Aus der Klinik für Infektiologie und Mikrobiologie der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. Jan Rupp
Infektiöse Infertilität bei Frauen:
Untersuchungen zur Bedeutung von C. trachomatis und den dazugehörigen Nachweisverfahren
Inauguraldissertation zur
Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck -Aus der Sektion Medizin-
von
Kathrin Gillmann aus Hamburg Lübeck 2018
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jan Rupp
2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Jan Weichert
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2018 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 19.12.2018
-Promotionskommission der Sektion Medizin
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Fertilität ... 1
1.2 Abnahme der Fruchtbarkeit im Alter ... 2
1.3 Infertilität ... 2
1.4 Infektiöse Infertilität ... 3
1.4.1 Infektionen des oberen weiblichen Genitaltraktes ... 4
1.4.2 Neisseria gonorrhoeae ... 5
1.4.3 Chlamydia trachomatis ... 6
1.4.4 Andere Erreger und Risikofaktoren der PID ... 8
1.4.5 Diagnostik einer infektiösen Infertilität ... 9
1.4.6 Diagnostik einer C. trachomatis-Infektion ... 11
1.5 Zusammenfassung und Fragestellung ... 12
2 Material und Methoden ... 14
2.1 Ethikantrag ... 14
2.2 Kollektiv der Kinderwunschpatientinnen ... 14
2.3 Kollektiv der fertilen Kontrollgruppe ... 14
2.4 Kollektiv der Risikogruppe ... 15
2.5 Vorgehen ... 15
2.6 Labormaterial ... 16
2.6.1 Geräte ... 16
2.6.2 Verbrauchsmaterialien ... 16
2.6.3 Kits ... 16
2.7 Labormethoden ... 17
2.7.1 Mikroskopie und Kultur ... 17
2.7.2 DNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion ... 18
2.7.3 Serologische Untersuchungen ... 20
2.8 Statistik ... 21
3 Ergebnisse ... 23
3.1 Vergleich mit einer Gruppe von fertilen Frauen (KON-F) ... 24
3.1.1 Untersuchungen auf aktuell bestehende urogenitale Infektionen ... 25
3.1.2 Untersuchungen zum Antikörper-Status gegenüber C. trachomatis ... 27
3.2 Vergleich mit einer Gruppe von infertilen Frauen (KON-I) ... 29
3.2.1 Untersuchungen auf aktuell bestehende urogenitale Infektionen ... 31
3.2.2 Untersuchungen zum Antikörper-Status gegenüber C. trachomatis ... 31
3.3 Vergleich mit Risikogruppe (RISK) ... 33
3.3.1 Untersuchungen auf aktuell bestehende urogenitale Infektionen ... 34
3.3.2 Untersuchungen zum Antikörper- Status gegenüber C. trachomatis ... 34
4 Diskussion ... 36
4.1 Hinweise auf infektiöse Infertilität in der Lebensgeschichte oder im Lebensstil ... 36
4.1.1 Nikotinkonsum ... 37
4.1.2 Sexuell übertragbare Krankheiten in der Vorgeschichte ... 37
4.2 Welche Rolle spielen Chlamydien bei der Entstehung infektiöser Infertilität? ... 39
4.2.1 Direktnachweis von C. trachomatis ... 39
4.2.2 Antikörperstatus gegenüber C. trachomatis ... 40
4.3 Wie gut sind die Nachweisverfahren? ... 41
4.4 Sonstiges ... 47
4.4.1 Gardnerella vaginalis ... 47
4.4.2 Ureaplasma urealyticum ... 49
4.5 Limitationen ... 49
5 Zusammenfassung ... 51
6 Literaturverzeichnis ... 52
7 Anhang ... 62
7.1 Abkürzungsverzeichnis ... 62
7.2 Aufklärungsbogen ... 65
7.3 Einverständniserklärung ... 66
7.4 Fragebogen ... 67
7.5 Tabellen und Diagramme ... 72
8 Danksagung ... 77
9 Lebenslauf ... 78
10 Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ... 79
10.1 Veröffentlichungen ... 79
10.2 Kongressbeiträge ... 79
1 Einleitung
Mit Einführung der Rentenversicherung und Abschaffung der Kinderarbeit vor ca.
100 Jahren wurden Kinder erstmals nicht mehr als Altersversorgung benötigt. Ca. 60 Jahre später kam die Antibabypille auf den Markt und machte das Kinderkriegen endgültig zu einer bewussten Entscheidung.
Deutschland gehört innerhalb der EU zu den Ländern mit einer unterdurchschnittlichen Geburtenzahl (Statistisches Bundesamt, 2017). Ursächlich für diese Entwicklung sind gesellschaftliche Veränderungen. Berufliche Etablierung und private Selbstverwirklichung rücken für die Frau zunächst in den Vordergrund.
Deutsche Mütter sind heute bei der Geburt ihres ersten Kindes fünf Jahre älter als noch in den Siebzigerjahren (Statistisches Bundesamt, 2013).
Ein weiterer Grund für die abnehmende Geburtenzahl ist die im Alter abnehmende Fruchtbarkeit. Wer mit der Familiengründung zu lange wartet, riskiert, kinderlos zu bleiben. Obwohl die meisten jungen Deutschen sich Kinder wünschen, hat jede fünfte Frau zwischen 40 und 44 Jahren in Deutschland keine Kinder (Statistisches Bundesamt, 2013).
1.1 Fertilität
Fertilität bezeichnet die Fähigkeit eines Organismus, sich fortzupflanzen. Die Fertilität des Menschen beginnt mit der Pubertät und endet bei der Frau mit dem Klimakterium.
Das fertile Intervall im Zyklus der Frau erstreckt sich ungefähr über 6 Tage: 5 Tag vor dem Eisprung bis zum Tag des Eisprungs (Dunson et al., 1999).
In einer groß angelegten Studie wurden 5574 gesunde Frauen untersucht. Nach einem Jahr ungeschützten Geschlechtsverkehrs waren 85 % der Frauen schwanger (Guttmacher, 1956). Diese Daten decken sich mit denen anderer Studien (Gnoth et al., 2003; Slama et al., 2012; Zinaman et al., 1996).
1.2 Abnahme der Fruchtbarkeit im Alter
Physiologische Alterungsprozesse im weiblichen Körper führen zu einer Abnahme der Fruchtbarkeit. Die Quantität und Qualität der Eizellen nimmt mit steigendem Alter ab. Da die Anzahl der Follikel ab dem 5. Monat der fetalen Entwicklung stetig abnimmt, steht bereits bei Eintritt in die Pubertät nur noch ein Bruchteil dieser zur Reproduktion zur Verfügung. Zusätzlich steigt im Alter das Risiko für chromosomale Fehlbildungen in den Eizellen, sodass sich die Zahl der zur Verfügung stehenden Eizellen weiter reduziert. Die physiologische Abnahme der ovariellen Durchblutung trägt ebenfalls zur abnehmenden Fertilität bei.
Zusätzlich zu den genannten physiologischen Alterungsprozessen steigt mit dem Alter auch das Risiko, durch eine Erkrankung oder deren Komplikationen unfruchtbar zu werden. Viele dieser Krankheiten verlaufen chronisch und führen erst nach langjährigem Verlauf zu fertilitätsbeeinträchtigenden Veränderungen.
1.3 Infertilität
Der Begriff Infertilität ist nach der WHO definiert als das Nichteintreten einer Schwangerschaft trotz regelmäßigen ungeschützten Geschlechtsverkehres über einen Zeitraum von einem Jahr (Zegers-Hochschild et al., 2009). Im deutschen Sprachgebrauch wurde lange Zeit zwischen Infertilität und Sterilität unterschieden.
Während die Sterilität das Ausbleiben einer Schwangerschaft bezeichnete, bezeichnete Infertilität das Unvermögen, eine eingetretene Schwangerschaft bis zur Geburt auszutragen. Im Englischen entfällt die Unterteilung der beiden Begriffe. Im Wandel des allgemeinen Sprachgebrauchs und nicht zuletzt durch angloamerikanische Einflüsse werden die beiden Begriffe inzwischen auch im deutschen Sprachraum synonym verwendet.
Die Prävalenz der ungewollten Kinderlosigkeit variiert je nach Quelle und kann nur geschätzt werden. Weltweit sind ca. 9 % der Paare ungewollt kinderlos. Die Prävalenz ist steigend und unterscheidet sich in entwickelten Ländern kaum von der Prävalenz in weniger entwickelten Ländern (Boivin et al., 2007).
Die Ursachen ungewollter Kinderlosigkeit gehen zu 45 % auf die Frau, zu 40 % auf den Mann und zu 35 % auf beide Partner zurück. In ca. 15 % der Fälle bleibt die Ursache ungeklärt (Schultze-Mosgau et al., 2007).
Die weibliche Sterilität hat vielfältige Ursachen. Diese lassen sich analog des oberen Genitaltraktes in ovarielle, uterine und tubare Störungen einteilen.
Ovarielle Störungen sind häufig endokriner Natur. Die Ovulation erfolgt verzögert oder bleibt aus. Ursachen hierfür können sein: Syndrom der polycystischen Ovarien, Schilddrüsendysfunktion, Hyperprolaktinämie, adrenal oder hypophysär bedingte Zyklusstörungen. Ovarielle Störungen stellen die häufigste Ursache für weibliche Sterilität dar (Unuane et al., 2011).
Uterine Ursachen sind zum größten Teil auf Myome, Polypen oder Fehlbildungen zurückzuführen. Synechien durch Infektionen oder wiederholte Kürettagen können ebenfalls zu uteriner Infertilität führen.
Je nach Quelle sind ungefähr 30 % der weiblichen Infertilitätsfälle in entwickelten Ländern auf tubare Störungen zurückzuführen (Healy et al., 1994; Miller et al., 1999).
Eine gestörte Tubenfunktion zeichnet sich durch Motilitätsstörungen oder eine Blockade des Eileiters aus. Dies kann dazu führen, dass Eizelle und Spermium entweder gar nicht aufeinander treffen oder, dass sie zwar aufeinandertreffen, aber nach Befruchtung zur Einnistung nicht in den Uterus weitertransportiert werden. Die befruchtete Eizelle wird entweder abgestoßen oder nistet sich im Eileiter ein. Eine sogenannte Tubargravidität kann schwerwiegende Folgen für die Frau haben.
Die Tubenfunktion kann durch postinfektiöse Veränderungen, postoperative Verwachsungen oder durch eine Tubarendometriose beeinträchtigt sein.
Postinfektiösen Veränderungen stellen die häufigste Ursache einer tubaren Infertilität dar (Ault et al., 1998).
1.4 Infektiöse Infertilität
Ungefähr 35 % der Fälle von weiblicher Infertilität sind auf postentzündliche Veränderungen zurückzuführen (Novy et al., 2009). Die Verwachsungen im Tubenlumen oder des umgebenden Peritoneums sind meist Folge aufgestiegener sexuell übertragbarer Infektionen (STIs).
1.4.1 Infektionen des oberen weiblichen Genitaltraktes
Der obere Genitaltrakt wird durch die Zervix vom unteren Genitaltrakt getrennt. Die meisten STIs befallen i.d.R. den unteren Genitaltrakt, einige sind jedoch in der Lage vom unteren in den oberen Genitaltrakt aufzusteigen. Chirurgische Eingriffe an Zervix oder Uterus, eine prolongierte Geburt, vorbestehende Infektionen oder ein hoher Östrogenspiegel begünstigen die Aszension. Aufgrund des geöffneten Zervikalkanals und der gelockerten Endometriumsbarriere, ist die Gefahr für aszendierende Infektionen während der Menstruation besonders hoch (Ovalle et al., 2016). Seltener können die Mikroorganismen auch hämatogen in den oberen Genitaltrakt gelangen.
Pelvic inflammatory disease (PID, Entzündliche Erkrankung des Beckens)
PID ist ein Sammelbegriff für Infektionen der Organe des kleinen Beckens. Gemeint sind jegliche Formen oder Kombinationen von Endometritis, Salpingitis, Tubo- Ovarial-Abszess und pelviner Peritonitis. Eine Mitbeteiligung der Organe des kleinen Beckens ist häufig. Ein Sonderfall ist das Fitz-Hugh Curtis Syndrom, eine begleitende Perihepatitis. Dieses Phänomen wird in ca. 10 % der Fälle von PID beobachtet. Mehr als 85 % der Fälle von PID entstehen durch aufsteigende Infektionen des unteren Genitaltraktes (Brunham et al., 2015) und stellen somit eine schwerwiegende Komplikation einiger STIs dar.
Am häufigsten ist die Salpingitis, die Entzündung der Eileiter. Sie tritt meist beidseits auf. Die Patientinnen klagen über Unterbauchschmerzen, in der gynäkologischen Untersuchung fällt ein Portioschiebeschmerz auf. Die Salpingitis kann aber auch asymptomatisch verlaufen. 60-80% der Betroffenen zeigen eine normale Körpertemperatur und auch im Blut keine Entzündungszeichen (Novy et al., 2009).
Studien in Schweden konnten zeigen, dass das Risiko für eine infektiöse Infertilität proportional zur Anzahl der durchgemachten Salpingitis-Episoden steigt. Nach der ersten Episode beträgt das Risiko 11 %, nach der zweiten beträgt es 23 % und nach der dritten 54 % (Pavletic et al., 1999; Scholes et al., 1996; Weström, 1994).
Zu den Erregern der PID gehören N. gonorrhoeae, C. trachomatis und M. genitalium (Brunham et al., 2015).
1.4.2 Neisseria gonorrhoeae
In 30 % der Zervixabstriche von Frauen mit akuter Salpingitis lässt sich N.
gonorrhoeae nachweisen (Novy et al., 2009). Gonokokken sind gramnegative Diplokokken, die sehr empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen, insbesondere Austrocknung, sind. Die Übertragung der Gonorrhoe erfolgt daher fast ausschließlich durch sexuellen Kontakt. Beim Mann äußert sich die Infektion als eitrige Urethritis, bei der Frau zunächst als Zervizitis oder Urethritis. In 10-20 % der gonorrhoeischen Zervizitis-Fälle kommt es zu aufsteigenden Infektionen (Pellati et al., 2008). Eine daraus resultierende PID verläuft meist akut und geht mit starken Schmerzen einher.
Sie führt daher häufiger zur Hospitalisation als PIDs anderer Genese (Reekie et al., 2014). Auch wenn Gonokokken hauptsächlich die nichtzilientragenden Zellen des Eileiters infizieren, kann die resultierende Entzündung auch die benachbarten zilientragenden Zellen beschädigen (Novy et al., 2009) und zu Infertilität führen.
Bis zur Abschaffung der Meldepflicht 2001 zeigte sich die Inzidenz der Gonorrhoe in Deutschland rückläufig (Robert Koch Institut, 2001). Es gibt allerdings Hinweise, dass es in den letzten Jahren zu einer Zunahme der Neuinfektionen gekommen ist. Da in Sachsen für die Gonorrhoe noch heute eine Labormeldepflicht besteht und sich dort die gemeldeten Fälle von 6,8 (2003) auf 13,7 Infektionen (2011) pro 100.000 Einwohner verdoppelt haben (Erhard, 2012), ist eine Zunahme der Infektionen auch in den anderen Bundesländern denkbar.
Zudem werden bei Gonokokken vermehrt Antibiotika-Resistenzen beobachtet. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Gonokokken durch Plasmide in der Lage sind, Resistenzgene untereinander auszutauschen. In Deutschland ist von einer Resistenzrate von 78 % gegen Penicillin und von 87 % gegen Ciprofloxacin auszugehen (Loenenbach et al., 2015). Aber auch gegen Cephalosporine konnten initial zunehmende Resistenzen nachgewiesen werden, seit 2010 zeigen sich die Resistenzen jedoch wieder abnehmend
(European Center for Disease Prevention and Control, 2017).
1.4.3 Chlamydia trachomatis
Die Infektion mit C. trachomatis ist die häufigste bakterielle STI weltweit.
Schätzungsweise sind 100,4 Mio. Erwachsene mit C. trachomatis infiziert (WHO, 2012).
Bei Frauen führt die Chlamydieninfektion zu Urethritis und Zervizitis. Es kann zu unspezifischen Symptomen kommen wie Unterleibschmerzen, Zwischenblutungen, vaginalem Ausfluss, postkoitalen Blutungen oder Dysurie. In den meisten Fällen verläuft die Infektion jedoch asymptomatisch (Turner et al., 2002), sodass nur ein Bruchteil der Erkrankungen diagnostiziert und therapiert wird. Eine Spontanheilung ist möglich, aber nicht die Regel (Molano et al., 2005; Morré et al., 2002).
Ungefähr 10-20 % der chlamydialen Zervizitiden aszendieren (Land und Evers, 2002;
Paavonen und Eggert-Kruse, 1999). Auch eine durch Chlamydien verursachte PID bleibt in vielen Fällen asymptomatisch (French et al., 2011), was sie von einer Gonokokken verursachten PID unterscheidet. In 33-40 % der PID-Fälle lässt sich C.
trachomatis nachweisen (Price et al., 2016; Ripa et al., 1980; Simms et al., 2006). Da in dieser und ähnlichen Studien nur Frauen mit symptomatischer PID untersucht wurden und chlamydiale PIDs häufig asymptomatisch verlaufen, ist demnach von einem deutlich größeren Anteil auszugehen.
Chlamydien-Infektionen verlaufen zudem häufig chronisch bzw. rekurrierend. 10-20
% der ausgeheilten Chlamydien-Infektionen kehren innerhalb von 12 Monaten zurück (Hosenfeld et al., 2009; Xu et al., 2011). Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen bieten die einzigartigen mikrobiologischen Eigenschaften der Chlamydien.
1.4.3.1 C. trachomatis – mikrobiologische Eigenschaften
C. trachomatis ist ein obligat intrazellulär lebendes Bakterium. Es lässt sich in mehrere Serovare einteilen. Die Serovare A-C infizieren die Konjunktiva und können bei chronischer Infektion zum Trachom führen, der häufigsten infektiösen Ursache für Erblindung (West, 2003).
Die Serovare D-K befallen ausschließlich den Urogenital- oder Darmtrakt. Die Serovare L1-L3 befallen regionäre Lymphknoten und verursachen das Lymphogranuloma venerum. Sie kommen vorwiegend in den Tropen vor.
C. trachomatis zeichnet sich durch seinen komplexen bi-phasischen Replikationszyklus aus: Die Elementarkörperchen sind etwa 0,3 µm groß und stellen die infektiöse Erscheinungsform der Chlamydien dar. Sie werden durch Endozytose vom Epithel aufgenommen. In der Zelle wandeln sie sich zu Retikularkörperchen, den ca. 1 µm großen, stoffwechselaktiven Formen, um. Die Retikularkörperchen vermehren sich durch binäre Teilung und füllen die infizierte Zelle nach und nach in einem sogenannten Einschlusskörperchen aus. Ca. 48 Stunden nach Infektion bilden sich die Retikularkörperchen wieder in Elementarkörperchen um (Choroszy-Król et al., 2012), sodass sie durch Exozytose oder nach Zugrundegehen der Wirtszelle andere Zellen infizieren können.
Zusätzlich zu diesen zwei Erscheinungsformen können Chlamydien atypische Retikularkörperchen ausbilden (s. Abb. 1). Bei ungünstigen Wachstumsbedingungen fahren die Retikularkörperchen ihren Stoffwechsel auf ein Minimum herunter und verändern ihre Morphologie, gekennzeichnet durch vergrößerte Retikularkörperchen in verkleinerten Einschlusskörperchen. Dieser Zustand wird als Persistenz bezeichnet und ist reversibel. Sobald die Wachstumsbedingungen sich bessern, wandeln sich die atypischen Retikularkörperchen wieder in stoffwechselaktive und teilungsfähige Retikularkörperchen um (Beatty et al., 1994).
Diverse Stimuli können den Übergang in die Persistenz induzieren. Bisher beschrieben wurden sub-inhibitorische Antibiotikagaben, IFN-γ, Tryptophan-, Glucose- und Eisenmangel (Jones et al., 2001; Lambden et al., 2006; Mpiga und Ravaoarinoro, 2006).
IFN-γ ist ein Zytokin, das nach Antigenkontakt v.a. von T-Zellen ausgeschüttet wird.
Es wirkt über die Aktivierung des Wirtsenzyms Indolamin-2,3-Dioxigenase, welches Tryptophan abbaut, sodass das Angebot an Tryptophan sinkt. Da Chlamydien auf Tryptophan in der Umgebung angewiesen sind, geraten sie in eine Mangelsituation. Je nachdem, wie ausgeprägt der Tryptophanmangel ist, sterben die Chlamydien oder gehen in die Persistenz. Ein nicht ausreichend hoher IFN-γ-Spiegel kann dazu führen, dass die Chlamydien nicht absterben, sondern ihr Übergang in die Persistenz induziert wird (Aiyar et al., 2014).
Abbildung 1: Entwicklungszyklus von C. trachomatis. Nach Internalisierung differenziert sich das Elementarkörperchen (EK) zum Retikularkörperchen (RK), der stoffwechselaktiven und teilungsfähigen Erscheinungsform. Bei guten Wachstumsbedingungen schließt sich die Replikationsphase an. Bei Nährstoffmangel oder Anwesenheit anderer Stressoren wandelt sich das RK in eine persistente Erscheinungsform um. Sobald sich die Wachstumsbedingungen bessern, erfolgt die Re-Differenzierung zum RK und der Entwicklungszyklus setzt sich fort. Die RK wandeln sich wieder in EK um. Ca. 48 Stunden nach Infektion werden die EK durch Zelllyse oder Exozytose freigesetzt, damit sie ihren Entwicklungszyklus in benachbarten Zellen fortsetzen können.
In Zellkultur- Modellen konnte gezeigt werden, dass persistente Wachstumsformen durch Abwehrreaktionen des Immunsystems oder gezielte Antibiotika-Therapien nur schwer zu erreichen sind (Dreses-Werringloer et al., 2001). Dies mag eine Erklärung für den häufig chronischen bzw. rezidivierenden Verlauf von Chlamydien-Infektionen sein.
1.4.4 Andere Erreger und Risikofaktoren der PID
Ungefähr 25 % der diagnostizierten PIDs sind weder durch Gonokokken noch durch Chlamydien bedingt (Eschenbach et al., 1975; Soper et al., 1994).
Bei 13-17 % der PID-Patientinnen konnte Mycoplasma genitalium in der Zervix nachgewiesen werden (Haggerty and Taylor, 2011; Simms et al., 2003). Da sich dieses Bakterium schlecht kultivieren lässt, begann seine Erforschung erst mit Etablierung der Polymerase chain reaction (PCR) in den 1980er Jahren.
Während M. genitalium inzwischen als Verursacher der PID anerkannt ist (Haggerty, 2008; Ross, 2005), ist die Rolle von Ureaplasma urealyticum und Mycoplasma hominis bei der Entstehung der PID Gegenstand aktueller Forschung. U. urealyticum konnte in einer Studie im Iran häufiger im Zervixabstrich infertiler Frauen nachgewiesen werden als bei fertilen Kontrollen (Seifoleslami et al., 2015).
M. hominis ist mit dem Krankheitsbild der bakteriellen Vaginose (BV) assoziiert (Cox et al., 2016). Die BV ist keine Infektion im klassischen Sinne. Der Begriff beschreibt vielmehr eine Störung der physiologischen Vaginalflora: Lactobacillen, die mit ihrer Milchsäureproduktion für den physiologisch niedrigen pH-Wert sorgen, werden verdrängt und der vaginale pH-Wert steigt an. Das Milieu wird anfällig für floraferne Bakterien. Anaerobier, Gardnerella vaginalis und M. hominis können sich ungehindert vermehren. Die Abwesenheit der Lactobacillen erleichtert anderen STIs den Eintritt in den weiblichen Genitaltrakt. Patientinnen mit BV haben ein 3,4-fach erhöhtes Risiko für eine Chlamydien-Infektion und ein 4-fach erhöhtes Risiko für eine Infektion mit N. gonorrhoeae (Wiesenfeld et al., 2003). Damit steigt auch ihr Risiko für die Entwicklung einer PID (Eschenbach et al., 1988; Ness et al., 2005; Sweet et al., 1979).
Weitere Risikofaktoren der PID sind alle Umstände, die die Aszension erleichtern: Im Uterus einliegende Fremdkörper mit Verbindung zur Vagina (Spirale, Kupferkette, etc.), gynäkologische Eingriffe, eine protrahierte Geburt oder eine Konisation (Novy et al., 2009).
Des Weiteren gelten die allgemeinen Risikofaktoren der STIs auch für die PID:
Promiskuität, ungeschützter Geschlechtsverkehr, junges Alter beim ersten Geschlechtsverkehr und die Verwendung von Intimduschen (Simms et al., 2006).
1.4.5 Diagnostik einer infektiösen Infertilität
Da die infektiöse Infertilität aus einer Funktionsstörung der Eileiter, im Englischen tubal factor infertility (TFI), besteht, konzentriert sich ihre Diagnostik auf die
Tubenfunktion und den Nachweis der auslösenden Infektion. Eine zuverlässige Tubenfunktionsdiagnostik ist in der Durchführung aufwändig und invasiv. Deshalb werden vor der Abklärung einer TFI zunächst andere Ursachen der Unfruchtbarkeit abgeklärt. Anamnese, hormonelle Diagnostik, Unterbauchsonographie und das Spermiogramm erfolgen meist vor der Tubenfunktionsdiagnostik.
Mittels Hysterosalpingographie (HSG) kann die Durchgängigkeit der Eileiter durch Röntgenaufnahmen beurteilt werden. Hierfür wird der Patientin Kontrastmittel durch die Zervix in den Uterus injiziert. Sind die Tuben offen, kann man im Röntgenbild den Weg des Kontrastmittels durch Uterus und Tuben in die freie Bauchhöhle verfolgen. Aufgrund der Strahlenbelastung wurde dieses Verfahren in Deutschland jedoch von der Hysterosalpingosonographie abgelöst. Hierbei erfolgt die Darstellung des Kontrastmittelverlaufs sonographisch. Diese Untersuchung kann auch durch niedergelassene Gynäkologen erfolgen, ist allerdings stark vom Untersucher abhängig und erlaubt zudem, ähnlich wie die HSG, keine definitive Aussage über die Tubendurchgängigkeit (Exacoustos et al., 2013; Saunders et al., 2013).
Präzisere Befunde werden mittels laparoskopischer Chromopertubation erzielt.
Hierfür werden unter Vollnarkose Kamera und Trokare in die im Vorfeld mit CO2
aufgeblähte Bauchhöhle der Patientin eingeführt. Der Uterus wird dann retrograd mit einem blauen Farbstoff (meist Methylenblau) gespült. Es wird geprüft, ob der Farbstoff durch die Eileiter in die Bauchhöhle austritt. Vorteile dieser Untersuchung sind die präzise Darstellung der Tubendurchgängigkeit und die Möglichkeit zur Lösung leichter Verwachsungen in selbiger Sitzung. Die Untersuchung ist allerdings sehr aufwändig und invasiv. Sie ist wie jeder andere chirurgische Eingriff mit Risiken verbunden. Komplikationen wie Blutungen, Verletzungen der Bauchorgane, Infektionen oder Narkosezwischenfälle sind zwar selten aber dennoch möglich. Des Weiteren erhält man keine komplette Information über die Funktionsfähigkeit der Tuben. Trotz nachgewiesener Durchgängigkeit kann die Motilität oder Zilienfunktion dennoch durch Narben oder Verwachsungen eingeschränkt sein.
1.4.6 Diagnostik einer C. trachomatis-Infektion
Direkte Nachweisverfahren
Lange Zeit galt der kulturelle Erregernachweis als Goldstandard in der Diagnostik einer C. trachomatis-Infektion (Schoenwald et al., 1988). Das Verfahren wurde jedoch zunehmend von sensitiveren und standardisierbaren Methoden abgelöst, sodass inzwischen der Direktnachweis mittels PCR die Methode der Wahl zur Diagnostik einer genitalen Chlamdieninfektion ist (Watson et al., 2002). Er kommt vor allem bei Verdacht auf akute Infektionen zum Einsatz. Als Untersuchungsmaterial dient ein Vaginal- oder Zervixabstrich. Die Untersuchung von Erststrahlurin zeigt eine etwas geringere Sensitivität als die Untersuchung eines Vaginal- oder Zervixabstrich (Centers for Disease Control and Prevention, 2014; Watson et al., 2002) Um Aufwand und Kosten gering zu halten, kann für ein Screening (In Deutschland trägt die gesetzliche Krankenkasse die Kosten für ein jährliches Screening beschwerdefreier Frauen bis zum abgeschlossenen 25. Lebensjahr) auch ein von der Patientin selbst entnommener Vaginalabstrich verwendet werden. Er bietet die gleiche Sensitivität wie ein vom Arzt entnommener Vaginalabstrich, jedoch eine leicht erniedrigte Spezifität (Forney et al., 2010; Polaneczky et al., 1998).
Indirekte Nachweisverfahren
Bei chronifizierten oder aufgestiegenen Infektionen sind die Erreger häufig nicht mehr im Vaginal- oder Zervixabstrich nachweisbar, sodass ihr Direktnachweis invasive Maßnahmen erfordern würde. Des Weiteren erlaubt der Direktnachweis keine Aussagen über die Ausmaße der Entzündung oder über bereits überwundene Infektionen.
Da i.d.R. nur invasive Infektionen zu nachweisbaren Antikörperspiegeln führen (Black, 1997), bietet die Serodiagnostik in diesen Fällen eine wenig invasive und günstige Alternative.
Als Goldstandard in der serologischen Diagnostik galt jahrelang der Mikroimmunfluoreszenztest (MIF). Hierbei dienen aufgereinigte Elementarkörper als Antigen. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird fluoreszenzmikroskopisch sichtbar gemacht. Das Verfahren ist in seiner Durchführung sehr aufwändig. Die Interpretation ist anspruchsvoll, vom Untersucher abhängig und bietet nur
unspezifische Ergebnisse, sodass sich der MIF für die klinische Diagnostik nur bedingt eignet.
Inzwischen sind mit ELISA und Immunoblot Tests verfügbar, die eine automatisierte und standardisierte Durchführung erlauben. Als Antigene dienen aufgereinigte oder rekombinant hergestellte chlamydiale Proteine, sodass Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen andere Chlamydien-Spezies wie C. pneumoniae seltener vorkommen. Die Bindungsreaktion wird enzymatisch mittels Peroxidase sichtbar gemacht (s.a. 2.7.3).
Die Testverfahren erlauben eine Unterscheidung zwischen IgG und IgA (und ggf. auch IgM). Die Betrachtung der Antikörper-Konstellation erlaubt in einigen Fällen Rückschlüsse auf den Verlauf der Infektion. Antichlamydiale IgG bleiben über einen langen Zeitraum nachweisbar, auch wenn die aufgestiegene Infektion längst überstanden ist oder erfolgreich mit Antibiotika behandelt wurde (Malik et al., 2009;
Paavonen, 2012). Der IgA-Titer wiederum sinkt ca. 20 Wochen nach Therapie unter die Nachweisgrenze (Kasamatsu et al., 1989). Diese Erkenntnisse legen nahe, dass ein alleiniger IgG-Antikörper-Nachweis für eine ausgeheilte Infektion spricht, während ein zusätzlicher Nachweis von IgA-Antikörpern Hinweise für eine aktive Infektion (akut, chronisch oder rezidivierend) geben kann (Mazzoli et al., 1998; Verkooyen et al., 1997). Die Verlässlichkeit dieser Schlussfolgerungen ist allerdings sehr umstritten (Bax et al., 2003; Clad et al., 2000). Es gibt jedoch Hinweise dafür, dass der Nachweis von IgG gegen spezifische Epitope für eine invasive Infektion spricht (Forsbach-Birk et al., 2010).
1.5 Zusammenfassung und Fragestellung
Ca. ein Drittel der Fälle von ungewollter Kinderlosigkeit bei Frauen ist heute durch postinfektiöse Veränderungen hervorgerufen. Infektionen mit N. gonorrhoeae, C.
trachomatis und Mykoplasmen können vom unteren in den oberen Genitaltrakt aufsteigen und eine Entzündung der Organe des kleinen Beckens verursachen, die als sogenannte PID der infektiösen Infertilität vorausgeht.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, nach Hinweisen für infektiöse Infertilität in der Lebensgeschichte und im Lebensstil der Betroffenen zu suchen. Außerdem soll untersucht werden, welche Rolle C. trachomatis bei der Entstehung infektiöser
Infertilität spielt und wie gut sich seine direkten und indirekten Nachweisverfahren zur Diagnostik einer solchen Infertilität eignen. Hierfür werden Untersuchungsbefunde (Zervixabstriche, serologische Untersuchungen) und mittels Fragebogen erhobene Daten von Frauen mit infektiöser Infertilität mit denen von gesunden Frauen verglichen.
Dabei sollen insbesondere antichlamydiale Antikörper auf ihre diagnostische Aussagekraft hinsichtlich einer infektiösen Infertilität untersucht werden. Ein hinreichend sensitiver und spezifischer serologischer Test könnte die Diagnostik einer infektiösen Infertilität erleichtern und invasive Methoden ggf. ersetzen.
2 Material und Methoden
2.1 Ethikantrag
Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität zu Lübeck am 05.01.2012 genehmigt (Aktenzeichen 11-185). Die Studienteilnehmerinnen nahmen freiwillig an der Studie teil. Die Daten wurden anonym gespeichert.
2.2 Kollektiv der Kinderwunschpatientinnen
Im Zeitraum von Februar 2012 bis April 2013 wurden im Universitären Kinderwunschzentrum Lübeck 48 Patientinnen für die vorliegende Studie rekrutiert.
Es handelte sich dabei um Patientinnen, die sich dort aufgrund ungewollter Kinderlosigkeit erstmalig vorstellten. Es wurden nur Patientinnen eingeschlossen, die Schwierigkeiten hatten, schwanger zu werden. Patientinnen mit habituellen Aborten wurden aus der Studie ausgeschlossen.
Diese 48 Patientinnen bilden die Studiengruppe infektiöse Infertilität (INF) und die infertile Kontrollgruppe (KON-I).
2.3 Kollektiv der fertilen Kontrollgruppe
Für die fertile Kontrollgruppe (KON-F) wurden im Zeitraum von März 2012 bis Mai 2013 durch Herrn Dr. med. Reinhard Lettau (niedergelassener Gynäkologe in Lübeck) 99 Studienteilnehmerinnen rekrutiert.
In KON-F eingeschlossen wurden gesunde fertile Frauen, die im Rahmen der jährlichen gynäkologischen Kontrolluntersuchung auf die Studie aufmerksam gemacht wurden und sich zur Teilnahme bereit erklärten. Einschlusskriterien waren mindestens eine erfolgreich abgeschlossene Schwangerschaft und keine aktuell bestehende Schwangerschaft.
2.4 Kollektiv der Risikogruppe
Die Risikogruppe (RISK) besteht aus 63 Frauen, die im Zeitraum von März 2012 bis Juni 2013 das Zentrum für sexuelle Gesundheit in Berlin-Mitte aufsuchten. Das Zentrum richtet sich vornehmlich an Prostituierte und Menschen mit promiskem Lebensstil. Da viele von ihnen die deutsche Sprache nur rudimentär beherrschten, wurde der Fragebogen ins Englische und Thailändische übersetzt. Zudem stand vor Ort eine Dolmetscherin für Bulgarisch zur Verfügung.
2.5 Vorgehen
Allen Studienteilnehmerinnen wurde ein zweiseitiger Aufklärungsbogen ausgehändigt. Zusätzlich wurden sie von ihrem behandelnden Gynäkologen über die Studie aufgeklärt und es bestand die Möglichkeit, Fragen zu stellen. Nach Unterschreiben des Einwilligungsbogens wurden den Studienteilnehmerinnen im Rahmen der gynäkologischen Untersuchung jeweils zwei Abstriche von der Zervix uteri entnommen. Ein Abstrich wurde im UTM Medium für Viren, Chlamydien, Mykoplasmen und Ureaplasmen der Fa. Copan transportiert. Das Transportmedium ist mit Vancomycin, Colistin und Amphotericin B versetzt, um einer unkontrollierten Vermehrung der Begleitflora entgegenzuwirken. Dieser Abstrich diente dem direkten Nachweis von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae und Ureaplasma urealyticum mittels PCR.
Der zweite Zervixabstrich wurde in Amies Agar-Gel-Medium der Fa. Copan transportiert und von den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums Schleswig- Holstein, Campus Lübeck mittels Mikroskopie und Kultur ausgewertet.
Zur serologischen Diagnostik wurde den Studienteilnehmerinnen 10 ml venöses Blut entnommen, welches in Serumröhrchen der Fa. Sarstedt transportiert wurde.
Jede Teilnehmerin wurde zudem gebeten, einen fünfseitigen Fragebogen auszufüllen.
Der Fragebogen diente der Erfassung demographischer Daten wie Alter, Nationalität, Schulabschluss. Des Weiteren enthielt er Fragen zum Lebensstil und zur aktuellen allgemeinen Anamnese. Abgefragt wurden u.a. Nikotinkonsum, Antibiotika-
Einnahmen und vorrausgegangene Infektionskrankheiten. Es folgten Fragen zur gynäkologischen Anamnese u.a. zur gynäkologischen Betreuung, evtl. vorhandenem Ausfluss, sexuellen Gewohnheiten, Verhütungsmethoden, Anzahl der Sexualpartner und vorrausgegangenen extra- und intrauterinen Schwangerschaften, sowie zu Schwangerschaftsabbrüchen.
2.6 Labormaterial
2.6.1 Geräte
Heizblock PCH-2 Grants Instruments Ltd, Shepreth, Großbritannien Vortex-Schüttler Reax 2000 Heidolph Instruments GmbH, Schwalbach
Zentrifuge 5417R Eppendorf AG, Hamburg
Megafuge 2.0 R Heraeus Instruments GmbH, Hanau Light Cycler Zentrifuge Roche Diagnostics, Mannheim Light Cycler 480 II Roche Diagnostics, Mannheim
2.6.2 Verbrauchsmaterialien
Pipetten Eppendorf Reference Eppendorf AG, Hamburg 10, 100, 1000 μl
Pipettenspitzen Biosphere filter tips Sarstedt AG &Co, Nümbrecht 10, 100, 1000 μl
Reaktionsgefäße 1,5 ml Sarstedt AG &Co, Nümbrecht
2.6.3 Kits
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen N.V., Venlo, Niederlande LightMix Kit C.trachomatis TIB MOLBIOL, Berlin
LightMix Kit N.gonorrhoeae TIB MOLBIOL, Berlin
LightMix Kit U.urealyticum LC TIB MOLBIOL, Berlin recomLine Chlamydia IgG, IgA Mikrogen GmbH, Neuried recomWell Chlamydia trachomatis IgG, IgA Mikrogen GmbH, Neuried
2.7 Labormethoden
2.7.1 Mikroskopie und Kultur
Mikroskopie
Die Mikroskopie gibt einen ersten Eindruck über Aussehen und Anzahl der im Abstrichmaterial vorhandenen Bakterien. Mithilfe der Gramfärbung können die Bakterien in zwei große Gruppen (grampositiv und gramnegativ) eingeteilt werden, was wiederum Rückschlüsse auf den Aufbau der Zellwand zulässt. Grampositive Bakterien erscheinen blau, gramnegative rot.
Kultur
Das Abstrichmaterial wurde zur Kultivierung auf folgenden Nährböden ausgestrichen:
Columbia-Agar (CO2) Universalnährmedium mit Schafsblut, bebrütet unter 5-10%iger CO2-Atmosphäre
Mac Conkey Agar Selektivnährmedium für gramnegative Bakterien, Laktose-positive Bakterien (z.B. E.coli) erscheinen rot, Laktose-negative farblos
Columbia-Agar Universalnährmedium mit Schafsblut u.a. zur Bestimmung des Hämolyse-Verhaltens der Bakterien
Gardnerella-Selektiv-Agar Teilweise selektives Nährmedium zur Isolierung von Gardnerella vaginalis, bebrütet unter 5- 10%iger CO2-Atmosphäre. Garnerella vaginalis
wächst hier in Form von grauen Kolonien mit Hämolyse-Höfen
Alle Platten wurden bei 37°C bebrütet und nach 24 und 48 Stunden abgelesen und ausgewertet. Die Auswertung erfolgte semiquantitativ, d.h. es wurde eine ungefähre Aussage über die Anzahl der vorkommenden Bakterien getroffen (vereinzelt – mäßig – reichlich – massenhaft).
MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of Flight)
Die kultivierten Mikroorganismen werden mit einer Matrix auf einem metallischen Träger gemischt und anschließend mit einem Laser beschossen. Dabei verdampft die Matrix und die zu untersuchenden Moleküle werden ionisiert. Ein Detektor registriert die Ionen und wandelt sie in elektrische Signale um. Die Signale werden als Diagramm visualisiert und mit einer Datenbank abgeglichen. So können Bakterien und Pilze bis auf Subspeziesebene identifiziert werden.
2.7.2 DNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion
DNA-Extraktion
Zur DNA-Extraktion wurde das QIAmp DNA Mini Kit der Fa. Qiagen verwendet.
Die Lyse der zellulären Bestandteile stellte den ersten Schritt der DNA-Isolierung dar.
Dies geschah mit 20 μl Proteinase K, die gemeinsam mit 200 μl AL-Puffer zu 200 μl Abstrichmaterial gegeben wurde. Nach 15 sec. vortexschütteln wurde das Lysat 10 min. bei 56°C inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Ethanol zugegeben und erneut 15 sec. gevortext. Im nächsten Schritt wurde das Lysat auf die Filtersäulen gegeben und bei 8000 rpm zentrifugiert. Die Filtersäulen enthielten eine Silica-Membran, die mithilfe der Puffer-Salze die DNA adsorbiert. Die folgenden Schritte dienten dem Auswaschen der übrigen Bestandteile, die sich noch an der Membran befanden (Lipide, Proteine etc). Hierfür wurde die Filtersäule zwei Mal mit jeweils unterschiedlichen Waschpuffern gespült und zentrifugiert. Im letzten Schritt wurde die aufgereinigte DNA mit Elutions-Puffer von der Membran gelöst und in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. „polymerase chain reaction“; PCR) wurde 1984 von Kary Mullis entwickelt. Sie ermöglicht die Vervielfältigung von spezifischen DNA- Sequenzen und in diesem Fall zum Nachweis von Bakterien. Zum Einsatz kamen in der vorliegenden Studie die Testkits C. trachomatis, N. gonorrhoeae und U.
urealyticum LC der Fa. TIB MOLBIOL Berlin, die nach folgendem Schema verwendet wurden:
H20 6,6 μl
Mg 2,4 μl
Mix HybProbe 2,0 μl
Reagenz 2,0 μl
IC 2,0 μl
15,0 μl
DNA 5,0 μl
ges. 20,0 μl
Es wurde mit dem Light Cycler 480 II der Fa. Roche Diagnostics GmbH gearbeitet. Das Gerät sorgte mithilfe des Cyclerprogrammes von Tibmolbiol für die Durchführung der folgenden Schritte:
1) Denaturierung 95°C 10 min.
2) Denaturierung 95°C 5 sec.
3) Annealing 62°C 5 sec. 50 Zyklen
4) Elongation 72°C 15 sec.
Nach jedem Zyklus erfolgte eine photometrische Messung, welche Rückschlüsse auf die Konzentration der spezifischen DNA-Sequenzen erlaubt.
2.7.3 Serologische Untersuchungen
Das Blut wurde im Serum-Röhrchen 3 Minuten bei 3500 Upm in der Megafuge 2.0 R der Fa. Heraeus Instruments GmbH, Hanau zentrifugiert, damit im Anschluss das Serum abgetragen werden konnte. Die serologischen Untersuchungen wurden von Frau Angela Gravenhorst durchgeführt.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Es wurde der Enzymimmun-Test recomWell Chlamydia trachomatis IgG, IgA der Fa.
MIKROGEN GmbH, Neuried verwendet.
Das verdünnte Patientenserum wurde dafür auf Mikrotiterplatten (MTP) pipettiert.
Sind im Serum Chlamydien-Antikörper vorhanden, binden diese an die rekombinanten Chlamydia trachomatis Antigene (MOMP, TARP, CPAF), mit denen die MTP beschichtet ist. Nach dem Auswaschen der nicht gebunden Antikörper, wurde die MTP mit Konjugatlösung inkubiert. Diese enthält anti-humane IgG bzw. IgA, die mit einer Peroxidase verbunden sind. Nach erneutem Auswaschen, wurde Tetramethylbenzidin auf die MTP gegeben. Tetramethylbenzidin ist ein chromogenes Substrat, das nach Aktivierung durch die Peroxidase blau wird. Im Photometer wurde anschließend die Extinktion gemessen.
Immunoblot
Es wurde der Immunoblot recomLine Chlamydia IgG, IgA der Fa. MIKROGEN verwendet.
Rekombinante Chlamydien-Antigene (MOMP, OMP2, TARP, CPAF, HSP60) werden durch den Hersteller auf einer Nitrozellulose-Membran fixiert, die in Form von Teststreifen erhältlich ist.
Der Teststreifen wurde mit verdünntem Probandenserum inkubiert. Sind im Serum Chlamydien-Antikörper vorhanden, lagern sich diese an die Antigene des Teststreifens an. Durch einen anschließenden Waschschritt wurden alle nicht
gebundenen Antikörper entfernt. Im zweiten Schritt wurde der Teststreifen mit anti- human-Immunglobulin Antikörpern (IgG bzw. IgA), die mit einer Peroxidase gekoppelt sind, inkubiert. Die Peroxidase katalysiert eine Färbereaktion, die spezifisch gebundene Antikörper nach einem erneuten Waschschritt sichtbar macht.
Die Teststreifen wurden visuell ausgewertet, wobei ein vom Hersteller vorgegebenes Punktebewertungs-System bei der Interpretation der Ergebnisse half.
2.8 Statistik
Zur Erfassung der Daten wurde Microsoft Excel verwendet. Die statistische Auswertung erfolgte durch Frau Univ.-Prof. Dr. rer. biol. hum. Inke König aus dem Institut für Medizinische Biometrie und Statistik, Universität zu Lübeck. Die statistischen Tests wurden mithilfe der Statistik-Software R durchgeführt.
Binäre Datensätze wurden mittels exakten Tests nach Fisher ausgewertet. Berechnet wurde der p-Wert, ein 95% Konfidenzintervall und die dazugehörige Odd’s Ratio.
Ordinale Datensätze wurden mittels Wilcoxon-Rangsummen-Test mit Kontinuitätskorrektur ausgewertet. Auch hier wurde der p-Wert, ein 95%
Konfidenzintervall und die dazugehörige Odd’s Ratio berechnet. Diagramme und Tabellen wurden mittels Microsoft Excel erstellt.
Zur Beurteilung der untersuchten Nachweisverfahren wurden Sensitivität und Spezifität des jeweiligen Tests ermittelt (s. Tab. 1).
Die Sensitivität beschreibt die Anzahl der richtig positiv Getesteten im Vergleich mit der Anzahl aller Erkrankten:
Sensitivität = A / (A+C)
Die Spezifität gibt an, wie viele vom Test richtigerweise als gesund erkannt werden im Vergleich mit der Anzahl aller Gesunden:
Spezifität = D / (B+D)
krank gesund
pos. Befund A B
neg. Befund C D
Tabelle 1: 4-Feldertafel zur Ermittlung von Sensitivität und Spezifität eines Nachweisverfahrens
3 Ergebnisse
Der Ergebnisteil dieser Arbeit gliedert sich in vier Abschnitte. Der erste Abschnitt stellt zunächst die Studiengruppe, bestehend aus Frauen mit infektiöser Infertilität, vor. Um eventuelle Gemeinsamkeiten bzw. Charakteristika von Frauen mit infektiöser Infertilität identifizieren zu können, wird die Studiengruppe in den darauffolgenden Abschnitten zwei Kontrollgruppen und einer Risikogruppe gegenübergestellt.
Verglichen werden mittels Fragebogen erhobene Daten zu Anamnese und Lebensstil.
Im Anschluss werden die Befunde der Zervixabstriche und die Befunde der serologischen Untersuchungen zum Antikörperstatus verglichen.
Studiengruppe infektiöse Infertilität (INF)
Aus der Kinderwunschsprechstunde ließen sich prospektiv 48 Frauen für die vorliegende Studie rekrutieren. 21 von ihnen erfüllten unsere Kriterien für infektiöse Infertilität (siehe auch Abb. 2).
Abbildung 2:Ein- und Ausschlusskriterien der Gruppen INF und KON-I (s.a. Abschnitt 3.3); PCOS:
Poly-zystisches Ovar-Syndrom
Ausgewählt wurden Frauen mit unerfülltem Kinderwunsch, die keinen Uterus myomatosus, keine Endometriose und kein Syndrom der polyzystischen Ovarien hatten. Zusätzlich war bei ihnen entweder eine tubare Auffälligkeit bekannt (pathologische Chromopertubation oder Z.n. Adnexitis), Entzündungszeichen in der Douglas-Spülflüssigkeit oder der Partner nachweislich fertil.
3.1 Vergleich mit einer Gruppe von fertilen Frauen (KON-F)
Die Gruppe der Frauen mit infektiöser Infertilität wurde verglichen mit einer Gruppe von fertilen Frauen (KON-F). Diese Gruppe besteht aus 99 Frauen, die mindestens eine erfolgreich abgeschlossene Schwangerschaft hinter sich haben und bei der jährlichen Vorsorgeuntersuchung durch ihren Gynäkologen nach vorheriger Aufklärung in die Studie eingeschlossen wurden.
Zwischen den Gruppen wurden zunächst die Angaben aus dem Fragebogen verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Patientinnen der Gruppe INF mit einem Altersmedian von 35 Jahren signifikant jünger sind als die Patientinnen der Gruppe KON-F (Wilcoxon Rangsummentest mit Kontinuitätskorrektur; p=0,005). Das Durchschnittsalter in KON-F beträgt 37,5 Jahren. Der Median liegt bei 38 Jahren.
p-Wert
n (21*) % n (97*) %
Höchster Abschluss 0,47
keiner 1 4,8 2 2,1
Hauptschulabschluss 3 14,3 17 17,5
Realschulabschluss 10 47,6 52 53,6
Hochschulreife 1 4,8 16 16,5
Hochschulabschluss 6 28,6 10 10,3
INF KON-F
Tabelle 2: Höchster Abschluss der Gruppen INF und KON-F im Vergleich; statistischer Test: Wilcoxon Rangsummentest mit Kontinuitätskorrektur; *: Anzahl der Personen, die diese Frage beantwortet haben
In Hinsicht auf den höchsten Schulabschluss gibt es keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (siehe Tab. 2).
p-Wert
n (21*) % n (99*) %
Nikotinkonsum 0,19
ja 9 (21) 42,9 27 (99) 27,3
nein 12 (21) 57,1 72 (99) 72,7
STI in der Vorgeschichte 9 (17) 52,9 42 (87) 48,3 0,79
HPV 1 (9) 11,1 11 (62) 17,7 1
N. gonorrhoeae 0 (10) 0 1 (66) 1,5 **
C. trachomatis 6 (14) 42,9 6 (64) 9,4 0,006
Herpes genitalis 0 (10) 0 2 (66) 3 **
Treponema pallidum 0 (10) 0 0 (65) 0 **
Vaginalmykose 6 (13) 46,2 39 (72) 54,2 0,76
HIV 0 (11) 0 0 (65) 0 **
Hepatitis (B oder C) 0 (11) 0 0 (65) 0 **
INF KON-F
Tabelle 3: Nikotinkonsum und STI in der Vorgeschichte der beiden Gruppe INF und KON-F im Vergleich; statistischer Test: exakter Test nach Fisher; *: Anzahl der Personen, die die jeweilige Frage beantwortet haben; **: ein aussagekräftiger p-Wert lässt sich aufgrund der niedrigen Fallzahlen nicht ermitteln
Während in der Kontrollgruppe 27 von 99 Patientinnen (27,3 %) rauchen, sind in der Studiengruppe 9 von 21 Patientinnen (42,9 %) Raucherinnen. Der Unterschied ist nicht signifikant (siehe Tab. 3).
Auf die Frage, jemals eine sexuell übertragbare Infektion gehabt zu haben, antworteten 52,9 % der infektiös Infertilen mit ja. In der Kontrollgruppe KON-F waren es 48,3 %. Aufgrund der niedrigen Fallzahlen konnten nicht alle Erreger einzeln ausgewertet werden (siehe auch Tab. 3). Es zeigte sich, dass sich die Gruppen nur in Hinsicht auf Chlamydien-Infektionen unterscheiden. 42,9 % der infektiös Infertilen und 9,4 % der Fertilen geben an, einmal eine genitale Chlamydien-Infektion gehabt zu haben (p=0,006). Von einer Vaginalmykose waren 46,2 % (INF) bzw. 54,2
% (KON-F) schon einmal betroffen (p=0,76). Unter den Frauen mit infektiöser Infertilität können sich 11,1 % an eine HPV-Infektion erinnern, unter den Fertilen sind es 17,7 % (p=1).
3.1.1 Untersuchungen auf aktuell bestehende urogenitale Infektionen
Von den zwei entnommenen Zervixabstrichen wurde einer per Mikroskopie und Kultur auf pathogene Keime untersucht.
Abbildung 3: Kulturelle Untersuchung der Zervixabstriche der Gruppen INF (n=21) und KON- F (n=99) im Vergleich
Am deutlichsten unterscheiden sich die Gruppen in Bezug auf den Nachweis von Gardnerella vaginalis: Der Leitkeim der bakteriellen Vaginose ließ sich in 14,3 % (INF) bzw. 7,1 % (KON-F) der Fälle nachweisen. Mit einem p-Wert von 0,38 ist der Unterschied jedoch nicht signifikant. Ein Wachstum von Candida albicans zeigte sich im Zervixabstrich bei 2 von 21 (9,5 %) infektiös Infertilen und 12 von 99 (12,1 %) Fertilen (p=0,94). Streptokokken der Serogruppe B (Streptococcus agalactiae) ließen sich bei 9,5 % (INF) bzw. 12,1 % (KON-F) nachweisen. Bei 4,8 % der infektiös Infertilen und 10,1 % der Fertilen fand sich E. coli im Abstrichmaterial (p=1). Keiner der Unterschiede ist statistisch signifikant (siehe Abb. 3).
p-Wert
n (21) % n (99) %
C. trachomatis 3 14,3 14 14,1 1
N. gonorrhoeae 0 0 0 0 *
U. urealyticum 5 23,8 20 20,2 0,77
INF KON-F
Tabelle 4: Direktnachweis von C. trachomatis, N. gonorrhoeae und U. urealyticum der Gruppen INF und KON-F im Vergleich; schwach positive und grenzwertige Ergebnisse wurden als negativ gewertet;
statistischer Test: exakter Test nach Fisher; *: ein aussagekräftiger p-Wert lässt sich aufgrund der niedrigen Fallzahlen nicht ermitteln
Der zweite entnommene Zervixabstrich diente dem Direktnachweis von C.
trachomatis, N. gonorrhoeae und U. urealyticum mittels PCR.
C. trachomatis ließ sich bei 14,3 % (INF) bzw. 14,1 % (KON-F) nachweisen. N.
gonorrhoeae war in beiden Gruppen nicht nachweisbar. U. urealyticum fand sich in 23,8 % bzw. 20,2 % der Abstriche. Hinsichtlich aktueller Infektionen durch oben genannte Bakterien zeigten sich also keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Eine Gegenüberstellung der Befunde ist Tab. 4 zu entnehmen.
3.1.2 Untersuchungen zum Antikörper-Status gegenüber C. trachomatis
Aufschluss über zurückliegende Infektionen kann die Serologie geben. Die Suche nach Antikörpern gegen C. trachomatis wurde mittels ELISA und Immunoblot durchgeführt (siehe auch Tab. 5).
p-Wert
n (21*) % n (99*) %
IgG 12 (19) 63,2 17 (89) 19,1 0,00026
IgA 9 (20) 45 11 (91) 12,1 0,0017
IgG 13 (21) 61,9 23 (99) 23,2 0,0011
IgA 5 (21) 23,8 14 (99) 14,1 0,3227
INF KON-F
Immunoblot ELISA
Tabelle 5:Gegenüberstellung der Ergebnisse von Immunoblot und ELISA der Gruppen INF und KON- F; fragliche Ergebnisse (Extinktionswerte im Graubereich, welcher vom Hersteller definiert ist als Bereich zwischen Extinktion Cutoff und Extinktion Cutoff + 20%) wurden vom Vergleich ausgeschlossen; statistischer Test: exakter Test nach Fisher; *: Anzahl der in den Vergleich eingehenden Proben
Bei 12 von 19 (63,2 %) infektiös Infertilen ließen sich im ELISA anti-chlamydiale IgG nachweisen, während diese nur bei 17 von 89 (19,1%) Fertilen nachweisbar waren (p=0,00026). Im Immunoblot zeigten sich 61,9 % (INF) und 23,2 % (KON-F) IgG positiv (0,0011). Der Unterschied zeigte sich also im ELISA deutlicher als im Immunoblot. IgA-Antikörper fanden sich im Immunoblot bei 23,8 % bzw. 14,1 % (p=0,32). Im ELISA waren es 45 % bzw. 12,1 % (p=0,0017). Auch bei den IgA ist der Unterschied zwischen den Gruppen im ELISA deutlicher.
Die nachgewiesenen Antikörper wurden mittels Immunoblot genauer untersucht und eingeteilt. Die Einteilung orientiert sich dabei an chlamydialen Proteinen. Hierbei handelt es sich um immunogene Proteine, die entweder auf der Zelloberfläche der Chlamydien lokalisiert sind oder anderweitig im Verlauf der Infektion mit dem Immunsystem des Wirts in Kontakt kommen und zur Bildung von Antikörpern führen.
INF KON-F OR p-Wert
IgG MOMP 47,6 20,2 3,545 0,0129
IgG OMP2 57,1 22,2 4,594 0,0026
IgG TARP 38,1 18,2 2,741 0,0758
IgG CPAF 57,1 19,2 5,511 8,00E-04
IgG HSP60 47,6 7,1 11,542 2,98E-05
IgA MOMP 4,8 8,1 0,571 1
IgA OMP2 4,8 0 ∞ 0,175
IgA TARP 23,8 3 9,696 0,0041
IgA CPAF 19 8,1 2,649 0,2202
IgA HSP60 14,3 1 15,74 0,0168
0,012 - 4,686 0,121 - ∞ 1,701 - 68,543 0,524 - 11,319 1,19 - 860,716 95% Konfidenzintervall
1,173 - 10,726 1,552 - 14,159 0,853 - 8,462 1,837 - 17,255 3,247 - 44,264
Tabelle 6:Antichlamydiale Antikörper im Immunoblot der Gruppen INF (n=21) und KON-F (n=99) im Vergleich; statistischer Test: exakter Test nach Fisher
Von den untersuchten IgG gegen diese Proteine waren alle bis auf IgG-TARP bei den infektiös Infertilen häufiger nachweisbar als in der Kontrollgruppe. 10 von 21 Patientinnen (47,6 %) waren IgG-MOMP positiv, in der Kontrollgruppe waren es 20 von 99 (20,2 %). IgG-OMP2 ließ sich bei 57,1 % der infektiös Infertilen und 22,2 % der Fertilen nachweisen. IgG-TARP fand sich in 38,1 % der INF-Seren und 18,2 % der KON-F-Seren. 57,1 % der Gruppe INF und 19,2 % der Kontrollgruppe waren IgG- CPAF positiv (p=0,00008). IgG-HSP60 fand sich im Serum von 47,6 % der infektiös Infertilen, im Serum der Fertilen bei 7,1 % (p=0,000003).
Unter den IgA zeigten nur die Nachweise von IgA-TARP (INF: 23,8 %; KON-F: 3 %) und IgA-HSP60 (INF: 14,3 %; KON-F: 1 %) signifikante Unterschiede. Eine vollständige Auflistung der Befunde ist Tab. 6 zu entnehmen.
Aus den erhobenen Daten lassen sich Sensitivität und Spezifität der einzelnen Antikörper für die Unterscheidung zwischen INF und KON-F berechnen (siehe Tab.
7).
Sensitivität Spezifität
IgG gesamt 0,619 0,768
IgG MOMP 0,476 0,798
IgG OMP2 0,571 0,778
IgG TARP 0,381 0,818
IgG CPAF 0,571 0,808
IgG HSP60 0,476 0,929
IgA gesamt 0,238 0,859
IgA MOMP 0,048 0,919
IgA OMP2 0,048 1
IgA TARP 0,238 0,97
IgA CPAF 0,19 0,919
IgA HSP60 0,143 0,99
Tabelle 7:Sensitivität und Spezifität des Immunoblots zur Unterscheidung von INF und KON-F
Mit einer Sensitivität von 0,619 besitzt IgG gesamt die höchste Sensitivität unter den untersuchten IgG. Die höchste Spezifität unter den untersuchten IgG besitzt IgG- HSP60 mit 0,929. Alle IgA zeigen eine hohe Spezifität (0,859-1) bei jedoch geringer Sensitivität (0,05-0,24). IgA gesamt und IgA-TARP zeigen die höchsten Sensitivitäten (jeweils 0,238), während IgA-OMP2 die höchste Spezifität (1) aufweist.
3.2 Vergleich mit einer Gruppe von infertilen Frauen (KON-I)
Um zu testen, ob die ermittelten Merkmale auch eine Unterscheidung zwischen Frauen mit infektiöser Infertilität und Frauen mit Infertilität anderer Genese erlauben, wird die Gruppe INF einer Gruppe von Frauen gegenübergestellt, die aus anderen Gründen infertil sind. 27 Patientinnen der Kinderwunschsprechstunde, die die Kriterien für infektiöse Infertilität nicht erfüllten, bilden die infertile Kontrollgruppe KON-I (siehe Abb. 2).
Die Patientinnen der Kontrollgruppe KON-I sind im Durchschnitt 31,8 Jahre alt. Der Altersmedian liegt bei 32 Jahren. Sie sind jünger als die Patientinnen der Gruppe INF mit einem Median von 35 Jahren. Der Unterschied ist allerdings nicht signifikant.
Auch in Hinsicht auf Nikotinkonsum und den höchsten Schulabschluss unterscheiden sich die Gruppen statistisch nicht.
STI in der Vorgeschichte
Die Angaben zu STI in der Vorgeschichte sind wie in 3.1 aufgrund niedriger Fallzahlen nicht vollständig auswertbar. 42,9 % der Frauen aus der Gruppe INF erinnern sich an eine durchgemachte C. trachomatis-Infektion, während sich in der infertilen Kontrollgruppe nur 5,6 % der Frauen an eine solche Infektion erinnern (p=0,03). Die Angaben zur Vaginalmykose unterscheiden sich zwischen den Gruppen nicht.
p-Wert
n (21*) % n (27*) %
Höchster Abschluss 0,472
keiner 1 (21) 4,8 1 (25) 4
Hauptschulabschluss 3 (21) 14,3 1 (25) 4
Realschulabschluss 10 (21) 47,6 13 (25) 52
Hochschulreife 1 (21) 4,8 2 (25) 8
Hochschulabschluss 6 (21) 28,6 8 (25) 32
Nikotinkonsum 0,36
ja 9 (21) 42,9 7 (25) 28
nein 12 (21) 57,1 18 (25) 72
STI in der Vorgeschichte 9 (17) 52,9 14 (24) 58,3
HPV 1 (9) 11,1 0 (16) 0 **
N. gonorrhoeae 0 (10) 0 1 (19) 5,3 **
C. trachomatis 6 (14) 42,9 1 (17) 5,6 0,03
Herpes genitalis 0 (10) 0 0 (18) 0 **
Treponema pallidum 0 (10) 0 1 (18) 5,6 **
Vaginalmykose 6 (13) 46,2 12 (20) 60 0,49
HIV 0 (11) 0 0 (18) 0 **
Hepatitis (B oder C) 0 (11) 0 1 (18) 5,6 **
INF KON-I
Tabelle 8: Anamnestische Angaben der Gruppen INF (n=21) und KON-I (n=27) im Vergleich;
statistischer Tests Wilcoxon Rangsummentest mit Kontinuitätskorrektur (höchster Abschluss), exakter Test nach Fisher (Nikotinkonsum, STI in der Vorgeschichte); *: Anzahl der Personen, die diese Frage beantwortet haben; **: ein aussagekräftiger p-Wert lässt sich aufgrund der niedrigen Fallzahlen nicht ermitteln
3.2.1 Untersuchungen auf aktuell bestehende urogenitale Infektionen
Die Untersuchung der Zervixabstriche auf aktuelle Infektionen ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen INF und KON-I (siehe Tab. 9). Allerdings waren auch in dieser Kontrollgruppe Gardnerellen nur halb so häufig nachweisbar wie in der Studiengruppe: In der Kontrollgruppe zeigten 2 der 27 Zervixabstriche (7,4 %) in der Kultur ein Gardnerellen-Wachstum, während es in der Studiengruppe mit 14,3 % doppelt so viele waren (p=0,64). Auch der Nachweis aller anderen Bakterien und Pilze unterschied sich statistisch nicht von dem der Studiengruppe.
In der PCR ließ sich bei 6 Patientinnen der Kontrollgruppe (22,2 %) C. trachomatis im Zervixabstrich nachweisen und bei 5 Patientinnen (18,5 %) U. urealyticum. Auch hier gibt es keine signifikanten Unterschiede zur Studiengruppe (siehe Tab. 9).
p-Wert
n (21) % n (27) %
Zervixabstrich: Kultur
Candida albicans 2 9,5 3 11,1 1
Streptococcus agalactiae 2 9,5 2 7,4 *
Gardnerella vaginalis 3 14,3 2 7,4 0,64
Escherichia coli 1 4,8 2 7,4 1
Klebsiella spp. 0 0 0 0 *
Zervixabstrich: PCR
C. trachomatis 3 14,3 6 22,2 0,71
N. gonorrhoeae 0 0 0 0 *
U. urealyticum 5 23,8 5 18,5 0,73
INF KON-I
Tabelle 9: Befunde der Zervixabstriche von INF (n=21) und KON-I (n=27) im Vergleich; *: ein aussagekräftiger p-Wert lässt sich aufgrund der niedrigen Fallzahlen nicht ermitteln
3.2.2 Untersuchungen zum Antikörper-Status gegenüber C. trachomatis
Im ELISA der Kontrollgruppe ließen sich bei 29,2 % der Frauen IgG bzw. bei 9,1 % IgA nachweisen. Damit unterscheiden sich diese Befunde signifikant von den Befunden der Studiengruppe (p=0,034 bzw. p=0,015).
Bei 8 von 27 Patientinnen (29,6 %) waren im Immunoblot antichlamydiale IgG
unterscheiden sie sich nur in Bezug auf IgG signifikant von der Studiengruppe (p=0,04).
Betrachtet man die einzelnen Proteine im Immunoblot, sind zwar alle Antikörper bis auf IgA-MOMP in der Studiengruppe häufiger nachweisbar, aber nur IgG-CPAF und IgG- HSP60 sind auch statistisch signifikant häufiger vertreten (siehe Tab. 10).
INF (%) KON-I (%) OR p-Wert
IgG MOMP 47,6 29,6 0,471 0,2402
IgG OMP2 57,1 29,6 0,324 0,0787
IgG TARP 38,1 18,5 0,377 0,1923
IgG CPAF 57,1 22,2 0,222 1,80E-02
IgG HSP60 47,6 11,1 0,144 8,00E-03
IgA MOMP 4,8 14,8 3,4 0,369
IgA OMP2 4,8 3,7 0,773 1
IgA TARP 23,8 11,1 0,408 0,272
IgA CPAF 19 14,8 0,744 0,716
IgA HSP60 14,3 0 0 0,077
0,009 - 63,337 0,055 - 2,439 0,120 - 4,607 0 - 1,812 0,119 - 1,780 0,081 - 1,213 0,079 - 1,636 0,050 - 0,876 0,021 - 0,703 0,303 - 179,529 95% Konfidenzintervall
Tabelle 10: Mittels Immunoblot ermittelte anti-chlamydiale Antikörper der Gruppen INF (n=21) und KON-I (n=27) im Vergleich; statistischer Test: exakter Test nach Fisher
Die Werte aus Tabelle 10 ergeben folgende Sensitivitäten und Spezifitäten:
Sensitivität Spezifität
IgG gesamt 0,619 0,704
IgG MOMP 0,476 0,704
IgG OMP2 0,571 0,704
IgG TARP 0,381 0,815
IgG CPAF 0,571 0,778
IgG HSP60 0,476 0,889
IgA gesamt 0,238 0,778
IgA MOMP 0,048 0,852
IgA OMP2 0,048 0,963
IgA TARP 0,238 0,889
IgA CPAF 0,190 0,852
IgA HSP60 0,143 1,000
Tabelle 11: Sensitivität und Spezifität des Immunoblots zur Unterscheidung von INF und KON-I
Der Nachweis von IgG gesamt im Immunoblot zeigt eine Sensitivität von 0,619 und eine Spezifität von 0,704 für das Erkennen von infektiöser Infertilität unter allen Kinderwunsch-Patientinnen. IgG-HSP 60 besitzt eine Sensitivität von 0,476 und eine Spezifität von 0,889. Des Weiteren zeigen IgG-CPAF und IgA-OMP2 eine Sensitivität von 0,571 und eine Spezifität von 0,778 (IgG-CPAF) bzw. 0,963 (IgA-OMP2).
3.3 Vergleich mit Risikogruppe (RISK)
Da Promiskuität und Prostitution Risikofaktoren für die Akquisition einer genitalen Chlamydieninfektion sind, wurde zusätzlich untersucht, wie die Studiengruppe sich von einer Risikogruppe (RISK) unterscheidet. Die Frauen der Gruppe RISK sind Patientinnen des Zentrums für sexuelle Gesundheit in Berlin-Mitte. Das Zentrum richtet sich vornehmlich an Personen mit promiskuitivem Lebensstil und Prostituierte. Es wird geprüft, ob die in 3.1 und 3.2 ermittelten Unterschiede auch im Vergleich mit dieser Risikokontrollgruppe Bestand haben.
RISK setzt sich zusammen aus 63 Frauen. Ihr Altersmedian liegt bei 28 Jahren. Die jüngste Studienteilnehmerin ist 18 und die älteste 57 Jahre alt. Wie in Tabelle 12 zu lesen, machte ca. die Hälfte von ihnen im Fragebogen Angaben zu STI in der Vergangenheit. 7 Frauen (22,6 %) berichten von einer Gonorrhoe in der Vorgeschichte. An eine genitale Chlamydien-Infektion können sich 31 % der Frauen erinnern.
p-Wert
n (21*) % n (63*) %
STI in der Vorgeschichte
HPV 1 (9) 11,1 4 (31) 12,9 1
N. gonorrhoeae 0 (10) 0 7 (31) 22,6 **
C. trachomatis 6 (14) 42,9 9 (29) 31 0,51
Herpes genitalis 0 (10) 0 2 (31) 6,5 **
Treponema pallidum 0 (10) 0 1 (32) 3,1 **
Vaginalmykose 6 (13) 46,2 15 (36) 41,7 1
HIV 0 (11) 0 0 (34) 0 **
Hepatitis (B oder C) 0 (11) 0 2 (35) 5,7 **
RISK INF
Tabelle 12: Angaben zu STI in der Vorgeschichte der Gruppen INF und RISK; statistischer Test:
exakter Test nach Fisher; *: Anzahl der Personen, die diese Frage beantwortet haben; **: ein
