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Zur Biosynthese der Vancomycin-Typ Glykopept^Ätibiotika
- Isolierung uniTStlilkturaufklärung von
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DISSERTATION
der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
2003
vorgelegt von
DANIEL BISCHOFF
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung
2 Glykopeptid-Antibiotika
2.1 Struktur und Einteilung der Glykopeptid-Antibiotika 4 2.1.1 Strukturaufklärung von Glykopeptid-Antibiotika 4 2.1.2 Nomenklatur der Vancomycin-Typ Glykopeptid-Antibiotika 5 2.1.3 Struktur und Stereochemie der Glykopeptid-Antibiotika 6 2.1.4 Einteilung der Glykopeptide 8 2.2 Wirkmechanismus und Resistenzentwicklung 11 2.2.1 Die Zellwandbiosynthese 11 2.2.2 Aufklärung des Wirkmechanismus von Glykopeptid-Antibiotika 12 2.2.3 Klinische Relevanz und Resistenzentwicklung von Glykopeptid-
Antibiotika 14 2.3 Die Biosynthese von Glykopeptid-Antibiotika 16 2.3.1 Frühe Biosynthese-Untersuchungen 16 2.3.2 Das Gencluster des Balhimycin-Produzenten^. balhimycina 16 2.3.3 Synthese der nicht-proteinogenen Aminosäuren 20 2.3.3.1 Die Biosynthese von 4-Hydroxyphenylglycin (Hpg) 20 2.3.3.2 Die Biosynthese von 3,5-Dihydroxyphenylglycin (Dpg) 22 2.3.4 Die Biosynthese des ungewöhnlichen Aminozuckers 4-oxo-Vancosamin
24 2.3.5 Aufbau des Peptidrückgrats 25 2.3.6 Tailoring-Reaktionen 27
3 Grundlagen der Untersuchung der Biosynthese von Vancomycin-Typ Glykopeptid-Antibiotika 28
3.1 Molekularbiologische Methoden 28 3.2 Fermentation von A. balhimycina-V/ildtyp und Biosynthesemutanten 31 3.3 Chromatographie und Massenspektrometrie 33 3.3.1 ESI-Massenspektrometrie und Analysator-Typen 33
Inhaltsverzeichnis
3.3.2 Ionenerzeugung im Elektrospray-Interface 34 3.3.3 Aufbau des ES-MS" - Bruker Esquire 3000plus Ion-Trap-MS 34 3.3.4 LC-ES-MS-Kopplung 36 3.3.5 Relative Quantifizierung von Balhimycin-Biosynthese-Metaboliten 37 3.3.6 Proben Vorbereitung 38 3.3.7 Präparative Aufreinigung von Balhimycin-Biosynthese-Metaboliten 40 3 3.7.1 Voraufreinigung 40 3.3.7.2 Affinitätschromatographie mit D-Ala-D-Ala-AffiGel™-Säulen
40 3.3.7.3 Präparative HPLC-MS - Merck Hitachi HTP-MS 41 3.3.8
3.3.9
Zusammenfassung der Voruntersuchung und Isolierung Hochauflösende Massenspektrometrie - Bruker APEX II MS
3.3.9.1 Analysatorzelle und Aufbau eines FT-ICR- Massenspektrometers
3.3.9.2 Ionenanalyse 3.4 Der Edman-Abbau
3.5 Kernresonanzspektroskopie 3.5.1
3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5
Das COSY-Experiment Das TOCSY-Experiment
Das NOESY- und ROESY-Experiment Das HSQC-Experiment
Das HMBC-Experiment
44 ESI-FT-ICR-
47
47 48 50 51 51 51 52 52 52
4 Zielsetzung 53 5 Die 3-Chlor-/J-hydroxytyrosin-Biosynthese 55
5.1 Die Balhimycin-Halogenase-Mutante AbhaA 58 5.1.1 Erzeugung der /lWja/4-Mutante (PH4) 58 5.1.2 Untersuchung der zlöAa^-Mutante mit LC-ES-MS 60 5.1.3 FT-ICR-MS-Untersuchung der zlWm/i-Mutante 63 5.2 Der Komplementierungsstamm AbhaA K (PH4-2) 65 5.2.1 Konstruktion des Komplementierungsstamms AbhaAK 65
Inhaltsverzeichnis UI
5.2.2 Untersuchung des Komplementierungsstamms AbhaAK imt LC-ES-MS 65 5.3 Die Balhimycin-Biosynthese-Mutanten bpsDcat, AoxyD und Abhp 68 5.3.1 Erzeugung der bpsDcat, AoxyD und /dWip-Mutanten 68 5.3.2 Supplementierung von bpsDcat, AoxyD und Abhp mit yß-Hydroxytyrosin
70 5.3.3 LC-ES-MS-Untersuchung der Supplementierung der bpsDcat-MxAasAe
mit /J-Hydroxytyrosin 71 5.3.4 LC-ES-MS-Untersuchung der Supplementierung der zloxyD-Mutante
mit /3-Hydroxytyrosin 75 5.3.5 LC-ES-MS-Untersuchung der Supplementierung von Abhp mit
Tyrosinderivaten 77 5.4 Die Komplementierungsmutante AbhpK 81 5.4.1 Komplementierung von Abhp mit dem intakten bhp-Gen 81 5.4.2 Untersuchung der Komplementierungsmutante AbhpK 81 5.5 Zusammenfassung - Untersuchung der Biosynthese von 3-ChIor-/?-
hydroxytyrosin 85
6 Die Seitenkettenzyklisierung von Vancomycin-Typ Glykopeptid-
Antibiotika 95
6.1 Molekularbiologische Experimente - Erzeugung der Oxygenase-Mutanten SPoxyA/B/C 96 6.2 Untersuchung der Biosynthese-Metabolite der oxyB-Typ-Mutantea 98 6.2.1 Voruntersuchung der SPoxyBcat-Mutmte 98 6.2.1.1 LC-ES-MS- und LC-ES-MSn-Untersuchung der SPoxyBcat-
Mutante 98 6.2.1.2 LC-ES-MS°-Untersuchung der Nebenmetabolite der
SPo;tyßca/-Mutante 107 6.2.2 Isolierung von SP-901 und SP-1066 aus Kulturfiltraten der SPoxyBcat-
Mutante 109 6.2.3 Strukturaufklärung von SP-901 und SP-1066 mit Aminosäurenanalytik,
Edman-Abbau und NMR 112 6.2.3.1 Aminosäurenanalytik 112
IV Inhaltsverzeichnis
6.2.3.2 Edman-Abbau 114 6.2.3.3 NMR-Untersuchungen von o;cy5-Typ-Metaboliten 117 6.2.4 Untersuchung der ASPoxyB-Mutante 127
6.2.4.1 LC-ES-MS und LC-ES-MS" Untersuchung der ASPoxyB- Mutante 127 6.2.5 Zusammenfassung der axy5-Typ-Metabolite 130 6.2.5.1 Strukturen 130 6.2.5.2 Relative Quantifizierung 131 6.2.5.3 Zwischenergebnis und Diskussion 133 6.2.6 Die fehlende Chlorierung der oxyS-Typ-Metaboliten 136 6.3 Untersuchung der Biosynthese-Metabolite der oxyA-Typ-MxAanttn 139 6.3.1 Voruntersuchung der fsSPoxyA- und der SPoxyAca/-Mutante 139 6.3.2 Aufreinigung der oxy^-Typ-Metabolite 146;
6.3.3 Strukturaufklärung des o^-Typ-Metaboliten DB-967 148 6.3.3.1 ESI-FT-ICR-MS von DB-967 148 6.3.3.2 Aminosäurenanalytik von DB-967 149 6.3.3.3 Edman-Abbau von DB-967 152 6.3.3.4 NMR-Untersuchung von DB-967 154 6.3.4 Zusammenfassung der ox)i4-Typ-Metabolite 160 6.3.4.1 Strukturen und relative Quantifizierung 160 6.3.4.2 Zwischenergebnis und Diskussion 166 6.4 Untersuchung der Biosynthese-Metabolite der oxyC-Typ-Mutanten 169 6.4.1 Voruntersuchung der SPoxyCcat- und /ISPoxyC-Mutanten 169 6.4.1.1 Voruntersuchung der SPoxyCcat-Mutante mit LC-ES-MS 169 6.4.1.2 Voruntersuchung der SPoxyCcat-Mutante mit ESI-FT-ICR-
MS 175 6.4.1.3 Voruntersuchung der ASPoxyC-Mutante mit LC-ES-MS 179 6.4.1.4 Voruntersuchung der ASPoxyC-Mutante mit ESI-FT-ICR-MS
183 6.4.2 Präparative Aufreinigung der aryC-Typ-Metabolite 185 6.4.2.1 Präparative Aufreinigung der SPoxyCcat-Mutante 185 6.4.2.2 Die Asparaginsäure-Isoasparaginsäure-Umlagerung der oxyC-
Typ-Metabolite 189 6.4.2.3 Aufreinigung der ASPoxyC-Mutante 192
Inhaltsverzeichnis
6.4.3 Strukturaufklärung der oxyC-Typ-Metabolite 195 6.4.3.1 Edman-Abbau von SP-1073-3 aus SPoxyCcat und DB-1306-2
/ SP-1306-4 sowie DB-1320-3 / SP-132O-5 aus ASPoxyC 196 6.4.3.2 Aminosäurenanalytik von SP-1073-3 aus SPoxyCcat und DB-
1306-2 / SP-1306-4 sowie DB-1320-3 / SP-132O-5 aus ASPoxyC 197 6.4.3.3 NMR-Untersuchung von SP-1073-3 aus SPoxyCcat 198 6.4.3.4 Röntgenstrukturanalyse von SP-1073-3 aus SPoxyCcat 205 6.4.3.5 NMR-Untersuchung von DB-1320-3 und SP-1320-5 aus
ASPoxyC 207 6.4.4 Zusammenfassung der oxyC-Typ-Metabolite 218 6.4.4.1 Charakterisierte Metabolite der SPoxyCcat-Mutante 219 6.4.4.2 Charakterisierte Metabolite der ASPoxyC-Mutante 222 6.4.4.3 Relative Quantifizierung 225 6.5 Zusammenfassung - Reihenfolge und Zuordnung der oxidativen
Ringschlüsse von Vancomycin-Typ Glykopeptid-Antibiotika 228
7 Zeitpunkt der Seitenkettenzyklisierung von Glykopeptid Typ I
Antibiotika 237
7.1 Ansätze zur Untersuchung des Zeitpunkts der Seitenkettenzyklisierung 238 7.2 Untersuchung der AdpgA-Mntante 240 7.2.1 Voruntersuchung der A/pg/4-Mutante 240 7.2.2 Aufreinigung der A?pg^-Typ-Metabolite 247 7.2.3 Strukturaufklärung der A//>&4-Typ-Metabolite 251 7.2.3.1 Untersuchung von DB-1126-10 aus AdpgA mit NMR 252 7.2.3.2 NMR-spektroskopische Untersuchung von BB-1126-6 der
AdpgA-Mutante 258 7.2.4 Zusammenfassung der Untersuchung der AdpgA-Mutante 262 7.3 Untersuchung der AbpsC-Mutante 270 7.3.1 Voruntersuchung der AbpsC-Mutante 270 7.3.2 Aufreinigung der ^ifcpiC-Typ-Metabolite 276 7.3.3 Strukturaufklärung von SV-^^™* I $¥-969^°° und DB-967zU)'"c 280
VI Inhaltsverzeichnis
7.3.3.1 Aminosäurenanalytik 280 7.3.3.2 Edman-Abbau von SP-9694**1 / S P - 9 6 9 ^s C und DB-967'*'"C
282 7.3.3.3 NMR-Untersuchung von SP-969/k**< / SP-969zli'"c bzw. DB-
967Ä p s C im Vergleich zu SP-969sf>'j bzw. T>K-961SPoxyA"" 285 7.3.4 Zusammenfassung der Untersuchung der ^ipsC-Mutante 289 7.4 Untersuchung der Oxygenasen A-C-, der AdpgA- und .^ApsC-Mutante auf
Vorläufer-PeptidederNRPS 290 7.5 Zusammenfassung - Die Aglykon-Biosynthese von Vancomycin-Typ
Glykopeptid-Antibiotika 300
8 Glykosylierung des Balhimycin-Aglykons 308
8.1 Molekularbiologische Experimente zur Erzeugung der Glykosyltransferase- Mutanten bgtfA/B/C 311 8.2 Untersuchung der Biosynthese-Metabolite der A?#B-Glykosyltransferase-
Mutanten 315 8.2.1 LC-ES-MS- und LC-ES-MS"- Untersuchung der V/Bca<-Mutante 315 8.2.2 LC-ES-MS- und LC-ES-MS11- Untersuchung der Abgtß-Mutante 319 8.2.3 Isolierung von Biosynthese-Metaboliten der Abgtß-Mutante 321 8.2.4 NMR-Untersuchung von Biosynthese-Metaboliten der Abgtß-Mutante
322 8.2.5 Zusammenfassung und Zwischenergebnis 325 8.3 Untersuchung der Biosynthese-Metabolite der A£f/X-Glykosyltransferase-
Mutanten 329 8.3.1 LC-ES-MS- und LC-ES-MS"- Untersuchung der bgtfAcat-Mutante 329 8.3.2 Isolierung von Biosynthese-Metaboliten der bgtfAcat-Mutante 332 8.3.3 Strukturaulklärung von Biosynthese-Metaboliten aus bgtfAcat 333 8.3.3.1 Zuckeranalytik 333 8.3.3.2 NMR-Untersuchung von Biosynthese-Metaboliten aus
bgtfAcat 334 8.3.4 Zusammenfassung und Zwischenergebnis 337 8.4 Untersuchung der Biosynthese-Metabolite der ÄgffC-Glykosyltransferase-
Mutanten 342
Inhaltsverzeichnis VII
8.4.1 LC-ES-MS- und LC-ES-MS"- Untersuchung der bgtfCcat-Mutante 342 8.4.2 LC-ES-MS- und LC-ES-MS"- Untersuchung der AbgtfC-MutwAe 345 8.4.3 Isolierung von Biosynthese-Metaboliten der AbgtfC 348 8.4.4 Strukturaufklärung von Metabolit (10) aus der AbgtfC-Mutante 349 8.4.5 Zusammenfassung und Zwischenergebnis 352 8.5 Zusammenfassung - Die Glykosylierung von Vancomycin-Typ Glykopeptid-
Antibiotika 359
9 Zusammenfassung und Ausblick 367
10 Experimenteller Teil 369
10.1 Mikrobiologische Experimente 369 10.1.1 Fermentation 369 10.1.2 Hemmhoftest mit dem Indikatorstamm B. subtilis 369 10.2 ES-MS, ES-MS/MS, LC-ES-MS und LC-ES-MSn-Untersuchungen 370 10.2.1 Probenvorbereitung - Festphasenextraktion (SPE) 370 10.2.2 ES-MS und LC-ES-MS°-Experimente 371 10.2.3 Relative Quantifizierung 373 10.3 Analytische HPLC 375 10.4 XAD-Adsorptionschromatographie 376 10.5 D-Ala-D-Ala-Affinitätschromatographie 378 10.6 Präparative HPLC-MS 379 10.6.1 Präparative HPLC-Säulen 379 10.6.2 Gradienten für präparative HPLC-MS-Untersuchungen 379 10.6.3 Das präparative HPLC-MS-System - HTP-MS (Merck-Hitachi) 380 i 10.6.4 Ausbeuten der aufgereinigten Peptide 381 10.7 Boc-Derivatisierung von DB-1126-10 und BB-1126-6 383 10.8 ESI-FT-ICR-Massenspektrometrie 383 10.9 Edman-Abbau 383 10.10 GC-MS 384 10.10.1 Aminosäureanalytik 384 10.10.2 Zuckeranalytik 385 10.11 NMR 385
VIII Inhaltsverzeichnis
11 Anhang NMR-Tabellen 387
11.1 'H- und "C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus SPoxyBcat 387 11.2 'H- und 13C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus SPoxyAcat 388 11.3 'H- und "C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus SPoxyCcat 389 11.4 !H- und "C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus ASPoxyC 400 11.5 'H- und 13C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus AdpgA 406 11.6 'H-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus AbpsC 407 11.7 'H- und "C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus AbgtfB 408 11.8 'H- und 13C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus bgtfAcat 413 11.9 *H- und 13C-chemische Verschiebungen von Metaboliten aus AbgtfC 417
