UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF
Institut für Pathologie
Prof. Dr. med. Guido Sauter
Intratumorale Heterogenität der EGFR Genvermehrung
im nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
vorgelegt von: Tobias Hoenig
aus Hamburg
Angenommen von der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 27.05.2015
Veröffentlicht mit Genehmigung der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. Guido Sauter
Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr. Heinz-Eckard Laack
Danksagung
Zunächst möchte ich mich herzlich bei Prof. Dr. med. Guido Sauter bedanken, der mir das Thema dieser Doktorarbeit in seinem Institut für Pathologie angeboten hat. Dr. Dr. Tobias Grob gilt mein besonderer Dank für seine engagierte Zusammenarbeit mit mir. Dank seiner tatkräftigen Unterstützung war die Publikation unseres Papers im Journal „Lung Cancer“ erst möglich.
Frau Christina Koop danke ich für ihre stetige Betreuung im Labor und ihre große Hilfe beim Erstellen eines Tissue Microarrays.
Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir zu jeder Zeit Rückhalt und Zuversicht gegeben haben.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...5
1.1 Tyrosinkinaserezeptoren (TKR)...5
1.1.1 Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor (EGFR)...6
1.2 Molekular zielgerichtete Therapie...7
1.2.1 Monoklonale Antikörper...7
1.2.2 Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)...7
1.2.3 EGFR- Aberrationen als prädiktiver Marker...8
1.3 Heterogenität von Tumoren...9
1.4 Ziel der Doktorarbeit...9
2 Material und Methoden...10
2.1 Erstellen eines Tissue Microarrays (TMA)...10
2.2 Zusammenstellen des Gewebekollektivs... 11
2.3 EGFR Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)... 11
2.4 EGFR Immunhistochemie (IHC)...12
2.5 EGFR Sequenzierung ...12
3 Ergebnisse...13
3.1 EGFR FISH ...13
3.1.1 Lymphknotenmetastasen...14
3.2 EGFR Immunhistochemie ...15
3.3 EGFR Mutationsanalyse amplifizierter Tumore...15
4 Diskussion...16
4.1 Molekulare Diagnostik bei Heterogenität...16
4.2 EGFR Aberrationen... 16
4.3 Hohe Polysomie...16
4.5 EGFR Amplifikationen...17
4.6 Vergleich Primärtumor vs Metastase ...18
4.7 Prädiktiver Wert... 19 4.8 EGFR Mutationen... 19 5 Fazit...21 6 Literaturverzeichnis...22 7. Paper...28 8. Lebenslauf...36 9. Eidesstattliche Versicherung ...38
1 Einleitung
Das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (NSCLC) ist ein maligner epithelialer Tumor der Lunge. Es ist eines der weltweit am häufigsten zum Tode führenden Karzinome bei Männern und Frauen (61).
Je nach Tumorstadium unterscheidet sich das therapeutische Vorgehen. Während nicht disseminierte NSCLC in frühem Stadium primär kurativ reseziert werden, wird bei fortgeschrittenem Tumorstadium oder Inoperabilität eine Chemo- und/oder Radiotherapie durchgeführt (62).
Ein weiterer, seit einigen Jahren etablierter Behandlungsansatz ist eine molekular gezielte Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren gegen den Epidermal-Growth-Factor-Receptor (EGFR). Diese Therapien werden abhängig von molekularen Analysen von EGFR-Aberrationen in einer (in der Regel durch eine Biopsie gewonnenen) Tumorgewebeprobe eingeleitet (s. Abschnitt 1.2).
Studien über prädiktive Marker für das Ansprechen dieser molekular zielgerichteten Therapien ergaben unterschiedliche Ergebnisse (s. Abschnitt 1.2.3). Dies könnte durch eine Heterogenität von EGFR-Aberrationen in einem Tumor begründet sein (s. Abschnitt 1.3).
Die folgenden Abschnitte beschreiben die Grundlagen des Epidermal-Growth-Factor-Receptor und dessen molekular zielgerichteter Therapie bei nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen und liefern damit die Basis zur Zieldefinition dieser Arbeit (s. Abschnitt 1.4).
1.1 Tyrosinkinaserezeptoren (TKR)
Wachstum, Morphogenese und Stoffwechselprozesse einer Körperzelle werden maßgeblich von Wachstumsfaktoren/-hormonen beeinflusst, welche an spezifische Rezeptoren binden, diese aktivieren und damit eine intrazelluläre Signalkaskade initiieren. Viele dieser Prozesse werden durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen reguliert, wobei die Phosphatgruppen meist auf die Aminosäuren Serin und Threonin aber auch auf Tyrosin übertragen werden (43). Eine wichtige Familie von membranständigen Wachstumshormonrezeptoren, welche die Phosphorylierung von Tyrosin katalysieren, sind die sogenannten Tyrosinkinaserezeptoren, zu denen u.a. die Insulin-, PDGF-, VEGF- und
ErbB-Mit der Aktivierung der Tyrosinkinase durch Phosphorylierung der Tyrosinreste werden weitere Adapterproteine aktiviert. Hierdurch werden verschiedene Signalkaskaden, wie z.B. der RAS/RAF-MAP-Kinase-Pathway oder der PI3K/AKT-Pathway aktiviert, die das Zellwachstum stimulieren und den apoptotischen Zelltod hemmen (41, 42, 44).
Mutationen im Gen von Tyrosinkinaserezeptoren können onkogene Wirkungen haben, indem sie über verschiedene Mechanismen eine konstitutive Aktivierung der Rezeptorkinasen bewirken und so zu einem unkontrollierten Wachstum und maligner Entartung der Zelle führen.
1.1.1 Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor (EGFR)
Auf der Basis struktureller Homologien lassen sich die Rezeptor-Tyrosinkinasen in verschiedene Familien einteilen. Eine von ihnen ist die ErbB- oder auch HER-(Human Epidermal Growth Factor Receptor) Familie, zu der insgesamt vier Rezeptoren gezählt werden: HER1/EGFR (ErbB1), HER2/c-neu (ErbB2), HER3 (ErbB3) und HER4 (ErbB4). Diese 170-200 kDa großen Glykoproteine haben trotz großer Gemeinsamkeiten alle eine unterschiedliche, spezifische Funktion (41, 42). Der EGF-Rezeptor kann parakrin, juxtakrin und autokrin durch verschiedene Liganden (EGF, TGF-α, Amphiregulin, Betacellulin und Epiregulin) aktiviert werden und mehrere, für das Zellwachstum essentielle, Signalkaskaden einleiten. Zu diesen gehören vor allem der bereits genannte RAS/RAF-MAP-Kinase-Pathway sowie der PI3K/AKT-Pathway. Des Weiteren findet eine Aktivierung der Proteine STAT3/5 und Proteinkinase C statt, welche ebenfalls eine proliferative Wirkung besitzen.
In vielen soliden Tumoren konnte eine verstärkte EGFR-Expression (u.a. aufgrund einer Amplifikation des auf Chromosom 7p12 kodierten EGFR-Gens) nachgewiesen werden (51, 52). EGFR-Überexpression wurde bei vielen Tumorentitäten mit fortgeschrittener Krankheit, aggressiveren Phenotyp und generell schlechter Prognose in Verbindung gebracht (1). Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass von diesen Tumoren häufig auch ein oder mehrere EGFR-Liganden produziert werden, wodurch es zu einer autokrinen Überstimulation kommt (44).
Die proliferativen Eigenschaften und das damit verbundene onkogene Potential des EGF-Rezeptors machen diesen zu einem stark beforschten Therapieziel in der Krebsbekämpfung.
1.2 Molekular zielgerichtete Therapie
Die zytostatische Wirksamkeit klassischer Chemotherapeutika und die damit verbundene mittlere Überlebenszeit/-rate ist bei fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen relativ gering, die systemischen Nebenwirkungen sind aber teilweise erheblich (53, 54). Daher ist es von großem Interesse, neue Medikamente zu entwickeln, die einen spezifischen Prozess der Signaltransduktion, der in den Tumorzellen verändert ist, hemmen und so molekular gezielt und nebenwirkungsarm wirken.
1.2.1 Monoklonale Antikörper
Ein möglicher Therapieansatz ist die Gabe von monoklonalen Antikörpern, die an Oberflächenmoleküle binden, die von den Tumorzellen vermehrt exprimiert werden. Die Bindung dieses Antikörpers an einen Rezeptor kann die Ligandenbindung und damit die Initiierung der Signaltransduktion verhindern, oder sie führt zur Zelllyse durch Aktivierung zytotoxischer Zellen des Immunsystems.
Ein klinisch etabliertes Beispiel bei Mamma- und Magenkarzinomen ist Trastuzumab, ein monoklonaler Antikörper gegen den HER2/Neu Rezeptor, der von ca 15-20% aller Mammakarzinome auf Grund einer HER2-Gen-Amplifikation vermehrt exprimiert wird. Bei Patienten mit HER2/Neu positiven Tumoren konnte unter der Behandlung mit Trastuzumab eine Überlebenszeitverlängerung, sowie eine Verringerung des Rezidivrisikos festgestellt werden (55).
Ein weiteres Beispiel ist Bevacizumab, ein Antikörper, der gegen den vaskulären epithelialen Wachstumsfaktor (VEGF) gerichtet ist und somit die Angioneogenese von Tumoren hemmt. Dieser Antikörper wird besonders für die Behandlung von fortgeschrittenen kolorektalen Karzinomen eingesetzt.
Weitere Präparate, welche für die Behandlung von Kolonkarzinomen Verwendung finden sind Cetuximab und Panitumumab. Sie sind gegen den EGF-Rezeptor gerichtete Antikörper.
1.2.2 Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)
Neben den extrazellulär wirkenden Antikörpern gibt es auch Medikamente, die intrazellulär Moleküle inhibieren, die für die Signaltransduktion und Zellproliferation
entstehenden BCR-ABL Fusionsproteins, welches für die Entstehung der chronisch-myeloischen Leukämie verantwortlich ist und führt bei fast allen Patienten zu einer hämatologischen und in ca. 85% der Fälle zu einer molekulargenetischen Remission (60).
Auch in der Behandlung des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms sind Inhibitoren der EGF-Rezeptor-Tyrosinkinasen wie Erlotinib und Gefitinib als molekular zielgerichtete Therapie bereits etabliert. Der Einsatz dieser Pharmaka ist allerdings nur in einigen Fällen indiziert (s. Abschnitt 1.2.3). In den meisten Fällen konnten keine oder nur sehr geringe Überlebensvorteile gegenüber der Chemotherapie beobachtet werden (56).
1.2.3 EGFR- Aberrationenals prädiktiver Marker
EGFR-Mutationen, EGFR-Genkopienanzahl und EGFR-Proteinexpression in NSCLC wurden in klinischen Studien als prädiktive Marker für das Ansprechen auf molekular zielgerichtete Therapien untersucht (2, 9, 13, 35, 58). Hierbei traten EGFR-Mutationen stets als stark prädiktive Marker für ein Ansprechen auf eine Therapie mit TKI, nicht jedoch mit Cetuximab hervor.
Es konnte gezeigt werden, dass in den Tumoren von Patienten, die besonders gut auf die Therapie ansprechen, eine Mutation des EGFR-Gens im Bereich der katalytischen Domäne vorhanden ist (Exon 18 - 21), was zu einer Etablierung der TKI-Erstlinientherapie bei Patienten mit EGFR-Mutationen führte (5-7, 45, 46).
Verschiedene Studien zur Untersuchung der EGFR-Genkopienanzahl als prädiktiver Marker für ein Ansprechen auf TKI und Cetuximab ergaben sehr unterschiedliche Resultate (8, 9, 13-18). Es wurde vorgeschlagen, dass durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ermittelte EGFR-Genkopieerhöhungen als prädiktiver Marker für eine TKI Therapie nicht nur auf EGFR-Genamplifikationen beschränkt sind, sondern auch auf hohe Polysomien von Chromosom 7 (≥40% der Tumorzellen mit mindestens vier Kopien) (10, 13-16, 49).
Die EGFR-Proteinexpression erwies sich in einigen Studien als unbrauchbarer prädiktiver Maker für TKI-Therapien (2, 3), jedoch wurde sie nach Ergebnissen der FLEX Studie als prädiktiver Marker für eine Cetuximab-Therapie vorgeschlagen (4). Eine Validierung dieser Resultate steht jedoch noch aus.
1.3 Heterogenität von Tumoren
Zellpopulationen ein und desselben Tumors können verschiedene Merkmale bzw. Mutationen tragen. Ursache dafür scheint ein Selektionsvorgang während des Tumorwachstums zu sein, der es ermöglicht, weitere Mutationen und chromosomale Aberrationen in den ohnehin schon unkontrolliert wachsenden Tumorzellen entstehen zu lassen. So kann es sein, dass zwei Biopsien aus demselben Karzinom verschiedene Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen, Mutations-oder FISH-Analysen haben (27, 34, 35, 47, 48).
1.4 Ziel der Doktorarbeit
Trotz beachtlicher Bemühungen hat sich kein klares Bild vom prädiktiven Wert der EGFR-Genkopienanzahl für eine Therapie mit TKI oder Antikörpern ergeben. Eine intratumorale genetische Heterogenität könnte eine mögliche Ursache für die unterschiedlichen Resultate sein. Solche Tumorheterogenitäten können besonders bei Bronchialkarzinomen von großer Bedeutung sein, da die Diagnose üblicher Weise anhand einer kleinen Biopsie (oder sogar weniger Zellen in Fällen von Zytologieproben) gestellt wird. Beim Vorliegen heterogener Tumore bestünde die Gefahr der Fehldiagnose und Fehlbehandlung. Bei entsprechender Heterogenität könnte der Großteil eines vermeintlich „EGFR-negativen“ Tumors durchaus mit TKIs wirksam in seiner Progression gehemmt werden. Auf der anderen Seite hätte ein vermeintlich „EGFR-positiver“ Befund bei Heterogenität zur Folge, dass nur ein Teil der Karzinomzellen durch diese Therapie gehemmt werden und der Rest nicht zur Remission gebracht werden kann.
Ziel dieser Doktorarbeit ist es, das Ausmaß von intratumoraler Heterogenität der EGFR-Genkopienanzahl und EGFR-Proteinexpression in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinome, mittels immunhistochemischer Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Tissue Micro Arrays, zu untersuchen.
2 Material und Methoden
2.1 Erstellen eines Tissue Microarrays (TMA)
Der Tissue Microarray (TMA) stellt eine seit mehreren Jahren etablierte Methode dar, mit Hilfe derer man eine große Anzahl von Geweben schnell und kostengünstig untersuchen kann. Hierzu werden aus den zu untersuchenden, in Paraffin eingebetteten Tumorgeweben (FFPE) Stanzen entnommen und diese anschließend in einen neuen Empfänger-Paraffinblock gebettet (Abb. 1). Auf diese Weise ist es möglich, mehrere hundert verschiedene Tumorgewebe auf einem solchen Empfängerblock zu sammeln und anschließend das gesamte Kollektiv auf einem Schnitt mit einer Färbung auf DNA-, RNA- und Proteinebene zu untersuchen (11).
Abbildung1: Schematische Darstellung der TMA-Herstellung a) Kopf des Arrayers mit Bohrer und
Hohlnadel, HE-Schnitt als Schablone und Tumorparaffinblock; b) Hohlnadel mit Tumorgewebe, Array; c) und d) Übertragung eines TMA-Schnittes auf einen Objektträger (Sauter et al. 2003)
2.2 Zusammenstellen des Gewebekollektivs
Um die Heterogenität von Biomarkerabweichungen in NSCLC zu analysieren, wurden in der Datenbank des Instituts für Pathologie der Universität Hamburg-Eppendorf 373 Patienten auf ausreichend verfügbares Tumorgewebe untersucht. In 144 Fällen waren mindestens vier in Paraffinblöcken eingebettetes, formalinfixiertes Tumorgewebe in den Archiven des Instituts gelagert. Von diesen Tumoren wurden jeweils acht verschiedene Gewebestanzen für die TMA-Konstruktion entnommen. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Stanzen von Arealen entnommen wurden, die weitest möglich von einander entfernt lagen (nach Möglichkeit von verschiedenen Blöcken; für genauere Angaben siehe Publikation). Außerdem wurden bis zu vier verschiedene Lymphknotenmetastasen von 62 (von den 144) Patienten mit positivem Lymphknotenbefall untersucht. Es wurde eine Stanze pro Metastase entnommen. Alle originalen Schnitte des für den TMA benutzen Gewebes wurden erneut gemäß den WHO 2004 Kriterien auf ihren histologischen Typ und ihr histologisches Grading untersucht (12).
2.3 EGFR Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Die TMA-Schnitte wurden mittels eines kommerziellen Kits proteolytisch vorbehandelt (Paraffin pre-treatment reagent kit, Abbott). Das Vysis LSI EGFR Spectrum Orange/CEP7 Spectrum Green Probe Kit (Abbott) wurde nach Herstelleranweisungen für die Detektion von EGFR-Genen benutzt. Das Vorhandensein von Tumorzellen wurde in jeder Tumorprobe durch Vergleich mit einem Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Referenz-TMA-Schnitt verifiziert. Auf jedem Spot wurden 20 Tumorzellen nach vorgeschlagenen Richtlinien zur Evaluation der EGFR-Genkopienanzahl ausgewertet (19).
FISH-Kriterien für die Wertung „EGFR positiv“:
1.) ≥40% der Tumorzellen weisen ≥4 EGFR Gensignale auf
2.) Tumorproben mit einer EGFR-Genamplifikation entsprechend folgender Kriterien: a) Das EGFR zu CEP7 Verhältnis aller Zellen ist >2 (bei ≥2 CEP7 Kopien pro Zelle) b) Gen-Cluster (≥4 EGFR Gensignale mit Clusterverteilung) in ≥10% der Zellen c) ≥15 EGFR Gensignale in ≥10% der Tumorzellen
2.4 EGFR Immunhistochemie (IHC)
Für die immunhistochemische Färbung der TMA-Schnitte wurde das EGFR pharmDx IHC-Kitsystem (Dako) nach Anweisung des Herstellers angewandt. Im Anschluss an die Inkubation mit dem primären monoklonalen Antikörper, Klon 2-18C9, gegen humanes EGFR-Protein verwendet dieses Kit ein gebrauchsfertiges Visualisierungsreagenz auf der Basis der Dextrantechnologie.
Auswertung:
Die Auswertung wurde von einem geschulten Pathologen mithilfe eines Lichtmikroskops durchgeführt. Dabei wurde die Intensität der Membranfärbung auf den einzelnen Gewebespots (in Analogie zum Scoringsystem von HER2 in Brust-und Magenkrebs (20)) in eine vierstufige Skala unterteilt (0, 1+, 2+, 3+).
2.5 EGFR Sequenzierung
Alle EGFR-amplifizierten Fälle wurden zusätzlich sequenziert, um etwaige Mutationen in der EGFR-Tyrosinkinasedomäne (Exons 18-21) festzustellen. Nachdem per Makrodissektion oder Laser-Capture Mikrodissektion (PALM Micro Beam Laser System, Zeiss Microlmaging) ein Tumorzellgehalt von mindestens 70% gewährleistet war, wurde die Tumor DNA vom FFPE Gewebe nach Standardprotokoll extrahiert (QiAmp DNA Mini Kit, Qiagen). Quantität und Qualität der DNA wurde mittels Nanodrop Spektrophotometer ND-1000 (Thermo-Scientific) evaluiert. 50 ng der DNA wurden in der PCR Reaktion eingesetzt, wobei der AmpliTaq Gold PCR Mastermix (Applied Biosystem) unter den empfohlenen Bedingungen des Herstellers verwendet wurde. DNA-Fragmente der Exons 18-21 wurden mittels spezifischer Primer amplifiziert. Nach Verifizierung per QlAxcel System (Qiagen) wurden die PCR Produkte mit einem enzymatischen Verfahren gereinigt (ExoSAP-IT; USB Products) und eine Sequenzierreaktion mit einem BidDye Terminater Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Sequenzierprodukte wurden mit einem ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) analysiert.
3 Ergebnisse
3.1 EGFR FISH
Die EGFR-Genkopienanzahl war mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in insgesamt 1055 Spots (durchschnittlich 7,3 Spots pro Tumor) der TMAs interpretierbar. In den 261 anderen Spots war die Analyse entweder aufgrund mangelnder Qualität der Hybridisierung, unzureichender Anzahl der analysierbaren Tumorzellen, oder komplett fehlender Tumorgewebeprobe auf dem TMA-Schnittpräparat nicht möglich.
In 37 (25,7%) Tumoren wurde eine hohe Polysomie (40% der Tumorzellen mit ≥4 Signalen des Chromosoms 7, gemäß (19)) nachgewiesen. 36 dieser Tumore waren heterogen für hohe Polysomie und wiesen andere Proben ohne EGFR-Genkopieerhöhung auf. In zwei von diesen Fällen konnte in verschiedenen Proben zusätzlich eine EGFR-Genamplifikation nachgewiesen werden. Ein Tumor konnte nicht auf seine Heterogenität evaluiert werden, da nur eine Gewebeprobe in der EGFR FISH Analyse analysierbar war, so dass in keinem der Tumore mit mehreren interpretierbaren Gewebeproben eine homogene hohe Polysomie aufgefunden werden konnte (Fig 1B der Publikation). Von den 35 Tumoren ohne gleichzeitige EGFR-Amplifikation wies ein Durchschnitt von 26,1% (1,8/6,8) Spots eine hohe Polysomie auf.
In dreizehn Tumoren konnte in ein bis elf Spots eine EGFR-Genamplifikation festgestellt werden, wobei sechs Fälle eine homogene Amplifikation und sieben Fälle eine intratumorale Heterogenität aufwiesen. Bei den heterogenen Fällen konnten im Durchschnitt in 34% (2,4/7,1) der Spots eine Genamplifikation nachgewiesen werden. Zwei dieser sieben Fälle beinhalteten, wie oben beschrieben, Spots mit hoher Polysomie des Chromosoms 7 neben Spots mit Amplifikation und negativen Spots.
Heterogene Tumore wurden separat histologisch untersucht, wobei keine morphologischen Unterschiede zwischen amplifizierten und nicht amplifizierten Tumorarealen im Grenzgebiet festgestellt wurden (Abb. 2).
Abbildung 2: Beispiel eines NSCLC mit heterogener EGFR Amplifikation und EGFR Expression
A) HE Färbung; B) EGFR Immunhistochemie; C) EGFR FISH Analyse eines amplifizierten Tumorgebietes; D) EGFR FISH Analyse eines nicht amplifizierten Tumorgebietes (Grüne Signale der FISH Analyse repräsentieren das Zentromer 7, orangene Signale repräsentieren das EGFR Gen)
3.1.1 Lymphknotenmetastasen
Zwischen den Primärtumoren und den korrespondierenden Lymphknotenmetastasen konnte keine Abweichung der EGFR-Amplifikationen festgestellt werden. Vier Tumore mit homogener EGFR-Amplifikation wiesen eine identische Amplifikation in bis zu drei Lymphknotenmetastasen auf.
Insgesamt konnten in 16 Fällen mit heterogener EGFR-Genkopieerhöhung zusätzliche Lymphknotenmetastasen evaluiert werden. Hierbei zeigten zwei Tumore eine fokale Amplifikation und 14 Tumore eine fokale hohe Polysomie. Die EGFR-Genkopienanzahl der Lymphknotenmetastasen war stets mit einem Teil des Primärtumors identisch. Unterschiedliche EGFR-Genkopieerhöhungen zwischen einzelnen Lymphknotenmetastasen eines Primärtumors konnten in vier von 11 Fällen nachgewiesen werden.
3.2 EGFR Immunhistochemie
Die immunhistochemische Analyse des EGFR-Proteins konnte in 1203 Gewebespots erfolgreich durchgeführt werden. Die anderen 113 Gewebespots wurden aus der Analyse ausgeschlossen, da die Spots auf dem TMA-Schnitt fehlten, oder zu wenige Tumorzellen für eine Evaluation enthielten. Im Durchschnitt waren 8,4 Spots eines jeden Tumors analysierbar. Eine starke Immunfärbung mindestens eines Spots kam in 84 (58,3%) und eine komplett negative Immunfärbung aller untersuchten Spots in 8 (5,6%) Tumoren vor. Die meisten Tumore zeigten ein gewisses Ausmaß an Heterogenität der EGFR-Expression. Nur 20 (13,9 %) Tumore wiesen eine komplette Homogenität in allen untersuchten Spots auf (8 Tumore negativ, 1 Tumor schwach positiv, 11 Tumore stark positiv). Alle 6 homogen amplifizierten Fälle wiesen hierbei eine homogen stark positive IHC-Färbung auf. 31 (21,5%) Tumore zeigten Areale mit starker Expression neben vollständig negativen Tumoranteilen.
3.3 EGFR Mutationsanalyse amplifizierter Tumore
In vier der dreizehn amplifizierten Tumore konnte per Sequenzanalyse eine typische Mutation des EGFR-Gens nachgewiesen werden. Zwei dieser Tumore zeigten eine homogene Amplifikation, die zwei anderen eine heterogene EGFR-Amplifikation.
4 Diskussion
4.1 Molekulare Diagnostik bei Heterogenität
Für molekular zielgerichtete Krebstherapien stellt Tumorheterogenität ein großes Problem dar. Der zu untersuchende Biomarker könnte lediglich in einer Fraktion eines Tumors vorhanden sein. Die molekulare Diagnostik von durch Biopsien gewonnenen Gewebeproben wäre dadurch in ihrer Aussagekraft limitiert. Unter einer zunächst effektiven molekular zielgerichteten Krebstherapie könnte es daher nach einiger Zeit zu Resistenzen kommen, nachdem zielstrukturpositive Tumorzellen abgestorben sind und zielstrukturnegative Zellen die Überhand gewinnen.
Gemessen an ihrer Wichtigkeit wurde die Heterogenität von Tumoren bisher in relativ wenigen Studien untersucht. In den meisten dieser Studien wurde die Heterogenität durch Analyse eines oder zweier Gewebeblöcke pro Tumor/Patient quantifiziert (28, 29, 37). Die gesamte Biologie eines großen Tumors kann jedoch nicht durch lediglich eine kleine Gewebesektion repräsentiert werden.
Unser Verfahren, in dem wir mittels TMA Proben von acht so weit wie möglich von einander lokalisierten Arealen pro Tumor analysiert haben, ermöglicht eine deutlich umfassendere Analyse molekularer Eigenschaften in einer großen Anzahl von Tumoren.
4.2 EGFR Aberrationen
In unserer Studie fanden wir in 48 (33,3%) von 144 NSCLC eine Erhöhung der EGFR-Genkopienanzahl. Hierbei waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen histologischen Subtypen erkennbar. Wir konnten auch keine signifikante Assoziation einer erhöhten EGFR-Genkopienanzahl mit dem histologischen Grad, oder mit dem Staging des Tumors feststellen. Vorherige Studien, die mittels FISH die EGFR-Genkopienanzahl in Bronchialkarzinomen untersucht haben, haben, mit einer Erhöhung bei 31-45% aller Tumore, vergleichbare Ergebnisse erzielt (15, 22, 23).
4.3 Hohe Polysomie
sich jedoch nicht bewährt. Eine ausgeprägte Heterogenität könnte Grund für den niedrigen prädiktiven Wert sein.
Die Daten unserer Studie zeigen eine sehr hohe Rate von Bronchialkarzinomen mit einer Heterogenität der Aberrationen der EGFR-Genkopienanzahl. Dies trifft insbesondere zu, wenn die EGFR-Aberration durch hohe Polysomie bedingt ist. Alle 36 Bronchialkarzinome (mit mindestens zwei auswertbaren Gewebespots), in denen eine hohe Polysomie nachgewiesen wurde, hatten Tumoranteile mit und ohne hohe Polysomie. Da die Evaluation von hoher Polysomie durch FISH schwierig und anfällig für Fehler ist, sind weitere Studien zur Validierung unserer Resultate sinnvoll (19).
Technische Limitationen können zu der Variabilität unserer Daten beigetragen haben. So ist z.B. bei der Determinierung, ob 40% der Zellen 4 oder mehr Signale aufweisen, oder nicht, die Dicke des Paraffinschnittes von entscheidender Bedeutung. Mit Zunahme der Schnittdicke werden FISH Analysen immer mehr Signale hervorbringen, da der Durchmesser von Tumorzellkernen stets größer ist, als die Tiefe des Schnittes.
Die Validität unserer FISH Daten wird durch die signifikante Assoziation zwischen hoher Polysomie und hohem Level von EGFR-Proteinexpression unterstützt. TMAs ermöglichen eine größtmögliche Standardisierung. Dennoch ist anzunehmen, dass sich in unseren Daten Fehler befinden können. Die lange Erfahrung unseres Labors für FISH Analyse bestärkt wiederum, dass eine wesentlich bessere Quantifikation von hoher Polysomie schwer zu erzielen ist (25-27).
Unabhängig davon zeigt unsere Studie, dass Analysen der EGFR-Genkopienanzahl durch eine einzelne Gewebeproben nur sehr unwahrscheinlich ein gesamtes Bronchialkarzinom repräsentieren können. Die Tumorgewebeproben auf unserem TMA simulieren bis zu einem gewissen Grad die Vorgehensweise in der Klinik, in der Biomarkeranalysen bei Bronchialkarzinomen mit sehr kleinen Biopsien durchgeführt werden.
4.4 EGFR Amplifikationen
EGFR-vereinbar, die eine Genamplifikation in 6-13% der NSCLC festgestellt haben (10, 13, 24).
Die Diagnose von Genamplifikationen durch FISH ist gegenüber der von hoher Polysomie einfach und mit sehr geringer Variabilität zu stellen (26). In 7 der 13 EGFR-amplifizierten NSCLC unserer Studie konnte ein heterogenes Amplifikationsmuster nachgewiesen werden. Dies demonstriert noch klarer die hohe Frequenz einer intratumoralen Heterogenität der EGFR-Genkopienanzahl.
Nur in 2 von 37 Tumoren mit hoher Polysomie konnte eine gleichzeitige EGFR-Genamplifikation in anderen Tumorarealen nachgewiesen werden. Dies spricht eher gegen die Hypothese, dass sich eine Amplifikation aus einer hohen Polysomie entwickelt.
4.5 Vergleich Primärtumor vs Metastase
Daniele et al. und Sun et al. führten zwei Studien durch, welche mittels FISH die Anzahl der EGFR-Genkopien in primären NSCLC und ihren Fernmetastasen verglichen (28, 29). Sun et al. untersuchten 55 Primärtumore und ihre korrespondierenden Gehirnmetastasen. Hierbei stimmten die Ergebnisse für hohe Polysomie in 50% und die für Genamplifikation in 67% der Fälle nicht überein. Die Autoren stellten eine deutlich höhere Frequenz von EGFR-Amplifikationen in Gehirnmetastasen im Vergleich zu ihren korrespondierenden Primärtumoren fest. Daniele et al. verglichen 38 NSCLC mit ihren korrespondierenden Gehirn- und Nebennierenmetastasen. Zwei der Fälle wiesen eine EGFR-Amplifikation auf. Ein Unterschied zwischen Primärtumor und Metastasen wurde hierbei nicht beschrieben. Die Ergebnisse für hohe Polysomie waren in 53% der Fälle nicht übereinstimmend. Es lag eine Tendenz höherer Polysomie in Metastasen verglichen mit den jeweiligen Primärtumoren vor.
In unserer Studie konnten wir keinen signifikanten Anstieg von Genamplifikationen oder hoher Polysomie in Lymphknotenmetastasen verglichen mit ihren Primärtumoren beobachten.
4.6 Prädiktiver Wert
Zwar liegen uns keine klinischen Verlaufsdaten der Patienten vor, dennoch rufen unsere Ergebnisse Zweifel an einem relevanten prädiktiven Wert von EGFR FISH Untersuchungen hervor, welche an Biopsien durchgeführt werden.
In unserer Studie wurden 6 von 144 (4,2%) Tumoren mit homogenen EGFR-Amplifikationen im Primärtumor und dessen Metastasen identifiziert. Angenommen dass EGFR, mit massiver Gen-Amplifikation, eine entscheidende biologische Rolle in diesen Krebszellen spielt, ist zu erwarten, dass zielgerichtetes Therapieren mit Tyrosinkinaseinhibitoren oder monoklonalen Antikörpern eine effektive Strategie bei solchen Tumoren darstellen könnte.
4.7 EGFR Mutationen
Mehrere klinische Studien haben eine positive Korrelation zwischen einer durch FISH bewerteten, erhöhten Anzahl der EGFR-Genkopien und dem Ansprechen auf EGFR-TKI gezeigt (13-16). In der großen Phase III INTEREST-Studie war eine hohe EGFR-Genkopienanzahl jedoch nicht prädiktiv für ein, durch eine Gefitinibtherapie erzieltes, progressionsfreies Überleben bei Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC (17, 18). Dementsprechend haben Ergebnisse der IPASS Studie nahegelegt, dass der anscheinende Erfolg von Gefitinib, der bei Patienten mit hoher Genkopienanzahl beobachtet wurde, auf eine gleichzeitig vorhandene EGFR-Mutation zurückzuführen ist (5). Es fand sich bei einem hohen Anteil (77,6%) der Tumore der Patienten eine EGFR-Mutation. Patienten ohne diese gleichzeitige Mutation haben nicht von einer Gefitinibtherapie profitiert.
Eine Mutation in der Tyrosinkinasedomäne vom EGFR-Gen ist der bisher am stärksten prädiktive Wert für das Ansprechen auf eine Anti-EGFR-Therapie. Hierbei ist zu beachten, dass möglicherweise auch Mutationen heterogen in Tumoren ausgeprägt sein können (35, 47, 48).
Taniguchi et al. entnahm aus 21 NSCLC mit bekannter EGFR-Mutation jeweils 50-60 separate Gewebeproben, die er einzeln auf das Vorhandensein einer Mutation untersuchte. Es wurden 15 homogene und 6 heterogene Fälle beschrieben. Bai et al. untersuchte in einer Studie 45 EGFR-mutierte NSCLC auf eine solche Heterogenität. Er analysierte jeweils 28-34 Foki pro Tumor. In ca 30% der Tumore zeigte sich eine
Vergleich zu homogenen Fällen mit einer niedrigeren EGFR-Genkopienanzahl assoziiert.
In unserer Studie wurde zur Mutationsanalyse der EGFR-amplifizierten NSCLC die DNA von jeweils nur einem großen Gewebefokus, anstatt mehrerer kleiner sequenziert. Eine Aussage zur Heterogenität dieser Mutationen lässt sich somit nicht machen.
Die Heterogenität von EGFR-Mutationen ist seltener, als die von Änderungen der Genkopienanzahl (34, 36). Yatabe et al. legen daher nahe, dass EGFR-Amplifikationen während der Tumorprogression in EGFR-mutierten Adenokarzinomen erworben werden (37). Erhöhungen der EGFR-Genkopienanzahl in Tumoren mit gleichzeitiger Mutation sind mit einem ansteigenden Verhältnis von mutiertem zu Wildtypallel assoziiert, was impliziert, dass das mutierte Allel selektiv amplifiziert wird (38).
Mehrere Studienergebnisse lassen vermuten, dass EGFR-Mutationen mit höherer Frequenz in EGFR-amplifizierten NSCLC auftreten (30-32). Die berichtete Frequenz von gleichzeitigen EGFR-Mutationen in EGFR-amplifizierten NSCLC hängt jedoch stark vom untersuchten Patientenkollektiv ab. EGFR-Mutationen sind in spezifischen Subgruppen wesentlich häufiger vorhanden. So z.B. bei Asiaten, Patienten mit Adenokarzinomen, Nichtraucher und Frauen (57, 59). Auf der anderen Seite ist die berichtete Frequenz der EGFR-Genkopienanzahl nicht abhängig vom ethnischen Ursprung (33), oder histologischem Subtyp (13, 24). Wir fanden gleichzeitig vorhandene EGFR-Mutationen in 4 von 13 amplifizierten Tumoren (30,8%). Dieses Ergebnis ist mit anderen Berichten über unselektierte europäische Kohorten vergleichbar. Capuzzo et al. fand in 6 von 9 amplifizierten NSCLC EGFR-Mutationen, während die gesamtdurchschnittliche Mutationsfrequenz der untersuchten Kohorte bei 17% lag (13).
EGFR-Mutationen kommen fast ausschließlich in Adenokarzinomen vor (39). Einige Autoren schlagen deshalb eine Limitierung von EGFR-Testungen auf Adenokarzinome vor (40). Es ist erwähnenswert, dass ein EGFR-mutiertes Plattenepithelkarzinom in unserer Studie gefunden wurde. Diese Beobachtung könnte ein Hinweis dafür sein, dass zumindest einige Patienten mit Plattenepithelkarzinomen von einer TKI-Therapie profitieren könnten.
5 Fazit
Der EGF-Rezeptor ist ein etabliertes therapeutisches Ziel bei fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen. EGFR-Mutationen sind der bisher stärkste prädiktive Marker für ein positives Ansprechen auf eine Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren. Der prädiktive Wert einer erhöhten EGFR-Genkopienanzahl ist bis heute nicht einheitlich geklärt.
Unsere Daten zeigen, dass Aberrationen der EGFR-Genkopienanzahl in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen in den meisten Fällen heterogen sind. Dies trifft insbesondere zu, wenn die EGFR-Aberration auf eine hohe Polysomie zurückzuführen ist. In unserer Studie zeigten 100% der Tumore mit hoher Polysomie (36 von 36) und 54% der Tumore mit einer EGFR-Amplifikation (7 von 13) eine heterogene Ausprägung. Diese Beobachtung stellt das Konzept in Frage, dass therapeutische Entscheidungen auf EGFR-FISH-Analysen basieren, welche durch kleine Biopsien gewonnen wurden.
Diskrepante Studienergebnisse über den prädiktiven Wert von EGFR-Aberrationen für molekular zielgerichtete Therapien mit Tyrosinkinaseinhibitoren (wie Erlotinib und Gefitinib) oder monoklonalen Antikörpern (z.B. Cetuximab) können durchaus durch eine solche intratumorale Heterogenität begründet sein.
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LungCancer79 (2013) 221–227
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Lung
Cancer
jo u rn al h om epa g e :w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / l u n g c a n
Frequent
intratumoral
heterogeneity
of
EGFR
gene
copy
gain
in
non-small
cell
lung
cancer
TobiasJ.Groba,∗,1,TobiasHoeniga,1,TillS.Clauditza,DjordjeAtanackovicb,AlexandraM.Koenigd,
YogeshK.Vashistd,HansKloseb,RonaldSimona,KlausPantelc,JakobR.Izbickid,CarstenBokemeyerb, GuidoSautera,WaldemarWilczaka
aDepartmentofPathology,UniversityMedicalCenterHamburg-Eppendorf,Hamburg,Germany
bDepartmentofOncology,HematologywithSectionPneumology,Hubertus-WaldTumorzentrum(UniversityCancerCenterHamburg),UniversityMedicalCenterHamburg-Eppendorf, Hamburg,Germany
cInstituteofTumourBiology,UniversityMedicalCenterHamburg-Eppendorf,Hamburg,Germany
dDepartmentofGeneral,VisceralandThoracicSurgery,UniversityMedicalCenterHamburg-Eppendorf,Hamburg,Germany
a r t i c l e i n f o
Articlehistory:
Received23April2012
Receivedinrevisedform8November2012 Accepted11November2012
Keywords:
Non-smallcelllungcancer EGFR
Fluorescenceinsituhybridization Immunohistochemistry Mutation
Heterogeneity
a b s t r a c t
NexttoEGFRmutation,EGFRgenecopynumberevaluatedbyfluorescenceinsituhybridization(FISH) emergedasapotentialpredictivemarkerforsensitivitytoEGFRtyrosinekinaseinhibitors,although controversialdataexist.Asthediagnosticaccuracyofpredictivebiomarkerscanbesubstantiallylimited byregionaldifferenceswithintumors,heterogeneityofEGFRgenecopygaininNSCLCwasassessedin thisstudy.Forthispurpose,anoveltissuemicroarray(TMA)basedanalysisplatformwasdeveloped. TMAswereconstructedcontaining8differenttissuecylindersfrom144primaryNSCLCs.From62of thesepatientsadditionalnodalmetastasesweresampled.EGFRgenecopynumberandEGFRexpression wasanalyzedbyFISHandimmunohistochemistryaccordingtothesuggestedguidelines.13(9.0%)ofthe 144evaluatedtumorsshowedEGFRamplificationand37(25.7%)tumorshighpolysomyinatleastone tumorarea.In7(53.8%)of13amplifiedcasestheanalysisofdifferenttumorareasrevealedsubclones withoutEGFRgenecopygainnexttosubcloneswithamplification.Allofthe36evaluabletumorswith highpolysomyshowedheterogeneityofEGFRgenecopynumberwithareasnegativeforgenecopy gainwithintheindividualtumors.HeterogeneityofEGFRgenecopygaininlungcancerchallengesthe conceptofusingsmallbiopsiesfortheanalysisofEGFRFISHstatus.EGFRgenecopynumberishighly heterogeneouswithinindividualNSCLCsandthisfindingmightwellbeareasonforthecontroversial clinicaldataexistingregardingresponsivenesstoanti-EGFRtherapy.
© 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Theepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)isareceptor tyro-sine kinase of theErbB family and has beenimplicated in the proliferationandsurvivalofcancercells.Aberrantexpressionof EGFRhasbeendetectedinmanyhumanepithelialmalignancies includingnon-smallcelllungcancer(NSCLC).MoreoverEGFR over-expressionhasbeenlinkedtoadvanceddisease,amoreaggressive phenotypeandoverallpoorprognosisinmanytumorentities[1]. EGFRis the target for tyrosine kinaseinhibitors (TKIs)suchas gefitiniborerlotinibandmonoclonalantibodiessuchascetuximab
∗ Correspondingauthorat:InstituteofPathology,University MedicalCenter Hamburg-Eppendorf,Martinistr.52,20246Hamburg,Germany.
Tel.:+4940741053173;fax:+4940741056815.
orpanitumumab.Theidentificationofthepatientswhoaremost likelytoderiveclinicalbenefitfromthesedrugsisofparamount importance.
EGFR mutations, EGFR gene copy number and EGFRprotein expressionhavebeenstudiedaspredictivebiomarkersinmajor clinicaltrialsin NSCLC.EGFRproteinexpressionyieldedlargely disappointingresultspredictingresponse toTKI[2,3].However, recently published results from the FLEX study suggest EGFR expressionasapredictorforcetuximabtherapy[4].EGFRmutation analysishasconsistentlyemergedasstrongpredictorforresponse toEGFRTKItherapyinNSCLCandleadtotheintroductionof first-lineEGFRTKItreatmentforpatientswithactivatingEGFRmutations
[5–7].FindingsregardingEGFRgenecopynumberasapredictive markerofresponsetoTKIs,havebeeninconsistent[8,9].In con-trasttoHER2testingfortrastuzumabtherapyinbreastcancer,it issuggestedthatEGFRgene copygainasapredictivemarkeris
222 T.J.Grobetal./LungCancer79 (2013) 221–227
Thecriteriafor EGFRpositivityassessed byfluorescencein situ hybridization(FISH)areeithergeneamplificationoraminimum subsetoftumorcells(≥40%)withatleastfourcopiesoftheEGFR
gene(highpolysomy).Thisdefinitionledtoconsiderableobstacles
[11].Especiallythereproducibilityusingdifferentmethodssuch asquantitativereal-time PCRis limited[12].Nevertheless, sev-eralclinicaltrialsshowedpositivecorrelationbetweenincreased
EGFRgenecopynumberasassessedbyFISHandresponsetoEGFR TKI[13–16].However,inthelargephaseIIIINTERESTstudyhigh
EGFRgenecopynumberwasnotpredictiveforprogression-free survivalachievedbygefitinibtreatmentinpatientswithadvanced NSCLC[17,18].Accordingly,resultsfromtheIPASSstudysuggest thattheapparentbenefitofgefitinibseeninpatientswithhigh
EGFRgenecopynumberwasdrivenbyoverlapwithacoexisting
EGFRmutation[5].
Despitetheseconsiderableeffortsaclearpictureofthe predic-tivevalueofEGFRgenecopynumberhasnotyetemerged.Genetic tumorheterogeneityrepresentsapossiblesourceforthe controver-sialresults.Geneticheterogeneitymightbeparticularlyessentialin lungcancerbecausediagnosisisusuallymadeonsmallbiopsiesor evenonafewcellsincasesofcytologyspecimens.Tobetter under-standtheextentofsuchheterogeneityweanalyzed144surgical specimensofnon-smallcelllungcancersextensivelyontheEGFR proteinandgenecopynumberlevelusinganoveltissuemicroarray (TMA)basedplatformforheterogeneityanalysis.Ourresults sug-gestthatsubstantialheterogeneityexistsforEGFRamplificationin lungcancerandthathighpolysomyofchromosome7asassessed byFISHisanunreliablepredictivemarkerwithoutconsistencyin NSCLC.
2. Materialsandmethods
2.1. Tissuesandconstructionoftissuemicroarrays
Patientswithextensiveretainedtumormaterial(atleast4 tis-sueblocksperpatient)wereidentifiedtoanalyzeheterogeneityof biomarkeralterationsinNSCLC.Among373patientsreviewedfor availabilityoflargetissuequantities,therewere144patientsfor whomatleast4blocksofparaffinembeddedformalinfixed tis-suehadbeenstoredatthearchivesoftheInstituteofPathology oftheUniversityMedicalCenter,Hamburg-Eppendorf.The num-berofavailabletissue blockswas8in 24,7in12,6in26, 5in 32and4 in50patients. Eightdifferenttissue coresweretaken perpatientforTMAconstruction.Accordinglynomorethantwo coreswereremovedfromonetissueblock.Emphasiswasplaced ontakingthesesamplesfromareasthatwereasdistantfromeach otheraspossible.Upto4differentlymphnodemetastaseswere alsoexaminedfrom62(ofthe144)patientswithnodalpositive disease.Onetissuecorewasanalyzedpermetastasis.Thenumber ofanalyzedmetastaseswas4in18,3in11,2in18,and1in15 patients.TMAswereconstructedaspreviouslydescribed[19].The usageofTMAsforresearchpurposeshasbeenapprovedbythelocal ethicscommittee.Consecutive4msectionsoftheresulting multi-tumorTMAblocksweretransferredtoanadhesivecoatedslide system(Instrumedics, Hackensack,USA)forfluorescencein situ hybridization,immunohistochemicalanalysisandH&Estained ref-erence.Alloriginalslidesof thetissues includedin theseTMAs hadbeenrevieweddetermininghistologicaltypebasedon mor-phologyandhistologicalgradeaccordingtoWHO2004[20].The pathologicstagewasobtainedfromtheprimaryreportofthe Insti-tuteofPathology.For fourcasesthepathologicstageismissing duetoincompletelymphnodesampling.Themedianpatientage
Table1
Clinicalandpathologicalcharacteristicsofthestudycohort.EGFRgenecopygain (highpolysomyorEGFRamplification)foundinatleastonetumorarea.
Highpolysomy EGFRamplification Totalcases 144 37(25.7%) 13(9.0%) Sex Female 36 7(19.4%) 5(13.9%) Male 108 30(27.8%) 8(7.4%) Histologictype Adenocarcinoma 79 22(27.8%) 6(7.6%) Squamouscell carcinoma 48 12 (25.0%) 5 (10.4%) Adenosquamous carcinoma 2 1(50.0%) 1(50.0%) Largecell undifferentated carcinoma 15 2(13.3%) 1(6.7%) Histologicgrade 1 2 0 0 2 64 19(29.7%) 4(6.3%) 3 63 16 (25.4%) 8 (12.7%) 4 15 2(13.3%) 1(6.7%) Stage(UICC) Ia 12 3(25.0%) 1(8.3%) Ib 29 6(20.7%) 0 IIa 6 1(16.7%) 0 IIb 37 11(29.7%) 4(10.8%) IIIa 30 6(20.0%) 3(10.0%) IIIb 19 6(31.6%) 3(15.8%) IV 7 3(42.9%) 1(14.3%)
2.2. EGFRfluorescenceinsituhybridization
FISHwasperformedonTMAsectionsusingacommercialkitfor proteolyticslidepre-treatment(paraffinpre-treatmentreagentkit, AbbottMolecular,Wiesbaden,Germany).TheVysisLSIEGFR Spec-trumOrange/CEP7SpectrumGreenProbe(AbbottMolecular)was usedforEGFRcopynumberdetectionaccordingtomanufacturer’s instructions.Presenceoftumorcellswasverifiedineachspotby comparisonofanH&Estainedconsecutivelycutreferencesection oftheTMA.Tumorcellsofeachspotwereevaluatedaccordingto thesuggestedguidelinesforevaluationofEGFRgenecopygain[21].
2.3. EGFRimmunohistochemistry
For EGFR protein detection, the EGFR pharmDX kit (Dako, Glostrup, Denmark) was used according to the manufacturer’s instructions. Membrane staining intensity in tumor cells was scoredinfourcategories(0–3+):nostaining(0),weakstaining(1+, lightbrownmembranestaining,visibleonlywithhigh magnifica-tion),intermediatestaining(2+,between1+and3+),andstrong staining(3+,dark-brownlinearmembranestaining).
2.4. EGFRsequencing
All EGFR amplified cases were sequenced for mutations in the EGFR tyrosine-kinase domain (exons 18–21). Tumor DNA wasextracted fromFFPE tissue after macrodissection or laser-capturemicrodissection(PALMMicro BeamLaserSystem,Zeiss MicroImaging,Munich,Germany)toensuretumorcellcontentof atleast70%.Extractionwasperformedasperstandardprotocols (QiAmpDNAMiniKit,Qiagen,Hilden,Germany).100ngofDNA were subjected toPCR reactions usingthe AmpliTaq Gold PCR mastermix(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)underthe
T.J.Grobetal./LungCancer79 (2013) 221–227 223 dif fe rent areas primary tumor corresponding metastases #026 #028 #059 #021 #097 #091 #116 #038 #080 #089 #139 #023 #107
EGFRamplification
high polysomy
EGFRFISH negative
test failure
A
dif ferent areas primary tumor corresponding metast ases #100 #065 #085 #089 #033 #067 #101 #035 #020 #041 #052 #066 #082 #087 #088 #122 #132 #045 #139 #008 #012 #032 #040 #048 #054 #060 #072 #075 #102 #112 #115 #118 #125 #133 #009 #046 #144B
Fig.1.IntratumoralheterogeneityofEGFRamplification(A)andhighpolysomyofchromosome7(B).ThecolumnsrepresentEGFRFISHresultsineightdifferentareasofthe primarytumorandinuptofourdifferentavailablelymphnodemetastasesfromthesametumor.Ofnote:twocases(#089and#139)showconcomitantEGFRamplification andhighpolysomyofchromosome7.Thesecasesarethereforeincludedinbothfigures.
forward 5′-GCTGGTAACATCCACCCAGA-3′ and reverse 5′
-GCAGGGTCTAGAGCAGAGCA-3′; exon 20 forward 5′
-CACACTG-ACGTGCCTCTCC-3′ and reverse 5′-TATCCCCATGGCAAACTCTT-3′;
exon 21 forward 5′-CCTCACAGCAGGGTCTTCTC-3′ and reverse
5′-ATCCTCCCCTGCATGTGTTA-3′.PCRproductsweresubjectedto
sequencingreactionwithBigDyeTerminaterCycleSequencingKit (Applied Biosystems)and analyzed onABI PRISM3100genetic analyzer(AppliedBiosystems).
2.5. Statistics
Contingencytableanalysisandchisquaretestswereusedto studytherelationshipbetweenFISHandIHCresults.SASsoftware (SASInstituteInc,NCUSA;JMP5.1software)wasusedfordata analysis.
3. Results
3.1. EGFRFISH
EGFR gene copy number was interpretable in 1055 arrayed tumorsamples.Anaverageof7.3differentspots(range0–12spots) wasanalyzableofeachtumor.Analysisfailedin261spotseither
tumors showed EGFR amplification (Fig. 1A).6 tumors showed homogeneousEGFRgeneamplificationinallanalyzablespots(4–11 differentspots;3squamouscellcarcinomas,2adenocarcinomas, andoneadenosquamouscarcinoma).7tumorsrevealed intratu-moralheterogeneityresultinginspotswithgeneamplificationand spotswithanegativeEGFRFISH.Twoofthesecasesalsoincluded spots withhighpolysomyof chromosome7,nextto amplifica-tionandnegativespots.Oftheseheterogeneoustumorsanaverage of 34.0% (2.4/7.1) spots showed gene amplification. Histologic reviewofthebordersbetweenamplifiedandunamplifiedareas revealednomorphologicaldifferenceswithinthetumor(Fig.2). High polysomyas definedby theUniversityof Colorado Group (40%oftumorcells with≥4 EGFRgene signals)[22]wasfound in37(25.7%)tumors(Table1).Twoofthesetumorsalsoshowed geneamplificationandnegativeresultsindifferentspots.Ofthe35 remainingtumors34wereheterogeneousforhighpolysomy show-ingotherspotsnegativeforEGFRcopynumbergain.Onetumor couldnotbeevaluatedforheterogeneityasonlyonetissuespot wasanalyzableinEGFRFISHanalysis.Ofthe35tumorswithout concomitantEGFRamplificationanaverageof26.1%(1.8/6.8)spots showedhighpolysomy.Innoneofthetumorsforwhichmultiple spotswereinterpretablehomogeneoushighpolysomywasfound (Fig.1B).
224 T.J.Grobetal./LungCancer79 (2013) 221–227
Fig.2.ExampleofaNSCLCwithheterogeneousEGFRamplificationandEGFRexpression(case#107).H&Estaining(A),EGFRimmunohistochemistry(B)andEGFRFISH analysisofamplifiedtumorareas(C)andnon-amplifiedtumorareas(D).FISHanalysisshowsgreensignalsrepresentingcentromere7andorangesignalsrepresentingEGFR gene.CellnucleiarecounterstainedwithDAPI.(Forinterpretationofthereferencestocolorintext,thereaderisreferredtothewebversionofthearticle.)
(Fig.1A).Lymphnodemetastasescouldbeevaluatedin16cases withheterogeneousEGFR genecopy gain(two tumorsshowing focalamplificationand14tumorsshowingfocalhighpolysomy). Inallcases heterogeneitywasfoundwithintheprimarytumor andEGFRcopynumberinlymphnodemetastaseswasidentical topartsoftheprimarytumor(Fig.1AandB).DiscrepantEGFRgene copygainbetweendifferentlymphnodemetastasesofatumorwas detectedinfourof11evaluablecasesreflectingtheheterogeneity foundintheprimarytumors.
3.2. EGFRimmunohistochemistry
ImmunohistochemicalanalysisofEGFRproteinwassuccessful in 1203 tumor tissue cores. An average of 8.4 different spots (range3–12spots)wasanalyzableofeachtumor.Onehundred andthirteentissuespotswereexcludedfromanalysisbecausethe spotsweremissingontheTMAslideordidnotcontainenough tumorcellsfor evaluation.TheappliedscoringforEGFRprotein expressionfollowedtherecentlypublishedscoringsystemofthe FLEXstudyinregardofstainingintensity.Assmalltumortissue
scoringsystem[4].CompletenegativeEGFRimmunostaininginall examinedtumorareaswasseenin8(5.6%)tumors.Astrong posi-tivityinatleastonetumorareawasfoundin84(58.3%)cases.Most tumorsshowedsomeextentofheterogeneityinEGFRexpression. Only20(13.9%)tumorsshowedcompletehomogeneityofEGFR expression in all examined tumor areas (8 tumors negative, 1 tumorweakpositive, 11 tumors strong expression). Thirtyone (21.5%)tumorsshowedtumorareaswithstrongexpressionnext tonegativetumor areas.BothFISH and IHCwereinterpretable in 1048 tissue spots and therefore could be matched (Fig. 3). StrongEGFRimmunostainingwasfoundsignificantlyassociated withEGFRamplification(p<0.001)aswellashighpolysomyof chromosome7(p<0.001).The6homogeneouslyamplifiedtumors alsoshowedhomogeneousstrongEGFRexpression.
3.3. EGFRmutationanalysisofamplifiedtumors
Sequenceanalysisof the13amplifiedtumors revealedEGFR
mutations in four cases (case #059: p.L747 T571del; #080: p.L858R; #097: p.E746A750del;#139: p.E746T751>A). Twoof
