„Elektrophysiologische und molekularbiologische
Charakterisierung der Dopamin-Autorezeptorantwort
individueller dopaminerger Mittelhirnneurone der Maus (Mus
musculus
L.) unter Kontrollbedingungen und nach
einmaliger in vivo Injektion von Kokain“
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem
Fachbreich Biologie (17) der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von Andrea Hetzel
aus Bernau
Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am angenommen.
Erstgutacher: Prof. Dr. Uwe Homberg Zweitgutachter: Prof. Dr. Birgit Liss
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... I Abkürzungsverzeichnis ... VII Zeichenerklärung... XI Abbildungsverzeichnis ... XII Tabellenverzeichnis ...XVII Zusammenfassung...XIX 1 Einleitung... 11.1 Das dopaminerge System im zentralen Nervensystem... 1
1.2 Elektrophysiologische Eigenschaften dopaminerger Mittelhirnneurone ... 4
1.3 Dopamin als Neurotransmitter... 5
1.3.1 Somatodendritische Freisetzung von Dopamin... 8
1.4 Die Dopaminrezeptoren ... 9
1.4.1 Der D2-Dopaminrezeptor: Struktur und Funktionen ... 11
1.4.2 Rezeptordesensitisierung... 14
1.4.3 Expression der Dopaminrezeptoren in mesencephalen dopaminergen Neuronen ... 16
1.4.4 Signaltransduktionswege der Dopaminrezeptoren... 17
1.4.4.1 Modulation des cAMP-Weges... 17
1.4.4.2 Modulation von Kaliumkanälen ... 19
1.5 GIRK-Kanäle ... 19
1.5.1 Expression von GIRK-Kanal Untereinheiten in mesencephalen dopaminergen Neuronen ... 22
1.5.2 Die GIRK2-Isoformen... 22
1.5.3 Kopplung des DR-D2 an GIRK2: Die Autorezeptorantwort ... 23
1.5.4 Desensitisierung und Deaktivierung der GIRK-Kanäle... 25
1.6 Pathologie des dopaminergen Mittelhirnsystems: Die Drogensucht... 26
1.6.1 Das natürliche Belohnungssystem und seine Beteiligung an der Drogenabhängigkeit ... 27
1.6.2 Molekulare Veränderungen bei der Drogensucht... 31
1.6.3 Kokain ... 32
2 Materialien und Methoden... 36
2.1 Material ... 36
2.1.1 Versuchstiere ... 36
2.1.2 Chemikalien und Geräte ... 36
2.1.3 Lösungen für Elektrophysiologie ... 36
2.1.3.1 Badlösungen ... 37
2.1.3.2 Pipettenlösungen ... 37
2.1.3.3 Applikationsringer ... 38
2.1.4 Enzyme und Kits ... 39
2.1.4.1 Enzyme ... 39
2.1.4.2 Kits... 40
2.1.5 Primer (Oligonukleotide) ... 40
2.1.5.1 Primer für multiplex-nested PCR... 40
2.1.5.2 Assays für real-time PCR... 43
2.2 Methoden I: Isolation von Einzelzell- und Zellpoolmaterial... 45
2.2.1 Aussaugen von Zytoplasma mittels Patchpipette... 45
2.2.2 Laser Mikrodissektion (LMD)... 46
2.2.2.1 Präparation und Herstellung von Gefrierschnitten ... 46
2.2.2.2 UV-Laser Mikrodissektion ... 47
2.2.2.3 Identifikation der Neurone ... 48
2.2.2.4 LMD einzelner Neurone ... 48
2.3 Methoden II: Elektrophysiologie ... 49
2.3.1 Gehirnpräparation und Herstellen von Gehirnschnitten ... 49
2.3.2 Die Patch-clamp Methode ... 50
2.3.2.1 Stromklemme und Spannungsklemme ... 51
2.3.2.2 Aufbau des Messstandes... 52
2.3.2.3 Der Vorverstärker... 55
2.3.2.4 Glaspipetten... 57
2.3.2.5 Elektroden... 58
2.3.3 Kompensationsprozeduren ... 60
2.3.3.1 Die Offset (Ausgleich) Kompensation ... 60
2.3.3.2 Kapazitätenkompensation... 60
2.3.3.3 Kompensation des Serienwiderstandes (Rs)... 62
2.3.5 Messkonfigurationen ... 65
2.3.5.1 Ganzzellableitung ... 65
2.3.5.2 Perforated Patch ... 65
2.3.6 Verwendete Messprotokolle ... 67
2.3.6.1 Messungen in der Stromklemme ... 67
2.3.6.2 Messungen in der Spannungsklemme... 68
2.3.7 Einwaschen von Pharmaka... 68
2.3.8 Lokale Applikationsexperimente... 69
2.3.9 Filtern der Signale ... 70
2.3.10 Datenanalyse ... 71
2.3.10.1 Bestimmung des Umkehrpotentials ... 71
2.3.10.2 Bestimmung der Dosis-Wirkungskurven ... 71
2.4 Methoden III: Molekularbiologie ... 72
2.4.1 Isolation von mRNA aus Gewebe ... 72
2.4.2 Konzentrationsbestimmung der RNA ... 73
2.4.3 Reverse Transkription ... 74
2.4.4 DNase-Verdau ... 75
2.4.4.1 A: RNA cleanup and concentration protocol, RNeasy Micro Kit, QIAGEN ... 76
2.4.4.2 B: RNA ExtractionKit, PALM ... 77
2.4.4.3 C: DNA-free, Ambion ... 77
2.4.5 Präzipitation ... 78
2.4.5.1 Präzipitation von RNA nach DNase-Verdau... 78
2.4.5.2 Präzipitation von DNA nach reverser Transkription ... 78
2.4.6 Design bzw. Auswahl von Oligonukleotiden... 79
2.4.6.1 Design der Primer für multiplex-nested PCR ... 79
2.4.6.2 Assays für real-time PCR... 81
2.4.7 Polymerasekettenreaktion (PCR)... 81
2.4.7.1 Allgemeines Vorgehen zur qualitativen PCR ... 81
2.4.7.2 multiplex–nested PCR... 82
2.4.7.3 Quantitative real-time PCR ... 84
2.4.7.4 Auswertung der real-time PCRs... 87
2.4.8 Agarosegelelektrophorese ... 88
2.4.9.1 Gelextraktion aus Agarosegelen ... 88
2.4.9.2 Reinigung von PCR Produkten ... 88
2.4.9.3 Konzentrationsbesimmung der DNA... 89
2.4.9.4 Vorbereitung von DNA zur Sequenzierung ... 89
2.5 Kokain- und Salineinjektion ... 89
2.6 Statistische Analyse von Daten... 90
3 Ergebnisse... 91
3.1 Design der Primer für die qualitative multiplex-nested PCR... 91
3.1.1 Primer für die Dopaminrezeptoren und GAD65... 91
3.1.2 Primer für den GIRK2 und die GIRK2-Isoformen ... 96
3.1.3 Aufreinigung von PCR-Produkten und Sequenzierung ...100
3.2 Assays für die real-time PCR ...100
3.2.1 Eigenschaften der Assays – Die Standardkurven ...101
3.3 Qualitative Einzelzellgenexpressionsanalyse mittels multiplex-nested PCR .. ...104
3.3.1 Expression der Dopaminrezeptoren...104
3.3.2 Einführen des zusätzlichen Markers GAD65...110
3.3.3 Koexpression der Dopaminrezeptoren und der GIRK-Kanäle...110
3.3.4 Expression der GIRK2-Isoformen ...113
3.4 Elektrophysiologische Untersuchungen ...118
3.4.1 Lokale Applikation ...119
3.4.1.1 Dopaminapplikation in der whole-cell Konfiguration...119
3.4.1.2 Block des Dopamintransporters in der whole-cell Konfiguration .121 3.4.1.3 Block des Dopamintransporters in der perforated Patch Konfiguration...123
3.4.2 Ermittlung der Dosis-Wirkungskurve für verschiedene Agonisten...125
3.4.3 Wird die Aktionspotentialfrequenz durch einen intrinsischen Dopamintonus reguliert? ...130
3.4.4 Applikation verschiedener Agonisten ...132
3.4.4.1 Die Applikation von Dopamin ...132
3.4.4.2 Die Applikation von Quinpirol ...135
3.4.4.3 Die Applikation von Baclofen ...138
3.5 Elektrophysiologische Untersuchungen: Veränderungen durch eine
einmalige in vivo Kokaininjektion...142
3.5.1 Charakterisierung der dopaminergen SN Neurone nach einmaliger in vivo Saline- bzw. Kokaininjektion ...142
3.5.2 Vergleich der Spontanaktivität dopaminerger SN Neurone aus nicht-injizierten und Saline- bzw. Kokain-nicht-injizierten Tieren ...147
3.5.3 Vergleich der Spontanaktivität dopaminerger VTA Neurone nach einmaliger in vivo Saline- bzw. Kokaininjektion ...149
3.5.4 Wird die Frequenz der Spontanaktivität im akuten Hirnschnitt durch GABA reguliert? ...149
3.5.5 Ermittlung der Dosis-Wirkungskurve für Dopamin nach Kokaininjektion. ...151
3.5.6 Die Applikation von Dopamin ...152
3.5.6.1 Messungen in der Spannungsklemme...152
3.5.6.2 Inhibition der durch Dopamin ausgelösten Stromantwort...153
3.5.6.3 Messungen in der Stromklemme ...156
3.6 Quantitative Genexpressionsanalyse mittels real-time PCR: Veränderungen durch eine einmalige in vivo Kokaininjektion ...169
3.6.1 Optimierung der real-time PCR ...169
3.6.1.1 Vergleich des TaqMan und des QuantiTect Master Mixes...169
3.6.1.2 Vergleich der Sensitivität vor und nach dem DNase-Verdau ...171
3.6.1.3 Vergleich der Sensitivität vor und nach Präzipitation der cDNA..172
3.6.2 Die Analyse der Genexpression in Zellpools...173
3.6.2.1 Genexpression in Jungtieren: D2-ähnliche DRs, GIRK2 und SUR1 ...174
3.6.2.2 Genexpression in Jungtieren: GIRK2-Isoformen und Kir6.2 ...176
3.6.2.3 Genexpression in adoleszenten Tieren: DR-D2s, DR-D2l, DR-D3 und GIRK2 ...179
3.6.2.4 Genexpression in adulten Tieren: DR-D2s, DR-D2l, DR-D3 und GIRK2 ...181
3.6.2.5 Zusammenfassung der Ergebnisse der Genexpressionsanalyse .... ...184
4 Diskussion...185
4.1.1 Ermittlung des empirischen Y-Schnittpunktes zur Bestimmung der
Detektionsschwelle ...185
4.2 Ergebnisse der Genexpressionsanalyse ...187
4.2.1 Expression von Dopaminrezeptoren in den dopaminergen SN und VTA Neuronen ...188
4.2.1.1 Dopaminerge Mittelhirnneurone ohne die Expression von Dopaminrezeptoren ...192
4.2.2 Expression von GIRK-Kanälen in dopaminergen SN und VTA Neuronen ...194
4.2.2.1 Koexpression der GIRK-Kanäle mit den Dopaminrezeptoren ...194
4.2.2.2 Expression der GIRK2-Isoformen ...194
4.3 Dosis-Wirkungskurven für verschiedene Agonisten ...197
4.4 Lokale Agonistenapplikation...198
4.4.1 Applikation von Dopamin ...198
4.4.2 Applikation von Quinpirol ...200
4.4.3 Applikation von Baclofen...201
4.4.4 Die Kinetiken der Deaktivierung und Desensitisierung...202
4.4.5 Messung des Umkehrpotentiales ...205
4.5 Veränderungen durch einmalige in vivo Kokaininjektion ...206
4.5.1 Kokain-induzierte Veränderungen der dopaminergen SN Neurone ...207
4.5.1.1 Inhibition des GIRK-Kanals in dopaminergen SN Neuronen...209
4.5.2 Kokain-induzierte Veränderungen der dopaminergen VTA Neurone .210 4.6 Ausblick...214
Literaturverzeichnis ...XXI Tabellarischer Lebenslauf ... XXXVII Eidesstattliche Erklärung... XXXVIII Danksagung ... XXXIX
Abkürzungsverzeichnis
Allgemein gebräuchliche Abkürzungen und Maßeinheiten, die auf Empfehlungen der IFPC (International Federation for Clinical Chemistry) und IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) beruhen, oder die zu den SI-Einheiten (Système Internationale d´Unités) zählen, werden nicht gesondert aufgeführt.
A Adrenalin Abb. Abbildung
AC anterior cingulärer Kortex
ACSF artifizielle cerebrospinale (Gehirn-) Flüssigkeit A/D analog/digital
ADHS Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndrom AMG Amygdala
AMP Adenosinmonophosphat
AMPA α-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazol Propionsäure AP Aktionspotential
ATP Adenosintriphosphat AZ Adenylatzyklase
BAPTA 1,2-Bis(2-aminophenoxy) ethane-N,N,N´,N´-tetraacetic acid tetrapotassium salt
BLA basolaterale Amygdala
bp Basenpaar
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
CB Calbindin
cDNA komplementäre DNA
CeN zentraler Nucleus der Amygdala
Cm Membrankapazität COMT Catechol-O-Methyl-transferase D Deutschland d dorsal D/A digital/analog DA Dopamin
DARPP-32 Dopamin- und cAMP reguliertes Phosphoprotein mit
32 kDa
DAT Dopamintransporter delta Rn (∆Rn) Änderung der Fluoreszenz
DLS dorsolaterales Striatum DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotidtriphosphat DOPAC 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure DPPX Dipeptidyl Peptidase 10 DS dorsales Striatum DR(s) Dopaminrezeptor(en)
dsDNA doppelsträngige DNA DTT Dithiothreonin DR-D2s Dopaminrezeptor D2 short (kurze Isoform)
DR-D2l Dopaminrezeptor D2 long (lange Isoform)
dUMP desoxy Uracilmonophosphat
dUTP desoxy Uraciltriphosphat
DV Differentialverstärker E Extinktion
Erev Umkehrpotential
EC50 halbmaximale effektive Konzentration
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglykol-bis(aminoethylether)-N,N'-tetraessigsäure EPSC erregender postsynaptischer Strom
EtOH Ethanol
f Frequenz
fmax maximale Frequenz
F Vorwärts (-primer)
FRET Fluoreszenz- (oder Förster-) Resonanz-Energietransfer
Gs stimulierendes G-Protein
Gi/o inhibitorisches G-Protein
GABA γ-Aminobuttersäure
GAD Glutamatdecarboxylase GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GASP G-Protein gekoppelter Rezeptor assoziiertes Sortierungsprotein GDP Guanosindiphosphat
GIRK G-Protein gekoppelter einwärts rektifizierender Kalium- kanal
GP Globus pallidus
GPCRs G-Protein gekoppelte Rezeptoren GRKs G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen GTP Guanosintriphosphat h Hill-Koeffizient
HCN-Kanäle hyperpolarisations-aktivierte zyklische Nukleotide
modulierte Kationenkanäle HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure Hipp Hippocampus I Strom (-Amplitude) IA A-Typ Kaliumkanal Ih vgl. HCN-Kanäle
Imax maximale Stromamplitude
IC50 halbmaximale inhibitorische Konzentration
i.p. intraparetoneal
IP3 Inositol-1,4,5-Trisphosphat
IPN Nucleus interpeduncularis
IPSP inhibitorische postsynaptische Potentiale
KCHIP Kaliumkanalinteraktionsprotein Kir-Kanäle einwärts-rektifizierende Kaliumkanäle
L-DOPA L-3,4-Dihydroxyphenylalanin
LMD Laser Mikrodissektion
LTD Langzeitdepression (long term depression) LTP Langzeitpotenzierung (long term potentiation) MAO Monoaminoxidase
MGB minor groove binder
mPFC medialer präfrontaler Kortex
mRNA messenger Ribonukleinsäure
mVMAT2 vesikulärer Monoamintransporter 2 der Maus MW Mittelwert
NA Noradrenalin
NAc Nucleus accumbens
NCS-1 neuronaler Calciumsensor-1
nd nicht definiert
n.d. nicht detektiert
NFQ nicht fluoreszierender Quencher
NHP Nachhyperpolarisation NMDA N-Methyl-D-Aspartat
n.s. nicht signifikant
OD optische Dichte
OPA Operationsverstärker
ORF orbitofrontaler Kortex
PCR Polymerasekettenreaktion PEN Polyethylennaphthalat PFC präfrontaler Kortex PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat PKA Proteinkinase A PKC Proteinkinase C PLC Phospholipase C
PN postnatal (nach der Geburt)
Poly dC Polydeoxycytidylic Acid
Poly I Poly Inositol
PP1 Proteinphosphatase 1
PSD postsynaptische Dichte (post synaptic density)
R Rückwärts (-primer)
R2 Bestimmtheitsmaß
Rf Rückkopplungswiderstand
RGS Regulatoren der G-Protein Signalweiterleitung Rn Fluoreszenz
Rm Membranwiderstand
ROX 6-Carboxy-X-Rhodamine
Rp Pipettenwiderstand
rpm Umdrehungen pro Minute
RRA Area retrorubralis
Rs Serienwiderstand RT Raumtemperatur Rxn Reaktionen S Sonde s.c. subcutan scPCR Einzelzell-PCR SDS Natriumdodecylsulfat SEM mittlerer Standardfehler (standard error of mean)
SN Substantia nigra
SNpc Substantia nigra pars compacta SNpr Substantia nigra pars reticulata SNPs single nucleotide polymorphisms
τ Zeitkonstante (Tau) TAE Tris-Acetat-EDTA TEA Tetraethylammoniumchlorid TH Tyrosinhydroxylase Thal Thalamus TMD Transmembrandomäne U Unit (Einheit) UE Untereinheit U/µl Units je µl üN über Nacht
UNG Uracil-DNA Glycosylase
unsp. unspezifisch UV ultraviolett v ventral
VMAT vesikulärer Monoamintransporter
VS ventrales Striatum
Zeichenerklärung
Zum besseren Verständnis der Abbildungen, wurden die Farben der Symbole und Balken in den verschiedenen Diagrammen des Ergebnisteils einheitlich dargestellt. Im Folgenden sind die Farben und die dazugehörigen Bedeutungen aufgeführt:
graue Symbole/Balken Messwerte dopaminerger VTA Neurone schwarze Symbole/Balken Messwerte dopaminerger SN Neurone
grau/schwarz gefüllte Symbole Messwerte von Neuronen nicht-injizierter Tiere orange gefüllte Symbole Messwerte von Neuronen Saline-injizierter Tiere gelb gefüllte Symbole Messwerte von Neuronen Kokain-injizierter Tiere
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Verteilung dopaminerger Zellgruppen im Gehirn der adulten Ratte... 2
Abb. 2: Anabolismus der Catecholamine Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin . 6 Abb. 3: Dopaminfreisetzung erfolgt somatodendritisch und axonterminal... 8
Abb. 4: Struktur der Dopaminrezeptoren... 10
Abb. 5: Schematische Darstellung der beiden Isoformen des D2-Dopaminrezeptors ... 12
Abb. 6: Rezeptordesensitisierung ... 14
Abb. 7: Stimulation der D1-ähnlichen und D2-ähnlichen Dopaminrezeptorwege 18 Abb. 8: Struktur der Kir-Untereinheiten der tetrameren Kanäle... 20
Abb. 9: Untereinheiten der GIRK-Kanäle ... 20
Abb. 10: Die Autorezeptorantwort in mesencephalen dopaminergen Neuronen... 24
Abb. 11: Schematische Darstellung der elektrophysiologischen Antwort eines dopaminergen Neurons auf belohnungsbezogene Stimuli (reward-related stimuli) ... 27
Abb. 12: Schematische Darstellung limbischer Bereiche, die die Drogenabhängigkeit beeinflussen... 30
Abb. 13: Die Wirkung von Kokain ... 33
Abb. 14: Überführen des Zytoplasmas aus der Patchpipette in ein steriles Gefäß 46 Abb. 15: Prinzip des Leica LMD 6000 ... 48
Abb. 16: Vibratom mit manuellem Transport, Model 752 ... 50
Abb. 17: Aufbau des verwendeten Messstandes ... 54
Abb. 18: Vereinfachtes Schaltbild eines Patch-clamp Verstärkers... 56
Abb. 19: Die Silber/Silberchlorid Elektrode ... 59
Abb. 20: Bildung der cell-attached perforated Patch Konfiguration... 66
Abb. 21: Schematische Abbildung der qualitativen mutiplex-nested PCR ... 83
Abb. 22: Prinzip der real-time PCR unter Verwendung eines TaqMan Assays... 85
Abb. 23: Ausschnitt aus dem Alignment der Sequenzen des DR-D1 und DR-D5 mit den konstruierten Primern ... 92
Abb. 24: Ausschnitt aus dem Alignment der Sequenzen der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren mit den konstruierten Primern ... 94
Abb. 25: Ausschnitt aus dem Sequenzalignment von GAD67 und GAD65 mit den konstruierten Primern für GAD65... 96
Abb. 26: Ausschnitt aus dem multiplen Sequenzalignment der verschiedenen GIRK2-Isoformen, aufgetragen gegen die komplette GIRK2-Sequenz... 98 Abb. 27: Schematische Darstellung der Sequenzen der GIRK2-Isoformen ... 99 Abb. 28: Ergebnisse der Standardkurve für GIRK2 ...102 Abb. 29: Nachweis der Expression der Dopaminrezeptoren und Markergene in
Mittelhirn-cDNA...105 Abb. 30: Exemplarisches Beispiel und zusammengefasste Ergebnisse der
Dopaminrezeptor-Genexpresion in einzelnen dopaminergen SN
Neuronen...105 Abb. 31: Genexpressionsprofil der Dopaminrezeptoren in dopaminergen SN und
VTA Neuronen nach DNase-Verdau...107 Abb. 32: Genexpressionsprofil der langen (DR-D2l) und der kurzen (DR-D2s)
Isoform in dopaminergen SN und VTA Neuronen...109 Abb. 33: Nachweis der Glutamatdecarboxylase GAD65 und GAD67 in
Mittelhirn-cDNA ...110 Abb. 34: Nachweis der Expression der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren, der
GIRK-Kanäle und der Markergene in Mittelhirn-cDNA...111 Abb. 35: Profil der Koexpression der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren mit den
GIRK1- und GIRK2-Kanälen in dopaminergen SN und VTA Neuronen.112 Abb. 36: Nachweis der Expression der GIRK2-Isoformen mit und ohne die
Markergene (TH, GAD65/67, CB) in Mittelhirn-cDNA ...114 Abb. 37: Expression der GIRK2-Isoformen in einzelnen dopaminergen SN und
VTA Neuronen ...115 Abb. 38: Genexpression der GIRK2-Isoformen in dopaminergen SN und VTA
Neuronen...116 Abb. 39: Identifikation dopaminerger SN und VTA Neurone im akuten Hirnschnitt...
...118 Abb. 40: Membrankapazität und Zugangswiderstand der untersuchten
dopaminergen SN und VTA Neurone ...120 Abb. 41: Lokale Applikation von 100 µM Dopamin auf dopaminerge SN bzw. VTA
Neurone...121 Abb. 42: Inhibition des Dopamintransporters mittels GBR12909 in dopaminergen
Abb. 43: Lokale Applikationen von 100 µM Dopamin auf dopaminerge SN Neurone in der perforated Patch Konfiguration ...124 Abb. 44: Wiederholte Dopaminapplikation auf dopaminerge SN Neurone,
gemessen in der perforated Patch Konfiguration...125 Abb. 45: Ermittlung der Dosis-Wirkungskurve für Dopamin in der
Spannungsklemme ...126 Abb. 46: Dosis-Wirkungskurven verschiedener Agonisten, gemessen in der
Spannungsklemme an dopaminergen SN bzw. VTA Neuronen ...127 Abb. 47: Ermittlung der Dosis-Wirkungskurve für Dopamin in der Stromklemme 129 Abb. 48: Dosis-Wirkungskurve von Dopamin, gemessen in der Stromklemme an
dopaminergen SN Neuronen ...130 Abb. 49: Inhibition des DR-D2 durch den selektiven DR-D2-Antagonisten Sulpirid
in dopaminergen SN Neuronen ...131 Abb. 50: Messungen der Spontanaktivität und der Stromantworten während bzw.
nach der lokalen Applikation von Dopamin auf dopaminerge SN und VTA Neurone, gemessen in der perforated Patch Konfiguration ...133 Abb. 51: Ergebnisse der Messungen der lokalen Applikation von Dopamin auf
dopaminerge Neurone der SN und VTA ...135 Abb. 52: Messungen der Spontanaktivität und der Stromantworten während bzw.
nach der lokalen Applikation von Quinpirol auf dopaminerge SN und VTA Neurone, gemessen in der perforated Patch Konfiguration ...136 Abb. 53: Ergebnisse der Messungen der lokalen Applikation von Quinpirol auf
dopaminerge Neurone der SN und VTA ...137 Abb. 54: Messungen der Spontanaktivität und der Stromantworten während bzw.
nach der lokalen Applikation von Baclofen auf dopaminerge SN und VTA Neurone, gemessen in der perforated Patch Konfiguration ...139 Abb. 55: Ergebnisse der Messungen der lokalen Applikation von Baclofen auf
dopaminerge Neurone der SN und VTA ...140 Abb. 56: Messung des Umkehrpotentials für den GIRK-Strom, aktiviert durch
verschiedene Agonisten, in dopaminergen SN Neuronen ...142 Abb. 57: Analyse der Aktionspotentiale in dopaminergen SN Neuronen nach
einmaliger in vivo Saline- bzw. Kokaininjektion...143 Abb. 58: Frequenz und induzierte Hyperpolarisation dopaminerger SN Neurone
Abb. 59: Analyse der sag-Amplitude und des rebound delay in den untersuchten dopaminergen SN Neuronen nach einmaliger in vivo Saline- bw.
Kokaininjektion...145 Abb. 60: Analyse des Ih- und des IA-Stromes in dopaminergen SN Neuronen nach
einmaliger in vivo Saline- bzw. Kokaininjektion...146 Abb. 61: Die Spontanaktivität dopaminerger SN Neurone ist nach der Injektion von
Saline oder Kokain signifikant erhöht gegenüber der Aktivität von
Neuronen nicht-injizierter Tiere...148 Abb. 62: Die Aktionspotentialfrequenz dopaminerger VTA Neurone ist nach
einmaliger in vivo Saline- und Kokaininjektion vergleichbar ...149 Abb. 63: Inhibition des GABAB-Rezeptors durch den GABAB
-Rezeptor-Antagonisten CGP54626 in dopaminergen SN Neuronen...150 Abb. 64: Dosis-Wirkungskurve von Dopamin, gemessen in der Stromklemme an
dopaminergen SN Neuronen, nach einmaliger in vivo Injektion von Kokain ...152 Abb. 65: Dopaminapplikation auf dopaminerge SN Neurone Saline- bzw.
Kokain-injizierter Tiere, gemessen in der Spannungsklemme ...153 Abb. 66: Inhibition der durch Dopaminapplikation hervorgerufenen Stromantwort
durch den selektiven Kir-Kanal-Blocker Tertiapin in dopaminergen SN Neuronen Saline- bzw. Kokain-injizierter Tiere ...154 Abb. 67: Inhibition der durch Dopaminapplikation hervorgerufenen Stromantwort
durch den nicht-selektiven Kaliumkanal-Blocker Barium in dopaminergen SN Neuronen Saline- bzw. Kokain-injizierter Tiere ...155 Abb. 68: Kurze Applikation (6 s) von Dopamin auf dopaminerge SN Neurone einen
Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...157 Abb. 69: Lange Applikation (60 s) von Dopamin auf dopaminerge SN Neurone
einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...158 Abb. 70: Kurze Applikation von Dopamin (6 s) auf dopaminerge VTA Neurone
einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...159 Abb. 71: Lange Applikation von Dopamin (60 s) auf dopaminerge VTA Neurone
einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...161 Abb. 72: Kurze Applikation von Dopamin (6 s) auf dopaminerge SN Neurone drei
Abb. 73: Lange Applikation von Dopamin (60 s) auf dopaminerge SN Neurone drei Tage nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...164 Abb. 74: Kurze Applikation von Dopamin (6 s) auf dopaminerge VTA Neurone drei
Tage nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...165 Abb. 75: Lange Applikation von Dopamin (60 s) auf dopaminerge VTA Neurone
drei Tage nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...167 Abb. 76: Lange Applikation von Dopamin (60 s) auf dopaminerge VTA Neurone
ohne Autorezeptorantwort ...168 Abb. 77: Vergleich der verschiedenen Master Mixe für die real-time PCR...170 Abb. 78: Ergebnisse der real-time PCR mit und ohne Präzipitation der cDNA ....172 Abb. 79: UV-LMD von einzelnen Neuronen aus dem Gewebe ...173 Abb. 80: Die Expression des DR-D2s, DR-D2l, DR-D3, GIRK2 und SUR1 in Pools
dopaminerger SN Neurone einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion in Jungtieren ...174 Abb. 81: Die Expression des DR-D2s, DR-D2l, DR-D3, GIRK2 und SUR1 in Pools
dopaminerger VTA Neurone einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion in Jungtieren ...175 Abb. 82: Die Expression des DR-D2s, DR-D2l und GIRK2 in Zellpools
dopaminerger SN und VTA Neurone adoleszenter Tiere einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...180 Abb. 83: Die Expression des DR-D2s, DR-D2l und GIRK2 in Zellpools
dopaminerger SN und VTA Neurone adulter Tiere einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...181 Abb. 84: Die Expression des DR-D2s, DR-D2l und GIRK2 in Zellpools
dopaminerger SN und VTA Neurone adulter Tiere drei Tage nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...183
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Bereits etablierte verwendete multiplex-nested Primer ... 41
Tabelle 2: Selbst konstruierte verwendete multiplex-nested Primer ... 42
Tabelle 3: Selbst konstruierte verwendete multiplex-nested Primer ... 43
Tabelle 4: Custom TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) ... 44
Tabelle 5: TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) ... 45
Tabelle 6: Die drei Gain-Bereiche des EPC 10... 57
Tabelle 7: Programm 10 des DMZ-Universal Puller... 58
Tabelle 8: Verwendete Datenbanken zum Primer design ... 79
Tabelle 9: Ergebnisse der Standardkurven für die verwendeten real-time PCR Assays ...103
Tabelle 10: Genexpression der Dopaminrezeptoren in dopaminergen SN und VTA Neuronen nach DNase-Verdau ...108
Tabelle 11: Genexpression der langen (DR-D2l) und der kurzen (DR-D2s) Isoformen in dopaminergen SN und VTA Neuronen ...109
Tabelle 12: Expression der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren, der GIRK1- und der GIRK2-Kanäle in dopaminergen SN und VTA Neuronen...113
Tabelle 13: Koexpression der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren mit dem GIRK1- bzw. GIRK2-Kanal in dopaminergen SN und VTA Neuronen ...113
Tabelle 14: Expression der GIRK2-Isoformen in den dopaminergen SN und VTA Neuronen ...117
Tabelle 15: Koexpression der GIRK2-Isoformen in den dopaminergen SN und VTA Neuronen ...117
Tabelle 16: Ergebnisse der Inhibition des Dopamintransporters mittels GBR12909 in dopaminergen SN Neuronen nach der Applikation von Dopamin ..123
Tabelle 17: EC50 bzw. IC50-Werte dopaminerger SN bzw. VTA Neurone ...130
Tabelle 18: Ergebnisse der Dopaminapplikation auf dopaminerge Neurone der SN und der VTA ...135
Tabelle 19: Ergebnisse der Quinpirolapplikation auf dopaminerge Neurone der SN und der VTA ...138
Tabelle 20: Ergebnisse der Baclofenapplikation auf dopaminerge Neurone der SN und der VTA ...141
Tabelle 21: Ergebnisse der whole-cell Charakterisierung der untersuchten dopaminergen SN Neurone nach einmaliger in vivo Saline- bzw.
Kokaininjektion ...147 Tabelle 22: Ergebnisse der Inhibition der durch Dopamin ausgelösten Stromantwort
mittels Tertiapin bzw. Barium in dopaminergen SN Neuronen Saline- bzw. Kokain-injizierter Tiere ...156 Tabelle 23: Ergebnisse der kurzen (6 s) und langen (60 s) Applikation von Dopamin
auf die untersuchten dopaminergen SN und VTA Neurone einen Tag nach Saline- oder Kokaininjektion ...162 Tabelle 24: Ergebnisse der kurzen (6 s) und langen (60 s) Applikation von Dopamin
auf die untersuchten dopaminergen SN und VTA Neurone drei Tage nach Saline- oder Kokaininjektion ...168 Tabelle 25: Ergebnisse der real-time PCR mit und ohne DNase-Verdau ...171 Tabelle 26: Ergebnisse der Genexpression der D2-ähnlichen DRs, des GIRK2 und
des SUR1 in Zellpools dopaminerger SN und VTA Neurone von
Jungtieren nach Saline- bzw. Kokaininjektion ...176 Tabelle 27: Ergebnisse der Genexpression der GIRK2-Isoformen und des Kir6.2
nach DNase Verdau in Zellpools dopaminerger SN und VTA Neurone von Jungtieren nach Salineinjektion...177 Tabelle 28: Ergebnisse der Genexpression der GIRK2-Isoformen und des Kir6.2
ohne DNase Verdau in den Zellpools dopaminerger SN und VTA
Neurone von Jungtieren nach Saline- bzw. Kokaininjektion...178 Tabelle 29: Ergebnisse der Expression des DR-D2s, DR-D2l, DR-D3 und GIRK2 in
den Zellpools dopaminerger SN und VTA Neurone adoleszenter Tiere nach Saline- bzw. Kokaininjektion...180 Tabelle 30: Ergebnisse der Genexpression des DR-D2s, DR-D2l, DR-D3 und
GIRK2 in den Zellpools dopaminerger SN und VTA Neurone adulter Tiere, einen Tag nach Saline- bzw. Kokaininjektion...182 Tabelle 31: Ergebnisse der Genexpression des DR-D2s, DR-D2l, DR-D3 und
GIRK2 in den Zellpools dopaminerger SN und VTA Neurone adulter Tiere, drei Tage nach Saline- bzw. Kokaininjektion...183 Tabelle 32: Schematische Übersicht der Ergebnisse der Genexpressionsanalyse
Zusammenfassung
Mesencephale dopaminerge Neurone der Substantia nigra (SN) und der Area tegmentalis ventralis (VTA) spielen eine bedeutende Rolle in der Pathophysiologie der Drogenabhängigkeit. Dopaminerge Projektionen von der VTA zum Nucleus accumbens, zur Amygdala und zum präfrontalen Kortex sind an den Belohnungs- und Verstärkungseffekten der Drogen beteiligt, während die nigrostriatalen Projektionen an der Bildung von Gewohnheiten (habits) mitwirken. In vivo Injektionen von Kokain führten in Tiermodellen zu Veränderungen der glutamatergen und GABAergen Signalweiterleitung. Es ist jedoch noch unklar, ob weitere Signal-moleküle ebenfalls an der Regulation der elektrischen Aktivität dieser dopaminergen Neurone beteiligt sind.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Dopamin-vermittelte Autorezeptor-antwort dopaminerger Mittelhirnneurone der SN und der VTA am Tiermodell junger Mäuse (Mus musculus L.) zu untersuchen. Hiefür wurde mittels qualitativer PCR die Expression der Dopaminrezeptoren und der GIRK-Kanaluntereinheiten in einzelnen Neuronen beider Populationen nachgewiesen, um die an der Dopamin-Auto-rezeptorantwort beteiligten Komponenten molekular zu identifizieren. Zusätzlich wurde die durch Dopaminapplikation stimulierte Autorezeptorantwort der dopaminergen SN und VTA Neurone elektrophysiologisch in in vitro Hirnschnitten untersucht und charakterisiert.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Identifikation möglicher Veränderungen der Dopamin-Autorezeptorantwort der dopaminergen SN und VTA Neurone durch eine einmalige in vivo Injektion von Kokain. Hierzu wurden molekularbiologisch das Genexpressionsmuster der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren und des GIRK2-Kanals mittels quantitativer real-time PCR, sowie elektrophysiologisch, mittels perforated Patch-clamp Technik, die Dopamin-Autorezeptorantwort der dopaminergen mesencephalen Neurone der SN und VTA nach einmaliger in vivo Saline- (Kontrolle) bzw. Kokaininjektion untersucht und verglichen.
Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit bestätigten, dass die dopaminergen SN und VTA Neurone hauptsächlich den D2-Dopaminrezeptor und den GIRK2-Kanal exprimieren. Hierbei wurde größtenteils eine Expression beider Spleißisoformen des
D2-Dopaminrezeptors (DR-D2s und DR-D2l) in beiden Neuronenpopulationen nachgewiesen, was vermuten lässt, dass beide Isoformen an der präsynaptischen Dopamin-Autorezeptorantwort beteiligt sein könnten. Nach einer einmaligen in vivo Injektion von Kokain war die Expression der DR-D2s-, DR-D2l- und GIRK2-mRNA in den dopaminergen VTA Neuronen, nicht jedoch in den dopaminergen SN Neuronen, junger Tiere signifikant herabreguliert. Hingegen erfuhr die Expression der DR-D2s-, DR-D2l- und GIRK2-mRNA in den untersuchten dopaminergen SN und VTA Neuronen adoleszenter und adulter Tiere nahezu keine Veränderungen durch die einmalige in vivo Kokaininjektion.
Der lokalen Applikation von Dopamin auf die mesencephalen dopaminergen Neurone folgte eine reversible Inhibition ihrer Spontanaktivität. Die einmalige in vivo Injektion von Kokain führte in den untersuchten dopaminergen VTA Neuronen, nicht jedoch in den untersuchten dopaminergen SN Neuronen, nach drei Tagen zu einer signifikanten Abnahme der Dopamin-vermittelten Inhibition der Spontanaktivität und somit zu einer signifikant verringerten Dopamin-Autorezeptorantwort.
Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig frühe Kokain-induzierte Veränderungen der Dopamin-Autorezeptorantwort dopaminerger Mittel-hirnneurone identifiziert und beschrieben. Diese dramatischen Veränderungen, hervorgerufen durch eine einmalige in vivo Kokaininjektion, können möglicherweise durch die folgende verringerte Dopamin-Autoinhibition die Wirkung von Kokain in den Projektionsgebieten der dopaminergen VTA Neurone zusätzlich verstärken.
Eine verringerte DR-D2-Bindung im Gehirn drogensüchtiger Tiere und Menschen ist bereits bekannt. Die Abnahme des DR-D2 in den untersuchten dopaminergen VTA Neuronen durch die einmalige Kokaingabe könnte einen Anfangspunkt in der Verringerung des DR-D2 durch die Einnahme von Drogen darstellen.
Da die signifikante Kokain-induzierte Veränderung der Genexpression und der Dopamin-Autorezeptorantwort in den untersuchten dopaminergen VTA Neuronen junger Tiere, nicht jedoch in denen adoleszenter bzw. adulter Tiere nachgewiesen wurde, deuten diese Ergebnisse auf eine stärkere Anfälligkeit dieser Neurone in den jungen Mäusen auf die Gabe von Kokain hin. Dieser Effekt scheint daher stark vom Alter der Tiere während der Kokaineinnahme abhängig zu sein.
1 Einleitung
In den 1950er Jahren wurde Dopamin als Neurotransmitter entdeckt (Carlsson, 1959). Seine Lokalisation im Gehirn der Ratte wurde kurze Zeit später durch Dahlström und Fuxe (Dahlström und Fuxe, 1964; Dahlström, 1971) beschrieben. Es konnte festgestellt werden, dass das Mittelhirn etwa 75 % aller Dopamin exprimierenden (dopaminergen) Zellen des gesamten Gehirns beinhaltet. Das dopaminerge Mittelhirnsystem ist an vielen verschiedenen wichtigen Funktionen, wie z.B. der Bewegung, Belohnung, Lernen und Erinnerung beteiligt. Störungen dieses Systems können zu einer Vielzahl unterschiedlicher Krankheiten führen. Gleichzeitig stellt das dopaminerge Mittelhirnsystem einen der Hauptspieler dar, welcher die Belohnungseffekte suchterzeugender Drogen vermittelt. Veränderungen des dopaminergen Systems bilden somit vermutlich u.a. die Grundlage für die Drogensucht und die Drogenabhängigkeit.
Drogenabhängigkeit ist ein zentrales Problem der heutigen Gesellschaft, besonders unter Jugendlichen und jungen Erwachsenen. Die zwanghaften Handlungen, die eine Folge der Abhängigkeit darstellen, werden leicht als gewollte Selbstzerstörung fehlinterpretiert und können zur sozialen Isolation der betroffenen Personen führen. Das vielleicht größte Problem der Drogensucht ist jedoch das hohe Rückfallrisiko des Drogenmissbrauchs, welches auch in der Drogenabstinenz, lange nachdem die Entzugserscheinungen abgeklungen sind, eventuell ein Leben lang, weiter besteht. Daher ist es ein zentrales Ziel, die neuronalen Mechanismen der Drogenabhängigkeit zu identifizieren und damit eventuell neue Behandlungsmöglichkeiten aufzudecken.
1.1 Das dopaminerge System im zentralen Nervensystem
Das dopaminerge System ist eines der am besten untersuchten und weitgehend vollständig charakterisierten Neurotransmittersysteme im Gehirn. Carlsson et al. (1962) waren die ersten, die die zwei primären Catecholamine, Noradrenalin (NA) und Dopamin (DA) in einzelnen neuronalen Systemen im Gehirn identifizierten. Mittlerweile wurde eine Vielzahl catecholaminerger neuronaler Zellgruppen im Säugergehirn beschrieben.
Die dopaminergen Neurone repräsentieren eine relativ kleine Gruppe von Neuronen im Bezug auf die gesamte neuronale Population im zentralen Nervensystem. Durch ihre stark divergierenden Verzweigungen beeinflussen sie jedoch große Gebiete des
Gehirns. In Abb. 1 ist die Verteilung der dopaminergen Neuronengruppen im Gehirn der adulten Ratte (außer Retina) schematisch dargestellt. Noch heute werden dopaminerge und weitere catecholaminerge Neuronengruppen nach einer Studie von Dahlström und Fuxe (1964) klassifiziert.
Abb. 1: Verteilung dopaminerger Zellgruppen im Gehirn der adulten Ratte
Schematische Abbildung eines sagitalen Schnittes durch das Gehirn einer adulten Ratte. Dopaminerge Neurone sind im Säugetiergehirn in verschiedenen Neuronengruppen lokalisiert. Die Bezeichnung der Zellgruppen (A8 bis A16) wurde aus der Studie von Dahlström und Fuxe (1964) übernommen. Die Regionen A8 bis A10 beinhalten die mesencephalen dopaminergen Neurone, die in der Area retrorubralis (RRA, A8), der Substantia nigra (SN, A9) und der Area tegmentalis ventralis (VTA, A10) lokalisiert sind. Die Hauptprojektionen der dopaminergen Neurone sind durch Pfeile gekennzeichnet. (Quelle: Björklund und Dunnett, 2007)
Im Gehirn sind dopaminerge Neurone im Mesencephalon (A8–A10), im Dien-cephalon (A11–A15), im Bulbus olfaktorius (A16) sowie in der Retina (A17) lokalisiert (Björklund und Dunnett, 2007; vgl. Abb. 1). Die Hauptmenge an Dopamin wird in den beiden Mittelhirnkernen, der Substantia nigra (SN) und der Area tegmentalis ventralis (VTA), synthetisiert. Die Dopaminfreisetzung aus den Zellkörpern dieser Areale erfolgt hauptsächlich in striatale und kortikolimbische Projektionsgebiete, die im Folgenden näher erläutert werden.
Im Mesencephalon befinden sich drei Areale, in denen dopaminerge Neurone lokalisiert sind, die Area retrorubralis (RRA, A8), die Substantia nigra (SN, A9) und die Area tegmentalis ventralis (VTA, A10). Nach ihrer Funktion werden die dopaminergen Mittelhirnneurone in unterschiedliche axonale Projektionssysteme unterteilt, das mesostriatale, das mesolimbische und das mesokortikale System (Lindvall et al., 1974; Fallon et al., 1978; Swanson, 1982). Projektionen, die das
mesostriatale System bilden, stammen hauptsächlich aus Dopamin-synthe-tisierenden Neuronen der Substantia nigra pars compacta (SNpc), die das dorsale Striatum innervieren. Der mesostriatale Weg ist u.a. beteiligt an der Koordination von Willkürbewegungen. Degeneration der mesostriatalen dopaminergen Innervationen führt zu Morbus Parkinson, einer der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, welche durch die Kardinalsymptome Rigor (Muskelstarre), Akinese (Bewegungs-losigkeit), Ruhetremor (Muskelzittern in Ruhe) und posturale Instabilität (Haltungs-instabilität) gekennzeichnet ist. Dopaminerge Neurone des mesokortikalen Projektionssystems sind in der VTA lokalisiert und innervieren verschiedene kortikale Areale (u.a. den medialen präfrontalen, cingulären und entorhinalen Kortex). Dieses System scheint an Kognition und dem Arbeitsgedächtnis (working memory) beteiligt zu sein. Eine Verringerung der mesokortikalen dopaminergen Transmission hat kognitive Störungen und die Negativsymptome der Schizophrenie, wie Antriebslosigkeit, depressive Symptome und motorische Defizite in der Mimik, zur Folge (Matthysse, 1973). Die Zellkörper dopaminerger Neurone des mesolimbischen Weges sind ebenfalls meist in der VTA lokalisiert. Mesolimbische Projektionen innervieren hauptsächlich den Nucleus accumbens, einen Teil des ventralen Striatums, aber auch weitere Hirnareale, wie das Tuberculum olfactorium und die Amygdala (Fallon et al., 1978; Fallon und Moore, 1978 a+b; Swanson, 1982) . Das mesolimbische System ist beteiligt an Motivation, Belohnung und Sucht (Koob und Bloom, 1988; Koob, 1992; Kapitel 1.6). Eine verstärkte dopaminerge Transmission des mesolimbischen Systems ist wahrscheinlich verantwortlich für die Positivsymptomatik der Schizophrenie, zu der Halluzinationen und Wahnvor-stellungen zählen (Matthysse, 1973).
Neben diesen Funktionen besitzt Dopamin auch weitere wichtige biologische Bedeutungen. Es spielt unter anderem eine wesentliche Rolle in der Hypophyse (Hirnanhangdrüse), wo es die Prolactinfreisetzung reguliert. Die Zellkörper des tuberoinfundibulären Dopaminsystems liegen im Nucleus infundibularis, einem Kern des Hypothalamus. Ihre Axone ziehen zur Eminentia mediana der Hypophyse. Freigesetztes Dopamin gelangt über die Portalgefäße in die Adenohypophyse und hemmt dort die Synthese von Prolactin (Aktories et al., 2005).
In Mäusen beträgt die Gesamtzahl dopaminerger Zellen im Mesencephalon etwa 20.000 – 30.000, wobei über die Hälfte dieser Neurone in der SN liegen. Die Anzahl
erhöht sich beim Menschen auf 400.000 – 600.000 Zellen, wobei über 70 % dieser Neuone in der SN lokalisiert sind (Björklund und Dunnett, 2007).
Neben den dopaminergen Neuronen sind in der SN und der VTA auch γ-Aminobuttersäure-synthetisierende (GABAerge) Interneurone und GABAerge Projektionsneurone lokalisiert. Als molekularer Marker für GABAerge Neurone wird der Nachweis der Glutamatdecarboxylase (GAD) verwendet, ein Enzym, das an der Synthese der γ-Aminobuttersäure (GABA) beteiligt ist.
1.2 Elektrophysiologische Eigenschaften dopaminerger Mittelhirnneurone
Mesencephale dopaminerge Neurone besitzen besondere elektrophysiologische Eigenschaften, die sie von benachbarten GABAergen Interneuronen und GABAergen Projektionsneuronen deutlich unterscheiden. Die dopaminergen Mittelhirnneurone sind in in vitro Hirnschnitten spontanaktiv und besitzen den sogenannten „Schrittmacher-Rythmus“ oder „pacemaker“. Sie feuern Aktionspotentiale mit einer Frequenz zwischen 1 und 4 Hz (Grace und Bunney, 1983), wobei dopaminerge SN Neurone Aktionspotentiale in einem sehr regelmäßigen Muster feuern, während die dopaminergen VTA Neurone ein weniger reguläres Erregungsmuster besitzen (Wohlfart et al., 2001). In vivo zeigen die dopaminergen Mittelhirnneurone neben der regelmäßigen pacemaker-Aktivität auch Gruppenentladungen, den sogenannten „bursts“. In dopaminergen Neuronen wacher Ratten konnte ein schneller Wechsel vom regelmäßigen Feuern zur burst-Aktivität und umgekehrt gezeigt werden (Freeman et al., 1985).
Zur Identifikation dopaminerger SN und VTA Neurone dient neben der Messung der Spontanaktivität auch die Analyse der Antwort auf hyperpolarisierende Strom-injektionen. Durch die Injektion hyperpolarisierender Ströme werden in dopaminergen SN Neuronen hyperpolarisationsaktivierte, zyklische Nukleotide modulierte (HCN;
hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-modulated) Ionenkanäle aktiviert.
HCN-Kanäle sind spannungsabhängige, nicht-selektive HCN-Kanäle für monovalente Kationen (permeabel für K+- und Na+-Ionen). In den dopaminergen SN Neuronen sind die
Untereinheiten HCN2, HCN3 und HCN4 exprimiert (Franz et al., 2000). Der durch die HCN-Kanäle fließende Ionenstrom (Nettonatriumeinstrom) wird Ih-Strom genannt. Er
wirkt der Hyperpolarisation entgegen. Die hierdurch hervorgerufene Abnahme in der Amplitude wird als „sag-Amplitude“ bezeichnet (Franz et al., 2000; Neuhoff et al., 2002). Dopaminerge VTA Neurone besitzen im Gegensatz zu den dopaminergen SN
Neuronen nur eine sehr kleine bzw. gar keine sag-Amplitude, d.h. sie geben eine geringe Ih-Strom-Aktivierung als Antwort auf eine hyperpolarisierende Strominjektion
(Neuhoff et al., 2002).
Die Repolarisation nach einer kurzen Membranhyperpolarisation führt in dopaminergen Mittelhirnneuronen zu einer spannungsabhängigen Aktivierung von A-Typ Kaliumkanälen. Der durch diese Kanäle fließende Auswärtsstrom wird als IA
-Strom bezeichnet. Dopaminerge VTA Neurone zeigen eine lange Öffnung der A-Typ Kaliumkanäle mit einer langsamen Inaktivierungskinetik des IA-Stromes. Diese führt
zu einer sichtbaren Verzögerung der Repolarisation des Membranpotentials. Man bezeichnet diese Verzögerung als „rebound delay“. Der IA-Strom dopaminerger VTA
Neurone ist langsam inaktivierend, während der IA-Strom dopaminerger SN Neurone
schneller inaktiviert (Liss et al., 2001). Die dopaminergen SN Neurone weisen nur einen kurzen bzw. keinen rebound delay auf (Neuhoff et al., 2002). Die dopaminergen SN und VTA Neurone zeigen eine Expression verschiedener Untereinheiten des A-Typ Kaliumkanals. Dopaminerge SN Neurone exprimieren die α-Untereinheit Kv4.3L und die β-Untereinheit „Kaliumkanalinteraktionsprotein 3.1“ (KCHIP3.1) (Liss et al., 2001). Weiterhin wurde die Expression der β-Untereinheit Dipeptidyl Peptidase 10 (DPPX) als Bestandteil neuronaler A-Typ Kaliumkanäle beschrieben (Nadal et al., 2003; Nadal et al., 2006). Die dopaminergen VTA Neurone exprimieren zusätzlich die β-Untereinheiten KCHIP1 und KCHIP4 (Liss, 2002;)
Sowohl der IA-Strom (Liss et al., 2001), als auch der Ih-Strom (Neuhoff et al., 2002)
besitzen Funktionen in der Regulation der Spontanaktivität mesencephaler dopaminerger SN Neurone. Liss und Kollegen (Liss et al., 2001) zeigten, dass der A-Typ Kaliumkanal eine Schlüsselrolle in der Kontrolle des „pacemakers“ der dopaminergen SN Neuronen besitzt. Eine komplette Inhibition des A-Typ Kaliumkanals führte in diesen Neuronen zur 2,7-fachen Beschleunigung der Aktionspotentialfrequenz. Neuhoff et al. (2002) wiesen weiterhin nach, dass die Ih
-Kanäle in den Calbindin-positiven dopaminergen SN Neuronen aktiv die Frequenz des „pacemakers“ kontrollieren. Die Inhibition des Ih-Stromes in diesen Neuronen
führte zu einer signifikanten Reduktion der Aktionspotentialfrequenz.
1.3 Dopamin als Neurotransmitter
Histamin und Serotonin gehören zusammen mit den drei Catecholaminen Adrenalin (A), Noradrenalin (NA) und Dopamin (DA) zu den biogenen Aminen. Defekte in den
Funktionen der biogenen Amine sind an verschiedenen psychiatrischen Krankheiten, wie z.B. der Schizophrenie, beteiligt (Purves et al., 2004). Auch viele sucht-erzeugende Drogen (wie Amphetamine und Kokain) beeinflussen das catechol-aminerge, hier vor allem das dopcatechol-aminerge, System (Aktories et al., 2005).
Dopamin ist mit etwa 80 % das am häufigsten vorkommende Catecholamin im Gehirn (Vallone et al., 2000). Die Synthese von Dopamin (Abb. 2) erfolgt, wie für die beiden anderen Catecholamine (A und NA), aus dem selben Vorläufer, der aromatischen Aminosäure Tyrosin. Diese wird entweder mit der Nahrung aufgenommen oder aus Phenylalanin synthetisiert. Der erste und geschwindigkeits-bestimmende Schritt in der Catecholaminsynthese wird durch das Enzym Tyrosinhydroxylase (TH) katalysiert. Diese Reaktion erfordert Sauerstoff als Cosubstrat und Tetrahydrobiopterin als Cofaktor, um Tyrosin in L-3,4-Dihydroxy-phenylalanin (L-DOPA) umzuwandeln. Der zweite Schritt besteht in der Decarboxy-lierung von L-DOPA, katalysiert durch das Enzym DOPA Decarboxylase (Aromatische L-Aminosäure Decarboxylase). Hierbei entsteht Dopamin (3-Hydroxytyramin / 3,4-Dihydroxyphenethylamin). Tyrosin L-DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin) Tyrosinhydroxylase O2, Tetrahydro-biopterin H2O, Dihydro-biopterin DOPA-Decarboxylase bzw. Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase CO2 Dopamin Dopamin Noradrenalin Adrenalin Dopamin-β-Hydroxylase O2, Ascorbin-säure H2O, Dehydro-ascorbinsäure Phenylethanolamin-N-Methyltransferase S-Adenosyl-methionin Homocystein
Abb. 2: Anabolismus der Catecholamine Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin
Die Synthese von Dopamin erfolgt in zwei Schritten aus der Aminosäure Tyrosin. Im ersten, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt wird Tyrosin durch das Enzym Tyrosinhydroxylase in L-DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin) umgewandelt. Durch Decarboxylierung von L-DOPA mittels DOPA-Decarboxylase (Aromatische-L-Aminosäure-DOPA-Decarboxylase) entsteht Dopamin. In noradrenergen Neuronen wird Dopamin durch Dopamin-β-Hydroxylase in Noradrenalin umgewandelt. Phenylethanol-amin-N-Methyltransferase katalysiert in adrenergen Neuronen die Synthese von Adrenalin aus Noradrenalin.
Nach der Synthese wird Dopamin durch den vesikulären Monoamintransporter 2 (VMAT2) in präsynaptische Vesikel transportiert und dort gespeichert. Durch Calcium-abhängige Exozytose wird Dopamin an den Axonterminalen aus den Vesikeln in den synaptischen Spalt freigesetzt und bindet dort an spezifische Membranrezeptoren, die Dopaminrezeptoren (Kapitel 1.4, Abb. 3). Durch den elektrogenen, Na+/Cl--abhängigen Dopamintransporter (DAT) wird das Dopamin gleichzeitig wieder in die Zelle aufgenommen. Die Dopaminkonzentration im synaptischen Spalt verringert sich, wodurch die Wirkung von Dopamin beendet wird. DATs sind in den dopaminergen Neuronen an perisynaptischen sowie nicht-synaptischen Regionen lokalisiert. An den nicht-nicht-synaptischen Regionen findet man die DATs diffus über weite Bereiche verteilt (Nirenberg et al. 1996; Hersch et al. 1997). Die perisynaptischen DATs vermitteln die Dopaminwiederaufnahme in die freisetzenden Axonterminalen. Das wieder aufgenommene Dopamin wird in den dopaminergen Neuronen entweder erneut in Vesikel transportiert oder abgebaut. In umliegende Gliazellen aufgenommenes Dopamin wird ausschließlich metabolisiert (Aktories et al., 2005). Das mitochondriale Enzym Monoaminoxidase (MAO) und das zytoplasmatische Enzym Catechol-O-Methyl-transferase (COMT) sind die zwei Hauptenzyme, die am Katabolismus von Dopamin beteiligt sind. Es gibt zwei Formen der Monoaminoxidase, MAO-A und MAO-B. Die MAO ist in der äußeren Mitochondrienmembran der meisten Zellen vorhanden. Catecholaminerge Axone besitzen nur die MAO-A zum Abbau von Dopamin, während Gliazellen beide Formen, MAO-A und MAO-B, enthalten (Aktories et al., 2005). COMT ist ebenfalls weit verbreitet, jedoch nicht in catecholaminergen Neuronen vorhanden. 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) und Homovanillinsäure stellen die Haupt-abbauprodukte von Dopamin dar (Aktories et al., 2005).
In noradrenergen bzw. adrenergen Neuronen werden aus Dopamin die Neurotransmitter Noradrenalin bzw. Adrenalin synthetisiert. Die Umwandlung von Dopamin zu Noradrenalin wird durch das Enzym Dopamin-β-Hydrolase katalysiert. In den adrenergen Neuronen erfolgt durch das Enzym Phenylethanolamin-N-Methyltransferase eine weitere Umwandlung von Noradrenalin in Adrenalin.
Die Expression des essentiellen an der Dopamin (Catecholamin-) Synthese beteiligten Enzyms Tyrosinhydroxylase (TH) kann in dopaminergen Neuronen des Mesencephalon als Marker zur eindeutigen Identifizierung verwendet werden, da sich
hier keine adrenergen und keine noradrenergen Neurone befinden. Das gilt jedoch nicht für alle dopaminergen Systeme. Im Hypothalamus, im Striatum und im Kortex wurden Zellen gefunden, die TH exprimieren, jedoch weder Dopamin noch Noradrenalin synthetisieren (Gaspar et al., 1987; Björklund und Dunnett, 2007). Weiterhin befinden sich z.B. im Hypothalamus und Bulbus olfactorius Neurone, die Dopamin synthetisieren, denen jedoch die vesikuläre Speicherung des Neuro-transmitters, aufgrund der Abwesenheit des vesikulären Monoamintransporters (VMAT2), fehlt (Ikemoto et al., 1996; Weihe et al., 2006). Die Expression von TH ist daher nicht in jedem Fall ausreichend, um sicherzustellen, dass ein Neuron catecholaminerg oder dopaminerg ist. Um Zellen als funktionale Dopamin-produzierende Neurone in anderen Regionen des Nervensystems zu identifizieren, sind daher zusätzliche Marker notwendig.
1.3.1 Somatodendritische Freisetzung von Dopamin
Neben der bekannten, Calcium-abhängigen Dopaminfreisetzung an Axonterminalen in den jeweiligen Projektionsregionen, wird der Neurotransmitter Dopamin von dopaminergen Neuronen der Substantia nigra (SN) und der Area tegmentalis ventralis (VTA) ebenfalls somatodendritisch, also vom Zellkörper und den Dendriten, freigesetzt (Bjorklund und Lindvall, 1975; Geffen et al., 1976; Abb. 3).
dopaminerges SN / VTA Neuron striatales Neuron D2 D2 D2 D1 oder DAT DAT somatodendritisch axonterminal Dopamin Vesikel
Abb. 3: Dopaminfreisetzung erfolgt somatodendritisch und axonterminal
Dopamin wird von dopaminergen SN und VTA Neuronen sowohl an den Axonterminalen, als auch somatodendritisch freigesetzt. Nach der Freisetzung bindet es an Dopaminrezeptoren (D1, D2). Über den Dopamintransporter (DAT) wird das freigesetzte Dopamin wieder in die dopaminergen Neurone aufgenommen (reuptake).
Eine mögliche Hypothese vermutet die somatodendritische Dopaminfreisetzung über Exozytose, wie sie an den Axonterminalen erfolgt. Hierfür spricht die Erkenntnis, dass die somatodendritische Dopaminfreisetzung stark Calcium-abhängig ist, was für
die exozytotische Freisetzung an den Axonterminalen charakteristisch ist (Geffen et al., 1976; Rice et al., 1997). Die Anzahl an Vesikeln, die für die exozytotische Dopaminfreisetzung erforderlich sind, ist jedoch in der SN sehr gering (Nirenberg et al., 1996). Hier stellt das glatte endoplasmatische Retikulum vermutlich den Hauptspeicherort des Dopamins dar (Mercer et al., 1979). Es gibt daher weitere Vermutungen darüber, dass die somatodendritische Freisetzung von Dopamin nicht über Exozytose von Vesikeln, sondern über einen vesikelunabhängigen Mechanismus durch die Umkehr des Dopamintransporters (DAT) erfolgt (Nirenberg et al., 1996). Ergebnisse von Cragg et al. (1997) konnten eine somatodendritische Dopaminfreisetzung über die Umkehr des DAT jedoch nicht bestätigen.
Es gibt weitere Unterschiede zwischen der somatodendritischen und axonterminalen Dopaminspeicherung und -freisetzung. Zum einen scheint in somatodendritischen Regionen weniger Dopamin gespeichert zu sein, als in den Terminalen. Des Weiteren scheint das Wiederauffüllen des Dopaminpools in der SNpc sehr langsam abzulaufen (Rice et al., 1997). Dieser Umstand könnte zumindest teilweise durch die limitierte Dopaminaufnahme in dieser Region über den DAT erklärbar sein. Untersuchungen von Rice et al. (1997) zeigten große Unterschiede im Anstieg der Dopaminkonzentration zwischen den somatodendritischen und axonterminalen Regionen nach Stimulation der Dopaminfreisetzung. Der Anstieg der Dopamin-konzentration war fünf Mal geringer in der SNpc (ca. 0,5 µM) als im dorsalen Striatum (ca. 2,5 µM) bei identischen Stimulationsparametern. Das bedeutet, dass somatodendritisch weniger Dopamin freigesetzt wird, als an den Axonterminalen. Das in der SN freigesetzte Dopamin ist auf extrazelluläre Diffusion (volume
transmission) angewiesen, um zu den entsprechenden Rezeptoren zu gelangen.
Weiterhin konnten Cragg et al. (1997) zeigen, dass die Wiederaufnahme von somatodendritisch freigesetztem Dopamin durch den DAT weniger wirksam ist, als an den Axonterminalen.
1.4 Die Dopaminrezeptoren
Die neuronalen Effekte von Dopamin werden über seine Bindung an prä- und postsynaptisch lokalisierte spezifische Membranrezeptoren, die Dopaminrezeptoren (DRs), vermittelt. Die Dopaminrezeptoren gehören zur Familie der sieben Transmembrandomänen- (TMD) G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Man unterscheidet fünf verschiedene DRs, DR-D1 bis DR-D5. Aufgrund ihrer Kopplung an
G-Proteine (Kapitel 1.4.4), ihrer Verteilung im zentralen Nervensystem und ihrer pharmakologischen Eigenschaften werden sie in zwei Unterfamilien eingeteilt, die D1-ähnlichen (DR-D1 und DR-D5) und die D2-ähnlichen (DR-D2, DR-D3 und DR-D4) Dopaminrezeptoren (Kebabian und Calne, 1979; Missale et al., 1998). Das aminoterminale Ende (NH2) besitzt in allen Rezeptorsubtypen eine ähnliche Anzahl
von Aminosäuren, die eine variable Anzahl an N-Glycosilierungsregionen tragen. Das carboxyterminale Ende (COOH) der DRs enthält Phosphorylierungsbereiche (Serin- und Threoninreste), welche vermutlich an der agonistenabhängigen Rezeptor-desensitisierung beteiligt sind. Die Region der dritten intrazellulären Schleife der Dopaminrezeptoren spielt eine Schlüsselrolle in der G-Protein Interaktion (Aktories et al., 2005).
Die D1-ähnlichen Dopaminrezeptoren, DR-D1 und DR-D5, sind an stimulierende G-Proteine (Gs) gekoppelt. Diese aktivieren die Adenylatzyklase. Die putative Struktur
der D1-ähnlichen DRs zeigt kurze intrazelluläre Schleifen und lange C-terminale Enden (Abb. 4A). Pharmakologische Studien zeigten, dass die D1-ähnlichen DRs an der Vermittlung von Verhaltensantworten beteiligt sind, die Aktivität von D2-Dopamin-rezeptoren modulieren und neuronales Wachstum und Differenzierung regulieren (Missale et al., 1998). Der DR-D5 besitzt eine etwa 10 Mal größere Bindungsaffinität für Dopamin, als der DR-D1 (Missale et al., 1998). Spezifische Agonisten und Antagonisten der D1-ähnlichen DRs besitzen meist vergleichbare Affinitäten zu beiden Rezeptoren und können diese daher nicht diskriminieren.
Extrazellularraum Intrazellularraum Membran NH2 COOH I II III IV V VI VII NH2 COOH A D1-ähnliche B Dopaminrezeptoren D2-ähnliche Dopaminrezeptoren Gs Gi/o I II III IV V VI VII
Abb. 4: Struktur der Dopaminrezeptoren
Die Dopaminrezeptoren gehören zur Klasse der sieben Transmembrandomänen (I bis VII), G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Sie werden in zwei Unterfamilien unterteilt, (A) die D1-ähnlichen (DR-D1 und DR-D5) und (B) die D2-ähnlichen (DR-D2, DR-D3 und DR-D4) Dopaminrezeptoren. Die D1-ähnlichen DRs sind an stimulierende G-Proteine (Gs) gekoppelt, besitzen kurze intrazelluläre Schleifen und
lange C-terminale Enden. Die D2-ähnlichen DRs koppeln an inhibitorische G-Proteine (Gi/o). Sie
besitzen kurze C-terminale Enden und eine lange dritte intrazelluläre Schleife. Die dritte intrazelluläre Schleife ist an der G-Protein-Kopplung beteiligt. (nach Gingrich und Caron, 1993)
Die D2-ähnlichen DRs sind an inhibitorische G-Proteine (Gi/o) gekoppelt, welche die
Adenylatzyklase inhibieren und unter anderem Ionenkanäle direkt aktivieren können. Die Mitglieder der Familie der D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren besitzen sehr ähnliche strukturelle und funktionelle Eigenschaften. Ihre Struktur zeigt kurze Enden am C-Terminus und eine lange dritte intrazelluläre Schleife (Tan et al., 2003; Abb. 4B). Ähnlich dem DR-D2 (Kapitel 1.4.1) besitzt der DR-D3 zwei Isoformen, die durch alternatives Spleißen entstehen. Für das Gen des DR-D4 wurden polymorphe Variationen in der kodierenden Sequenz identifiziert (Barr et al., 1993; Seaman et al., 1999; Okuyama et al., 1999). Es wurde eine 48-Basenpaarsequenz beschrieben, die bis zu sieben Mal in der dritten intrazellulären Schleife des DR-D4 wiederholt wird (Van Tol et al., 1991). Im Gegensatz zur genomischen Struktur der D2-ähnlichen Rezeptoren, die durch Introns unterbrochen ist, besitzen die Gene der D1-ähnlichen Rezeptoren (DR-D1 und DR-D5) keine Introns in ihren kodierenden Bereichen, ähnlich anderen GPCRs (Dohlman et al., 1987).
Untersuchungen mit verschiedenen Dopaminrezeptoragonisten und -antagonisten zeigten in Tiermodellen eine bedeutende Rolle der Dopaminrezeptoren in Motor-funktionen wie z.B. der Vorwärtsbewegungen, im Aufzuchtverhalten und bei Katalepsie (Starrheit) (Baik et al., 1995; Kelly et al., 1997; Jung et al., 1999b). Studien an mutanten Mäusen, in denen eines der Dopaminrezeptorgene ausgeschaltet wurde, trugen stark zur Aufklärung der Funktionen der DRs bei. Untersuchungen an mutanten DR-D2 knockout Mäusen (DR-D2-/-), bei denen das DR-D2-Gen ausgeschaltet ist, zeigten deutliche motorische Beeinträchtigungen (Baik et al., 1995). Diese waren charakterisiert durch verringerte und unkoordinierte Bewegungen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der DR-D2 für Kognition und endokrine Funktionen von großer Bedeutung ist (Saiardi et al., 1997; Goldman-Rakic, 1999). Mutante DR-D3 und DR-D4 knockout Mäuse zeigten ebenfalls einen untypischen Bewegungsphänotyp (Tan et al., 2003). DR-D3 Mutanten besaßen einen hyperaktiven Phänotyp (Accili et al., 1996; Xu et al., 1997; Jung et al., 1999a), während DR-D4 Mutanten eine reduzierte Bewegung aufwiesen (Rubinstein et al., 1997).
1.4.1 Der D2-Dopaminrezeptor: Struktur und Funktionen
Der D2-Dopaminrezeptor zählt zur Gruppe der D2-ähnlichen DRs. Alternatives Spleißen des sechsten Exons, welches eine 29 Aminosäure-Insertion in der dritten
intrazellulären Schleife des Rezeptors kodiert, führt zur Bildung von zwei Isoformen aus dem DR-D2-Gen (Abb. 5), einer kurzen D2s; short) und einer langen (DR-D2l; long) Isoform (Giros et al., 1989).
Extrazellularraum Intrazellularraum Membran NH2 COOH 444 A B I II III IV V VI VII I II III IV V VI VII NH2 COOH 415 DR-D2s DR-D2l 29 Aminosäure Insertion
Abb. 5: Schematische Darstellung der beiden Isoformen des D2-Dopaminrezeptors
Zwei verschiedene DR-D2 Isoformen sind beschrieben, eine kurze (DR-D2s) und eine lange (DR-D2l). Die lange Isoform DR-D2l besitzt eine 29 Aminosäure-Insertion in der dritten intrazellulären Schleife, verglichen mit der kurzen DR-D2s Isoform. Die DR-D2l spezifische Aminosäure-Insertion ist grün markiert. (nach Vallone et al., 2000)
Generell ist die lange Isoform DR-D2l im zentralen Nervensystem der Maus stärker exprimiert, verglichen mit der kurzen Isoform DR-D2s, mit Ausnahme des Stammhirns, in dem die Isoform DR-D2s dominant exprimiert wird (Montmayeur et al, 1991). DR-D2s ist in dopaminergen Neuronen des Hypothalamus, der Substantia nigra und des Kortex im Gehirn von Primaten stärker exprimiert, als die lange Isoform DR-D2l (Emilien et al., 1999). Die Expression der Isoformen ist gewebespezifisch und deutet somit auf eine mögliche funktionelle Spezifität hin. Da die 29 Aminosäure-Insertion in der dritten zytoplasmatischen Schleife des DR-D2l lokalisiert ist, die auch an der G-Protein Interaktion beteiligt ist, besteht die Möglichkeit, dass beide Isoformen auf unterschiedliche Weise an G-Proteine binden und somit verschiedene intrazelluläre Signale vermitteln könnten. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die beiden DR-D2-Isoformen eine unterschiedliche Bindung an G-Proteine aufweisen (Montmayeur et al., 1993; Guiramand et al., 1995). So verleiht die 29 Aminosäure-Insertion des DR-D2l dieser Isoform eine größere Affinität für die Bindung an das inhibitorische G-Protein Gαi2 im Vergleich zur Isoform D2s. Die Kopplung des
DR-D2l an Gαi2 führt zur verstärkten Inhibition der Adenylatzyklase (Montmayeur et al.,
1993). Die Insertion, die in der Isoform DR-D2l vorhanden ist, spielt also eine kritische Rolle in der Selektivität der G-Protein Interaktion mit dem Rezeptor
(Guiramand et al. 1995). Weiterhin konnten O`Hara et al. (1996) zeigen, dass der DR-D2l mit verschiedenen G-Proteinen interagieren kann, um die Adenylatzyklase und den cAMP-Spiegel zu modulieren.
D2-Dopaminrezeptoren stellen das Hauptziel vieler antipsychotischer Arzneimittel (sogenannter Neuroleptika, wie z.B. Haloperidol) dar, die bei neurologischen Erkrankungen, wie z.B. Schizophrenie, eingesetzt werden (Tan et al., 2003). Mercuri et al. (1997) konnten zeigen, dass die D2-Dopaminrezeptoren als hauptsächliche somatodendritische Autorezeptoren in den dopaminergen Neuronen der Substantia nigra (SN) und der Area tegmentalis ventralis (VTA) eine wesentliche Rolle spielen. Durch die Generierung von mutanten Mäusen, in denen selektiv die lange Isoform des DR-D2-Genes ausgeschaltet wurde (DR-D2l-/-) und nur noch die kurze Isoform gebildet werden konnte, war es möglich, die separaten Funktionen beider Isoformen zu untersuchen (Usiello et al., 2000; Wang et al., 20001). Die DR-D2l-/- Mäuse zeigen verschiedene verhaltensbiologische Besonderheiten. Einige Veränderungen ähneln den phänotypischen Merkmalen, die in der generellen DR-D2-/- Maus auftraten, wie Hypoaktivität und reduzierte Empfindlichkeit auf die Gabe von D2-ähnlichen Rezeptorliganden (Baik et al., 1995). Es gibt jedoch klare phänotypische Unterschiede zwischen beiden mutanten Mäusen. So bleibt zum Beispiel die Autorezeptor-vermittelte Inhibition der Dopaminsynthese und -freisetzung auf D2-ähnliche Rezeptoragonisten in der DR-D2l-/- Maus intakt. Die kataleptischen Effekte, die bei hohen Dosen des D2-Antagonisten Haloperidol unter Kontrollbedingungen auftraten, fehlten hingegen in der DR-D2l-/- Maus. Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, dass die kurze Isoform DR-D2s die Autorezeptorkontrolle der Dopamin-freisetzung vermittelt, während die lange Isoform DR-D2l den Hauptangriffspunkt für Haloperidol darstellt (Usiello et al., 2000). Lindgren et al. (2003) zeigten, ebenfalls unter Verwendung beider mutanten Mäuse (DR-D2-/- und DR-D2l-/-), dass die kurze Isoform DR-D2s in den nigrostriatalen Nervenendigungen an der Regulation der Tyrosinhydroxylase beteiligt ist2, während die lange Isoform DR-D2l in striatalen
medium spiny Neuronen an der Regulation des Dopamin- und cAMP-regulierten
Phosphoproteins mit einer Masse von 32 kDa (DARPP-32, selektiv im Striatum
1 In DR-D2 Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der D2-Dopaminrezeptoren im
Striatum von Wildtypmäusen und mutierten DR-D2l-/- Mäusen nicht unterschiedlich ist, was vermutlich auf eine erhöhte DR-D2s Bindung zurückzuführen ist.
2
Aktivierung der D2-Autorezeptoren an den Axonterminalen hemmt die Dopaminsynthese und -freisetzung (Starke et al., 1989).
exprimiert) mitwirkt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wiesen darauf hin, dass DR-D2s der präsynaptischen Autorezeptorfunktion dient, während DR-D2l haupt-sächlich postsynaptisch tätig ist.
1.4.2 Rezeptordesensitisierung
Die starke Aktivierung eines Rezeptors führt zu einer reduzierten Fähigkeit zukünftiger Stimulation (Desensitisierung), während eine geringe Aktivierung einen Anstieg der Fähigkeit der Stimulation zur Folge hat (Sensitisierung). Der Prozess der Rezeptordesensitisierung moduliert die Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Rezeptordesensitisierung ist durch eine Reduktion in der Rezeptor-vermittelten Antwort nach seiner Aktivierung durch Agonisten oder natürliche Liganden charakterisiert. Sie repräsentiert einen kritischen Adaptationsmechanismus, der gegen eine Rezeptorüberstimulation schützt. Untersuchungen zeigten, dass die Desensitisierung eine grundlegende Eigenschaft aller GPCRs zu sein scheint (Leaney et al., 2004). Die Desensitisierung aktivierter GPCRs erfolgt durch Phosphorylierung an Serin- und Threoninresten der intrazellulären Domänen des Rezeptors (Ferguson, 2001; Nestler und Aghajanian, 1997; Abb. 6). GRK β-Arr P P P P P P β-Arr P P P β-Arr Internalisierung Clathrin 1. 2. 3. 5. Extrazellularraum Intrazellularraum Membran Wiederverwendung „Resensitisierung“ Dopamin Abbau 4. Gi/o Abb. 6: Rezeptordesensitisierung
Die Bindung von Dopamin führt zur Aktivierung des Rezeptors (1.). Eine verlängerte Aktivierung des Rezeptors führt zur Phosphorylierung durch GRKs (2.) und anschließende Bindung von β–Arrestin (3.), was die Entkopplung des Rezeptors von der G-Proteininteraktion zur Folge hat. β–Arrestin bindet an Clathrin-Adaptorproteine als auch an Clathrin selbst (4.). Dadurch wird die Initiation der Internalisierung des desensitisierten Rezeptors erleichtert (5.). Der internalisierte Rezeptor kann entweder wieder in die Membran eingebaut werden, oder er wird zum Abbau markiert (Goodmann et al., 1996; Laporte et al., 1999). Gi/o, inhibitorisches G-Protein; GRK, G-Protein gekoppelte
Die Rezeptorphosphorylierung wird hierbei vorwiegend durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) durchgeführt. Sie dient der Entkopplung des Rezeptors von der G-Proteinaktivierung, begünstigt die β-Arrestinbindung und damit die Internalisierung der inaktiven Rezeptoren (Krupnick und Benovic, 1998). Studien konnten zeigen, dass neben den GRKs auch die second messenger-abhängigen Proteinkinasen A und C (PKA und PKC) zur Phosphorylierung und somit zur Desensitisierung aktivierter Dopaminrezeptoren beitragen. Nach der Internalisierung wird der Rezeptor entweder wieder verwendet (recycelt, d.h. er wird erneut in die Membran eingebaut; Resensitisierung), oder er wird in den Lysosomen abgebaut. Ein Molekül, welches die D2-Dopaminrezeptoren zum Abbau in Lysosomen markiert, konnte von Bartlett et al. (2005) identifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das G-Protein-gekoppelte Rezeptor-assoziierte Sortierungsprotein (GASP; G protein
coupled receptor-associated sorting protein). Eine Folge der DR-D2 –
GASP-Interaktion ist die fehlende Resensitisierung der DR-D2-vermittelten Antwort. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Modulation der DR-D2 – GASP-Interaktion eine wichtige Rolle in der Reduktion des D2-Dopaminrezeptors darstellt. Es wurde nachgewiesen, dass die Internalisierung aktivierter D2-Dopaminrezeptoren durch die Subtypen GRK2 und GRK5 erhöht wird (Ito et al., 1999, Iwata et al., 1999). In situ Hybridisierungsstudien zeigten, dass GRK2-mRNA unter anderem in der SNpc und der VTA vorhanden ist. Weiterhin scheint GRK6-mRNA in dopaminergen Neuronen der SN exprimiert zu sein (Erdtmann-Vourliotis et al., 2001).
Kabbani et al. (2002) fanden einen weiteren Regulationsmechanismus der Rezeptordesensitisierung. Sie konnten nachweisen, dass der neuronale Calciumsensor-1 (NCS-1) die GRK-vermittelte Desensitisierung des aktivierten D2-Dopaminrezeptors modulieren kann. Hierfür verringert NCS-1 die Agonisten-induzierte Rezeptorinternalisierung über einen Mechanismus, der eine Reduktion der D2-Dopaminrezeptorphosphorylierung involviert. Dieser Effekt ist begleitet von einem Anstieg der DR-D2-vermittelten cAMP-Inhibition nach Dopaminstimulation. Es wurde daher vermutet, dass die Mechanismen, die der Rezeptordesensitisierung unterliegen, durch die Aktivierung von Proteinen moduliert werden, die sowohl mit dem Rezeptor als auch mit den Kinasen interagieren können.
