RUMINANTS WIEDERKÄUER RUMINANTS RUMIANTES 反刍动物 反芻動物
Standardized. Streamlined. Efficient.
RealPCR MAP DNA Test
Eine neue effiziente PCR-Methode zur akkuraten Bestimmung von Mycobacterium avium subsp.
(MAP)
RealPCR bei IDEXX (CAG)
• Die molekulardiagnostik Labore von IDEXX in Sacramento und Ludwigsburg, nutzen die modulare RealPCR Plattform seit 2007.
• Bisher sind 200 RealPCR tests entwickelt worden für die IDEXX Referenzlabore Weltweit. In Ludwigsburg werden pro Jahr etwa 350.000 Proben in 2 MioTests untersucht.
• Das modulare Konzept der RealPCR Platform wird nun in der IDEXX Livestock, Poultry, and Dairy Division für Kunden verfügbar gemacht.
“Die modulare RealPCR Plattform, reduziert die Kosten der Analysen, durch verringerten Arbeitsaufwandt,
geringere Investitionen in Maschinen und die effizientere Nutzung der Reagenzien.”
Christian Leutenegger, DrVetMed, PhD, FVH, Head of Molecular Diagnostics, IDEXX Molecular Diagnostics Laboratory
Detection Mix
RNA Master Mix
Positivkontrolle DNA Master Mix
Detection Mix
DNA or RNA Master Mix
spezifische Positivkontrolle
traditionelle Real-time PCR IDEXX modulares System
RealPCR – gemeinsame Reagenzien
spezifisch
gemeinsam
Detection Mix: Primer und Sonden für Zielsequenz und interne Probenkontrolle
Master Mix: Enzyme und Nukleotide Positivkontrolle
10 Jahre Erfahrung mit der modularen RealPCR Plattform
traditionelle real-time PCR kits IDEXX RealPCR
Detektions mix
Positiv kontrolle
Negativ kontrolle Gemeinsame Reagenzien
RNA / DNA master mix Zielspezifisch
Standardisiertes PCR-Programm
• Ein Programm für alle RNA und DNA Zielsequenzen
• Unterschiedliche Tests in einem PCR lauf (70min)
• weniger Fehler aufgrund unterschiedlicher PCR Programme
• geringerer Schulungsaufwand für Personal
Real-time PCR Schritte Temperatur Zeit Zyklen
reverse Transkription 50°C 15 min 1
initiales denaturieren 95°C 1 min 1
Amplifikation 95°C
60°C
15 sec 30 sec
45
erhöhter Durchsatz mit der RealPCR Plattform
RealPCR MAP DNA Test Ablauf
Optimierte pre-extraction zur standardisierten MAP Detektion
Sensitivität und Spezifizität
Analytische Sensitivität <10 Kopien
Sample status Sample number IDEXX RealPCR
MAP Discrepant Diagnostic
sensitivity Confirmed
positives
164 162 2 98.8%
Confirmed negatives
226 224 2 99.1%
Bestätigte positive and negative Proben aus Europa und Nordamerika
Exklusivität wurde durch testen von 24 Proben verschiedener Mycobacteria
Spezies bzw. Bakterien und Viren bestätig, basierend auf den vVrgaben des FLI
Es wurde keine unspezifische Amplifikation festgestellt
Schwach positive Proben
Vergleich zu anderen Tests
• Zwei schwach positive Proben wurden vor der Extraktion in negativen Proben verdünnt
• Die Proben wurden mit IDEXX RealPCR und dem PCR-Test eines anderen Herstellers getestet
No Ct
No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct
0 10 20 30 40 50
Neat 1:10 1:100 1:1K Neat 1:10 1:100 1:1K
Sample 1 Sample 2
Ct Values
Vergleich
RealPCR MAP Other PCR
MAP Testing
Test Probentyp Performance Pro’s Con’s
Kultur Feces Se 30-50%
Sp ≤ 100%
Positives Ergebnis ist Aussagekräftig, hohe
Spezifität, gute Bestätigung eines Befundes
Bis zu 14 Wochen, schwache Sensitivität in jungen bzw.
subklinischen Tieren und
schwachen/mittleren Exkretierern
PCR Feces Se 30-70%
Sp ≤ 100%
schnell, hohe spezifität, positives Ergebnis Aussagekräftig
Schwache Sensitivität in in
jungen bzw. subklinischen Tieren Tankmilch Guter Indikator für MAP in
Milch
Kaum Informationen zu Prevalenz, Kontaminationen möglich
ELISA Blut Se 40-80%
Sp > 99%
Einfach, schnell, kostengünstig
Blutprobe erforderlich Milch Se 40-80%
Sp > 99%
Einfacher als Blut, option häufiger zu testen
Nachverfolgung schwieriger Tankmilch Se 20-30%
Sp 99%
Güntig und einfach. Zeigt Anwesenheit von MAP
Poor sensitivity: a negative result does not mean a lot
Johne‘s Diagnose und Management
• Wiederholte ELISA tests erlauben eine frühere Identifizierung infizierter Tiere (Nielsen & Ersboll 2006).
• Kühe können wechselnde Ergebnisse aufweisen, dies kann frustrierend sein für Veterinäre und Halter.
• Jedes einmal positiv getestete Tier sollte als Risiko Tier behandelt werden.
• In Gebiete mit TB Haut Tests, können MAP ELISA Ergebnisse beeinflusst sein.
- Proben für MAP sollten vor dem Test gezogen werden.
- Alternativ können Feces zur analyse mit PCR genutzt werde.
• Kolostrum management: pasteurisieren (60°C for 60 minutes) is zur MAP-Eliminierung ausreichend. Die morbidität wird signifikant reduziert (Donahue 2012)
• Risko Einschätzung – Tests zur status Etablierung – Tests für Krankheitsmanagement.
Guidelines Johne‘s ELISA und PCR Diagnose
• Status Etablierung
- Herdenstatus (Tankmilch–negative, schließt MAP Anwesenheit nicht aus; Test der Schlachtiere, Ziel 30 Kühe Screening oder ganze Herde Testen)
• Minimum Tests
- Halbjährig 30 Tiere
- Halbjährig Schlachttiere testen
- Häufiger (vierteljährig) abhängig von Management und Prevalenz
• Kontrollen
- strategische Tests-zur Management Entscheidung:
Transitionsphasen: Laktation, Trockenstehen oder Empfängnis
Minimum: Einzeltest bei Trockenstehphase
• Ideal: Zwei Tests pro Jahr (vor Trockenstehphase und vor Empfängnis) oder Vierteljährig
• In ganzjährig kalbenden Herden ist ein jährlicher Test pro Tier unzureichend
Use ELISA to Use PCR to
Management Entscheidung
Status etablieren Identifikation von Exkretierern
RealPCR MAP DNA Test
RealPCR MAP DNA Mix RealPCR ASFV DNA Mix
