren Einfluss auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration in mit Fura-2 beladenen GMZ untersucht. Es zeigte sich, dass bei einer Konzentration von 10-5 M Ap3A und Ap4A eine signifikante intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhung induzierten, die annähernd so stark ausfiel wie die von ATP und Thrombin. Das Nukleotid Adenosintriphosphat (ATP) bewirkt typischerweise eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in GMZ über purinerge Rezeptoren (Erlinge und Mitarbeiter, 1993), wohingegen Thrombin eine solche Erhöhung über Rezeptoren bewirkt, die nicht zur Klasse der purinergen Rezeptoren gehören (Reusch und Mitarbeiter, 2001). Ap5A und Ap6A zeigten keine wesentlichen Erhöhungen der untersuchten Kalziumkonzentration im Vergleich zu einer unstimulierten Kontrollgruppe (Abbildung 7).
Ergebnisse - 32 -
100 500 400 300 200
0
Maximale [Ca ] (nmol/l)
Ap3A Kontrolle
Ap4A Ap5A
Ap6A
ATP Thrombin
2+ I
Abbildung 7: Ap3A, Ap4A, ATP und Thrombin induzieren in glatten Gefäßmuskelzellen eine Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration. Die intrazellulären Kalziumkonzentrationen wurden in mit Fura-2 (2 µM) beladenen Zellen, die zuvor drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden, gemessen. ATP und die Diadenosinpolyphosphate wurden in einer Konzentration von 10-5 M, Thrombin in einer Konzentration von 2 U/ml eingesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte der maximalen Werte von Durchschnittskurven (50 Einzelmessungen) mit den dazu gehörenden Standardabweichungen.
Die Diadenosinpolyphosphate wurden in den in dieser Arbeit vorgestellten Experimenten zur Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration in einer Konzentration von 10-5 M eingesetzt. Um zu zeigen, dass mittels dieser Konzentration eine annähernd maximale Wirkung erreicht werden kann, wurden die intrazellulären Kalziumkonzentrationserhöhung durch ATP und Ap4A für 10-7 M bis hin zu 10-4 M gemessen. Dies ergab in einem Diagramm, bei der die intrazelluläre Kalziumkonzentration über die Konzentration des Agonisten aufgetragen wurde, eine sigmoidale Kurve, die für beide Substanzen bei der Konzentration von 10-5 M annähernd den maximalen Wert erreichte (Abbildung 8).
zytosolische Ca -Konzentration [nM]
0 100 200 300 400 500
Konzentration (lgM)
-7 -6 -5 -4
Ap4A ATP
2+
Abbildung 8: Konzentrationsabhängige, durch Ap4A und ATP induzierte Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Für die jeweiligen Konzentrationen sind die Durchschnittswerte der maximalen Konzentrationserhöhungen (n=3) von Kalzium mit den dazu gehörenden Standardabweichungen durch Ap4A und ATP dargestellt.
3.3.2 P2Y-Rezeptoren vermitteln die teilweise Pertussistoxin sensitive intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhung durch Ap4A in GMZ
Um die an der von Ap4A vermittelten Kalziumkonzentrationserhöhung beteiligten Rezeptoren genauer zu klassifizieren, wurden Experimente unter kalziumfreien und unter kalziumhaltigen Bedingungen gemessen. Diese Messungen zeigten, dass Ap4A unabhängig von der Kalziumkonzentration im Extrazellularraum eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration von Kalzium bewirkte, womit eine Beteiligung der P2X-Rezeptoren, die Ionenkanäle darstellen, durch die im geöffneten Zustand Kalziumionen aus dem extra- in den intrazellulären Raum strömen, weitgehend ausgeschlossen werden konnte.
Durch eine direkt vor der Messung durchgeführte 18-stündige Inkubation der GMZ mit Pertussistoxin konnte gezeigt werden, dass die durch Ap4A induzierte intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhung um die Hälfte reduziert wurde (Abbildung 9). Pertussistoxin überträgt ADP-Ribose auf heterotrimere GTP-bindende
Ergebnisse - 34 -
Proteine, wobei diese ADP- Ribosylierung ausschließlich in der nukleotidbindenden alpha-Untereinheit des inhibierenden Gi-Proteins erfolgt, wodurch dieses irreversibel gehemmt wird. Durch die gezeigte Abnahme der Konzentrationserhöhung von Kalzium konnte eine eindeutige Beteiligung einer Gi-Komponente nachgewiesen werden.
zytosolische Ca -Konzentration [nM]
100 500 600
400 300 200
0
1 2 3 4
Ap4A
Zeit [Minuten]
2+
mit PTX mit Kalzium ohne Kalzium
Abbildung 9: Ap4A (10-5 M) induziert in glatten Gefäßmuskelzellen eine intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhung, die unabhängig von der Kalziumkonzentration im Extrazellularraum aber Pertussistoxin-sensitiv ist. Dargestellt sind die jeweiligen Durchschnittskurven (n=4), die in mit Fura-2 (2 µM) beladenen Zellen ermittelt wurden. Die entsprechenden Zellen wurden über 18 Stunden vor Beginn der Messungen mit Pertussistoxin (200 ng/ml) vorbehandelt. Ein nominal extrazellulär kalziumfreies Milieu wurde durch Zugabe von EDTA (1 mM) erreicht.
3.3.3 Die Entleerung intrazellulärer Kalziumspeicher führt zu der von Ap4A induzierten Kalziumkonzentrationserhöhung
Da zuvor gezeigt werden konnte, dass die durch Ap4A induzierte intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhung auch bei einem nominal kalziumfreien extrazellulären Milieu ausgelöst werden konnte, sollte darüber hinaus dargestellt
werden, dass die Kalziumkonzentrationserhöhung über die Entleerung intrazellulärer Kalziumspeicher erklärt werden kann. Dazu wurde die inhibitorische Substanz Thapsigargin eingesetzt. Thapsigargin ist ein aus der Wurzel der Pflanze Thapsia garganica gewonnener hochspezifischer Hemmstoff der Kalzium-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums in glatten Muskelzellen (SERCA) (Inesi und Mitarbeiter, 1992) und entleert die intrazellulären Kalziumspeicher (A. Tsukamoto und Mitarbeiter, 1993). Die Interaktion von Thapsigargin mit SERCA ist irreversibel und es wird angenommen, dass durch diese Substanz SERCA dephosphoryliert wird und die ATPase dadurch eine geringere Affinität zu Kalzium einnimmt. (Carafoli und Brini, 2000). Dieser Effekt wurde genutzt, um nachzuweisen, dass das Diadenosinpolyphosphat Ap4A nur über eine Entleerung intrazellulärer Speicher eine zytosolische Kalziumkonzentrationserhöhung bewirkt (Abbildung 10). Dazu wurden die GMZ zuerst mit der Substanz Thapsigargin stimuliert, was zu der erwarteten intrazellulären Kalziumkonzentrationserhöhung durch die oben erwähnte Entleerung intrazellulärer Speicher führte. Nach dreiminütiger Wartezeit konnte nun eine Stimulation der gleichen Zellen durch Ap4A keine erneute Erhöhung der Kalziumkonzentration induzieren, was verdeutlichte, dass Ap4A seine Effekte auf den intrazellulären Kalziumspiegel dieser GMZ nur über die Beeinflussung des sarkoplasmatischen Retikulums modulieren kann.
Ergebnisse - 36 -
zytosolische Ca -Konzentration [nM]
100 500 600
400 300 200
0
Zeit (Minuten)
1 2 3 4 5 6
700
Thapsigargin Ap4A
2+
Abbildung 10: Ap4A induziert keine weitere zytosolische Kalziumkonzentrationserhöhung in glatten Gefäßmuskelzellen, wenn intrazelluläre Kalziumspeicher zuvor durch Thapsigargin (1 µM) entleert wurden. Dargestellt sind die 50 Einzelmessungen und die dazu gehörende Durchschnittskurve der Konzentration des zytosolischen Kalziums in glatten Gefäßmuskelzellen, die zur Messung mit Fura-2 (2 µM) beladen und zuvor für drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden.
3.3.4 P2Y1 vermittelt mit weiteren P2Y-Rezeptoren den durch Ap4A induzierten Anstieg der zytosolische Kalziumkonzentration
Wie im Abschnitt 3.3.2 gezeigt, sind P2X-Rezeptoren nicht an der durch Ap4A induzierten zytosolische Kalziumkonzentrationserhöhung beteiligt. Somit müssen P2Y-Rezeptoren diese Wirkung vermitteln. 2met-thio-ADP gilt als ein spezifischer Agonist des P2Y1-Rezeptors (Jiang und Mitarbeiter, 1997) und wurde verwendet, um eine Beteiligung dieses Rezeptors bei der Vermittlung von der Erhöhung des intrazellulären Kalziumpegels zu untersuchen. Abbildung 11 zeigt, dass Ap5A und Ap6A keinen Einfluss auf die gemessene zytosolische Kalziumkonzentration nahmen, wohingegen Ap4A die schon oben beschriebene Kalziumantwort induzierte.
2met-thio-ADP konnte daraufhin keine wesentliche Änderung des intrazellulären Kalziumspiegels bewirken, ganz im Gegensatz zu dem am Ende des Experimentes eingesetzten Thrombin. Als die Reihenfolge der Zugabe der beiden Substanzen Ap4A und 2met-thio-ADP umgekehrt wurde (Abbildung 12), konnte sowohl eine Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration mit Ap4A als auch mit 2met-thio- ADP erreicht werden. Aus dieser Beobachtung heraus konnte eine Beteiligung des P2Y1-Rezeptors bei der Vermittlung der intrazellulären Kalziumkonzentrations- erhöhung durch Ap4A gezeigt werden. Der spezifische P2Y1-Agonist 2met-thio-ADP konnte nur seine Wirkung erzielen, wenn nicht zuvor durch Ap4A dessen Rezeptor aktiviert und internalisiert wurde.
zytosolische Ca -Konzentration [nM]
100 500 600
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0
Zeit [Minuten]
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700
Ap5A Ap6A Ap4A 2met-thio-ADP Thrombin
2+
Abbildung 11: 2met-thio-ADP induziert nach vorheriger Aktivierung durch Ap4A in GMZ keine zytosolische Kalziumkonzentrationserhöhung. Dargestellt sind 50 Einzelmessungen mit der dazu gehörenden Durchschnittskurve von intrazellulären Kalziumkonzentrationen in mit Fura-2 (2 µM) beladenen glatten Gefäßmuskelzellen. Die Zellen wurden vor den jeweiligen Messungen über drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert und mit den entsprechenden Agonisten aktiviert. Ap5A, Ap6A, Ap4A und 2met-thio-ADP kamen in den Konzentrationen von 10-5 M, Thrombin in der Konzentration von 2 U/ml zum Einsatz.
Ergebnisse - 38 -
zytosolische Ca -Konzentration [nM]
100 500 600
400 300 200
0
Zeit [Minuten]
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700
2-met-thio-ADP Ap4A Thrombin
2+
Abbildung 12: Ap4A induziert nach vorangegangener 2met-thio-ADP-Stimulation eine intrazelluläre Kalziumkonzentrationserhöhung in GMZ. Dargestellt sind 50 Einzelmessungen mit der dazu gehörenden Durchschnittskurve von intrazellulären Kalziumkonzentrationen in mit Fura-2 (2 µM) beladenen aortalen glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte. Die Zellen wurden vor den jeweiligen Messungen über drei Tage unter serumfreien Bedingungen kultiviert und mit den entsprechenden Agonisten aktiviert. Ap4A und 2met-thio-ADP kamen in den Konzentrationen von 10-5 M, Thrombin in der Konzentration von 2 U/ml zum Einsatz.
3.4 Ap4A induziert in glatten Gefäßmuskelzellen keine Differenzierung
Die Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 kann in glatten Gefäßmuskelzellen bei der Übermittlung von proliferativen oder differenzierenden Signalen bedeutend sein.
Dabei spielt nicht nur allein die Phosphorylierung dieser Kinasen eine wichtige Rolle, sondern auch die Dauer der Stimulation der Proteine ERK1/2 (Marshall, 1995).
Reusch und Mitarbeiter (2001) konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass Thrombin zwei Phasen der ERK-Aktivierung induziert, wobei beide Phasen für die Differenzierung von GMZ bedeutsam sind. Diesem Gedanken folgend wurde der durch Ap4A induzierte Grad der Phosphorylierung von ERK1/2 innerhalb eines Stimulationszeitraumes von 180 Minuten gemessen. Es zeigte sich für die ersten 15 Minuten eine signifikante Steigerung der Phosphorylierung der untersuchten MAP-
