Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2009
© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-08-7
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net
Tierärztliche Hochschule Hannover
Immunhistochemische Charakterisierung von olfaktorischen Rezeptorneuronen und Gliazellen
in der Riechschleimhaut des Hundes
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Patricia Petra Monika Bock aus Alzenau in Unterfranken
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Konstantin Wewetzer, Ph.D.
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
2. Gutachter: Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2009
Für Mama
und meine Familie
Wo kämen wir hin, wenn jeder sagte, wo kämen wir hin und keiner ginge, um zu sehen, wohin wir kämen, wenn wir gingen.
Kurt Marti
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits vorab veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht:
Bock P., Beineke A., Techangamsuwan S., Baumgärtner W., Wewetzer K.
(2007): Differential expression of HNK-1 and p75NTR in adult canine Schwann cells and olfactory ensheathing cells in situ but not in vitro. J. Comp. Neurol. 505: 572-585
Bock P., Rohn K., Beineke A., Baumgärtner W., Wewetzer K. (2009): Site-specific population dynamics and variable OMP expression in the adult canine olfactory epithelium. eingereicht
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Poster präsentiert:
Bock P., Beineke A., Baumgärtner W., Wewetzer K. (2007): Expression of HNK-1 by subpopulations of olfactory neurons and Schwann cells in the adult canine nasal mucosa in situ and its regulation in vitro.
7th meeting of the German Neuroscience Society, 31th Göttingen Neurobiology Conference, 29. März - 1. April 2007
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 4
2.1 Das olfaktorische System ... 4
2.1.1 Riechschleimhaut... 5
2.1.2 Vomeronasalorgan ... 10
2.1.3 Bulbus olfactorius... 11
2.2. Das regenerative Potential des olfaktorischen Systems und die Therapie von Rückenmarksverletzungen ... 12
2.2.1 Olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zellen ... 12
2.2.2 Morphologischer Phänotyp olfaktorischer Hüllzellen... 16
2.2.3 Molekularer Phänotyp olfaktorischer Hüllzellen... 18
2.2.4 Der Neurotrophinrezeptor p75NTR und das Zuckerepitop HNK-1 ... 19
2.3 Das molekulare Profil und das Verteilungsmuster von olfaktorischen Rezeptorneuronen ... 20
2.3.1 Antigenexpression olfaktorischer und vomeronasaler Rezeptorneurone... 21
2.3.2 Olfaktorische und vomeronasale Rezeptoren ... 23
3 Hypothesen und Ziele ... 24
4 Differential expression of HNK-1 and p75NTR in adult canine Schwann cells and olfactory ensheathing cells in situ but not in vitro ... 26
4.1 Abstract... 27
4.2 Introduction ... 28
4.3 Materials and Methods... 32
4.4 Results... 37
4.5 Discussion ... 48
4.6 Acknowledgments... 54
4.7 Literature cited ... 54
5 Site-specific population dynamics and variable OMP expression in the adult
canine olfactory epithelium... 63
5.1 Abstract... 64
5.2 Introduction ... 65
5.3 Materials and Methods... 68
5.4 Results... 71
5.5 Discussion ... 85
5.6 Acknowledgments... 91
5.7 References ... 91
6 Diskussion...100
6.1 Differentielle Expression von HNK-1 und p75NTR in olfaktorischen Hüllzellen und Schwann-Zellen in situ aber nicht in vitro...101
6.2 Morphologische und molekulare Heterogenität der Riechschleimhaut des Hundes ...105
6.3 Antigenexpression im kaninen Vomeronasalorgan ...109
6.4 Schlussbetrachtung ...111
7 Zusammenfassung...113
8 Summary...116
9 Literaturverzeichnis ...119
10 Anhang ...136
10.1 Ergänzendes Material zu Kapitel 4 und 5 ...136
10.2 Abkürzungen...137
11 Danksagung ...140
1 Einleitung
Traumatische Rückenmarksschäden des Hundes gehören zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen in der veterinärmedizinischen Praxis und entstehen entweder extrinsisch durch Unfälle (z.B. Autounfälle) oder intrinsisch durch Bandscheibenvorfälle (Macias et al., 2002; Itoh et al., 2008). Chondrodystrophe Hunderassen, wie z.B. Dackel und Pekinese, sind in besonderem Maße von Bandscheibenvorfällen betroffen, die meist mit großer Schmerzhaftigkeit und nicht selten mit permanenter Paralyse einhergehen (Bray und Burbidge, 1998; Itoh et al., 2007, 2008; Bruce et al., 2008). Trotz großer Fortschritte in der Entwicklung neuer Therapieansätze und chirurgischer Methoden ist die Prognose für betroffene Tiere in etwa 40% der Fälle schlecht bis infaust (Smith und Jeffery, 2006; Bull et al., 2008). In Deutschland sind etwa 5,3 Millionen Hunde in 13,4% der Haushalte registriert (Industrieverband Heimtierbedarf, 2006). Hierzu gehören neben Familienhunden z.B.
Blindenhunde und Begleithunde, die für viele Menschen eine große Hilfe im Alltag darstellen. Dies verdeutlicht die Relevanz der Forschung auf dem Gebiet kaniner Rückenmarksverletzungen.
Die Therapie von Rückenmarksverletzungen stellt bei Mensch und Tier nach wie vor eine große Herausforderung dar (Barnett und Riddel, 2007). Große Hoffnungen werden seit einigen Jahren in die Transplantation olfaktorischer Hüllzellen (olfactory ensheathing cells, OECs) gesetzt (Lu et al., 2001; Santos-Benito und Ramon-Cueto, 2003). OECs sind mit Schwann-Zellen eng verwandte Gliazellen der Riechnerven und des Bulbus olfactorius (Wewetzer et al., 2002), die zur Bildung der Glia limitans beitragen. Da OECs an der Grenzfläche zwischen zentralem (ZNS) und peripherem Nervensystem (PNS) vorkommen, und da die von OECs umhüllten Axone olfaktorischer Rezeptorneurone lebenslang in das ZNS einwachsen, wird ihnen ein besonderes regeneratives Potential zugesprochen, das dem der Schwann-Zelle überlegen sein soll (Graziadei und Monti Graziadei, 1985; Ramón-Cueto et al., 2000;
Toft et al., 2007). Zahlreiche Studien am Nagermodell haben in den letzten Jahren gezeigt, dass OECs tatsächlich die Regeneration im ZNS fördern (Barnett und Chang, 2004; Wewetzer et al., 2002). Da bislang jedoch nur wenige Studien zu
größeren Säugetieren oder zum Menschen vorliegen, ist zurzeit die Übertragbarkeit der am Nager erhobenen Befunde auf den Menschen schwer abzuschätzen. Das kürzlich eingeführte kanine Modell könnte in diesem Zusammenhang als translationales System für die klinische Nutzung wichtige Informationen liefern (Radtke et al., 2004; Féron et al., 2005; Jeffrey et al., 2005). Zudem werden selbst Befunde des Nagermodells zur Teit noch kontrovers diskutiert. (Harvey und Plant, 2006; Radtke und Wewetzer, 2009). Der in diesem Zusammenhang wichtigste Aspekt betrifft den Reinheitsgrad der bislang verwendeten OEC-Präparationen und die Frage, inwiefern zumindest einige der bislang berichteten regenerativen Eigenschaften von OECs tatsächlich auf kontaminierende Zellen, wie z.B.
Fibroblasten oder Schwann-Zellen, zurückzuführen sind. Zellsuspensionen des Bulbus olfactorius können aus den Hirnhäuten stammende Schwann-Zellen und Fibroblasten enthalten. Da zurzeit keine verlässlichen Zelltyp-spezifischen Marker für OECs oder Schwann-Zellen verfügbar sind, lässt sich der Anteil von Schwann-Zellen in den Dissoziaten nicht bestimmen. Die Tatsache, dass meningeale Fibroblasten regenerative Effekte besitzen, erschwert die Interpretation der Studien, die ungereinigte Bulbus olfactorius-Gesamtzellsuspensionen verwendeten (Li und Raisman 1994; Li et al., 1998). Neben dem Bulbus olfactorius können OECs auch aus Nasenschleimhaut-Bioptaten gewonnen werden (Bianco et al., 2004; Jani und Raisman, 2004; Ito et al., 2006). Da die Riechschleimhaut neben OECs jedoch auch Schwann-Zellen trigeminaler Afferenzen enthält, besteht hier ebenfalls das Problem der seleketiven Anreicherung bzw. Visualisierung von OECs (Harvey und Plant, 2006; Radtke und Wewetzer, 2009).
Das zentrale Problem bei der Einschätzung des regenerativen Potentials von OECs und Schwann-Zellen stellt somit die enge molekulare Verwandtschaft sowie der Mangel an Zelltyp-spezifischen Markern zur selektiven Visualisierung beider Zelltypen und zur Antikörper-gestützten Reinigung von OEC-Kulturen dar (Harvey und Plant, 2006; Wewetzer und Brandes, 2006). Es sind demnach noch ausgedehnte Studien über den molekularen Charakter und den Phänotyp von OECs und Schwann-Zellen nötig, um so die spezifischen Eigenschaften beider Zelltypen
genau zu definieren und die Grundlagen für einen möglichen therapeutischen Einsatz von OECs zu erarbeiten.
In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass sich kanine OECs in vitro signifikant von denen des Nagers unterscheiden und Gemeinsamkeiten mit Primaten-OECs aufweisen. So berichteten Krudewig et al. (2006), dass adulte kanine OECs im Gegensatz zur Ratte ohne Zusatz von Mitogenen proliferieren und nicht auf die Zugabe von den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöhenden Substanzen wie z.B.
Forskolin reagieren. Darüber hinaus zeichnen sich OECs des Primaten und des Hundes, nicht aber die der Ratte, durch eine stabile, über einen längeren Zeitraum erfolgende Expression des Neurotrophinrezeptors p75NTR aus. (Krudewig et al., 2006; Rubio et al., 2008). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Studien am Hundemodell, für den Hund als Patienten aber auch als translationales Modell zur Entwicklung neuer Therapieansätze für den Menschen.
2 Literaturübersicht
2.1 Das olfaktorische System
Das olfaktorische System von Säuger und Mensch gliedert sich in einen zentralen und einen peripheren Anteil. Der Bulbus olfactorius und der olfaktorische Kortex sowie weitere Hirnregionen, wie z.B. der Hypothalamus, in die der Bulbus olfactorius Projektionen entsendet, stellen den zentralen, das olfaktorische Epithel, der olfaktorische Nerv sowie die Nervenfaserschicht des Bulbus olfactorius den peripheren Anteil dar. Auch olfaktorische Hüllzellen (olfactory ensheathing cells, OECs) werden dem peripheren Anteil des olfaktorischen Systems zugeordnet (Asan, 2004; Franklin und Barnett, 2004). Des Weiteren findet sich beim Hund und anderen Tierspezies das am Boden der Nasenhöhle, bilateral in der Schleimhaut des Nasenseptums gelegene Vomeronasalorgan, auch Jakobsonsches Organ genannt, dessen Funktion mit der Chemorezeption von Pheromonen in Zusammenhang gebracht wird (Banks, 1986; Seiferle, 1992; Døving und Trotier, 1998; Asan, 2004).
Ein weiteres chemosensorisches Organ, das Septal Organ, auch Organ von Masera genannt, besteht aus einem kleinen Areal olfaktorischen Epithels, das im ventralen Bereich des Nasenseptums lokalisiert ist und dem vermutlich ebenfalls eine Rolle bei der Geruchswahrnehmung zukommt (Weiler und Farbman, 2003). Zudem findet sich bei verschiedenen Säugetieren eine Ansammlung von Neuronen im rostalen Teil des Nasenseptums, deren Axone zum Bulbus olfactorius ziehen. Hierbei handelt es sich um das Grüneberg Ganglion, dem möglicherweise ebenfalls chemosensorische Funktionen zukommen (Fleischer et al., 2006; Mamasuew et al., 2008). Auf die beiden letztgenannten Organe soll jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht näher eingegangen werden.
2.1.1 Riechschleimhaut
Die Riechschleimhaut beinhaltet das olfaktorische Epithel (OE) und erstreckt sich über ein tierartlich unterschiedlich großes Gebiet der Siebbein- und Nasenmuscheln sowie des kaudalen Nasenseptums (Read, 1908; Seiferle, 1992). Beim Hund nimmt die olfaktorische Region der Nasenschleimhaut etwa die Hälfte der Ethmoturbinalien und ein Drittel bis die Hälfte des Nasenseptums ein (Read, 1908). Die Fläche der Riechschleimhaut variiert bei den einzelnen Hunderassen. So wurde für den Dackel eine Riechfeldgröße von 74,84 cm2, für den Airedale Terrier eine Riechfeldgröße von 83,50 cm2 und für den Deutschen Schäferhund eine Riechfeldgröße zwischen 95,7 cm2 und 169,5 cm2 ermittelt (Wieland, 1938; Lauruschkus, 1942; Müller, 1955).
Makroskopisch lässt sich die olfaktorische Schleimhaut beim Hund sowie bei anderen Tierarten und beim Menschen anhand ihrer gelblichen Färbung, die auf einer Pigmentierung der Stützzellen beruht, von der respiratorischen Schleimhaut unterscheiden (Read, 1908; Bucher und Wartenberg, 1989; Seiferle, 1992; Skinner et al., 2005). Generell besteht das olfaktorische Epithel aus Mikrovillizellen, Stützzellen, olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORNs), Basalzellen und Bowmanschen Drüsen mit ihren Ausführungsgängen (Read, 1908; Seiferle, 1992;
Asan, 2004; Barnett und Chang, 2004; Abb. 2-1).
Mikrovillizellen besitzen einen birnenförmigen Zellkörper, der auf Höhe der Stützzellsomata im apikalen Drittel des Epithels gelegen ist. Sie weisen einen schmalen apikalen Fortsatz mit Mikrovillibesatz auf und kommen in einem zahlenmäßigen Verhältnis von etwa einer Mikrovillizelle auf 10-20 ORNs vor. Es lassen sich zwei Typen von Mikrovillizellen unterscheiden (Typ I und Typ II).
Während Typ I-Zellen vermutlich chemorezeptive Funktionen ausüben, ist die Bedeutung von Typ II-Zellen noch nicht geklärt (Asan, 2004).
modifiziert nach Barnett und Chang, (2004)
Abbildung 2-1: Schematische Darstellung des Riechepithels mit den von olfaktorischen Hüllzellen umgebenen olfaktorischen Axonen auf ihrem Weg zum Bulbus olfactorius.
Bei Stützzellen handelt es sich um längliche, zylindrische Zellen, die sich von der Basalmembran bis zur Oberfläche des olfaktorischen Epithels erstrecken und diesem somit Stabilität verleihen (Weiler und Farbman, 1998). Ihre die ovalen Kerne
enthaltenden Somata liegen einreihig in einer schmalen Zone im oberen Drittel des Epithels, unmittelbar apikal der ORNs und bilden so die am weitesten luminal gelegene Zellreihe (Weiler und Farbman, 1998). Ihr Zellleib verjüngt sich nach basal, da hier die Zellkerne der ORNs sowie die Basalzellen nahezu die gesamte Breite des Epithels einnehmen (Bucher und Wartenberg, 1989; Seiferle, 1992). Neben der Stabilisierung des Epithels wird den Stützzellen auch eine mögliche Rolle bei der Geruchswahrnehmung sowie bei der Neutralisierung toxischer Noxen zugesprochen (Getschell et al., 1984; Dahl und Gerde, 1994; Voigt et al, 1985). Darüber hinaus phagozytieren Stützzellen zu Grunde gegangene ORNs und verhindern deren direkten Kontakt untereinander (Suzuki et al., 1996; Weiler und Farbman, 1998).
ORNs, auch Riechzellen genannt, sind bipolare Neurone mit einem spindelförmig- erweiterten, den runden Zellkern enthaltenden Mittelteil (Bucher und Wartenberg, 1989; Berry et al., 1995). Sie sind vor allem im mittleren und basalen Drittel des Epithels lokalisiert und besitzen einen apikalen Dendriten, der sich knopfartig in das Lumen vorwölbt und eine unterschiedliche Anzahl, in der Regel sechs bis 14, Zilien trägt (Seiferle, 1992; Schwob, 2002). Die Axone der ORNs durchdringen die Basalmembran, werden in der Lamina propria von olfaktorischen Hüllzellen umgeben und vereinigen sich zu den Nervi olfactorii, die durch die Lamina cribrosa des Siebbeins hindurch über die Nervenfaserschicht in den Bulbus olfactorius eintreten (Bucher und Wartenberg, 1989; Seiferle, 1992; Franklin und Barnett, 2004). Das Riechepithel soll beim Menschen bis zu 30 Millionen, beim Dackel etwa 125 Millionen und beim Schäferhund etwa 225 Millionen ORNs enthalten (Müller, 1955; Asan, 2004). Studien bei Nager und Mensch zeigen, dass ORNs aufgrund ihrer ständigen Erneuerung im Riechepithel in unterschiedlichen Entwicklungsstadien vorliegen (Fabman, 1994; Franklin und Barnett, 2004). Während sich reife ORNs vorwiegend im mittleren Drittel des Epithels befinden, sind juvenile ORNs hauptsächlich im basalen Drittel lokalisiert (Verhaagen et al., 1989; Farbman, 1990; Nibu et al., 1999).
Die unreifen ORNs beginnen, einen axonalen Fortsatz sowie einen Dendriten auszubilden, welche zunächst den Bulbus olfactorius bzw. die Epitheloberfläche noch nicht erreichen (Farbman, 1994; Nibu et al., 1999). Im Laufe des Reifungsprozesses wandert der Zellkörper apikal, Axon und Dendrit wachsen zu
ihrer vollen Länge aus und an der Epitheloberfläche tritt der knopfartige Fortsatz des Dendriten in Erscheinung (Farbman, 1994). Einige Autoren beschreiben zudem, dass juvenile ORNs im Gegensatz zu reifen ORNs noch keine Zilien auf ihren apikalen dendritischen Fortsätzen tragen (Chuah et al., 1985; Farbman, 1994; Abb. 2-2).
Unmittelbar auf der Basalmembran liegt eine weitere Zellpopulation des Riechepithels, die Basalzellen. Man unterscheidet bei Nagern zwischen rundlichen (globose basal cells; GBCs) und horizontalen, eher länglichen Basalzellen (horizontal basal cells; HBCs; Schwob, 2002; Asan, 2004). GBCs liegen als apikale Schicht auf den HBCs und stellen vermutlich Vorläuferzellen für ORNs und für nicht-neuronale Epithelzelen dar (Graziadei und Graziadei, 1979a; Huard et al., 1998; Schwob, 2005;
Murdoch und Roskams, 2007). HBCs liegen unmittelbar auf der Basalmembran. Ihre Funktion ist noch nicht eindeutig geklärt. Vermutlich stellen sie Vorläuferzellen für GBCs und eventuell auch für ORNs dar (Mackay-Sim und Kittel, 1991; Murdoch und Roskams, 2007). Beim Hund existiert, ähnlich wie beim Menschen, lediglich eine Population von Basalzellen, die apikal der Basalmembran aufliegt (Hahn et al., 2005;
Skinner et al., 2005). Es wird angenommen, dass, zumindest beim Menschen, diese Basalzellen, wie GBCs beim Nager, als neuronale Vorläuferzellen dienen (Hahn et al., 2005). Es ist anzunehmen, dass dies auch für den Hund zutrifft, auch wenn diesbezüglich noch nähere Untersuchungen ausstehen.
modifiziert nach Farbman, (1990)
Abbildung 2-2: Verschiedene Reifestadien olfaktorischer Rezeptorneurone von der Basalzelle (B) zur reifen Riechzelle (3) mit apikalem Fortsatz und Zilien. In der Frühphase beginnen die unreifen, im basalen Drittel des Epithels gelegenen olfaktorischen Rezeptorneurone (1) einen Dendriten und ein Axon auszubilden. Im nächsten Reifestadium (2) schiebt sich der Zellkörper weiter nach apikal, das Axon hat den Bulbus olfactorius erreicht, jedoch noch keine Synapsen gebildet und der Dendrit wächst zur Epitheloberfläche, ohne jedoch das Lumen zu erreichen. S = Stützzelle; N = olfaktorischer Nerv; OEC = olfactory ensheathing cell, olfaktorische Hüllzelle.
2.1.2 Vomeronasalorgan
Das Vomeronasalorgan (VNO), auch Jakobsonsches Organ genannt, wurde 1813 von dem dänischen Anatom Ludvig Jacobson entdeckt (Døving und Trotier, 1998).
Es handelt sich hierbei um eine paarige, tubuläre Struktur, die parallel zum ventro- rostralen Teil des Nasenseptums orientiert ist, von einer knorpeligen oder knöchernen, dem Vomer zugehörigen Hülle umgeben wird, kaudal blind endet und rostral über den Ductus incisivus mit der Mund- und Nasenhöhle verbunden ist (Banks, 1986; Døving und Trotier, 1998; Seiferle, 1992; Dennis et al., 2003). Vögel, Fische, Krokodile und Chamäleons besitzen kein VNO (Døving und Trotier, 1998).
Beim Hund erstreckt sich das VNO bis etwa auf Höhe des zweiten und dritten Prämolaren. (Seiferle, 1992). Es wird angenommen, dass das VNO der Chemorezeption von Pheromonen dient und ihm daher eine herausragende Bedeutung für das Sozialverhalten des Hundes zukommt (Adams und Wiekamp, 1984; Døving und Trotier, 1998; Dennis, et al., 2003). Der rostrale Anteil des Vomeronasalorgans ist von respiratorischem Epithel, der kaudale Anteil auf seiner lateralen Seite von respiratorischem und auf seiner medialen Seite von olfaktorischem Epithel ausgekleidet (Banks, 1986). Respiratorisches Epithel kleidet beim Hund etwa ein Drittel bis ein Viertel des Lumens aus und geht in einer Übergangszone, der so genannten transitional zone, in sensorisches Epithel über (Dennis et al., 2003). Auch das Epithel des Vomeronasalorgans besteht aus Basalzellen, vomeronasalen Rezeptorneuronen (VRNs), Stützzellen und Drüsen (Dennis et al., 2003). Wie im olfaktorischen Epithel der Nasenschleimhaut vereinigen sich auch hier die Axone der VRNs und schließen sich zum Nervus vomeronasalis zusammen, der zum Bulbus olfactorius accessorius zieht (Seiferle, 1992; Døving und Trotier, 1998). Der Bulbus olfactorius accessorius ist dem Bulbus olfactorius dorsal aufgelagert und besitzt beim Nager einen dem Bulbus olfactorius vergleichbaren Aufbau, während er beim Hund lediglich aus einer Ansammlung undeutlich abgegrenzter glomerulärer Strukturen besteht (Salazar et al., 1992).
2.1.3 Bulbus olfactorius
Der Bulbus olfactorius, auch Riechkolben genannt ist eine paarige Struktur und stellt den am weitesten rostral gelegenen Anteil des Endhirns (Telencephalon) dar (Seiferle, 1992). Die beiden Riechkolben liegen in den Fossae ethmoideae des Siebbeins und grenzen mit ihren ventralen Flächen an die Lamina cribrosa, durch die die aus der Nasenschleimhaut stammenden Fila olfactoria in den Bulbus olfactorius eintreten (Seiferle, 1992; Asan, 2004). Der Bulbus olfactorius ist durch einen laminären Aufbau gekennzeichnet. Die periphere Schicht, das Stratum fibrosum externum, wird von den Fila olfactoria gebildet. Diese endigen in dicht verästelten Endbäumchen, welche mit den Dendritenverzweigungen der Mitral- und Büschelzellen die Glomerula olfactoria bilden. Auf dieses Stratum glomerulosum, das zudem die äußere Körnerschicht (Stratum granulosum externum) beinhaltet, folgt die äußere plexiforme Schicht (Stratum plexiforme externum), in der große und kleine Büschelzellen, Endigungen der inneren Körnerzellen sowie Dendriten der Mitralzellen zu finden sind. Die Mitralzellen selbst bilden das an die äußere plexiforme Schicht angrenzende Stratum mitrale und senden jeweils einen Hauptdendrit zu einem Glomerulum (Berry et al., 1995). Ihre Axone durchqueren die angrenzende innere plexiforme Schicht (Stratum plexiforme internum) und bilden schließlich den Tractus olfactorius. Die innere Körnerschicht schließlich (Stratum granulosum internum) enthält kleine Nervenzellen (innere Körnerzellen), die Impulse von den Mitralzellen erhalten und diese hemmend beeinflussen (Seiferle, 1992; Berry et al., 1995).
2.2 Das regenerative Potential des olfaktorischen Systems und die Therapie von Rückenmarksverletzungen
ORNs sind aufgrund ihrer exponierten Lage in der Nasenschleimhaut ständigen Umwelteinflüssen und Schädigungen durch z.B. Toxine, bakterielle oder virale Infektionserreger oder Traumata ausgesetzt. Das Riechepithel besitzt die einzigartige Fähigkeit, ORNs regelmäßig aus Basalzellen nachzubilden (Graziadei und Monti Graziadei, 1983; Mackay-Sim und Kittel, 1991; Caggiano et al., 1994). Die Axone der neu gebildeten ORNs treten in den Bulbus olfactorius ein und etablieren in den Glomerula olfactoria synaptische Verbindungen mit den Mitralneuronen des Bulbus olfactorius. (Raisman, 1985). Dies ist eine außergewöhnliche Eigenschaft, da periphere Neurone in der Regel nicht in der Lage sind, in das zentrale Nervensystem adulter Säugetiere einzuwachsen (Raisman, 1985; Wewetzer und Brandes, 2007).
2.2.1 Olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zellen
Die außergewöhnliche Fähigkeit des olfaktorischen Systems, lebenslange Neurogenese zu betreiben, liegt im Vorhandensein neuronaler Stammzellen im olfaktorischen Epithel begründet (Graziadei und Graziadei, 1979b; Mackay-Sim und Kittel, 1991; Franceschini und Barnett, 1996; Fairless und Barnett, 2005). Zudem wird bislang angenommen, dass olfaktorische Hüllzellen für die Entwicklung und das gerichtete Wachstum von neu gebildeten olfaktorischen Rezeptorneuronen eine entscheidende Rolle spielen (Raisman, 1985; Field et al., 2003; Santos-Benito und Ramón-Cueto, 2003). Bei olfaktorischen Hüllzellen (olfactory ensheathing cells, OECs) handelt es sich um Gliazellen des olfaktorischen Systems, die die Axone der olfaktorischen Rezeptorneurone umhüllen und sie auf dem Weg vom olfaktorischen Epithel, durch die Lamina cribrosa hindurch, bis zur Nervenfaserschicht des Bulbus olfactorius begleiten (Ramón-Cueto und Avila, 1998; Au und Roskams, 2003; Field und Raisman, 2003; Franklin und Barnett, 2004; Wewetzer und Brandes, 2007).
OECs sind somit gleichzeitig Bestandteil des PNS und des ZNS (Raisman, 1985;
Field and Raisman, 2003; Santos-Benito und Ramón-Cueto, 2003). Sie entwickeln sich aus der olfaktorischen Plakode, einer Struktur, die in der rostrolateralen Region des embryonalen Kopfes lokalisiert ist (Doucette, 1991; Ramón-Cueto und Avila, 1998; Franklin und Barnett, 2004). Lange Zeit wurden OECs in Anlehnung an die Terminologie der Glia peripherer Nerven als olfaktorische Schwann-Zellen bezeichnet (Gasser, 1956; De Lorenzo, 1957; Cuschieri und Bannister 1975).
Nachfolgende Studien erbrachten jedoch Unterschiede zwischen OECs und Schwann-Zellen hinsichtlich Entwicklung und Morphologie sowie Ähnlichkeiten von OECs und Astrozyten (Barber und Lindsay, 1982; Chuah und Au, 1991). Dies führte zur Etablierung des Begriffs der „olfaktorischen Hüllzelle“ als ein intermediärer Zelltyp, der sowohl Eigenschaften peripherer als auch zentraler Glia in sich vereint (Ramón-Cueto und Valverde, 1995; Chuah und West, 2002; Wewetzer et al., 2002;
Fairless und Barnett, 2005).
OECs gilt seit einigen Jahren ein besonderes Interesse wegen ihres vermuteten regenerationsfördernden Potentials (Franklin und Barnett, 2000; Li et al., 2007).
Diese Annahme basiert vor allem auf dem engen Kontakt der OECs zu den sich lebenslang neu bildenden ORNs. (Ramón-Cueto und Nieto-Sampedro, 1994;
Raisman, 2001). Man vermutet, dass OECs nicht nur das Wachstum der Axone in PNS und ZNS fördern, sondern auch ihren Eintritt in das ZNS ermöglichen (Li et al., 2005a; Raisman and Li, 2007). So entstand die Idee eines möglichen therapeutischen Einsatzes dieser Zellpopulation zur Therapie von Rückenmarksverletzungen (Chuah und West, 2002; Au und Roskams, 2003; Fairless und Barnett, 2005).
Seit einigen Jahren wird intensiv an der Transplantation regenerationsfördernder Zellen in geschädigte Rückenmarksareale geforscht. Befunde von Aguayo et al.
(1981) zeigten am Nager-Modell, dass in das ZNS implantiertes peripheres Nervengewebe axonales Wachstum zu steigern vermag. Daher und da Axone im PNS eine relativ gute Regenerationsfähigkeit besitzen, lag zunächst das Augenmerk auf der Transplantation von Schwann-Zellen. Man nahm an, dass diese ein geeignetes Substrat bilden, welches das axonale Wachstum geschädigter Neurone im ZNS stimulieren könnte (Cajal, 1928; Santos-Benito und Ramón-Cueto, 2003).
Problematisch ist, dass es nach Verletzungen des Rückenmarks zu einer reaktiven Astrogliose mit Bildung einer so genannten Glianarbe kommt, welche die Heilung und das gerichtete axonale Wachstum behindert (Verdú et al., 2001; Santos-Benito und Ramón-Cueto, 2003; Barnett und Chang, 2004). Zudem ist es für die erfolgreiche Regeneration von entscheidender Bedeutung, dass eine Remyelinisierung der geschädigten und der sich neu bildenden Nervenfasern erfolgt (Lakatos et al., 2000). Ziel muss es daher sein, Zellen in das betroffene Rückenmarksareal zu transplantieren, die der glialen Narbenbildung entgegenwirken und gleichzeitig axonales Wachstum und Remyelinisierung fördern (Barnett et al., 2000; Barnett und Chang, 2004). Schwann-Zellen erwiesen sich hinsichtlich dieser Kriterien als nicht ideal, da diese in Gegenwart von Astrozyten eine geringe Überlebensrate und geringe Remyelinisierung aufwiesen (Guénard et al., 1994;
Lakatos et al., 2000). OECs hingegen scheint die Anwesenheit von Astrozyten nicht negativ zu beinflussen, was auf ihre natürliche Co-Existenz mit Astrozyten im Bulbus olfactorius zurückzuführen sein könnte (Bartolomei und Greer, 2000; Lakatos et al., 2000; Fairless und Barnett, 2005). Es wurde sogar postuliert, dass transplantierte OECs im Gegensatz zu Schwann-Zellen dazu beitragen, dass sich Astrozyten- Fortsätze in geschädigten Rückenmarksregionen neu anordnen und dass OECs einen Kanal bilden, durch den regenerierte Axone hindurch treten können (Li et al., 2005a,b). Zudem ist beschrieben, dass OECs nach Transplantation in photochemisch geschädigtes Rückenmark der Ratte die auftretende Astrozytose minimieren (Verdú et al., 2001). Von großer Bedeutung für einen möglichen Einsatz von OECs in der Therapie von Rückenmarkserkrankungen ist darüber hinaus die Tatsache, dass OECs, obwohl in situ unter normalen Bedingungen nicht- myelinisierend, in vitro in der Lage sind, Axone zu myelinisieren (Devon und Doucette, 1992; Li et al., 1998; Barnett et al., 2000).
Aus den genannten Gründen und weil OECs, anders als Schwann-Zellen, physiologischerweise im zentralen Nervensystem vorkommen, geht man davon aus, dass die Transplantation von OECs in das geschädigte ZNS bessere therapeutische Ergebnisse erzielt als die von Schwann-Zellen (Lakatos et al., 2000; Raisman, 2001;
Li et al., 2005a). Durchgeführte in vivo-Versuche bei Nagern bestätigten die
Annahme, dass durch transplantierte OECs axonale Remyelinisierung und Regeneration sowohl im peripheren Nervensystem (Verdú et al., 1999) als auch im Rückenmark stimuliert werden können (Santos-Benito und Ramon-Cueto, 2003;
Ramón-Cueto et al., 2000; Lu et al., 2001; Toft et al., 2007). Allerdings kann nicht völlig ausgeschlossen werden, dass die transplantierten OEC-Kulturen möglicherweise Schwann-Zell-Kontaminationen der Hirnhäute enthielten, was das regenerative Potential der OECs in Frage stellen würde (Harvey und Plant, 2006).
Da die ausgeprägten morphologischen Unterschiede von OECs und Schwann-Zellen in Kultur verloren gehen, wird darüber hinaus z.T. postuliert, dass es sich bei OECs und Schwann-Zellen gar nicht um verschiedene Zellpopulationen handelt, sondern dass OECs ihren spezifischen Phänotyp erst durch den Kontakt mit den Axonen olfaktorischer Rezeptorneurone entwickeln (Wewetzer und Brandes, 2006; Wewetzer und Brandes, 2007). Es sind demnach noch detaillierte Studien nötig, um die wirkliche Identität und den Nutzen der OECs für die Therapie von Rückenmarkserkrankungen zu ergründen.
Um zu überprüfen, ob sich die bisher bei Nagern erzielten therapeutischen Erfolge auf größere Spezies übertragen lassen, wurden Versuche mit adulten kaninen OECs durchgeführt. Die Studien zeigten, dass diese zum einen in der Lage sind, das Rückenmark von Ratten zu remyelinisieren (Smith et al., 2002) und dass zum anderen die autologe Transplantation adulter kaniner OECs möglich ist (Jeffery et al., 2005). Diese Untersuchungen sind nicht nur aus veterinärmedizinischer Sicht als therapeutischer Ansatz für den Hund, sondern auch aus vergleichenden Aspekten interessant, da der Hund ein translationales Modell zwischen Nager und Mensch für die Erforschung und Therapie von Rückenmarksverletzungen darstellt (Smith et al., 2002; Jeffery et al., 2006; Krudewig et al., 2006). Die Etablierung des Hundes als translationales Modell begründet sich hauptsächlich durch die vergleichbare Größe und Struktur von kaninem und humanem Rückenmark und dadurch, dass Rückenmarksverletzungen beim Hund, ähnlich wie beim Menschen, natürlicherweise, z.B. nach Bandscheibenvorfällen oder Traumata, relativ häufig auftreten (Janssens, 1990; Smith et al., 2002; Skinner et al., 2005; Krudewig et al., 2006). Die Tatsache, dass Rückenmarksverletzungen Veterinär- und
Humanmediziner vor ähnliche klinische Probleme stellen, unterstreicht die Bedeutung des kaninen Modells, zur Überprüfung der Effizienz und möglicher Komplikationen einer OEC-Transplantation, bevor Studien am Menschen durchgeführt werden (Smith et al., 2002; Jeffery et al., 2005). Zwar gibt es erste Berichte über komplikationslose autologe Transplantation von OECs beim Menschen, jedoch liegen noch keine Erkenntnisse über den tatsächlichen Nutzen eines solchen Eingriffes vor (Féron et al., 2005).
2.2.2 Morphologischer Phänotyp olfaktorischer Hüllzellen
Voraussetzung für die weitergehende Forschung auf dem Gebiet der OEC- Transplantation und für die Beurteilung des regenerativen Potentials von OECs ist die Gewinnung reiner OEC-Kulturen, das heißt Kulturen, die nicht durch z.B.
Schwann-Zellen „kontaminiert“ sind (Wewetzer et al., 2002; Mackay-Sim, 2005).
Prinzipiell besteht die Möglichkeit, OECs sowohl aus dem Bulbus olfactorius als auch aus der Riechschleimhaut zu gewinnen (Féron et al., 1998; Bianco et al., 2004). Die Isolierung olfaktorischer Hüllzellen aus dem Bulbus olfactorius ist allerdings mit einem nicht unerheblichen chirurgischen Aufwand und einer daraus resultierenden großen Belastung für den Patienten verbunden und hat zudem eine irreversible Schädigung und einen Verlust des Geruchssinns des Patienten zur Folge (Bianco et al., 2004; Jani und Raisman, 2004). Demgegenüber kann aus der Riechschleimhaut mittels Biopsie auf vergleichsweise einfachem Wege Gewebe entnommen werden (Lu et al., 2001; Au und Roskams, 2003; Jani und Raisman, 2004; Skinner et al., 2005). Um diese Methode allerdings klinisch zu etablieren, bedarf es einer genauen phänotypischen und molekularbiologischen Charakterisierung der OECs, sowohl in situ als auch in vitro. Da in der Riechschleimhaut sowohl OECs als auch Schwann- Zellen vorliegen, ist diese Charakterisierung insbesondere im Hinblick auf eine Antikörper-gestützte Reinigung von OEC-Kulturen von entscheidender Bedeutung (Wewetzer et al., 2002; Mackay-Sim, 2005).
OECs vereinen Eigenschaften peripherer (Schwann-Zellen) und zentraler (Astrozyten) Glia in sich, weshalb sie heute als intermediärer Zelltyp bezeichnet werden (Ramón-Cueto und Valverde, 1995; Chuah und West, 2002; Wewetzer et al., 2002; Fairless und Barnett, 2005). OECs sind in situ unter normalen Umständen nicht-myelinisierend und umgreifen, anders als Schwann-Zellen mit filigranen Fortsätzen Bündel von bis zu 150 Axonen (Field et al., 2003; Franklin und Barnett, 2004; Fairless und Barnett, 2005). Die Isolierung und Kultivierung von OECs und Schwann-Zellen führt zu einem Verlust zelltypspezifischer Eigenschaften und zur Entwicklung eines gemeinsamen Phänotyps (Wewetzer und Brandes, 2007). Beide Zellen besitzen in vitro eine spindelförmige, bi- bis tripolare Morphologie, was eine Differenzierung auf molekularer Ebene mittels zelltypspezifischer Marker nötig macht (Wewetzer und Brandes, 2007).
Wie bereits erwähnt, weisen OECs nicht nur Ähnlichkeiten mit Schwann-Zellen auf.
Studien von Doucette (1984) zeigten, dass OECs nicht nur die olfaktorischen Neurone umhüllen sondern auch einen Teil der Glia limitans auf der Oberfläche des Bulbus olfactorius bilden. Dies spricht für ihre Ähnlichkeit mit Astrozyten, aus denen sich die Glia limitans des Gehirns prinzipiell zusammensetzt (Zachary, 2007). Die Tatsache, dass OECs, nicht aber Astrozyten, ein elektronendichtes Zytoplasma besitzen, spricht jedoch gegen eine Zuordnung der OECs zur Gruppe der Astrozyten (Barnett et al., 1993). In Kultur lassen sich OECs aufgrund ihrer bipolaren Morphologie leicht von den sternförmigen Astrozyten unterscheiden (Perez Velazquez et al., 1996).
2.2.3 Molekularer Phänotyp olfaktorischer Hüllzellen
Trotz einer Vielzahl von Studien über die Transplantation von OECs bei Tier und Mensch, ist noch relativ wenig über ihre molekularen Eigenschaften bekannt (Féron et al., 2005; Wewetzer et al., 2002). Da jedoch, wie bereits erwähnt, die morphologischen Unterschiede von OECs und Schwann-Zellen in Kultur verloren gehen, ist eine Differenzierung beider Zellen auf molekularer Ebene von großer Wichtigkeit, um ihr regeneratives Potential nach Transplantation vergleichen zu können (Wewetzer et al., 2002; Wewetzer und Brandes, 2006). Hierbei muss berücksichtigt werden, dass das molekulare Profil der Zellen in vitro unter Umständen nicht mit der Markerexpression in situ, sprich in der Nasenschleimhaut oder dem Bulbus olfactorius, übereinstimmt, dass die Markerexpression vom Entwicklungszustand der Zellen (neonatal/adult) und von den Kulturbedingungen abhängt und dass tierartspezifische Unterschiede vorliegen können (Ramón-Cueto und Avila, 1998; Chuah und West, 2002; Wewetzer und Brandes, 2006).
Die Tatsache, dass OECs sowohl Astrozyten- als auch Schwann-Zell-spezifische Markermoleküle exprimieren, macht ihre Differenzierung in situ und in vitro schwierig (Wewetzer et al., 2002). Vergleichende in vitro-Studien am Nager-Modell zeigen, dass OECs in Kultur ein ähnliches antigenes Expressionsmuster aufweisen wie nicht-myelinisierende Schwann-Zellen. Beide Zellpopulationen exprimieren beispielsweise den Neurotrophinrezeptor p75NTR, das Kalzium-bindende Protein S- 100 und das Glykolipid O4 (Ramón-Cueto und Avila, 1998; Wewetzer et al., 2002;
Wewetzer et al., 2005). Auch das saure Gliafaserprotein (GFAP) wird von beiden Zellpopulationen in Kultur exprimiert, ist aber zugleich ein Marker für Astrozyten (Wewetzer et al., 2002; Ramón-Cueto und Avila, 1998). Die Differenzierung von OECs und Astrozyten stellt allerdings aufgrund der fehlenden p75NTR–Expression in Astrozyten kein größeres Problem dar (Smith et al., 2002). Dies macht deutlich, dass auch auf molekularer Ebene die eigentliche Herausforderung in der Differenzierung von OECs und Schwann-Zellen liegt (Wewetzer et al., 2002).
Die in vitro-Eigenschaften kaniner OECs wurden bislang nur unvollständig charakterisiert. Smith et al. (2002) zeigten, dass kultivierte kanine OECs die gleiche
Markerexpression aufweisen wie Nager-OECs. Allerdings fanden Krudewig et al.
(2006), dass sich die Morphologie von kaninen und Nager-OECs in Abhängigkeit des Wachstumsfaktors Forskolin unterscheidet. So zeigen kanine OECs nur unter Forskolin-Behandlung eine spindelförmige Morphologie, wohingegen Nager-OECs nur in Abwesenheit von Forskolin ein spindelförmiges Aussehen aufwiesen (Krudewig et al., 2006). Nicht zuletzt diese Beobachtung macht deutlich, wie wichtig es ist, nicht nur bei Maus und Ratte sondern auch beim Hund eine differenzierte molekulare Charakterisierung von OECs vorzunehmen und OEC- und Schwann-Zell- spezifische Marker in situ und in vitro zu identifizieren.
2.2.4 Der Neurotrophinrezeptor p75NTR und das Zuckerepitop HNK-1
Der niedrig-affine Neurotrophinrezeptor p75NTR ist seit langem als Marker für kultivierte OECs beschrieben (Ramón-Cueto und Avila, 1998; Wewetzer et al., 2002).
P75NTR gehört zur Familie der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptoren (TNFR) und bildet mit den Tyrosinrezeptorkinasen der Trk-Familie und mit Sortilin die Gruppe der Neurotrophin-Rezeptoren (Schweigreiter, 2006; Underwood und Coulson, 2008).
Nicht nur OECs sondern auch Schwann-Zellen exprimieren jedoch in Kultur p75NTR, was eine Differenzierung dieser beiden Zellarten mittels p75NTR unmöglich macht (Wewetzer et al, 2002). Im Gegensatz zur Expression in vitro stellen sich in situ lediglich nicht-mylinisierende Schwann-Zellen, nicht aber myelinisierende Schwann- Zellen und OECs, p75NTR-positiv dar (Jessen et al., 1990; Jessen und Mirsky, 1991).
Zur Differenzierung adulter OECs von Schwann-Zellen in Kultur ist demnach ein zelltypspezifischer Marker nötig.
Im Nervensystem interagieren die verschiedensten Zelltypen miteinander und bilden so ein präzises neuronales Netzwerk (Morita et al., 2008). Während dieser Prozesse sorgen mit Proteinen gekoppelte Zuckerepitope der Zelloberfläche für eine strukturelle Vielfalt dieser Proteine, was zu einer Regulation der Zell-Zell-Erkennung, der Zell-Interaktion und der Zellmigration führt (Kleene und Schachner, 2004). Zu
diesen Zuckerepitopen zählt auch das Human Natural Killer-1 (HNK-1) Epitop, welches eines der charakteristischsten Glykoepitope des zentralen Nervensystems darstellt (Schwarting et al, 1987; Morita et al, 2008). HNK-1 ist nur auf bestimmten Molekülen wie Zelladhäsionsmolekülen (NCAM, L1, P0 etc.), extrazellulären Matrix- Proteinen (Tenascin-R, Phosphacan etc.) und Glykolipiden (SGGL-1 und SGGL-2) vorhanden (Saghatelyan et al., 2000; Liedtke et al., 2001). Die Expression des HNK- 1-Epitops ist unter anderem mit der Interaktion zwischen Neuronen und Gliazellen sowie mit dem Wachstum astrozytärer Fortsätze assoziiert (Bronner-Fraser, 1987).
Bezüglich der angestrebten Differenzierung von OECs und Schwann-Zellen ist es von besonderem Interesse, dass HNK-1 im Nager-Modell von myelinisierenden Schwann-Zellen exprimiert wird (Martini und Schachner, 1986; Martini et al., 1988).
Erstaunlicherweise fanden Martini et al. (1994) und Saito et al. (2005) HNK-1 bei Nagern insbesondere in mit motorischen Axonen assoziierten, myelinisierenden Schwann-Zellen. Inwieweit dies auch für den Hund zutrifft, soll unter anderem in dieser Studie geklärt werden. Die Ergebnisse bei Ratte und Maus sowie die Tatsache, dass HNK-1 vor Kurzem beim Menschen als zelltypspezifischer Marker zur Differenzierung trigeminaler Schwann-Zellen von OECs beschrieben wurde, legt die Vermutung nahe, dass dieses Zucherepitop auch beim Hund als differentieller Marker eingesetzt werden könnte (Bianco et al., 2004).
2.3 Das molekulare Profil und das Verteilungsmuster von olfaktorischen Rezeptorneuronen
Da der Hund ein wichtiges translationales Modell für die Entwicklung neuer Therapien humaner Rückenmarksverletzungen darstellt, ist nicht nur die molekulare Charakterisierung kaniner OECs und deren Abgrenzung von Schwann-Zellen wichtig, sondern auch die detaillierte Untersuchung des kaninen olfaktorischen Epithels als klinisch zugängliche Quelle für OECs (Radtke und Wewetzer, 2009). Das besondere Interesse gilt in diesem Zusammenhang dem bislang nur spärlich untersuchten molekularen Profil von ORNs sowie dem Verteilungsmuster reifer und
unreifer ORNs innerhalb des olfaktorischen Epithels. Da OECs die Axone der ORNs umhüllen, könnte das Verteilungsmuster der ORNs wichtige Hinweise auf die Lokalisation olfaktorischer Hüllzellen geben, zumal diese bislang in situ nicht eindeutig mittels spezifischer Marker identifizierbar sind (Ramón-Cueto und Avila, 1998; Au und Roskams, 2003; Wewetzer und Brandes, 2007). Darüber hinaus soll ein Vergleich der Antigenexpression von adulten kaninen ORNs und adulten kaninen vomeronasalen Rezeptorneuronen (VRNs) erfolgen, um deren Ähnlichkeiten und Unterschiede in beiden olfaktorischen Subsystemen des Hundes näher zu beleuchten.
2.3.1 Antigenexpression olfaktorischer und vomeronasaler Rezeptorneurone
Das olfaktorische Markerprotein (OMP) wird Spezies-übergreifend als der klassische Marker für alle reifen ORNs angesehen (Graziadei et al, 1980; Buiakova et al., 1994;
Au und Roskams, 2003). Es handelt sich hierbei um ein zytoplasmatisches Protein mit nicht geklärter Funktion, dessen Expression erst beginnt, wenn die Axone der ORNs den Bulbus olfactorius erreicht haben (Graziadei et al, 1980; Buiakova et al., 1994). Die reifen, OMP-positiven ORNs sind im mittleren Drittel des olfaktorischen Epithels lokalisiert und zeichnen sich durch einen meist deutlichen apikalen Dendriten aus (Heilmann et al., 2000; Skinner et al., 2005; Weiler und Benali, 2005).
Die Annahme, dass alle reifen ORNs unabhängig von ihrer Lokalisation im olfaktorischen Epithel OMP exprimieren, führte dazu, dass in vielen Studien das olfaktorische Epithel allein anhand der vorhandenen OMP-Expression identifiziert und vom respiratorischen Epithel abgegrenzt wurde (Vassar et al., 1993; Nibu et al., 1999). Inwieweit die OMP-Expression allerdings möglicherweise regionalen oder interindividuellen Schwankungen unterliegt, und ob die OMP-Immunreaktivität immer strikt mit dem Vorhandensein von reifen ORNs assoziiert ist, wurde, insbesondere beim Hund, noch nicht geklärt.
Für das Vomeronasalorgan wird bei der Maus eine positive OMP-Immunreaktivität aller sensorischer Neurone beschrieben (Martinez-Marcos et al., 2005). Bei Ratte, Frettchen und Primaten hingegen stellten sich lediglich wenige, beim Menschen nahezu keine VRNs OMP-positiv dar (Weiler et al., 1999; Witt et al., 2002; Dennis et al., 2004). Für den Hund sind bislang keine diesbezüglichen Daten publiziert.
Als Marker für unreife ORNs wird für Mensch und Nager unter anderem TrkB beschrieben (Roskams et al., 1996; Nibu et al., 1999; Féron et al., 2008). TrkB gehört zur Familie der Tyrosin-Rezeptorkinasen (Trk) und bindet brain derived neurotrophic factor (BDNF) mit hoher Affinität (Barbacid et al., 1991; Féron et al., 2008). Da unreife ORNs im basalen Drittel des olfaktorischen Epithels lokalisiert sind, ist hier auch die TrkB-Immunreaktivität laut Féron et al. (2008) am ausgeprägtesten.
Inwieweit TrkB auch beim Hund als Marker für unreife ORNs geeignet ist, bleibt zu klären.
Im Vomeronasalorgan wurde die TrkB-Expression bislang nur in wenigen Studien untersucht. So beschreiben Garcia-Suarez et al. (1997), dass VRNs beim Pferd TrkA aber nicht TrkB exprimieren. Die vorliegende Arbeit soll Aufschluss über die TrkB- Expression im kaninen Vomeronasalorgan geben.
Ein Protein, das bei Nagern und Primaten von allen ORNs, unabhängig vom Entwicklungsstatus, exprimiert wird, ist das protein gene product 9.5 (PGP9.5;
Heilmann et al., 2000; Dennis et al., 2004; Weiler und Benali, 2005). Hierbei handelt es sich um ein für Neurone und neuroendokrine Zellen spezifisches zytoplasmatisches Protein (Thomson et al., 1983; Day et al., 1990). Beim Hund wurde von Dennis et al. (2003) eine positive PGP9.5-Immunreaktivität bei einer Vielzahl der VRNs beschrieben. Inwiefern dies auch für das kanine olfaktorische Epithel zutrifft, soll in dieser Studie überprüft werden.
2.3.2 Olfaktorische und vomeronasale Rezeptoren
Olfaktorische Rezeptoren (ORs), die zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören, werden hauptsächlich auf der Oberfläche der Zilien olfaktorischer Rezeptorneurone exprimiert und ermöglichen die Umwandlung eines chemischen Signals in neuronale Aktionspotentiale, welche zu den Glomerula des Bulbus olfactorius weitergeleitet werden (Olender et al., 2004a,b; Quignon et al., 2005). Auf diese Weise dienen ORs der Detektion und Unterscheidung von Millionen von Gerüchen (Olender et al., 2004a,b). Es ist bekannt, dass ORNs das G-Protein Gαolf exprimieren. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei ORNs hinsichtlich der G-Protein-Expression um eine relativ homogene Zellpopulation handelt (Benbernou et al., 2007; Wakabayashi et al., 2007). Interessanterweise berichten jedoch Wakabayashi et al. (2007), dass bei der Ziege ORNs existieren, die den vomeronasalen Rezeptor V1r exprimieren, nicht jedoch Gαolf. Generell werden zwei Familien vomeronasaler Rezeptoren unterschieden: V1r und V2r (Breer et al., 2006).
Die bei der Ziege nachgewiesenen V1r-positiven ORNs sind sowohl OMP als auch Gap43 negativ (Wakabayashi et al., 2007). Da es sich bei OMP um einen Marker für reife Neurone und bei Gap43 um einen Marker für unreife Neurone handelt, wird postuliert, ob diese ORNs ein Stadium zwischen reifen und unreifen Neuronen darstellen (Wakabayashi et al., 2007). Inwieweit derartige Zwischenstadien von ORNs auch beim Hund anzutreffen sind und inwieweit diese eventuell andere, für unreife Rezeptorneurone typische Antigene exprimieren, ist bislang ungeklärt.
Aufgrund der unterschiedlichen Rezeptorexpression von olfaktorischen und vomeronasalen Neuronen stellt sich daher die Frage, ob ORNs und VRNs eventuell eine unterschiedliche Antigenexpression aufweisen.
3 Hypothesen und Ziele
Die zuverlässige Herstellung reiner OEC-Präparationen ohne Schwann-Zell- Kontamination stellt eine besondere Schwierigkeit bei der Definition des regenerativen Potentials olfaktorischer Hüllzellen dar (Wewetzer et al., 2002;
Wewetzer und Brandes, 2006). Da diesbezüglich bislang nur vereinzelte Studien zu größeren Säugetieren vorliegen, ist nicht klar, inwiefern die am Nagermodell erhobenen Daten auf Hund und Mensch übertragbar sind. Da kanine OECs Ähnlichkeiten mit denen des Menschen aufweisen und sich nachweislich von denen der Ratten unterscheiden, besitzt der Hund eine besondere Bedeutung als translationales Modellsystem (Krudewig et al., 2006).
Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist es daher, kanine OECs und Schwann-Zellen in vivo und in vitro hinsichtlich der Expression zelltypspezifischer Marker, die zukünftig zur Reinigung beider Zelltypen verwendet werden könnten, zu analysieren.
Hierzu wurde kürzlich postuliert, dass das Zuckerepitop HNK-1 und der Neurotrophinrezeptor p75NTR spezifisch von Schwann-Zellen bzw. von OECs exprimiert werden und daher als spezifische Markermoleküle verwendet werden könnten. Diese Hypothese sollte im ersten Teil der Arbeit überprüft werden.
Im Hinblick auf die Entwicklung zukünftiger autologer Transplantationstherapien besitzt die Riechschleimhaut besondere Bedeutung als Quelle regenerationsfördernder OECs. In diesem Zusammenhang ist es nicht nur wichtig, durch Charakterisierung des molekularen Expressionsprofils Reinigungsprotokolle für OECs zu etablieren, sondern auch deren Verteilung in der Riechschleimhaut zu bestimmen. Da die Gegenwart von OECs unmittelbar mit der Lokalisation olfaktorischer Rezeptorneurone assoziiert ist, war es das Ziel des zweiten Teils der vorgelegten Arbeit, das kanine olfaktorische Epithel unter besonderer Berücksichtigung des molekularen Charakters und des Verteilungsmusters olfaktorischer Rezeptorneurone immunhistologisch näher zu charakterisieren und dies mit Befunden aus dem Vomeronasalorgan zu vergleichen.
Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse sollen zu einer detaillierteren Charakterisierung des olfaktorischen und vomeronasalen Epithels des Hundes beitragen. So sollen Grundlagen für die Gewinnung reiner kaniner OEC- Präparationen und damit für den Vergleich des regenerativen Potentials kaniner OECs und Schwann-Zellen gelegt werden.
4 Differential expression of HNK-1 and p75
NTRin adult canine Schwann cells and olfactory ensheathing cells in situ but not in vitro
Patricia Bock1, Andreas Beineke1, Somporn Techangamsuwan1,3, Wolfgang Baumgärtner1, Konstantin Wewetzer1,2*
1 Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, 30559 Hannover, Germany
2 Center of Anatomy, Hannover Medical School, 30625 Hannover, Germany
3 Department of Pathology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand
Published in:
The Journal of Comparative Neurology 505: 572-585, 2007
* Corresponding author:
Konstantin Wewetzer, PhD
University of Veterinary Medicine Hannover, Department of Pathology, Bünteweg 17, 30559 Hannover (Germany), Tel.: 49-511-953-8670, Fax: 49-511-953-8675
Email: konstantin.wewetzer@tiho-hannover.de
4.1 Abstract
Olfactory ensheathing cells (OECs) are promising candidates for autologous cell transplantation therapies of nervous system injury and disease. Large animal models are relevant for transferring experimental data into clinical practice. In vivo studies have suggested that adult canine OECs may display similar regenerating capacities as their rodent counterpart. However, data on their molecular phenotype required for generating pure cell preparations are still scarce. In the present study, we comparatively analyzed the expression of the carbohydrate HNK-1 epitope and the neurotrophin receptor p75NTR in adult canine Schwann cells and olfactory ensheathing cells in situ and in vitro. Myelinating and non-myelinating Schwann cells in situ exclusively expressed HNK-1 and p75NTR, respectively, while OECs were negative for both markers. In vitro, OECs and Schwann cells shared cell surface expression of p75NTR but not of HNK-1, which could be detected transiently in intracellular vesicles. This suggests that Schwann cells and OECs in vitro phagozytose HNK-1+ cellular debris. The cultivation-induced down-regulation of HNK-1 expression in Schwann cells and up-regulation of p75NTR in OECs argues for axonal signals controlling the expression of both markers in situ. While HNK-1 expression in Schwann cells is most likely controlled by signals inducing myelination, e.g. neuregulin, the mechanisms that may suppress p75NTR expression in OECs in situ remain to be elucidated. Interestingly, HNK-1 expression in the adult dog was found both in sensory and motor nerve myelinating Schwann cells. This is reminiscent of humans and differs from rodents and underscores the importance of large animal models for translational research.
Key words:
OEC; olfactory neuron; differentiation; neuron-glia-interaction
4.2 Introduction
The olfactory system has gained wide interest because of its ability to maintain neurogenesis throughout lifetime (Graziadei and Monti-Graziadei, 1985; Calof et al., 1996). Olfactory ensheathing cells (OECs) are considered attractive candidates for cell transplantation-based therapies of central nervous system (CNS) injury and disease (Raisman and Li, 2007; Barnett and Riddell, 2007). Based on their association with axonal processes of olfactory neurons that enter the CNS throughout lifetime, it was suggested that OECs may display a unique capacity for CNS repair (Ramón-Cueto and Valverde, 1995; Franklin and Barnett, 1997). During the recent years, a variety of studies has shown that OECs in fact promote neural repair under experimental conditions (Raisman, 2001; Wewetzer et al., 2002; Santos- Benito and Ramón-Cueto, 2003; Boyd et al., 2005). Despite intensive efforts, however, the in vivo actions of OECs and their relative regenerative capacity compared to Schwann cells have remained poorly-defined (Harvey and Plant, 2006;
Wewetzer and Brandes, 2006).
This is, at least in part, due to the lack of specific molecular markers suitable for the selective identification of either cell type (Wewetzer et al., 2002; Vincent et al., 2005;
Wewetzer and Brandes, 2006). The nasal mucosa as a readily accessible source of OECs, for example, harbors both OECs and Schwann cells. In the absence of specific markers, it is not possible to determine the percentage of Schwann cells contaminating olfactory mucosa-derived OEC cultures (Mackay-Sim, 2005). Thus, there is no control over the cellular composition of the transplant, making it impossible to correlate the observed regenerative effects with a specific cell type.
Along this line, Harvey and Plant (2006) argued that the Schwann cell-like remyelination observed after transplantation of olfactory bulb-derived OECs (Franklin et al., 1996; Imaizumi et al., 1998; Barnett et al., 2000; Radtke et al., 2004; Sasaki et al., 2004) is not due to the OECs themselves but either to contaminating Schwann cells derived from the meninges or to host Schwann cells invading the lesion site.
The controversy on the remyelinating capacity of OECs underscores the need to characterize the molecular phenotype of OECs. It is not until the identification of
reliable cell type-specific markers, that the in vivo actions of OECs and Schwann cells will be defined accurately (Wewetzer and Brandes, 2006).
In the present study, we analyzed adult canine OECs and Schwann cells in situ and in vitro with respect to expression of two cell surface molecules previously introduced as cell type-specific markers: the carbohydrate HNK-1 epitope and the neurotrophin receptor p75NTR. The adult dog is an interesting intermediate model system towards the clinical use of OECs and Schwann cells (Smith et al., 2002; Jeffery et al., 2006).
It was shown that adult canine OECs are able to remyelinate the rat spinal cord (Smith et al., 2002) and that autologous transplantation of adult canine OECs is reliable and safe (Jeffery et al., 2005). The HNK-1 epitope has been recently described as a cell type-specific marker for human Schwann cells (Bianco et al., 2004). Cultured trigeminal Schwann cells but not OECs stained positive for HNK-1 (Bianco et al., 2004).
The sulfated carbohydrate CD57/HNK-1 epitope (human natural killer-1) was originally defined by a monoclonal antibody raised against a T cell line (Abo and Balch, 1981). HNK-1 is highly expressed in the nervous system (Chou et al., 1987;
Miragall and Dermietzel, 1992; Rollenhagen et al., 2001) and a major determinant of myelin sheath glycoproteins belonging to the immunoglobulin superfamily, e.g. the major peripheral myelin protein P0, peripheral myelin protein-22 (PMP-22), the myelin-associated glycoprotein (MAG, Kruse et al., 1984; Quarles, 1997) and other adhesive molecules like tenascin-R and -C (TN-R, TN-C; Bartsch et al., 1993).
However, HNK-1 is not only coupled to adhesion molecules, but it is also directly involved in adhesive phenomena (Schachner et al., 1995). HNK-1-deficient mice posess a reduced extracellular space (Sykova et al., 2005). Anti-HNK-1-antibodies block interactions of neural cell types (Keilhauer et al., 1985) and interfere with the binding of neural cells to laminin (Hall et al., 1993; 1997) or with the homophillic binding of the neural cell adhesion molecule (Cole and Schachner, 1987). In the rat peripheral nervous system, HNK-1 is predominantly found in myelinating Schwann cells associated with motor axons but not with sensory axons (Martini and Schachner, 1986; Martini et al., 1992; Low et al., 1994; Martini et al., 1994; Saito et al., 2005). During development, HNK-1 is initially expressed by all premyelinating and
non-myelinating cells before down-regulation at early postnatal stages. Upon myelination it is then up-regulated in those Schwann cells that associate with motor axons (Schachner et al., 1995).
The low affinity neurotrophin receptor p75NTR is the prototype of an OEC and Schwann cell marker (Ramón-Cueto and Avila, 1998; Wewetzer et al., 2002). Both cultured OECs and Schwann cells express p75NTR irrespective of their developemental stage. Contrary to this is the expression in situ. In the neonatal rat, p75NTR is expressed by all Schwann cells but only a minority of OECs (Franceschini and Barnett, 1996; Wewetzer et al., 2005). During postnatal development there is down-regulation of p75NTR in OECs (Gong et al., 1994, Lim and Brunjes, 1999) and myelinating Schwann cells while non-myelinating Schwann cells maintain its expression in the adult (Jessen et al., 1990; Jessen and Mirsky 1991, 2004).
Table 4-1: HNK-1 and p75 expression in adult canine olfactory ensheathing cells (OECs) and Schwann cells in situ and in vitro1
HNK-1 p75NTR
In situ
OECs
- -
Myelinating Schwann cells
+ -
Nonmyelinating Schwann cells
- +
In vitro
OECs
- +
Schwann cells
- +
1HNK-1 and p75NTR expression in situ was confined to myelinating and non-myelinating Schwann cells, respectively, whereas OECs were negative for both antigens. Culturing of Schwann cells in the absence of neurons resulted in loss of HNK-1 expression in parallel to down-regulation of MBP. Expression of p75NTR in vitro was maintained in Schwann cells under non-myelinating conditions and up-regulated in OECs.
In order to test the feasibility of HNK-1 and p75NTR as cell type-specific molecular markers in the adult canine system, we analyzed both their expression pattern in situ by immunocytochemistry as well as their distribution after isolation and culturing. We show here that adult canine myelinating and non-myelinating Schwann cells in situ display exclusive expression of HNK-1 and p75NTR, respectively, whereas OECs were negative for both antigens. During culturing, myelinating Schwann cells lost expression of HNK-1 in parallel with the loss of expression of myelin proteins, e.g.
MBP, while non-myelin-forming Schwann cells maintained p75NTR expression. This implies that HNK-1 but not p75NTR expression in Schwann cells is controlled by axonal signals. OECs in vitro also did not express HNK-1 and up-regulated p75NTR expression implying inhibitory control of p75NTR expression by olfactory neurons in situ. The observation that both Schwann cells and OECs in vitro did not express HNK-1 argues against the use of HNK-1 as a specific marker for cultured adult Schwann cells.
4.3 Materials and Methods
Antibodies
Monoclonal antibodies included mouse anti-human-p75NTR-antibodies (American Tissue Culture Collection, clone HB8737, Levi et al., 1994) used as hybridoma supernatants (1:5) and mouse anti-CD57/HNK-1-antibodies (Sigma C 6680, Saint Louis, Missouri, USA; 1:500). The anti-HNK-1-antibody recognizes a sulfoglucuronyl epitope linked to several glycolipids, glycoproteins, and proteoglycans that have been implicated in cell-cell interactions (Kruse et al., 1984; Chou et al., 1987; Quarles, 1997; Bartsch et al., 1993). HNK-1 is expressed in many species ranging from insects to humans albeit at different levels (O´Shannessy et al., 1985; Villar-Cheda et al., 2006). The used antibody is derived from the VC1.1 hybridoma generated by fusion of mouse myeloma cells with splenocytes from BALB/c mice immunized with cat cerebral cortex homogenates (Arimatsu et al., 1987; Naegele and Barnstable, 1991). Anti-p75NTR-antibody (hybridoma ME20.4) was generated by immunization of BALB/c mice with the WM245 human melanoma cell line and its specificity for p75NTR has been established (Ross et al., 1984, Scarpini et al., 1988). Anti-p75NTR- antibodies inhibited binding of iodinated NGF to its receptor, immunoprecipitated a 75kDa entity following metabolic labelling (Ross et al., 1984) and stained Western blots of human neuroblastoma and neuroepithelioma cell lines (Baker et al., 1989).
Polyclonal antibodies used were goat-anti-rabbit-olfactory marker protein (OMP)- antibodies (Wako Chemicals 544-10001, Richmond, VA, 1:3,000) and rabbit anti- myelin basic protein (MBP)-antibodies (Chemicon AB980, Temecula, CA; 1:800).
OMP as a highly specific marker for mature olfactory neurons is a cytoplasmic protein (19kDa) whose expression is phylogenetically well conserved across vertebrate species (Buiakova et al., 1994) and not turned on until the olfactory neuron axons have reached their final target in the olfactory bulb (Graziadei et al., 1980). For generation of the antiserum, introduced by Keller and Margolis (1975), goats received multiple injections of rodent olfactory marker protein (Keller and Margolis, 1976). The MBP sequence is highly conserved from mammals to chicken.
The isoforms (17.2, 18.5, 20.2, 21.5) of adult human MBP are generated by
differential splicing of a single mRNA transcript (Boggs, 2006) and are expressed in a developmentally regulated manner. The 18.5kDa isoform is predominantly expressed by mature oligodendrocytes and Schwann cells. The immunogen for the used antibody was human brain MBP (McTigue et al., 1998). The antibody whose specificity has been confirmed in many studies is suitable for specific labelling of myelinating Schwann cells and oligodendrocytes.
Histological procedures
Tissue was prepared from young adult Beagle dogs (4 to 6 month-old) not suffering from diseases affecting the nervous and respiratory system as determined by clinical and histopathological examination. The animals were treated according to the legal and ethical requirements of the University of Veterinary Medicine Hannover and tissue was collected at necropsy (Department of Pathology, University for Veterinary Medicine Hannover). Heads were skinned, transected sagittally along the nasal septum and fixed in neutral buffered paraformaldehyde (10%) overnight. Frontal sections (0.5 cm thick) were cut and decalcified in ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 10%) and paraformaldehyde (5%, pH 7.4) for 8-14 days with several changes of the solution. Maxillary nerve and sympathetic trunk were fixed and treated with the same decalcifying reagents for the sake of comparability. After decalcification, the tissue was rinsed in distilled water and embedded in paraffin for enzyme immunohistochemistry.
Immunohistochemistry
Paraffin sections (4 µm thick) were cut and mounted on SuperFrost® Plus slides (Menzel-Gläser, Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, Germany). Sections were deparaffinized in a descending series of ethanol. Endogenous peroxidase was blocked with H2O2 (0.5% in methanol) for 30 minutes at room temperature (RT). For visualization of p75NTR, sections were pretreated with sodium-citrate buffer (10mM, pH 6.0) in the microwave (800W, 20min.). The sections were treated with normal goat and horse (OMP staining) serum (1:5) diluted in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.1) for 20 minutes at RT to reduce non-specific binding. Incubation with
the primary antibodies diluted in PBS containing bovine serum albumin (BSA, 1%) was done overnight (4°C). After washing, biotinylated goat-anti-mouse-antibodies (BA-9200) for HNK-1 and p75NTR, horse-anti-goat-antibodies (BA-9500) for OMP and goat-anti-rabbit-antibodies (BA-1000, all: Vector Labs, Burlingame, CA) for MBP were applied (1:200, 45 min., RT) followed by the avidin-biotin-peroxidase (ABC) complex system (30 min, RT; Vectastain® Elite ABC Kit, PK6100, Vector Labs, Burlingame, CA). Color development was done using 3,3-diaminobenzidine- tetrahydrochloride (DAB, 0.05%) and H2O2 (0.03%) in PBS followed by counterstaining with hemalaun. After rinsing in distilled water and dehydration sections were coverslipped (Roti®Histokit II, Carl Roth GmbH +Co, Karlsruhe, Germany). Specificity controls included the replacement of primary antibodies by ascites from non-immunized BALB/c mice (monoclonal antibodies), normal rabbit serum (polyclonal rabbit antibodies) and normal goat serum (polyclonal goat antibodies).
Cell culture
Olfactory bulb, both maxillary and sciatic nerve and cervicothoracic ganglion were prepared from dogs (Beagle, 4 to 6 month-old) not suffering from a nervous and respiratory system disease, as determined by clinical and histopathologic examination. Tissue was collected at necropsy under sterile conditions at the Department of Pathology (University for Veterinary Medicine Hannover). Isolation of OECs was essentially done as described previously (Krudewig et al., 2006). Briefly, enzymatic treatment was done using trypsin (0.25%, PAA, Marburg, Germany) in DME medium (Gibco Life Technol., Eggenstein, Germany) and cells were mechanically dissociated in the presence of DNase I (0.05%, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) using a fire-polished Pasteur pipette (Krudewig et al., 2006).
Cells were cultured on poly-L-lysine (0.5mg/ml) under standard conditions (5%CO2, 37°C) in DME medium supplemented with fetal calf serum (FCS, 10%, PAA Marburg, Germany) and pencillin/streptomycin (1%, PAA, Marburg, Germany). 96-well microtiter plates and 25cm2 flasks (Nunclon, Nunc, Germany) were used for immunocytochemical analysis and expansion, respectively. OECs were expanded
using heregulin-1ß (HRG-1ß). After 7-10 days, cultures had reached confluency and were used for antibody-based purification.
For isolation of trigeminal Schwann cells, maxillary nerves were separated from surrounding connective tissue and cut into segments of about 0.5 cm length. The epineural sheath was removed and the nerve segments were cut into pieces (1mm3) using a scalpel. Enzymatic treatment was done with trypsin, collagenase and hyaluronidase (1% each) for 45min. at 37°C. Tissue dissociation and culture conditions were identical to those used for OECs.
Immunofluorescence
Immunostaining was done either with live OECs and Schwann cells or following fixation with paraformaldehyde (4%). For cell surface staining, viable cells were incubated with the primary and secondary antibodies diluted in complete medium (DME medium, 10%FCS) for 15min. at 37°C/5% CO2 (Wewetzer et al., 2005). For simultaneous visualization of a monoclonal and polyclonal antibody, mouse and rabbit-specific antibodies (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova, Hamburg, Germany) conjugated to Cy3 and Cy2, respectively, were used, whereas two monoclonal antibodies were detected by the combined application of IgM- (1:100, TRITC, Southern Biotechnology Associates, Biozol, Germany) and IgG1- specific (1:100, Alexa 488, Invitrogen Molecular Probes, Germany) antibodies.
Cultures were fixed with paraformaldehyde (4%) and nuclei were counterstained using bisbenzimide (Krudewig et al., 2006).
For the detection of intracellular antigens, cells were fixed with paraformaldehyde and permeabilized using Triton-X100 (0.25%) diluted in PBS containing bovine serum albumin (BSA, fraction V, 1%, Sigma, Germany). Incubation of primary and secondary antibodies was done in this solution each for 1h at RT. Double immunostaining was done using the antibody conjugates described above, nuclei were stained using bisbenzimide. Cultures were rinsed in PBS and inspected under fluorescent excitation. Specificity controls included the omission of the primary antibodies and the application of antibodies directed against intracellular antigens to
