Vergleichende Untersuchungen über die Expression von Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren in senilen Plaques im zentralen Nervensystem alter Hunde und Menschen

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Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Frankfurter Str. 89 · Tel.: 06 41/ 2 44 66 · Fax: 06 41/ 2 53 75

e-mail: Geschaeftsstelle@dvg.net · Homepage: http://www.dvg.net ISBN 3-938026-54-5

S il k e S te p h a n ie P a u l H a n n o v e r

Vergleichende Untersuchungen über die Expression von Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren in

senilen Plaques im zentralen Nervensystem alter Hunde und Menschen

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmed izin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Silke Stephanie Paul aus Karlsruhe

Hannover 2005

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1. Auflage 2005

ISBN 3-938026-54-5

Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net

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Vergleichende Untersuchungen über die Expression von Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren in

senilen Plaques im zentralen Nervensystem alter Hunde und Menschen

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Silke Stephanie Paul

aus Karlsruhe

Hannover 2005

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Andrea Tipold

Tag der mündlichen Prüfung: 21. November 2005

Die Anfertigung dieser Arbeit wurde gefördert durch ein Promotionsstipendium des Cusanuswerkes, Bischöfliche Studienförderung e.V.

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Für meine Eltern

in großer Liebe und Dankbarkeit

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Die Frage bleibt

Halte dich still, halte dich stumm, Nur nicht forschen, warum, warum?

Nur nicht bittre Fragen tauschen, Antwort ist doch nur wie Meeresrauschen.

Wie’s dich auch aufzuhorchen treibt, Das Dunkel, das Rätsel, die Frage bleibt.

Theodor Fontane

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Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden auf folgender Tagung präsentiert:

Paul, S., W. Schachenmayr, K. Kuchelmeister, W. Baumgärtner u. S. Alldinger

"Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in the brains of dogs and Alzheimer’s patients - a comparative study"

Vortrag, 22. Kongress der European Society of Veterinary Pathology (ESVP), Olsztyn, Polen 15. - 18. September 2004

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Die Alzheimer-Krankheit des Menschen ... 3

2.1.1 Allgemeines ... 3

2.1.2 Pathogenese ... 3

2.2 Altersbedingte Veränderungen im zentralen Nervensystem von Hunden... 16

2.2.2 Aß-Proteinablagerungen und neurofibrilläre Tangles ... 16

2.2.3 Kognitive Dysfunktionen bei alten Hunden ... 19

2.3 Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihre Inhibitoren (TIMPs)... 21

2.3.2 Klassifizierung und Aufbau der MMPs... 21

2.3.3 Klassifizierung und Aufbau der TIMPs ... 27

2.3.4 Expression, Aktivierung, Regulation und Substrate der MMPs und TIMPs ... 28

2.3.5 Physiologie und Pathophysiologie der MMPs und TIMPs ... 31

2.3.6 MMPs und TIMPs und Aß-Proteinablagerungen... 33

3 Material und Methoden ... 35

3.1 Hunde ... 35

3.2 Menschen... 35

3.3 Gewinnung und Aufarbeitung der Organproben ... 36

3.4 Histochemische Färbemethoden... 38

3.4.1 HE-Übersichtsfärbung ... 38

3.4.2 Silberfärbung nach Campbell-Switzer ... 38

3.4.3 Silberfärbung nach Gallyas ... 39

3.4.4 Kongorot-Färbung ... 40

3.5 Lektinhistochemische und immunhistologische Färbemethoden... 41

3.5.1 Antikörper und Seren ... 41

3.5.2 Protokolle zur Durchführung der ABC-Methode... 43

3.5.3 Doppelmarkierungstechniken... 46

3.5.4 Kontrollen... 48

3.6 Verwendete Nomenklaturen ... 50

3.7 Befunderhebung, Auswertung und statistische Aufarbeitung der Daten ... 50

4 Ergebnisse ... 53

4.1 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne... 53

4.1.1 Hunde ... 53

4.1.2 Menschen... 53

4.2 Hunde - Histochemische, lektinhistochemische und immunhistologische Darstellung des Aß-Proteins, der Gliazellreaktionen, neuritischer Komponenten und des Synaptophysins... 55

4.2.1 Immunhistologischer Nachweis des Aß-Proteins... 55

4.2.2 Histochemischer Nachweis des Aß-Proteins mittels Silberfärbung nach Campbell-Switzer ... 56

4.2.3 Histochemischer Nachweis fibrillären Aß-Proteins mittels Kongorot-Färbung ... 57

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4.2.4 Histochemischer Nachweis neuritischer Komponenten mittels

Silberfärbung nach Gallyas... 57

4.2.5 Immunhistologischer Nachweis von Synaptophysin ... 58

4.2.6 Immunhistologischer Nachweis von GFAP... 58

4.2.7 Lektinhistochemischer Nachweis BS-1-positiver Zellen... 59

4.3 Menschen - Histochemische und immunhistologische Darstellung des Aß-Proteins, der Gliazellreaktionen, neuritischer Komponenten und des Synaptophysins ... 60

4.3.1 Immunhistologischer Nachweis des Aß-Proteins ... 60

4.3.2 Histochemischer Nachweis des Aß-Proteins mittels Silberfärbung nach Campbell-Switzer... 61

4.3.3 Histochemischer Nachweis fibrillären Aß-Proteins mittels Kongorot-Färbung... 62

4.3.4 Histochemischer Nachweis neuritischer Komponenten mittels Silberfärbung nach Gallyas... 62

4.3.5 Immunhistologischer Nachweis von Synaptophysin ... 63

4.3.6 Immunhistologischer Nachweis von GFAP... 63

4.3.7 Immunhistologischer Nachweis von CD68 ... 64

4.4 Hunde und Menschen - Immunhistologische Nachweise der MMPs und TIMPs... 65

4.4.2 Immunhistologischer Nachweis von MMP-1 ... 66

4.4.10 Immunhistologischer Nachweis von TIMP-1 ... 80

4.4.11 Immunhistologischer Nachweis von TIMP-2 ... 83

4.5 Fotografische Dokumentation der Ergebnisse ... 86

5 Diskussion ... 109

5.1 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne ... 109

5.2 Hunde - Aß-Proteinablagerungen, Gliazellreaktionen, neuritische Komponenten und Synaptophysin-Immunreaktivität ... 111

5.3 Menschen - Aß-Proteinablagerungen, Gliazellreaktionen, neuritische Komponenten und Synaptophysin-Immunreaktivität ... 117

5.4 Immunhistologischer Nachweis der MMPs und TIMPs... 119

5.4.1 Hunde ... 119

5.4.2 Menschen ... 125

5.5 Schlussfolgerung... 134

6 Zusammenfassung... 137

7 Summary... 141

8 Literaturverzeichnis... 145

9 Anhang ... 185

9.1 Untersuchte Hunde und Menschen ... 185

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9.2 Lösungen und Puffer für die histochemischen, lektinhistochemischen und

immunhistologischen Untersuchungen... 190

9.2.1 Histochemie - Silberfärbung nach Campbell-Switzer ... 190

9.2.2 Histochemie - Silberfärbung nach Gallyas... 192

9.2.3 Histochemie - Kongorot-Färbung... 192

9.2.4 Lektinhistochemie und Immunhistologie ... 193

9.3 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper ... 197

9.4 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel... 200

9.5 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen... 201

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1 Einleitung

Die Alzheimer-Krankheit stellt die Hauptursache seniler Demenzerkrankungen des Menschen dar. Sie führt aufgrund abnormer Akkumulationen verschiedener Proteine im Gehirngewebe zu einem graduellen und unaufhaltsamen Verlust der kognitiven Fähigkeiten und endet mit dem physischen und psychischen Verfall des erkrankten Menschen. Die histopathologischen Hauptmerkmale der Krankheit sind extrazelluläre, aus Aß-Protein bestehende senile Plaques und intraneuronale, als neurofibrilläre Tangles bezeichnete Ansammlungen hyper- phosphorylierten Tau-Proteins. Senile Plaques und neurofibrilläre Tangles treten zwar auch in den Gehirnen alter, nicht-dementer Menschen im Rahmen des physiologischen Alterungsprozesses auf, sie liegen in den Gehirnen von Alzheimer-Patientinnen und -Patienten jedoch in weit größerer Zahl und in für die Krankheit charakteristischen Gehirnregionen vor.

Senile Plaques werden anhand ihrer Morphologie in diffuse, primitive, klassische und "burnt- out" Plaques eingeteilt, welche verschiedene Stadien der Plaquereifung darstellen. Diffuse Plaques stellen als initiale Form der Aß-Proteinablagerungen die Frühstadien der Plaqueentstehung dar. In Gehirnen alter Hunde lassen sich Aß-Proteinablagerungen nachweisen, die in Morphologie und Aufbau den diffusen Plaques des Menschen ähneln, so dass der Hund als natürliches Tiermodell für die Untersuchung der initialen Vorgänge der Plaqueentstehung des Menschen dient.

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind zinkabhängige Enzyme einer zurzeit 25 Mitglieder zählenden Enzymfamilie, die neben Molekülen der extrazellulären Matrix (EZM) zahlreiche weitere Substrate abbauen und an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie beispielsweise Angiogenese, Wundheilung und Tumormetastasierung beteiligt sind. MMPs werden als inaktive Zymogene sezerniert und bedürfen zu ihrer Aktivierung einer proteolytischen Spaltung. Aktivierte MMPs können unter anderem von ihren endogenen Inhibitoren, den "Tissue inhibitors of metalloproteinases" (TIMPs) gehemmt werden.

Den MMPs und TIMPs wird eine Rolle in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit des Menschen zugesprochen. So konnten sowohl in Assoziation mit senilen Plaques und

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neurofibrillären Tangles als auch im Liquor und Plasma von Alzheimer-Patientinnen und -Patienten eine erhöhte Expression verschiedener MMPs und TIMPs, wie beispielsweise MMP-1, -3, latentes MMP-9 und TIMP-1 nachgewiesen werden. Auch in Gehirnen alter Hunde mit senilen Plaques konnte mittels Zymographie eine erhöhte Expression von latentem MMP-9 festgestellt werden. Da aktivierte MMPs in der Lage sind, das Aß-Protein zu spalten, wird ihnen eine Rolle in der Pathogenese der Plaqueentwicklung zugesprochen.

Ziel dieser Arbeit war es, mittels immunhistologischer Methoden die Assoziation verschiedener MMPs und TIMPs mit senilen Plaques in den Gehirnen alter Hunde und Alzheimer-Patientinnen und -Patienten zu vergleichen sowie die Eignung des Hundes als Tiermodell bezüglich der MMP- und TIMP-Beteiligung in den frühen Plaqueformen der Alzheimer-Krankheit des Menschen zu evaluieren. Zusätzlich sollten die Expressionsmuster der einzelnen MMPs und TIMPs in den Gehirnen junger und alter Hunde ohne Aß- Proteinablagerungen untersucht und den MMP- und TIMP-Expressionsprofilen in den Gehirnen alter Hunde mit senilen Plaques gegenübergestellt werden.

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2 Literaturübersicht

2.1 Die Alzheimer-Krankheit des Menschen

2.1.1 Allgemeines

Morbus Alzheimer ist eine beim Menschen auftretende neurodegenerative Erkrankung, die sich überwiegend im höheren Lebensalter manifestiert (ROCCA et al., 1991). Sie trägt den Namen des Neuropathologen und Psychiaters Alois Alzheimer, der vor fast hundert Jahren das Gehirn einer 56 Jahre alten und schwer dementen Patientin histopathologisch untersuchte und die erhobenen Befunde als „eigenartige Erkrankung der Hirnrinde“ bezeichnete (ALZHEIMER, 1906). Die Erkrankung stellt die Hauptursache seniler Demenz dar und äußert sich klinisch in einer schweren Beeinträchtigung der kognitiven Gehirnleistungen mit mentalem und physischem Verfall des Menschen bis hin zum Tod (HAMPEL et al., 1999).

Das Risiko, an Alzheimer zu erkranken, steigt mit dem Erreichen des 60. Lebensjahres an und verdoppelt sich in jedem folgenden Lebensjahrzehnt exponentiell. Neuere Untersuchungen sagen voraus, dass sich im Rahmen der demografischen Entwicklung die Inzidenz der Erkrankung in den nächsten 50 Jahren verdreifachen wird (MATTSON, 2004). Die Alzheimer-Krankheit kann zwar klinisch mittels neurologischer Untersuchungen, neuropsychologischer Tests und bildgebender Verfahren mit hoher Wahrscheinlichkeit diagnostiziert werden, eine definitive Diagnose lässt sich jedoch erst post mortem anhand der charakteristischen histopathologischen Veränderungen im Gehirn stellen (MIRRA et al., 1991; HAMPEL et al., 1999).

2.1.2 Pathogenese

Es existieren sporadische, also ohne evidente familiäre Häufung auftretende, und genetische Formen der Alzheimer-Krankheit, wobei die sporadischen Fälle für über 90% der Alzheimererkrankungen verantwortlich sind. Bei den genetisch bedingten Formen ("familial Alzheimer’s disease", FAD) unterscheidet man zwischen frühen, vor dem 60. Lebensjahr auftretenden ("early-onset") und nach dem 60. Lebensjahr auftretenden "late-onset"

Varianten. Die "early-onset" Formen beruhen auf autosomal-dominant vererbten Mutationen

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des "Amyloid-Precursor-Protein"-Gens (APP, Chromosom 21) oder der Presenilin Gene 1 (Chromosom 14) und 2 (Chromosom 1; MASTERS et al., 1981; BEYREUTHER et al., 1991;

HENDRIKS und VAN BROECKHOVEN, 1996; LENDON et al., 1997). Für ca. 10% der sporadischen Formen und ungefähr 50% der "late-onset" Varianten der familiären Form der Alzheimer-Krankheit hingegen wird ein Suszeptibilitäts-Gen (Apolipoprotein E4 (ApoE4), Chromosom 19) verantwortlich gemacht. Bei Trägern des mutierten Gens kommt es nicht zwingend zu einem Ausbruch der Krankheit, aber das Risiko zu erkranken ist stark erhöht und das Erkrankungsalter deutlich herabsetzt (DAL FORNO et al., 1996; LEVY-LAHAD und BIRD, 1996).

Die histopathologischen Hauptmerkmale im Gehirn von Alzheimer-Patientinnen und -Patienten stellen neurofibrilläre Tangles ("neurofibrillary tangles"), Neuropilfäden ("neuropil threads"), senile Plaques und ein auf bestimmte Gehirnregionen (vor allem im CA1-Feld des Hippocampus) begrenzter Neuronenverlust dar (PROBST et al., 1991;

BRAAK und BRAAK, 1991a; WEST et al., 1994; WEST et al., 2004). Des Weiteren lassen sich in den Pyramidalneuronen des Hippocampus granulovakuoläre Degenerationen (SIMCHOWICZ, 1911) und Hirano-Körperchen ("Hirano bodies"; HIRANO et al., 1966) nachweisen. Alle diese Veränderungen treten zum großen Teil auch im Rahmen des normalen Alterungsprozesses auf und finden sich teilweise auch bei anderen Krankheitskomplexen. Sie weichen aber bei der Alzheimer-Krankheit sowohl hinsichtlich ihrer Ausprägung als auch der Lokalisation der Läsionen von dem histologischen Bild physiologischer altersbedingter Veränderungen bzw. anderer Krankheitskomplexe ab (PROBST et al., 1991; KNOPMAN et al., 2003).

Neurofibrilläre Tangles bestehen ultrastrukturell aus paarigen, doppelhelixartig gewundenen Filamenten ("paired helical filaments", PHF), die im Zytoplasma von Neuronen liegen und zum größten Teil aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein bestehen (GOLDMAN und YEN, 1986; GOEDERT et al., 1991). Hyperphosphoryliertes Tau-Protein verliert seine Fähigkeit, an Mikrotubuli zu binden, was in einer Destabilisierung des Mikrotubuli-Netzwerkes der Zelle und einem gestörten axonalen Transport resultiert (LINDWALL und COLE, 1984). Die daraus folgenden neuronalen Dysfunktionen bedingen letztlich den Untergang der

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Nervenzellen, so dass die neurofibrillären Tangles frei und ohne Zellassoziation als so genannte "ghost tangles" im Neuropil vorliegen. PHFs finden sich auch in den dystrophischen Neuriten und Axonen primitiver und klassischer Plaques sowie in den Dendriten der Nervenzellen des Kortex, wo sie als Neuropilfäden ("neuropil threads") bezeichnet werden (BRAAK et al., 1986). PHFs sind lichtmikroskopisch im HE-Schnitt kaum zu erkennen, lassen sich aber immunhistologisch mit anti-Tau-Antikörpern oder verschiedenen Versilberungsmethoden, wie beispielsweise der Silberfärbung nach Gallyas oder der modifizierten Bielschowsky-Methode, darstellen (GALLYAS, 1971; YAMAMOTO und HIRANO, 1986; BRAAK und BRAAK, 1991b). In den Gehirnen alter, nicht dementer Menschen finden sich nur wenige neurofibrilläre Tangles in Neuronen der transentorhinalen und entorhinalen Region sowie des Hippocampus, während in den Gehirnen von Alzheimer- Patientinnen und -Patienten das Auftreten neurofibrillärer Tangles einem charakteristischen Muster folgt, welches sich anhand der Schwere und Lokalisation der Veränderungen in sechs Stadien unterteilen lässt (BRAAK und BRAAK, 1991a). Stadium I und II zeichnen sich durch Bildung neurofibrillärer Tangles in der transentorhinalen und entorhinalen Region aus, wobei diese Stadien noch keine neurologischen Ausfallserscheinungen bedingen (präklinische Phase). Im Stadium III und IV sind zusätzlich die angrenzenden subkortikalen und kortikalen Anteile des limbischen Systems wie Hippocampus, temporaler und basaler Neocortex betroffen und es lassen sich die ersten klinischen Anzeichen einer Alzheimer-Erkrankung feststellen. Dem klinisch voll entwickelten Krankheitsbild entspricht das zusätzliche Auftreten zahlreicher neurofibrillärer Tangles in den Neuronen der Assoziationsgebiete des frontalen, temporalen und parietalen Kortex sowie verschiedener subkortikaler Kerne (Stadium V und VI).

Senile Plaques besitzen keine einheitliche Struktur, sondern können sich aus neuronalen (dystrophische Neuriten) und nicht-neuronalen Komponenten (extrazelluläre Aß- Proteinablagerungen, reaktive Mikrogliazellen und Astrozyten) zusammensetzen und lassen sich anhand ihrer Morphologie und ihres ultrastrukturellen Aufbaus sowie in Abhängigkeit der proportionalen Anteile ihrer Komponenten in verschiedene Plaqueformen unterteilen (PROBST et al., 1991). Das Aß-Protein liegt in Abhängigkeit der Plaqueform in nicht- fibrillärer oder fibrillärer Form ("Amyloid") vor (OGOMORI et al., 1989; PROBST et al.,

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1991). Amyloid ist ein Überbegriff für homogene, extrazellulär im Gewebe abgelagerte und aus verschiedenen Vorläuferproteinen abgeleitete Glykoproteinkomplexe, die aus Amyloidfibrillen (Proteine in ß-Faltblattstruktur), der so genannten P-Komponente des Amyloids und Proteoglykanen der extrazellulären Matrix bestehen (WESTERMARK, 1998).

Amyloidablagerungen sind alkohol- und wasserunlöslich sowie proteolyseresistent und zeigen nach Imprägnierung mit Kongorot (PUCHTLER et al., 1962) aufgrund der Doppelbrechung des polarisierten Lichtes eine grün schimmernde Farbe (Dichroismus). Nach Inkubation mit Thioflavin S wird Amyloid zur Entsendung eines charakteristischen gelbgrünen Fluoreszenz- lichtes angeregt (CUMMINGS et al., 1996c).

Für die Plaqueformen im Gehirn des Menschen gibt es in der Literatur viele synonym verwendete Bezeichnungen. Diffuse Plaques (YAMAGUCHI et al., 1988) oder "pre- amyloid-deposits" (TAGLIAVINI et al., 1988) werden auch als "amorphe" (ROZEMULLER et al., 1989) oder "diffuse non-neuritic" (GRIFFIN et al., 1995) Plaques angesprochen. In dieser Plaqueform liegt das Aß-Protein in nicht-fibrillärer Form (Abb. 2.1; YAMAGUCHI et al., 1989) vor, so dass sich diffuse Plaques nicht mittels Kongorot- oder Thioflavin-S- Färbungen darstellen lassen (OGOMORI et al., 1989). Sie können jedoch durch Aß-Protein- Immunhistologie und zahlreiche Silberfärbungen, wie beispielsweise der modifizierten Bielschowsky- oder Campbell-Switzer-Methode, visualisiert werden (YAMAMOTO und HIRANO, 1986; CAMPBELL et al., 1987; DOI-YI et al., 1991). Diffuse Plaques variieren in ihrer Größe (10-200µm) und sind meist sehr unscharf begrenzt (YAMAGUCHI et al., 1988;

PROBST et al., 1991). Diffuse Plaques enthalten keine dystrophischen Neuriten und stellen die Start- und Frühstadien der Plaqueentwicklung dar (YAMAGUCHI et al., 1988;

ROZEMULLER et al., 1989). Sie enthalten oft morphologisch intakte Neuronen und werden als initiale Form der Aß-Proteinablagerung sowohl im Rahmen des normalen Alterungsprozesses als auch einer klinisch noch nicht erkennbaren Alzheimer-Erkrankung angesehen (HAGA et al., 1989; YAMAGUCHI et al., 1991; MORRIS et al., 1996). In Assoziation mit diffusen Plaques finden sich keine aktivierten Mikrogliazellen oder reaktive Astrozyten (ROZEMULLER et al., 1989; SASAKI et al., 1997). Primitive oder "diffuse neuritic" (GRIFFIN et al., 1995) Plaques bestehen aus geschwollenen, z.T. dystrophischen Neuriten und fibrillären Aß-Proteinablagerungen und zeigen bezüglich ihrer Morphologie

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eine recht große Heterogenität, die vom Vorhandensein einzelner "Amyloidfäden" und geschwollener Neuriten (Abb. 2.1) bis hin zu großen Mengen an fibrillären Aß- Proteinablagerungen und dystrophischen Neuriten (Abb. 2.1) reicht.

Abbildung 2.1: Die verschiedenen Plaqueformen im Gehirn des Menschen

1 2a 2b 3 4

1 = diffuser Plaque, 2a = primitiver Plaque mit wenig fibrillärem Aß-Protein, 2b = primitiver Plaque mit größeren Mengen an fibrillärem Aß-Protein, 3 = klassischer Plaque, 4 = "burnt-out" Plaque; 2a, 2b und 3 werden auch unter dem Begriff "neuritische Plaques" zusammengefasst

Primitive Plaques werden in der Literatur auch als "large size fibrillary deposits" (OGOMORI et al., 1989) oder "atypische" Plaques bezeichnet (PROBST et al., 1991). In Assoziation mit primitiven Plaques finden sich zahlreiche aktivierte Mikrogliazellen und große, stark GFAP- positive reaktive Astrozyten (ROZEMULLER et al., 1989; PIKE et al., 1995a; SHENG et al., 1997). Aus primitiven Plaques entwickeln sich klassische Plaques (Abb. 2.1), in denen ein zentraler Kern aus kondensiertem, fibrillären Aß-Protein (Amyloid) von einem peripheren Kranz dystrophischer Neuriten und Astrozytenfortsätzen umgeben ist (PROBST et al., 1991).

Klassische Plaques werden auch als "typische" (OGOMORI et al., 1989) oder reife ("mature") bzw. "dense core neuritic" (GRIFFIN et al., 1995) Plaques bezeichnet. In und um klassische Plaques lassen sich ebenfalls aktivierte Mikrogliazellen und reaktive Astrozyten nachweisen, allerdings in geringerer Menge als bei den primitiven Plaques (ROZEMULLER et al., 1989;

SHENG et al., 1997). Da sowohl primitive als auch klassische Plaques dystrophische Neuriten enthalten, werden die beiden Plaqueformen auch unter dem Begriff neuritische Plaques zusammengefasst. Der so genannte "burnt-out", "compact" (OGOMORI et al., 1989) oder "dense core non-neuritic" (GRIFFIN et al., 1995) Plaque (Abb. 2.1) besteht nur noch aus einem Amyloidkern und stellt das Endstadium der Plaqueentwicklung dar. In

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Assoziation mit "burnt-out" Plaques finden sich weder aktivierte Mikrogliazellen noch reaktive Astrozyten (SHENG et al., 1997). Weitere Aß-Proteinablagerungen in den Gehirnen von Alzheimer-Patientinnen und -Patienten stellen subpial und -ependymal, sowie in der pre- α-Neuronenschicht des entorhinalen Kortex gelegene diffuse, wolkige Ansammlungen nicht- fibrillären Aß-Proteins dar (OGOMORI et al., 1989).

In der Tunica media und adventitia kleinerer Arterien und Arteriolen der Leptomeninx und des Parenchyms finden sich vornehmlich Akkumulationen des fibrillären Aß-Proteins, was zur Ausbildung einer kongophilen Angiopathie führt, von der Venen und Kapillaren weniger häufig betroffen sind (PANTELAKIS, 1954; ESIRI und WILCOCK, 1986; YAMAGUCHI et al., 1992; SHINKAI et al., 1995). Hochgradige Amyloidablagerungen können zu Gefäßwand- schädigungen, daraus resultierenden Blutungen sowie zu einer Zerstörung der Blut-Hirn- Schranke führen (MANDYBUR, 1986).

Aß-Proteinablagerungen in Plaques und Gefäßen lassen sich durch verschiedene Silberfärbungen wie beispielsweise der modifizierten Bielschowsky- oder Campbell-Switzer- Methode nachweisen (YAMAMOTO und HIRANO, 1986; CAMPBELL et al., 1987). Sie lassen sich darüber hinaus sehr gut immunhistologisch darstellen, wobei jedoch nicht zwischen fibrillären und nicht-fibrillären Aß-Proteinanteilen unterschieden werden kann (DOI-YI et al., 1991; PROBST et al., 1991). Kongorot- oder Thioflavin-S-Färbungen hingegen markieren deutlich fibrilläre Aß-Komponenten und dystrophische Neuriten in primitiven, klassischen und "burnt-out" Plaques bzw. Gefäßen (PROBST et al., 1991).

In den Gehirnen alter, nicht dementer Menschen finden sich vornehmlich diffuse Plaques und nur zu einem geringen Anteil primitive und klassische Plaques (DAYAN, 1970;

OGOMOROI et al., 1989; DICKSON et al., 1992). Die Plaques liegen hauptsächlich in der Großhirnrinde (Lobus frontalis und temporalis), im Mandelkern (Nucleus amygdaloideum), im entorhinalen Kortex sowie im Hippocampus vor. Mit zunehmender Plaquezahl in der Großhirnrinde treten sie vereinzelt auch in subkortikalen Kerngebieten wie z.B. dem Nucleus caudatus und dem Hypothalamus auf, während im Kleinhirn und Rückenmark keine Plaques zu finden sind (OGOMORI et al., 1989). In den Gehirnen von Alzheimer-Patientinnen und

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-Patienten ist die Plaquegesamtzahl sehr viel höher und es liegen neben diffusen Plaques deutlich mehr primitive und klassische Plaques vor als in den Gehirnen nicht-dementer alter Menschen (OGOMORI et al., 1989). Vor allem im Subiculum und dem CA-1 Feld des Ammonshorns lassen sich große Mengen primitiver Plaques nachweisen. Die ersten Plaques finden sich im transentorhinalen und entorhinalen Kortex, im Hippocampus und im Mandelkern (Nucleus amygdaloideum). Mit dem Fortschreiten der Erkrankung lassen sich auch zahlreiche Plaques in Assoziationsgebieten des frontalen, parietalen und temporalen Neokortex nachweisen (BRAAK und BRAAK, 1991a).

Nach Purifikation des Aß-Proteins aus Plaques und meningealen Blutgefäßen von Alzheimer- Patientinnen und -Patienten und der Aufklärung seiner Aminosäuresequenz konnte das kodierende Gen seines Vorläuferproteins, des "Amyloid Precursor Protein" (APP), auf Chromosom 21 identifiziert werden (GLENNER und WONG, 1984; KANG et al., 1987;

TANZI et al., 1988). Das Aß-Protein ist ein konstitutiv sezerniertes Produkt der proteolytischen Spaltung des APPs im physiologischen Metabolismus des Körpers (HAASS et al., 1992). Das APP ist integraler Bestandteil der Zellmembran und liegt im menschlichen Körper in drei verschiedenen Isoformen (695, 751 und 770 Aminosäuren) vor. Die kürzeste Isoform mit 695 Aminosäuren wird fast nur in Neuronen exprimiert, während die beiden anderen Isoformen sowohl in neuronalen als auch nicht-neuronalen Zellen vorkommen (SELKOE, 1999). Grundsätzlich kann das APP zwei verschiedenen Abbauwegen unterliegen (Abb. 2.2), wobei im Rahmen des amyloidogenen APP-Abbaus die pathogenetisch für die Plaqueentwicklung bedeutsamen Aß-Proteine entstehen. Beim amyloidogenen APP-Abbau wird das APP zunächst durch die membranverankerte β-Sekretase ("ß-site APP-cleaving enzyme", BACE1) am N-terminalen Ende der Aß-Domäne gespalten (Abb. 2.2, VASSAR et al., 1999). Dies führt zur Generierung eines löslichen APP-Fragmentes (sAPPß) sowie eines membranverankerten, C-terminalen, aus 99 Aminosäuren bestehenden Protein-Fragmentes (C99). Das C99-Fragment wird in einem nächsten Schritt durch die γ-Sekretase, einem heterodimeren, aus Presenilin, Nicastrin, PEN-2 ("Presenilin enhancer-2") und APH-1 ("Anterior pharynx-defective phenotype 1") bestehenden Proteinkomplex, gespalten (TAKASUGI et al., 2003). Aus dieser Spaltung entstehen eine intrazelluläre APP-Domäne

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sowie vornehmlich 40 Aminosäuren lange Aß-Protein-Monomere (90%) und nur zu einem geringen Anteil aus 42 Aminosäuren bestehende Aß42-Monomere (10%; SELKOE, 1999).

Abbildung 2.2: Schematischer APP-Abbau Antiamyloidogener APP-Abbau

- keine Plaqueentwicklung -

Amyloidogener APP-Abbau

- Plaqueentwicklung -

Plaque

C83 sAPPα

neurotroph, neuroprotektiv

α-Sekretase (ADAM10,

ADAM17)

ß-Sekretase (BACE1)

sAPPβ

C99 γ-Sekretase

Aβ40/42

p3

APP

Aβ-Oligomere

Zellkern

Modulation der Genexpression Apoptose-Induktion

Intrazelluläre APP-Domänen γ-Sekretase

Zellmembran

Antiamyloidogener APP-Abbau

- keine Plaqueentwicklung -

Amyloidogener APP-Abbau

- Plaqueentwicklung -

Plaque

C83 sAPPα

ADAM17)

sAPPβ

Aβ40/42

p3

APP

Aβ-Oligomere

Zellkern

Zellmembran

Plaque

C83 sAPPα

ADAM17)

sAPPβ

Aβ40/42

p3

APP

Aβ-Oligomere

Zellkern

Intrazelluläre APP-Domänen

Zellkern

Zellmembran

(nach LICHTENTHALER und HAAS, 2004) Aβ40/42 = Aus 40 bzw. 42 Aminosäuren bestehende Aß-Protein-Monomere, ADAM10 = "a disintegrin and metalloproteinase" 10, ADAM17 = "a disintegrin and metalloproteinase" 17, APP = "amyloid precursor protein", sAPP = lösliche Spaltprodukte des APP, BACE1 = "ß-site APP-cleaving enzyme 1" (β-Sekretase), C83 = aus 83 Aminosäuren bestehendes C-terminales Ende des APP, C99 = aus 99 Aminosäuren bestehendes C-terminales Ende des APP, p3 = p3-Peptid

Aß42 zeigt jedoch eine sehr viel höhere Affinität zur Selbstaggregation als Aß40, weshalb die initialen Plaqueformen (diffuse Plaques) und Gefäßablagerungen nur aus Aß42 bestehen (IWATSUBO et al., 1994; SHINKAI et al., 1995). Man nimmt an, dass Aß42 als Kristallisationskern für die Ablagerungen des Aß40-Proteins fungiert, welches sich im Laufe

(23)

der Plaquereifung ablagert und in primitiven und klassischen Plaques nachweisbar ist (JARRET et al., 1993).

Ein zweiter, alternativer, antiamyloidogener APP-Abbau führt über eine durch die α-Sekretase vermittelte APP-Spaltung zur Entstehung eines membranständigen, 83 Aminosäuren langen Protein-Fragments (C83) und eines löslichen APP-Anteils (sAPPα). Das C83-Fragment unterliegt ebenfalls einer Spaltung durch die γ-Sekretase, wobei ein als p3 bezeichnetes Peptid und die intrazelluläre APP-Domäne freigesetzt werden. Als α-Sekretasen konnten in vitro bisher drei Enzyme aus der Familie der ADAMs ("a disintegrin and metalloproteinase") identifiziert werden; ADAM9, ADAM10 und ADAM17 (= "tumor necrosis factor-α converting enzyme" (TACE); BUXBAUM et al., 1998; KOIKE et al., 1999;

LAMMICH et al., 1999). In einer neueren Studie gelang es, die α-Sekretase-Aktivität für ADAM10 auch in vivo nachzuweisen (POSTINA et al., 2004). Dem aus der α-Sekretase- Spaltung entstehenden löslichen Anteil des APPs (sAPPα) werden neuroprotektive und neurotrophe Eigenschaften zugesprochen (MATTSON et al., 1997). Die Rolle des p3 Peptids ist weitestgehend ungeklärt, obwohl eine möglicherweise pathogene Funktion postuliert wurde (HIGGINS et al., 1996). Die intrazellulären APP-Domänen ("APP intracellular domains", AICD) scheinen sowohl direkt als auch indirekt in der Lage zu sein, die Genexpression zu modulieren (LAFERLA, 2002).

Alle bisher bekannten, genetisch bedingten "early-onset" Varianten der Alzheimer-Krankheit gehen mit einer erhöhten Produktion von Aß42 bzw. Aß40 und 42 einher, da die Genmutationen entweder im Substrat (APP) lokalisiert sind oder in den Proteasen (Presenilin 1 und 2 der γ-Sekretase), welche das APP spalten (SELKOE, 1997). Die Tatsache, dass die vererbbaren Varianten das gleiche histopathologische Bild aufweisen wie die Veränderungen bei der sporadischen Form der Alzheimer-Erkrankung, deutet auf die wichtige Rolle des APP und des Aß-Proteins in der Pathogenese des Morbus Alzheimer hin (SELKOE, 1999).

Genmutationen des Tau-Proteins hingegen führen, auch in transgenen Tieren, zur Entwicklung einer weniger häufig auftretenden Demenzform, der Fronto-temporalen Demenz mit Parkinsonismus auf Chromosom 17 (FTDP-17). Diese Krankheit ist gekennzeichnet durch hochgradige Ansammlungen zahlreicher neurofibrillärer Tangles, es finden sich jedoch

(24)

keine Aß-Proteinablagerungen in Form von diffusen oder neuritischen Plaques (GOEDERT und SPILLANTINI 2000; HUTTON, 2001).

Abbildung 2.3: Die "Aß-Hypothese"

Auf der Basis dieser Beobachtungen gründet die so genannte "Aß- oder Amyloid-Hypothese" (Abb.

2.3), die die Akkumulation des Aß42-Proteins als erstes und zentrales Ereignis eines kaskadenartig ablaufenden pathogenetischen Prozesses der Alzheimer-Krankheit ansieht (HARDY und SELKOE, 2002; SELKOE, 2002a). Durch genetisch bedingte Faktoren kommt es bei den familiären Formen der Alzheimer-Krankheit entweder zur selektiven Über- produktion von Aß42 (Mutationen im APP-Gen oder den Presenilin-Genen 1 und 2; PS1, PS2) oder aufgrund des bei Trisomie 21 dreifach vorliegenden Chromosoms 21 und des darauf codierten APP-Gens zu einer gesteigerten Aß-Gesamtproduktion (Aß40 und Aß42). Auch bei Trägern des Apo

ε

4-Allels kommt es zu einer Erhöhung der Aß- Gesamtproduktion (SCHMECHEL et al., 1993).

Darüber hinaus erhöht ApoE4 die Rate der Fibrillenbildung des Aß42-Proteins (MA et al., 1994). Bei den nicht genetisch bedingten, sporadischen Alzheimerfällen resultiert der erhöhte Aß42-Gehalt vermutlich unter anderem aus einem gestörten oder verminderten Aß-Abbau, wobei jedoch die Ursachen hierfür bisher weitestgehend ungeklärt sind.

Die aus der Aß42-Überproduktion und/oder dem gestörten Aß42-Abbau resultierenden Aß42-

(nach SELKOE, 2002b) Großflächige neuronale/synaptische

Dysfunktionen und selektiver Neuronenverlust, Transmitterdefizite

DEMENZ

Akkumulation und Oligomerisation von Aß42 im limbischen System

und im Assoziationskortex

Aktivierung von Mikrogliazellen und Astrozyten (Komplementfaktoren, Zytokine etc.)

Entzündungsreaktion

Gestörter Ionenhaushalt der Nervenzelle Oxidativer Stress

Störung der Synapsenfunktion

Akkumulation der Aß42-Oligomere in diffusen Plaques

Beeinflussung der Aktivität verschiedener Kinasen /Phosphatasen

Bildung neurofibrillärer Bündel Erhöhte Gehalte an Aß42 Genetische Mutationen (APP, PS1, PS2)

ApoE4-Allel

Altern + unbekannte Faktoren

Großflächige neuronale/synaptische Dysfunktionen und selektiver Neuronenverlust, Transmitterdefizite

DEMENZ

Akkumulation und Oligomerisation von Aß42 im limbischen System

und im Assoziationskortex

Aktivierung von Mikrogliazellen und Astrozyten (Komplementfaktoren, Zytokine etc.)

Entzündungsreaktion

Gestörter Ionenhaushalt der Nervenzelle Oxidativer Stress

Störung der Synapsenfunktion

Akkumulation der Aß42-Oligomere in diffusen Plaques

Beeinflussung der Aktivität verschiedener Kinasen /Phosphatasen

Bildung neurofibrillärer Bündel Erhöhte Gehalte an Aß42 Genetische Mutationen (APP, PS1, PS2)

ApoE4-Allel

Altern + unbekannte Faktoren

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Monomere lagern sich zu stabilen, löslichen Oligomeren zusammen, die in diffusen Plaques zu nicht-fibrillären Aß-Polymeren akkumulieren. In diffusen Plaques kommt es zu einer, möglicherweise direkt durch die Aß42-Oligomere ausgelösten, Aktivierung von Mikrogliazellen (ROHER et al., 1996). Die aktivierten Mikrogliazellen produzieren IL-1, welches die APP-Neusynthese sowie dessen Spaltung fördert; gleichzeitig aktivieren die löslichen APP-Spaltprodukte (sAPP) wiederum Mikrogliazellen und induzieren in diesen die Sekretion von IL-1 (Abb. 2.4; GRIFFIN et al., 1995; BARGER und HARMON, 1997).

Abbildung 2.4: Schematische Darstellung ausgewählter molekularer Interaktionen in einem primitiven Plaque im Rahmen der Plaquereifung

Mikrogliazelle Astrozyt

S100ß ApoE

α1ACT

IL-1

C3

S100ß Ca++

S100ß IL-1

APP

Aβ40/42

Neuron APP+

Neuriten Apo E

Mikrogliazelle Astrozyt

S100ß ApoE

α1ACT

IL-1

C3

S100ß Ca++

S100ß IL-1

APP

S100ß ApoE

α1ACT

IL-1

C3

S100ß Ca++

S100ß IL-1

APP

Aβ40/42

Neuron APP+

Neuriten Apo E

(nach GRIFFIN et al., 1997) α1ACT = α1-antichymotrypsin, Aβ40/42 = Aus 40 bzw. 42 Aminosäuren bestehende Aß-Protein-Monomere, APP = "amyloid precursor protein", Apo E = Apoliprotein E, Ca++ = Calciumion, C3 = Protein der Komple- mentkaskade, IL-1 = Interleukin-1, S100ß = S100ß-Protein

(26)

Da IL-1 in Astrozyten die Produktion verschiedener akuter Phase Proteine und/oder Aß- bindender Proteine wie z.B. α1-Antichymotrypsin (α1ACT), Apolipoprotein E, das C3-Protein der Komplementkaskade und S100ß induziert (Abb. 2.4; WU et al., 1993; DAS et al., 1994), kommt IL-1 in der Plaquentwicklung eine wichtige Rolle zu. Während α1-Antichymotrypsin und Apolipoprotein E die Umwandlung des nicht-fibrillären in fibrilläres Aß-Protein ("Amyloid") vorantreiben, fördert S100ß das Neuritenwachstum und erhöht in Neuronen die intrazellulären Calciumgehalte, so dass es zur Entstehung neuritischer Plaques mit neuronalen Degenerationen kommt (KLIGMAN und MARSHAK, 1985; BARGER und VAN ELDIK, 1992; MA et al., 1994). Auch IL-6 wird eine wichtige Rolle in den frühen Stadien der Plaqueentwicklung zugesprochen, da es in den Gehirnen von Alzheimer-Patientinnen und -Patienten vornehmlich in diffusen und primitiven Plaques nachgewiesen wird, nicht jedoch in klassischen und "burnt-out" Plaques (HÜLL et al., 1995). Plaque-assoziierte, aktivierte Mikrogliazellen setzen neben proinflammatorischen Zytokinen auch NO-Verbindungen und reaktive Sauerstoffspezies ("reactive oxygen species", ROS) frei, was zur Entwicklung eines lokalen, chronischen Entzündungsprozesses führt, der ebenfalls die Plaqueentwicklung vorantreibt und neurodegenerative Veränderungen initiiert (McGEER und McGEER, 2002).

Auch Zink und Kupferionen fördern die Aggregation des Aß-Proteins zu Fibrillen, während bei dieser Reaktion entstehendes Wasserstoffperoxid wahrscheinlich zu einer Schädigung der Zellmembranen führt (CHERNY et al., 2001). Im Zuge der Plaque-assoziierten Entzündungsprozesse kommt es in Neuronen und ihren zellulären Fortsätzen zu schwerwiegenden metabolischen Störungen, die zu Phosphorylierungsstörungen des Tau- Proteins und damit zur Bildung neurofibrillärer Tangles führen (SELKOE, 1997). Dies führt zur Schädigung und dem Verlust von Synapsen und Neuronen und daraus resultierenden Transmitterdefiziten (v.a. Acetylcholin und Glutamat), die das klinische Bild der Alzheimer- Krankheit prägen (SELKOE, 1997).

Während viele der Gliazell-assoziierten Reaktionen im Gehirn von Alzheimerkranken die neurodegenerativen Veränderungen vorantreiben, besitzen Mikrogliazellen durch ihre Fähigkeit, das Aß-Protein zu phagozytieren, auch eine Schutzfunktion (MATTSON et al., 2004). Es wird jedoch postuliert, dass die von Plaque-assoziierten Astrozyten produzierten Proteoglykane (z.B. Heparansufat-Proteoglykan) eine Barriere bilden, die die Phagozytose

(27)

des Aß-Proteins durch Mikrogliazellen verhindert (DE WITT et al., 1998). Darüber hinaus fördern viele der in Plaques vermehrt vorliegenden EZM-Proteine wie beispielsweise Fibronektin oder Perlekan die Ablagerung des Aß-Proteins in Plaques (HOWARD und PILKINGTON, 1990; SNOW et al., 1994).

Warum es bei den sporadischen Formen der Alzheimer-Krankheit zu einem gestörten bzw.

verlangsamten Abbau des Aß-Proteins kommt, ist bislang noch ungeklärt. Verschiedene Proteasen besitzen in vitro die Fähigkeit des Aß-Abbaus (u.a. Cathepsin D und E, Matrix- Metalloproteinase (MMP) -2 und -9, "Endothelin-converting enzyme"), wobei jedoch nur sehr wenige dieser Proteasen in der Lage sind, die fibrillären Formen des Aß-Proteins abzubauen (ROHER et al., 1994; BACKSTROM et al., 1996; SAIDO, 2000; ECKMAN et al., 2001). In vivo erfolgt die Regulierung der zerebralen Aß-Gehalte vornehmlich durch die Metalloprotease Neprilysin und das "insulin degrading enzyme" (IDE), die jedoch fast ausschließlich monomeres Aß abbauen (IWATA et al., 2001; FARISS et al., 2003). In vitro zeigte Plasmin die Fähigkeit, fibrilläres Aß zu degradieren; die Bestätigung diese Eigenschaft in vivo steht bislang jedoch noch aus (TUCKER et al., 2000).

Lange Zeit galt nur fibrilläres Aß-Protein als stark neurotoxisch und für die Initiierung Plaque-assoziierter Mikrogliazellaktivierung und der daraus resultierenden Entzündungs- reaktionen verantwortlich (PIKE et al., 1993; LORENZO und YANKER, 1994). In neueren Studien konnte jedoch nachgewiesen werden, dass schon lösliche Oligomere, nicht aber die monomeren oder fibrillären Formen des Aß-Proteins in der Lage sind, im Rattengehirn in vivo zu einer Störung der so genannten "long-term potentiation" (LTP), einem elektro- physiologischen Korrelat der synaptischen Plastizität und Indikator für synaptische Dysfunktionen, zu führen (WALSH et al., 2002). Es wird postuliert, dass die milden kognitiven Beeinträchtigungen ("mild cognitive impairment", MCI), die die ersten Anzeichen der Alzheimer-Krankheit darstellen, durch Aß-Oligomer-vermittelte Störungen der Synapsenfunktion im Hippocampus ausgelöst werden (SELKOE, 2002b). Diese Annahme wird unterstützt durch die Tatsache, dass das Ausmaß der kognitiven Defizite von Alzheimer- Patientinnen und -Patienten am besten mit dem "Pool" an löslichem Aß (inkl. Oligomere) im

(28)

Kortex korreliert und nicht - wie in früheren Studien publiziert - mit der Anzahl an Plaques oder neurofibrillären Tangles (ARRIAGADA et al., 1992; NÄSLUND et al., 2000).

2.2 Altersbedingte Veränderungen im zentralen Nervensystem von Hunden

Im ZNS alter Hunde finden sich histopathologische Veränderungen, die zum Teil den Befunden in den Gehirnen alter Menschen entsprechen. So werden neben neuronalen Lipofuszinspeicherungen auch Fibrosen der Meningen und des Plexus choroideus beschrieben (BORRAS et al., 1999). Bezüglich eines Neuronenverlustes im Gehirn alter Hunde gibt es widersprüchliche Angaben. Während von MORYS et al. (1994) ein auf das Claustrum beschränkter Neuronenverlust bei über 17 Jahre alten Hunden beschrieben wurde, konnten BALL et al. (1983) im Kortex keinen Verlust von Neuronen nachweisen. Die weiße Substanz zeigt ebenfalls altersbedingte, degenerative Veränderungen, die durch eine erhöhte Anzahl degenerierter Axone und MHC Klasse II- und BS-1-positiver Mikrogliazellen sowie eine Zunahme Ubiquitin-positiver Granula zwischen den Myelinscheiden charakterisiert sind (UCHIDA et al., 1992a; FERRER et al., 1993; CZASCH, 2001). Darüber hinaus liegen in den Gehirnen alter Hunde regelmäßig Aß-Proteinablagerungen im Parenchym der grauen Substanz und in meningealen und parenchymalen Gefäßen vor (WISNIEWSKI et al., 1970;

UCHIDA et al., 1991; BORRAS et al., 1999). Da die kaninen und humanen Aminosäuresequenzen des Aß-Proteins identisch sind, stellt der Hund eine der wenigen Tierspezies dar, die spontane Aß-Ablagerungen im Gehirn entwickelt (JOHNSTONE et al., 1991).

2.2.2 Aß-Proteinablagerungen und neurofibrilläre Tangles

Eine kongophile Angiopathie und amorphe, "Alzheimer-ähnliche Plaques" im Gehirn von Hunden wurden 1956 zum ersten Mal beschrieben (VON BRAUNMÜHL, 1956). Die Aß- Proteinablagerungen in den Gefäßen alter Hunde bestehen sowohl aus Aß42 als auch Aß40 und liegen in den meisten Gefäßen in fibrillärer Form (Amyloid) vor, was mittels Kongorot- Färbungen deutlich dargestellt werden kann (GIACCONE et al., 1990). Die Amyloid-

(29)

ablagerungen finden sich vornehmlich in den äußeren Schichten der Tunica media von Arteriolen und Kapillaren der Meninx und des Parenchyms der grauen Substanz (BORRAS et al., 1999). Manche Autoren beschreiben eine durch Amyloidablagerungen ausgelöste Degeneration der glatten Muskelzellen der Tunica media und daraus resultierende Gehirnblutungen (DAHME und SCHRÖDER, 1979; UCHIDA et al., 1990). In anderen Untersuchungen erwies sich die Tunica media durch hochgradige Amyloidablagerungen zwar als stark erweitert, die Membrana elastica interna und das Endothel waren jedoch meist intakt und es konnten keine Gehirnblutungen nachgewiesen werden (ISHIHARA et al., 1991;

BORRAS et al., 1999). Das Auftreten von senilen Plaques im Hundegehirn ist ein signifikant altersabhängiger Prozess, der zwischen dem 8. und 9. Lebensjahr beginnt (HEAD et al., 2000;

PUGLIESE et al., 2004; CZASCH et al., 2005), wobei die Plaquedichte in den meisten Studien keiner nachweisbaren proportionalen Zunahme mit dem Alter der Hunde unterliegt (YOSHINO et al., 1996; CZASCH, 2001). Der Lobus frontalis stellt die Gehirnregion dar, in der sich Plaques am konstantesten nachweisen lassen und sich die höchsten Plaquedichten finden (YOSHINO et al., 1996; HOU et al., 1997; HEAD et al., 2000; CZASCH, 2001).

Plaques liegen jedoch auch, vor allem bei Tieren mit hohen Plaquedichten, im Lobus parietalis und occipitalis sowie in anderen Gehirnregionen wie den Basalganglien und dem Thalamus vor (HEAD et al., 2000; CZASCH, 2001). Im Hippocampus finden sich nur wenige Plaques, es lässt sich jedoch dort mittels Aß-Immunhistologie ein bandartiges Signal im Stratum moleculare des Gyrus dentatus nachweisen (CUMMINGS et al., 1993; HOU et al., 1997; CZASCH et al. 2005). Bezüglich der in den Gehirnen alter Hunde nachgewiesenen Plaqueformen gibt es in der Literatur widersprüchliche Angaben. Viele Autoren beschreiben nur das Auftreten von diffusen Plaques und können weder primitive noch klassische Plaques nachweisen (GIACCONE et al., 1990; CUMMINGS et al., 1993, 1996a, b; RUSSEL et al., 1996; WEGIEL et al., 1996; PUGLIESE et al., 2004; CZASCH et al., 2005). Andere Autoren hingegen berichten über das Vorliegen primitiver und klassischer Plaques mit Kongorot- oder Thioflavin S-positiven, fibrillären Aß-Proteinanteilen und aufgeblähten und dystrophischen Neuriten (WISNIEWSKI et al., 1970; PAULI und LUNGINBÜHL, 1971; SELKOE et al., 1987; RUSSEL et al., 1992; SHIMADA et al., 1991, 1992b; PAPAIOANNOU et al., 2001).

In diesen Studien machen jedoch neuritische Plaques nur einen geringen Teil der nachgewiesenen Plaques aus, so dass diffuse Plaques bei weitem die am häufigsten

(30)

auftretende Plaqueform im Gehirn alter Hunde darstellen. Die diffusen Plaques des Menschen und des Hundes zeigen große morphologische und strukturelle Gemeinsamkeiten (GIACCONE et al., 1990; RUSSEL et al., 1992; UCHIDA et al., 1992a, 1992b, 1993;

CUMMINGS et al., 1993). So bestehen die diffusen Plaques des Hundes ebenfalls nur aus Aß42-Protein, enthalten oft mehrere morphologisch intakte Neuronen und sind meist unscharf begrenzt (SHIMADA et al 1992b; UCHIDA et al., 1992b; CUMMINGS et al., 1996a, b;

TEKIRIAN et al., 1996; WISNIEWSKI et al., 1996; HOU et al., 1997; NAKAMURA et al., 1997). Die diffusen Plaques im Hundegehirn sind in der Regel jedoch größer als die diffusen Plaques des Menschen (GIACCONE et al., 1990; CUMMINGS et al., 1993, 1996a, b;

RUSSEL et al., 1996; WEGIEL et al., 1996). Sie präsentieren sich als 50 bis zu 300µm große, aufgelockerte und unscharf begrenzte Aß-Proteinablagerungen; es finden sich jedoch auch kompakte, kleinere Plaques mit relativ scharfer Begrenzung (WEGIEL et al., 1996; HOU et al., 1997; SATOU et al., 1997; GIACCONE et al., 1990; CZASCH et al., 2005). Darüber hinaus liegen vor allem im Stratum pyramidale internum und multiforme der Großhirnrinde (Schicht V und VI) wolkige, sehr große Aß-Proteinlablagerungen, die nur teilweise als einzelne Plaques angesprochen werden können und oft konfluieren und die ganze Länge einer Großhirnfurche durchziehen (SATOU et al., 1997; CZASCH, 2001).

Diffuse Plaques im Hundegehirn führen, analog zu den Befunden beim Menschen, weder zu Astrozyten- noch Mikrogliazellreaktionen. In der grauen Substanz alter Hunde finden sich zwar eine altersabhängige Astrogliose sowie leicht hypertrophe Astrozyten, die jedoch nicht in auffälliger Kolokalisation mit diffusen Plaques vorliegen (SHIMADA et al., 1992a;

CUMMINGS et al., 1996a; BORRAS et al., 1999; CZASCH, 2001). In Assoziation mit neuritischen Plaques lassen sich hingegen reaktive Astrozyten nachweisen (SHIMADA et al., 1992a; NAKAMURA et al., 1997). Eine Assoziation aktivierter Mikrogliazellen mit neuritischen Plaques wurde bisher nur von WISNIEWSKI et al. (1970) beschrieben, während dieses Ergebnis in neueren Studien nicht bestätigt werden konnte (CUMMINGS et al., 1993;

ROFINA et al., 2003).

Warum im Hundegehirn vornehmlich diffuse Plaques auftreten und es nicht oder nur selten zur Entstehung neuritischer Plaques mit fibrillärem Aß-Protein kommt, ist bislang ungeklärt.

(31)

Möglicherweise ist die Lebenszeit von Hunden zu kurz oder aber das Fehlen aktivierter, IL-1 und -6 sezernierender Gliazellen und anderer die Plaquekondensation vorantreibender Komponenten wie beispielsweise Heparansulfat-Proteoglykane sind dafür verantwortlich zu machen (CUMMINGS et al., 1996d; CZASCH, 2001).

In den Gehirnen alter Hunde finden sich sehr vereinzelt neuritische Veränderungen wie beispielsweise APP-positive, dystrophische Neuriten und Tau-positive Ablagerungen in neuritischen Plaques. Neurofibrilläre Tangles konnten bislang jedoch nur in einer einzigen Studie bei zwei Hunden nachgewiesen werden (PAPAIOANNOU et al., 2001), während andere Autoren sie mittels verschiedener immunhistologischer und histochemischer Färbemethoden nicht darstellen konnten (SHIMADA et al., 1991; RUSSEL et al., 1992;

CUMMINGS et al., 1993, 1996b; CZASCH et al., 2005). Sie scheinen daher im Gegensatz zu Plaques keine regelmäßig auftretende Veränderung im ZNS alter Hunde darzustellen.

Der alternde Hund stellt somit ein ideales Tiermodell für natürlich auftretende Aß- Proteinablagerungen in Form diffuser Plaques und kongophiler Angiopathie dar und kann für die Untersuchung der pathogenetischen Prozesse der frühen Plaqueformen bzw. der Plaqueentwicklung sowohl im Rahmen der Alzheimer-Krankheit als auch des physiologischen Alterungsprozesses des Menschen dienen.

2.2.3 Kognitive Dysfunktionen bei alten Hunden

Altersbedingte Verhaltensänderungen und kognitive Störungen sind bei alten Hunden unterschiedlich stark ausgeprägt. Es gibt Tiere, deren Symptome denen menschlicher Alzheimer-Patientinnen und -Patienten ähneln und andere Tiere, deren Symptome den normalen, physiologischen kognitiven Dysfunktionen alter Menschen entsprechen (CUMMINGS et al., 1996b). Viele Autoren unterscheiden daher klar zwischen dementen und klinisch-neurologisch unauffälligen alten Hunden (HEAD et al., 1995; ADAMS et al., 2000;

MILGRAM et al., 2005). Altersbedingte Verhaltensänderungen des Hundes, die nicht ausschließlich organisch (beispielsweise durch Gehirntumoren) bedingt sind, werden als

"kognitive Dysfunktionen" bezeichnet (RUEHL und HART, 1998). Im Sinne einer kognitiven Dysfunktion lassen sich die geriatrischen Verhaltensänderungen von Hunden in vier

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Hauptkategorien unterteilen: Abnehmendes Interesse an der Umwelt, Verlust von Aufmerksamkeit, Wahrnehmung und des Wiedererkennens, Zustände der Desorientierung und Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus. In den letzten Jahren wurden vermehrt Arbeiten publiziert, in denen die Autoren mit Hilfe standardisierter Tests das Lern- und Erinnerungsvermögen von Hunden verschiedener Altersklassen untersuchten (HEAD und MILGRAM, 1992; ADAMS et al., 2000). Untersuchungen mit dem Ziel, eine Korrelation zwischen dem Grad der kognitiven Dysfunktionen und den morphologischen Veränderungen im Gehirn nachzuweisen, stellten bei Hunden mit hohen Plaquedichten Defizite des Kurzzeitgedächtnisses und ein insgesamt schlechteres Bestehen von Lerntests fest (CUMMINGS et al., 1993, 1996a). Auch das topographische Verteilungsmuster der Plaques im Hundegehirn scheint mit kognitiven Ausfallserscheinungen wie z.B. einem schlechten Kurzzeitgedächtnis in Zusammenhang zu stehen (HEAD et al., 1998). PUGLIESE et al.

(2005) weisen im Liquor von Hunden mit schweren kognitiven Defiziten einen signifikant höheren Laktat- und Pyruvatgehalt nach als bei Hunden mit leichten kognitiven Störungen.

Wie es im Hundegehirn trotz morphologisch intakter Nervenzellen und dem Fehlen vieler für die Alzheimer-Krankheit des Menschen charakteristischer histopathologischer Veränderungen (z.B. neuritische Plaques und neurofibrilläre Tangles) zur Störung der kognitiven Funktionen durch diffuse Aß-Proteinablagerungen kommen kann, war lange Zeit unklar. Neuere Forschungsergebnisse belegen, dass bei der Ratte schon die löslichen, oligomeren Formen des Aß42-Proteins in vivo noch vor ihrer Akkumulation in diffusen Plaques Synapsenschädigungen hervorrufen können (WALSH et al., 2002). Somit könnte auch beim Hund der Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von diffusen Aß42- Proteinablagerungen, die gleichzeitig einen Pool für die oligomeren Formen darstellen und den kognitiven Dysfunktionen hergestellt werden.

(33)

2.3 Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihre Inhibitoren (TIMPs)

Vor über vierzig Jahren entdeckten GROSS und LAPIERE (1962) im Rahmen ihrer Studien mit Teilen von Kaulquappenschwänzen ein kollagenolytisches Enzym, das an der Involution des Kaulquappenschwanzes beteiligt ist. Heute zählt die Enzym-Familie der Matrix- Metalloproteinasen (MMPs), zu der auch dieses Enzym gehört, bislang 25 bei Vertebraten vorkommende MMP-Mitglieder, wovon 23 auch beim Menschen nachgewiesen wurden (WOESSNER, 2002; VISSE und NAGASE, 2003). MMPs konnten aber auch bei einer Reihe von Nicht-Vertebraten, wie beispielsweise im Süßwasserpolypen (Hydra spec.;

LEONTOVICH et al., 2000), im Seeigel (Echinoidea; LEPAGE und GACHE, 1990) und im Pflanzenreich beim Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana; MAIDMENT et al., 1999) identifiziert werden.

2.3.2 Klassifizierung und Aufbau der MMPs

MMPs, auch Matrixine genannt, gehören als Subfamilie M10A mit zwei weiteren Subfamilien (Serralysine, M10B und Fragilysine, M10C) zur Familie M10 des Metalloproteinasen-Clans MA. Eine mit den MMPs eng verwandte Familie stellt die Familie M12 mit ihren Subfamilien (Astacine, 12A und Adamalysine, 12B) dar (RAWLINGS et al., 2004). Diese enge Verwandtschaft liegt jedoch nicht in einer ähnlichen Primärstruktur begründet, sondern beruht auf einer bei allen Enzymen konservierten, als "Metzincin-Faltung"

("met-turn") bezeichneten Protein-Struktur (BODE et al., 1993).

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind zinkabhängige Endopeptidasen, die Moleküle der extrazellulären Matrix (EZM) wie beispielsweise Proteoglykane und Kollagen degradieren (NAGASE und WOESSNER, 1999) und in ihrer Gesamtheit in der Lage sind, nahezu alle Proteine der EZM abzubauen (Tabelle 2.1). Zunächst wurden die MMPs anhand ihrer Substratspezifitäten in Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und Matrilysine eingeteilt (YONG et al., 1998). Da die MMPs aber sehr häufig überlappende Substratspezifitäten besitzen (Tabelle 2.1) und die ständig wachsende Liste der MMP-Substrate zunehmend auch nicht-EZM-Proteine beinhaltete, begann man, die MMPs systematisch zu nummerieren

(34)

(MMP-1, MMP-2 etc.) und anhand ihrer Struktur und ihres Domänenaufbaus einzuteilen (McCAWLEY und MATRISIAN, 2001; EGEBLAD und WERB, 2002; STAMENKOVIC, 2003). Es existieren im Moment acht verschiedene MMP-Strukturklassen. Fünf dieser Strukturklassen bestehen aus in den Extrazellulärraum sezernierten MMPs (Gruppe I-V, Tabelle 2.1), während die MMPs der anderen drei Strukturklassen an der Zellmembran verankert werden (Gruppen VI-VIII, Tabelle 2.1). In der Strukturklasse der sezernierten MMPs unterscheidet man MMPs mit einfacher Hämopexin-Domäne (wie z.B. MMP-1, -3, -10, -13), Gelatine-bindende MMPs (MMP-2 und -9), MMPs mit minimaler Domäne (MMP-7, -26), Furin-aktivierte, sezernierte MMPs (MMP-11 und -28) und MMPs mit Vitronektin-ähnlichen Einschüben (MMP-21; EGEBLAD und WERB, 2002). Die an der Zellmembran verankerten MMPs ("membrane-type"-MMPs, MT-MMPs) lassen sich je nach Bindungstyp in Typ I-transmembrane MMPs (MMP-14 bis -16, MMP-24), Typ II- transmembrane MMPs (MMP-23) und GPI-(Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol)-verankerte MMPs (MMP-17, MMP-25) unterteilen (SOMERVILLE et al., 2003).

(35)

Tabelle 2.1: Schematische Einteilung der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) der Vertebraten

DIE FAMILIE DER MATRIX-METALLOPROTEINASEN (MMPS) MMP-Strukturklassen MMP-Bezeichnungen EZM-Substrate

(Auswahl) (Auswahl)

I - MMPs mit einfacher Hämopexin-Domäne

MMP-1 Kollagenase-1, Kollagen Typ I-III, VII, VIII, X,

Interstitielle Kollagenase XI, Gelatine, Fibronektin, basisches Myelinprotein ("myelin basic protein", MBP), Vitronektin, Laminin, Aggrekan

MMP-3 Stromelysin-1, Transin-1 Kollagen Typ II-V, IX, MBP,

Gelatine, Elastin, Fibronektin, Vitronektin, Laminin

MMP-8 Kollagenase-2, Kollagen Typ I-III, Aggrekan

Neutrophile Kollagenase

MMP-10 Stromelysin-2, Transin-2 Kollagen Typ III-V, Gelatine,

Elastin, Fibronektin, Aggrekan

MMP-12 Metalloelastase, Kollagen Typ I, IV, MBP,

Makrophagen-Elastase Gelatine, Elastase, Fibronektin

MMP-13 Kollagenase-3 Kollagen Typ I-V, IX-XI,

Gelatine, Fibronektin, Aggrekan, Perlekan, Tenascin

MMP-18 Kollagenase-4 (Xenopus) Kollagen Typ I (Ratte)

MMP-19 RASI-1 ("Rheumatoid arthritis Kollagen Typ I, IV, Gelatine,

synovial inflammation") Laminin, Entaktin, Aggrekan

MMP-20 Enamelysin Amelogenin, Aggrekan

MMP-22 CMMP ("Chicken MMP", Gallus) Casein, Gelatine

MMP-27 nicht bekannt

II - Gelatine-bindende MMPs

MMP-2 Gelatinase A, 72-kDa Gelatinase Kollagen Typ I, III-V, VII, X,

72 kDa Typ IV Kollagenase XI, XIV, Gelatine, Fibronektin, Elastin, Entaktin, Laminin,

Tenascin, MBP

MMP-9 Gelatinase B, 92-kDa Gelatinase Kollagen Typ IV, V, VII, X, XI,

92 kDa Typ IV Kollagenase XIV, Gelatine, Elastin, MBP, Vitronektin, Laminin, Aggrekan, Versikan

(36)

Tabelle 2.1 (Fortsetzung)

DIE FAMILIE DER MATRIX-METALLOPROTEINASEN (MMPS) MMP-Strukturklassen MMP-Bezeichnungen EZM-Substrate

(Auswahl) (Auswahl)

III - MMPs mit minimaler Domäne

MMP-7 Matrilysin, Matrin, PUMP1 Kollagen Typ I-V, Gelatine, MBP,

("putative metalloproteinase") Elastin, Fibronektin, Vitronektin, Laminin

MMP-26 Matrilysin-2, Endometase Kollagen Typ IV, Gelatine, Fibro-

nektin, Vitronektin

IV - Furin-aktivierte, sezernierte MMPs

MMP-11 Stromelysin-3 Gelatine, Fibronektin, Laminin

MMP-28 Epilysin, Neurolysin Casein

V - MMPs mit Vitronektin-ähnlichen Einschüben

MMP-21 Homolog des Xenopus XMMP nicht bekannt

VI - Typ I-transmembrane MMPs

MMP-14 MT1-MMP, MT-MMP-1 Kollagen Typ I-III, Gelatine,

Fibronektin, Tenascin, Laminin

MMP-15 MT2-MMP, MT-MMP-2 Fibronkektin, Tenascin, Entaktin,

Laminin, Aggrekan

MMP-16 MT3-MMP, MT-MMP-3 Kollagen Typ I, III, Gelatine,

Fibronektin, Vitronektin

MMP-24 MT5-MMP, MT-MMP-5 Fibronektin, Gelatine, Chondroitin-

Sulfat-Proteoglykan (CSP)

VII - Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI) - verankerte MMPs

MMP-17 MT4-MMP, MT-MMP-4 Gelatine

MMP-25 MT6-MMP, MT-MMP-6 Kollagen Typ IV, Gelatine,

Fibronektin, CSP

VIII - Typ II-transmembrane MMPs

MMP-23 "cysteine array"-MMP (CA-MMP) Gelatine

(nach STERNLICHT und WERB, 2001; EGEBLAD und WERB, 2002; WOESSNER, 2002)