25-OH-Vitamin D
3: Vergleichsmessungen zwischen
Immunoassays, HPLC und LC-MS/MS
und der Versuch des 3-epi-25-Hydroxyvitamin-D
3-Nachweises in Erwachsenen
Abschlussarbeit des Postgradualstudiums „Toxikologie und Umweltschutz“
an der Universität Leipzig 12. Matrikel
Vorgelegt von Andrea Hanenberg
Diplom-Ingenieurin der Technischen Chemie (FH) aus Nürnberg
05.07.2012
Es ist Elternpflicht jeden Säugling in seinem ersten Lebensjahr
vorbeugend mit der Hanauer Quarzlampe bestrahlen zu lassen,
da auch die Entstehung der Rachitis durch vorbeugende Bestrahlung
sicher verhindert werden kann.
„Rachitis bekämpfen heißt auch den Masern, dem Keuchhusten und banalen Erkrankungen
ihre Gefährlichkeit nehmen“ (Dr. Josef Husler 1885 – 1976)
Simplicissimus vom 15. März 1926
Dank
Ganz besonderen Dank gilt meinem Institutsleiter Prof. Dr. med. Thomas Bertsch, der mir die Durchführung dieser Vergleichsmessungen ermöglichte und mich mit fundierten
Hintergrundwissen unterstützte.
Weiter danke ich Frau Aschenneller, Frau Koch und Frau Pröbster für die Installation der Immunoassays und die Bestimmung der Patientenwerte.
Inhaltsverzeichnis
1 Einführung ... 6
1.1 Allgemeines ... 6
1.2 Strukturen ... 7
1.3 Aufnahme bzw. Metabolisierung von Vitamin D ... 9
1.4 Wirkung ... 11
1.5 Fragestellung ... 14
2 Materialien und Nachweisverfahren ... 14
2.1 Immunoassays ... 15
2.2 HPLC-Analytik ... 18
2.3 LC-MS/MS-Analytik ... 19
3 Ergebnisse ... 21
3.1 Immunoassays ... 22
3.2 HPLC-Analytik ... 28
3.3 LC-MS/MS-Analytik ... 30
3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse ... 32
4 Diskussion ... 32
4.1 Diskussion der Fragestellung ... 32
4.2 Diskussion der Methodik ... 32
4.3 Diskussion der Ergebnisse ... 34
5 Zusammenfassung ... 36
6 Literatur ... 37
7 Anhang ... 41
Abkürzungsverzeichnis
25-OH-Vitamin D2 25-Hydroxyvitamin D2 25-OH-Vitamin D3 25-Hydroxyvitamin D3
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
DBP Vitamin-D-Bindeprotein
Epimer 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3
HPLC High Performance Liquid Chromatography
I. E. Internationale Einheiten
LC-MS/MS Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry
LOB Limit of Blank
LOD Limit of Detection
LOQ Limit of Quantitation
MRM Multiple Reaction Monitoring
NIST National Institute for Standards and Technology
VDR Vitamin-D-Rezeptor
1 Einführung 1.1 Allgemeines
Vitamin D (Calciferol) ist kein klassisches Vitamin. Vitamin D3 (Cholecalciferol) als
wichtigster Vertreter dieser Gruppe, wird überwiegend aus dem körpereigenen Cholesterin in der Haut, durch UV-Strahlung der Sonne, produziert. Es kann wegen seiner strukturellen Ähnlichkeit zu Cholesterin auch zu den Secosteroiden gezählt werden. Es kommt nur in wenigen Nahrungsmitteln natürlich vor, wird aber als Zusatz in Nahrungsmitteln (Vitamin D2
in den U.S.A.) bzw. als diätetisches Nahrungsergänzungsmittel (Vitamin D2 in den U.S.A und Vitamin D3 in Deutschland) angeboten. Aufgrund seiner weitreichenden physiologischen Wirkungen kann es auch zu den Hormonen gezählt werden. (YOUNG, 2012; BAYER, 2010) Nach Hydroxylierung des Vitamin D in der Leber zirkulieren die 25-OH-Vitamin D-
Metaboliten (25-OH-Vitamin D3 und 25-OH-Vitamin D2) im Blutkreislauf.
Sie haben eine lange Halbwertszeit (einige Wochen) und eignen sich aus diesem Grund hervorragend zur klinischen Diagnostik (NORMAN, 2008; OFENLOCH-HAEHNLE, 2012).
Die aktive Form im Körper ist das 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3. Es entsteht nach einer weiteren Hydroxylierung von 25-OH-Vitamin D3 vor allem in der Niere und hat nur eine kurze Halbwertszeit (einige Stunden). Daher ist es zur Routine-Bestimmung des Vitamin D- Status nicht geeignet (ZERWEKH, 2008; HOLICK, 2007).
Die Messung von 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 ist nur sinnvoll bei Hypervitaminosen im hyperkalzämischen Zustand wie beim Sarcoidismus, IIH und anderen metabolischen Knochenkrankheiten z. B. renaler Osteodystrophie (JONES, 2012) und bei chronischer Niereninsuffizienz bzw. Rachtitis Typ I und II (ERLENFELD, 2010).
Das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 unterscheidet sich lediglich durch die asymmetrische Stellung einer Hydroxygruppe in Position C-3 im A-Ring des 25-OH-Vitamin D3
(LENSMEYER ET AL., 2012; LUKAČIN, 2010). Es wird zum Teil in Immunoassays erfasst und in vielen chromatographischen Methoden wird es vom 25-OH-Vitamin D3 nicht getrennt und erhöht somit in beiden Fällen den gemessenen Wert.
1.2 Strukturen
1.2.1 Vitamin D3 (Cholecalciferol)
Abb. 1
1.2.2 25-OH-Vitamin D3 (Calcidiol)
Abb. 2
1.2.3 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (Calcitriol)
Abb. 3
1.2.4 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3
Abb. 4
1.3 Aufnahme bzw. Metabolisierung von Vitamin D
1.3.1 Aufnahme bzw. physiologische Entstehung des Vitamin D
Nahrungsmittel, die Vitamin D enthalten, sind vor allem fetter Fisch wie Lachs, Makrele, Sardine und Dorsch und der aus ihnen gewonnene Lebertran. In geringen Mengen findet man es auch in Pilzen, Fleisch, Eigelb und in Milchprodukten (HOLICK, 2003; KIELY UND BLACK, 2012).
Da Vitamin D2 bei der industriellen Herstellung weniger aufwendig und kostengünstiger zu produzieren ist als Vitamin D3, wird es in Nordamerika bei Milch, Cerealien und Margarine künstlich zugesetzt bzw. als Nahrungsergänzungsmittel zur Supplementierung benutzt (VIETH ET AL., 2007). Der Nachteil von Vitamin D2 ist die geringere Wirksamkeit: die gleiche Menge an Vitamin D2 hat nur ca. ein Drittel der Wirkung von Vitamin D3 (VIETH;
1999; WOLPOWITZ UND GILCHREST, 2006)
Vitamin D3 wird vom Körper bei Sonnenexposition produziert. Das körpereigene Cholesterin wird zu 7-Dehydrocholesterol oxidiert. Durch Photolyse und anschließender thermischer Isomerisierung wird 7-Dehydrocholesterol zu Vitamin D3 umgewandelt. Vitamin D3 entsteht bei einer UVB-Strahlung von 280 – 310 nm (ZHANG UND NAUGHTON, 2010; BOGH, 2012). Die Expositionsdauer mit UVB-Strahlen zur Bildung von Vitamin D3 hängt vom Winkel zum Zenit, also vom Abstand zum Äquator und von der Jahreszeit ab. Je flacher der Einstrahlwinkel der Sonne, umso dicker ist die Ozonschicht und umso weniger UVB-Strahlen können die Erde erreichen (ZHANG UND NAUGHTON, 2010; HOLICK, 2004).
10.000 IE (entspricht ca. 250µg) werden bereits bei einem 10 - 15minütigen Sonnenbad bei hellhäutigen Menschen produziert. Zwei „Sonnenbäder“ die Woche sollten zum Erhalt des Vitamin D-Spiegels genügen. Die „natürliche“ Sonnenexposition kann man auch durch Solarienbesuch ersetzen (HOLICK, 2007).
Sonnencremes mit Sonnenschutzfaktor 8 reduzieren die Produktion des Vitamin D3 um 95%
und Sonnenschutzfaktor 15 verhindert sie sogar bis zu 99% (ZHANG UND NAUGHTON, 2010; MÜHLEBACH UND BISCHOFF-FERRARI, 2007).
Desweiteren ist die Menge der Vitamin D-Produktion vom Alter der Person,
Hautbeschaffenheit, Smog, Beschaffenheit der Kleidung etc. abhängig (ZHANG UND NAUGHTON, 2010; HOLICK, 2004).
Da durch die mangelnde Sonnenexposition in Deutschland, vor allem in den Wintermonaten, selten die nötige Menge vom Körper produziert werden kann, wird auch hier Vitamin D supplementiert. Hierzu wird in Deutschland Vitamin D3 verwendet (ROTH ET AL., 2008).
Toxische Konzentrationen an 25-OH-Vitamin D3 können durch Sonnenexposition nicht entstehen. Es wird angenommen, dass es eine Konzentration an Vitamin D3 im Körper gibt, bei der eine weitere, natürliche Produktion des Vitamins durch Sonnenexposition verhindert wird (BOGH, 2012). Eine Hypervitaminose an Vitamin D kann also nur durch künstliche Zufuhr entstehen. Diese kann zu hohen Calciumwerten im Serum, einer Hypercalcämie führen (VIETH, 1999).
1.3.2 Metabolische Aktivierung bzw. Metabolisierung von Vitamin D3
Da Vitamin D3 selbst biologisch inert ist, muss es erst in seine physiologisch aktive Form 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 umgewandelt werden. Es wird an ein Vitamin D-Bindeprotein (DBP) gebunden und zur Leber transportiert. Hier wird es durch das Enzym 25-Hydroxylase hydroxyliert und zirkuliert als Komplex 25-OH-Vitamin D3–DBP (Speichereinheit) im Körper. Wird es benötigt, erfolgt eine weitere Hydroxylierung durch das Enzym 1α- Hydroxylase hauptsächlich in der Niere. Das 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 wird dann im Blutkreislauf zum Zielort transportiert (BOGH, 2012).
Nach neueren Forschungen ist das Enzym 1α-Hydroxylase auch in anderen Zellen und Geweben enthalten. Es beeinflusst die Transkription verschiedenster hormonsensitiver Gene (GRÖBER, 2010).
Abb. 5: Metabolisierung von Vitamin D3 (Gröber,2010)
Abb. 6: Epimerisierung von Vitamin D3 (SINGH ET AL., 2006)
Die biologische Signifikanz von 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 und unter welchen Konditionen bzw. in welchem Maße die Epimerisierung stattfindet, wurde noch nicht geklärt (STEPMAN ET AL, 2011; KOBOLD 2012).
1.4 Wirkung
Eine Übersicht der Wirkungen findet man bei GRÖBER, 2010:
1.4.1 Die klassische Wirkung im Knochenstoffwechsel: Calcium- und Phosphat-Homöostase
Bei Erwachsenen kann Vitamin-D-Mangel zu Osteomalazie bis hin zu Osteoporose führen, d. h. reduzierter Knochendichte, erhöhten Knochenschmerzen und Knochenbrüchigkeit.
Vor allem Senioren haben ein höheres Risiko zu stürzen und damit ein höheres Risiko, eine Fraktur zu erleiden (TURNER ET AL., 2012).
Bei Kindern kann Vitamin D-Mangel zu Rachitis führen.
Vitamin D hat im Knochenstoffwechsel folgende Funktionen:
Steigerung der intestinalen Resorption von Calcium aus der Nahrung Steigerung des Einbaus von Calcium in den Knochen
Verringerung der Calciumausscheidung über die Niere Aktivierung von Osteoklasten
Stimulierung der Transkription von Osteocalcin und Osteopontin
Suppression der Nebenschilddrüsenfunktion: somit Hemmung der Biosynthese von Parathormon, sodass Vitamin D der Entwicklung eines Hyperparathyreoidismus entgegenwirkt
1.4.2 Extraskelettäre Wirkung von Vitamin D
Vitamin-D-Rezeptoren sind nicht nur in den Knochen, sondern auch in diversen anderen Geweben vorhanden. Vitamin D bewirkt im Körper eine Regulierung der Zellproliferation und Zelldifferenzierung, des Insulinstoffwechsels, der Immunabwehr und weiterer
lebenswichtiger Körperfunktionen.
1.4.2.1 Immunologische Wirkung
Immunmodulation: antiinflammatorische und immunstabilisierende Wirkungen:
Vitamin-D-Rezeptoren werden von Monozyten und Leukozyten mit der höchsten Phagozytoserate exprimiert
Verstärkung der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen, Erhöhung der Phagozytoseaktivität und –rate
Verstärkung der Aktivität lysosomaler Enzyme in Makrophagen
Regulation der Th1/Th2-Zellen: Unterdrückung der Produktion proinflammatorischer Zytokine und Steigerung der Produktion antiinflammatorischer Zytokine
Vitamin D-Hormon stimuliert die genetische Expression von antimikrobiellen Peptiden (z.B. Cathelicidin) in humanen Monozyten
Verminderung der Infektanfälligkeit
Senkung des Risikos für Kolon-, Mamma- und Prostatakarzinom
1.4.2.2 Tumorerkrankungen
Niere, Hirn, Darm, Prostata, Knochen, Haut, Brust und Leber sind Gewebe, die 1α-
Hydroxylasen exprimieren und somit Vitamin-D-Rezeptoren besitzen. Auch hier gilt, dass 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 in ausreichenden Mengen lokal synthetisiert werden kann, wenn 25-OH-Vitamin D3 im Blut in adäquater Konzentration vorhanden ist.
Eine hohe Vitamin D-Konzentration reduziert die Bildung des prostataspezifischen Antigens (PSA) signifikant und somit das Entstehen eines Prostata-Karzinoms.
Weitere potenziell antikanzerogenen Wirkungen werden auf verschiedene Mechanismen zurückgeführt:
Hemmung der Tumorzellenproliferation,chemopräventive Wirkung Induktion der Differenzierung und Apoptose von malignen Zellen Downregulation der Telomerase
1.4.2.3 Herz-Kreislauferkrankungen
Kardiozyten exprimieren Vitamin-D-Rezeptoren
Die Aktivität der Adenylatcyclase in den Kardiozyten ist abhängig von 1,25- Dihydroxy-Vitamin D3. Eine verminderte Aktivität ist infolge einer intrazellulären Akkumulation von Calciumionen mit einem Blutdruckanstieg und einer erhöhten Gefäßreaktivität assoziiert
Hemmung der Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems
Inverse Korrelation des Blutdrucks mit dem Vitamin-D3-Status, Reduktion des systolischen Blutdrucks
Entgegegenwirken einer Hypertrophie des Herzens
Reduzierende Wirkung auf Triglycerid- und Parathormonkonzentration
1.4.2.4 Aufrechterhaltung von Muskelfunktionen bzw. Sturzhäufigkeit Regulation der neuromuskulären Funktion
Zunahme der Muskelmasse und Muskelkraft
Verbesserung der muskulären Koordination (Sturzprophylaxe)
1.4.2.5 Diabetes mellitus Typ 1
Regulation der Insulinsekretion der Beta-Zellen des Pankreas Schutz humaner Pankreaszellen vor zytokininduzierter Apoptose
Senkung des Risiko für Diabetes mellitus Typ 1 durch Vitamin-D3-Supplementierung in der frühen Kindheit
1.4.2.6 Autoimmunerkrankungen
Multiple Sklerose ist eine Autoimmunerkrankung, die im Zusammenhang mit dem Klima steht. Es ist schon seit langem bekannt, dass Multiple Sklerose wesentlich häufiger in den gemäßigten Breiten vorkommt als in den Tropen. Es besteht eine negative Korrelation zwischen Sonnenlichtexposition und Multiple-Sklerose-Inzidenz. Bei Studien wiesen ca. die Hälfte der MS-Patienten einen Vitamin-D-Mangel im Bereich < 20ng/ml auf. Weitere Studien zeigten, dass sich die Schubhäufigkeit verringert und sich die Muskelfunktion und somit die Lebensqualität durch Vitamin-D-Supplementierung verbessert.
1.4.2.7 Kognitive Funktionen
Nach den neuesten Studien hat Vitamin D auch Einfluss auf die kognitiven Fähigkeiten und spielt eine gewisse Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von Demenz. Vitamin-D- Rezeptoren sind im Gewebe des Gehirns. Die aktive Form, 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3, hat neuroaktive Effekte gezeigt, z. B. die Phagozytose des Amyloid-Belags, ein Marker der Alzheimer Krankheit, der zur Neurodegeneration der Neuronen in der primären Hirnschicht führt. Desweiteren wirkt Vitamin D als direktes Antioxidans und reguliert die Produktion von einigen neurotrophen Faktoren, die das Überleben, die Entwicklung und die Funktion der Neuronen steuern. Ein Vitamin-D-Mangel kann zwar noch nicht als Ursache bewiesen werden, jedoch besteht auf jeden Fall ein Zusammenhang (SONI ET AL., 2012)
1.4.3 Wirkung des 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3
Die physiologische Rolle und Relevanz des Epimers ist noch unklar (LENSMEYER, 2011).
Eine Vermutung ist, dass die 1,25-Dihydroxy-Epimere ebenso in der Lage sind, die
Expression verschiedenster Gene über den Vitamin-D-Rezeptor zu regulieren, wie das nicht epimerisierte 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3. Die Umkehrung der Konfiguration am
asymmmetrischen C3 verhindert nicht die Bindung an den Vitamin-D-Rezeptor. Sie scheint jedoch deutlich schwächer zu sein. Obwohl die Unterdrückung der Genexpression des
Parathormons genauso effektiv erfolgt wie beim 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 und die Epimere ähnliche antiproliferative Eigenschaften in epithelialen Zellen auslösen, sind doch die durch Calcium induzierten Effekte auf den Knochenstoffwechsel deutlich beeinträchtigt (SINGH ET AL., 2006; LUKAČIN, 2010).
1.5 Fragestellung
Die Einteilung der Werte und der Grad des Vitamin D-Mangels wird in Deutschland wie folgt vorgenommen (BISCHOFF-FERRARI, 2012):
Werte < 20 ng/ml (< 50 nmol/L) hochgradiger 25-OH- Vitamin-D3-Mangel Werte zwischen 20 und 30 ng/ml (50 - 75 nmol/L): 25-OH- Vitamin-D3-Mangel
Werte ab 30 ng/ml (75 nmol/L): 25-OH- Vitamin-D3-Spiegel für eine optimale Knochendichte
(BISCHOFF-FERRARI, 2011)
Werte zwischen 30 - 44 ng/ml (75 - 110 nmol/L): 25-OH- Vitamin-D3-Spiegel hat zusätzlich weitere positive gesundheitliche Effekte.
Vitamin D ist zur Gesunderhaltung des Menschen essentiell. Aus diesem Grund ist es wichtig, den Vitamin-D-Spiegel zu messen und, wenn nötig, in den Wintermonaten zu
supplementieren (VIETH ET AL., 2007). Aus analytischer Sicht stellt die korrekte
Bestimmung des Vitamin-D-Status eines Patienten aber durchaus eine Herausfordeung dar.
Zurzeit ist die Zahl der Patienten, die Vitamin-D-Mangel haben, abhängig vom Test, mit dem man den Wert gemessen hat (HEIJBOER, 2012).
Vitamin D ist ein schwieriger Analyt: sein hydrophober Charakter, die hohe Konzentration des Vitamin-D-Bindeproteins im Serum, die Affinität des Vitamin D zum Vitamin-D- Bindeprotein und die zum Teil immer noch fehlende Standardisierung (vor allem bei den Immunoassays) tragen dazu bei, dass die Messung des Vitamin-D-Status keine leichte Aufgabe ist (HOLLIS, 2004; CARTER, 2012).
In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von drei Immunoassays und einer HPLC-Methode einer LC-MS/MS-Methoden gegenübergestellt und diskutiert. Zusätzlich wurde eine weitere LC-MS/MS-Methode mit längerer Laufzeit eingesetzt, um die Häufigkeit und die
Größenordnung des 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 in Patientenproben von Erwachsenen zu ermitteln. Dies alles dient zur Ermittlung einer robusten und für den klinischen Alltag tauglichen Methode, die den Vitamin D-Status eines Patienten richtig darstellt.
2 Materialien und Nachweisverfahren
Die Messungen erfolgten aus 125 Restseren, die für Routinetests ins Labor kamen. Das jeweilige Restmaterial hatte ein Mindestvolumen von 1500 µl und wurde in vier Aliquots gesammelt (1 x 600 µl und 3 x 300 µl) und bei -20° eingefroren. Die Sammelzeit betrug ca. 3 Wochen im Januar 2012. Die Haltbarkeit bei eingefrorenen Proben ist zeitlich nicht begrenzt, selbst nach bis zu viermaligen Einfrieren und Auftauen bleiben die Konzentrationen stabil.
(DE LA HUNTY, 2010)
Immunoassays spielen in der Routine eines klinischen Labors eine große Rolle, da diese Methoden einen hohen Probendurchsatz haben.
Jedoch werden hohe Anforderungen an einen Immunoassay zur Vitamin D3-Bestimmung gestellt: zu den Schwierigkeiten des Analyten an sich (hydrophober Charakter, hohe Konzentration des Vitamin-D-Bindeprotein etc.) kommen noch die verschiedenartigsten Interferenzen. Es werden also eine gute Vorbehandlung zur Beseitigung des Vitamin-D-
Bindeproteins erwartet sowie eine gute Wahl des Antikörpers. Und schließlich wird eine Vergleichbarkeit zu den LC-MS/MS-Ergebnissen erwartet (OFENLOCH-HAEHNLE, 2012).
Die Probenvorbereitung bei der HPLC-Methode ist zeitlich aufwendig und die Verwechslungsgefahr der Proben ist durch mehrere Aufarbeitungsschritte hoch.
Eine HPLC-Anlage mit UV-Detektion ist finanziell weniger aufwendig als eine LC-MS/MS und die Quantifizierung von 25-OH-Vitamin D2 und 25-OH-Vitamin D3 erfolgt in beiden Fällen differenziert (DE LA HUNTY, 2010).
Testkits mit CE-Zeichen sind erhältlich.
Die LC/MS-MS–Methode wird als Referenzmethode zur Quantifizierung von 25-OH-Vitamin D3 und 25-OH-Vitamin D2 verwendet. Das Prinzip der Isotopenverdünnung mit stabilem isotopengelabelten Internen Standard ist allgemein anerkannt als die Methode mit der höchsten erreichbaren analytischen Richtigkeit und Präzision (Kobold, 2012).
Testkits mit CE-Zeichen sind erhältlich.
Durch Methodenmodifikation, d. h. durch Änderung der Analysensäule und des Gradientenprogramms an der LC-MS/MS, wird das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 chromatographisch vom 25-OH-Vitamin D3 abgetrennt.
2.1 Immunoassays
2.1.1 Sequentieller kompetitiver Ein-Schritt-Immunoassay mit monoklonalen Antikörpern (CLIA):
ADVIA Centaur® Vitamin D Total Assay der Firma Siemens Reagenz Lotnr.: 008 PackungsID: 14698
Kalibratoren Lotnr.: C 3406 Gerät: Centaur 5718
Parameter, durch den Assayhersteller für den Anwender bereitgestellt:
Messbereich: 3,7 – 150 ng/ml Durchsatz: 240 Tests pro Stunde
Between run coefficient of variation (CV) bei einer Konzentration von 11,7 ng/ml: 11,1 % und bei 132,1 ng/ml: 4,8 %
Störende Substanzen: < 10% für Hämolyse, Lipämie, Ikterus, Cholesterin, Harnsäure und Human-Immunglobuline.
Erfassung von 25-OH-Vitamin D2 und 25-OH-Vitamin D3: Kreuzreaktivität von 104,5 % bzw. 100,7%
3-epi-25-Hydroxyvitamin D3: 1,0%
Sensitivität: LoB (Limit of Blank): 1,6 ng/ml, LoD (Limit of Detection): 3,2ng/ml, LoQ (Limit of Quantitation): 3,52 ng/ml
Verwendung eines kovalenten, an paramagnetischen Partikeln (PMP) gebundenen, monoklonalen Anti-Fluorescein-Antikörper der Maus, ein mit Acridiniumester (AE) markierten monoklonalen Anti-25(OH) Vitamin-D-Antikörper der Maus und ein mit
Fluorescein markiertes Vitamin-D-Analogon. Zwischen der Menge an Vitamin D in der Probe und den vom System gemessenen relativen Lichteinheiten (RLU) besteht ein umgekehrt proportionales Verhältnis (Testbeschreibung SIEMENS, 2012)
Abb. 7: Testprinzip von ADVIA Centaur® Vitamin D Total Assay (SIEMENS, 2012)
2.1.2 Verzögerter Ein-Schritt-Chemilumineszenz-Mikropartikel-Immunoassay (CMIA) mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern
ARCHITECT 25-OH Vitamin D Reagenz der Firma Abbott Reagenz Lotnr. 00612B000
Kalibratoren Lotnr.: 03412A000 Gerät: ARCHITECT i1000
Parameter, durch den Assayhersteller für den Anwender bereitgestellt:
Between run coefficient of variation (CV) bei einer Konzentration von 19 ng/ml: 3,0 % und bei 75 ng/ml: 2,7 %
Messbereich: 8 - 160 ng/ml Durchsatz: 100 Tests pro Stunde
Störende Substanzen: < 10% für Hämolyse, Lipämie, Ikterus, Protein, Rheumafaktor, HAMA, Erythrozyten
Erfassung von 25-OH-Vitamin D2 und 25-OH-Vitamin D3: Kreuzreaktivität von 52% bzw.
105%
24,25-Dihydroxy-Vitamin D3: 112 % 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3: 12,6 % 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3: 2,7 %
Sensitivity: LoB: 1,9 ng/ml, LoD: 3,1 ng/ml und LOQ: 8,0 ng/ml
Mikropartikel mit polyklonalen Antikörpern und Konjugat mit monoklonalen Antikörpern:
Trennung der Bindung von DBP und Vitamin D der Probe durch Freisetzungsreagenz.
Versetzung mit paramagnetischen Mikropartikeln, die Anti-Vitamin-D (Schaf, polyklonal) beschichtet sind. Die anschließende Zugabe vom Konjugat besteht aus biotinmarkierten Vitamin D und Antikörper gegen Biotin (Maus, monoklonal), die mit Acridinium versetzt sind. Der Konjugatkomplex bindet an freien Bindungsstellen der Mikropartikel. Die Vitamin- D-Konzentration in der Probe ist umgekehrt proportional zur Signalintensität
Abb 8: Konjugat-Komponenten von ARCHITECT 25-OH-Vitamin D Reagenz (Kundeninformation ABBOTT, 2010).
Abb 9 Testprinzip von ARCHITECT 25-OH-Vitamin D Reagenz (Kundeninformation ABBOTT, 2010).
2.1.3 ElektroChemiLumineszenz ImmunoAssay (ECLIA) auf Bindeproteinbasis
Elecsys® Vitamin D Total Assay der Firma Roche.
ReagenzLotnr.: 167216 Kalibratoren Lotnr.: 164474 Gerät: Cobas e 401
Parameter, durch den Assayhersteller für den Anwender bereitgestellt:
Messbereich: 3 – 70 ng/ml
Between run coefficient of variation: (CV) at the LoQ (9-15 ng/ml): ≤1,5 ng/ml und für Konzentrationen größer 15 ng/ml kleiner/gleich 10%
Störende Substanzen: sichtbare Anzeichen von Hämolyse können stören. Der Test wird nicht beeinflusst durch Ikterus (Bilirubin< 1129 µmol/L) , Lipämie (Intralipid< 400mg/dL) und Biotin (< 287 nmol/L)
Erfassung von Vitamin D2 und Vitamin D3: Kreuzreaktivität von 81 bzw. 98%
24,25-Dihydroxy-Vitamin D : 121 %
C-3 Epimer von 25-Hydroxy-Vitamin D3 : 93 %
Sensitivity: LoB: 2,0 ng/ml, LoD: 3,0 ng/ml and LOQ: 9,0 ng/ml
Trennung der Bindung von Vitamin-D-Bindeprotein und Vitamin D der Probe durch ein Vorbehandlungsreagenz. Freigesetztes Vitamin D mit Rutheniummarkierten Vitamin-D- Bindeprotein bildet einen Komplex bei Inkubation. Nach der Zugabe von Streptavidin- beschichteteten Mikropartikeln und biotinylierten Vitamin D werden die ungebundene Ruthenium-markierten Vitamin-D-Bindeproteine besetzt. Es entsteht ein Komplex aus biotinylierten Vitamin D und Ruthenium-markierten Vitamin-D-Bindeproteine, der über die Biotin-Streptravidin-Wechselwirkung an die Festphase gebunden wird. Die Mikropartikel werden durch magnetische Wirkung auf der Oberfläche der Elektroden fixiert. Ungebundene Substanzen werden entfernt. Durch Anlegen einer Spannung wird die Chemilumineszenz induziert und mit Photomultiplier gemessen (Testbeschreibung ROCHE, 2011).
Abb. 10: Testprinzip vom Elecsys® Vitamin D Total Assay (Testbeschreibung ROCHE, 2011)
2.2 HPLC-Analytik mit dem Reagenzkit der Firma Chromsystems
HPLC 1100 Chemstation mit isokratischer Pumpe und UV-Detektor der Firma Agilent.
Reagenzien, Kalibrator und Kontrollen der Firma Chromsystems.
Parameter, durch den Assayhersteller für den Anwender bereitgestellt:
LOQ (theoretisch und vom Detektor abhängig): 1,4 ng/ml:
Between run coefficient of variation: (CV) bei einer Konzentration von 25,2 ng/ml: 3,3% und bei 90,4 ng/ml: 2,3 %
Messbereich: 4 – 250 ng/ml
Kalibrator und Kontrollen der Firma Chromsystems basieren auf lyophilisiertem Material aus Humanserum und werden wie Proben behandelt.
Nach der Zugabe des Internen Standards wird durch eine Proteinfällung die Bindung zwischen Vitamin D und dem Bindeprotein aufgebrochen. Der Analyt wird freigesetzt und über eine Festphasenextraktion aufgereinigt und aufkonzentriert. An einer isokratischen HPLC-Anlage mit UV-Detektion (265 nm) werden die Proben gemessen. Die HPLC-Methode ist eine Methode zur separaten Quantifizierung von 25-OH-Vitamin D3 und 25-OH-Vitamin D2. Die Probenvorbereitung ist zeitlich aufwendig und die Verwechslungsgefahr der Proben ist durch mehrere Aufarbeitungsschritte hoch.
Trennung des 25-OH-Vitamin D2 und 25-OH-Vitamin D3. Es ist jedoch keine Abtrennung des Epimers möglich.
Nähere Angaben können über die Reagenzien der Firma Chromsystems nicht gemacht werden, da diese dem Firmengeheimnis unterliegen.
Abb. 11: HPLC-Chromatogramm einer Patientenprobe
2.3 LC-MS/MS-Analytik mit dem Reagenzkit MassChrom® der Firma Chromsystems
2.3.1 Kurze Methode ohne Epimererfassung HPLC-Anlage der Firma Shimadzu
MS/MS-Detektor ABI 4000 QTRAP der Firma ABSciex
Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollen der Firma Chromsystems Parameter, durch den Assayhersteller für den Anwender bereitgestellt:
LOQ (theoretisch und vom Detektor abhängig): 3,0 ng/ml Messbereich: 3,0 – 250 ng/ml
Analysendauer: 6 Minuten
Kalibratoren und Kontrollen der Firma Chromsystems basieren auf lyophilisiertem Material aus Humanserum und bestehen aus 4 Kalibratoren und 2 Kontrollen, die wie Proben
behandelt wurden. Der Interne Standard ist isotopenmarkiert.
Nach Zugabe des deuterierten Internen Standards wird die Bindung zwischen Vitamin D und dem Bindeprotein durch eine Proteinfällung aufgebrochen und das Protein ausgefällt. Der Analyt wird freigesetzt und über ein Online-Verfahren aufgereinigt. Dies erfolgt mit einer sogenannten Trap-Säule. Anschließend werden im MRM-Modus und der Verwendung einer APCI-Quelle die Proben analysiert.
Das allgemeine Prinzip der LC-MS/MS:
- Ionengenerierung in der Gasphase
- Im 1. Quadrupol wird der Precursor (Vorläuferion) mit definiertem Masse/Ladungsverhältnis herausgefiltert.
- Im 2. Quadrupol wird der Precursor selektiv in der Kollisionszelle fragmentiert - Im 3. Quadrupol wird ein weiteres spezifische Fragment selektiert
Üblicherweise geht eine HPLC-Trennung vorab, um die Komplexität der Probe zu reduzieren, die Analyten anzureichern und potentielle Matrixeffekte zu reduzieren.
Dies erfolgt bei einer relativ kurzen Analysendauer von 6 Minuten. Nähere Angaben können über die Reagenzien der Firma Chromsystems nicht gemacht werden, da diese dem
Firmengeheimnis unterliegen.
Abb. 12: MRM-Übergänge eines Kalibrators
2.3.2 Lange Methode mit 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3-Erfassung LC-MS/MS-Anlage und Aufarbeitung siehe Punkt 2.3.1
Parameter, durch den Assayhersteller für den Anwender bereitgestellt:
LOQ (theoretisch und vom Detektor abhängig): 3,0 ng/ml Messbereich: 3 – 250 ng/ml
Analysendauer: 25 Minuten
Das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 unterscheidet sich lediglich durch die asymmetrische Stellung einer Hydroxygruppe in Position C-3 im A-Ring (LUKAČIN, 2010).
Analytisch gesehen haben die Epimere das gleiche Molekulargewicht und bilden die gleichen Masse/Ladungs-Paare und somit die gleichen „Parent“ und „Product Ion“-Paare nach der Ionisation an der LC-MS/MS und sind nur über die unterschiedliche Retentionszeit erfassbar (SHAH ET AL., 2011; STEPMAN ET AL., 2011).
Zur Abtrennung des 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 wird die Säule und das Gradientenprogramm zu 2.3.1 modifiziert.
3 Ergebnisse
Alle Tests wurden streng nach den Richtlinien der Hersteller durchgeführt.
Die Konzentrationen werden bei allen Tests in ng/ml angegeben. Die Umrechnung in nmol/L wird durch Multiplikation mit dem Faktor 2,5 erhalten. Die Referenzmethode für den
Vergleich aller Methoden ist die LC-MS/MS-Methode. Alle Werte kleiner der
Bestimmungsgrenze wurden aus der Evaluierung herausgenommen. Daraus ergibt sich je nach Test eine unterschiedliche Anzahl von Wertepaaren n.
Es wurde eine Passing-Bablok Regressionsanalyse durchgeführt, um einen
Methodenvergleich zu erstellen. Um die Abweichung in ng/ml und die prozentualen Abweichungen der einzelnen Messwerte zu den LC-MS/MS-Werten besser zu erkennen, wurde mit diesen Parametern zusätzlich ein Bland-Altman-Test vollzogen. Alle statistischen Daten wurden mit der Software „Analyse-it“ für Microsoft Excel berechnet.
Die Sammlung der 125 Proben erfolgte im Winter. Aus diesem Grunde sind einige der Patientenwerte kleiner der Bestimmungsgrenze und viele im unteren Bereich. Die an der LC- MS/MS gemessenen Konzentrationen der Proben lagen zwischen 3,3 und 60,4 ng/ml. Der Mittelwert ist bei 13,6 ng/ml, der Median bei 11,4 ng/ml.
Die Aliquots wurden nur einmal aufgetaut, gemischt und anschließend gemessen.
Es sind ausschließlich Proben von Erwachsenen gesammelt worden.
25-OH-Vitamin D2 sollte im Vitamin-D-Status separat zum 25-OH-Vitamin D3 als Analyt erfasst werden. Details zur klinischen Relevanz und Serumkonzentration sind jedoch kaum bekannt, da das Vitamin D2 nur begrenzt erforscht ist (NORMAN, 2008; OFENLOCH- HAEHNLE, 2012). 25-OH-Vitamin D2 wurde in 8 Fällen, alle unterhalb der
Bestimmungsgrenze (< 2 ng/ml), beobachtet. Das Epimer in erkennbarer Konzentration hat man in 27 Fällen gefunden. In 10 Proben wurde mehr als 20% des 25-OH-Vitamin D3 als 3- epi-25-Hydroxyvitamin D3 gefunden.
3.1 Immunoassays
3.1.1 Advia Centaur® (Monoklonaler Immunoassay) versus LC-MS/MS Die Steigung der Passing-Bablok-Regressionsgeraden ist 0,30. Der Schnittpunkt mit der Y- Achse liegt bei 2,81. Der Bias beträgt -6,08 ng/ml bzw. einem Bias von -47,7%.
Bei höheren Vitamin D-Konzentrationen ist eine größere Abweichung der Messwerte zwischen den beiden Methoden feststellbar.
Abb. 14: Passing-Bablok Regressionsanalyse für den Methodenvergleich Advia Centaur®
und LC-MS/MS.
Abb. 15: Bland-Altman Plot: Bias von -6,08 ng/ml zwischen Advia Centaur® und LC- MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -17,9 ng/ml bis 5,82 ng/ml.
Abb. 16: Bland-Altman Plot: Bias von -47,7 % zwischen Advia Centaur® und LC-MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -122,9% bis 27,4%
3.1.2 ARCHITECT (Polyklonaler Immunoassay) versus LC-MS/MS
Die Steigung der Passing-Bablok-Regressionsgeraden ist 0,72. Der Schnittpunkt mit der Y- Achse liegt bei 6,15.
Die Passing-Bablok-Gerade kreuzt die 45°-Gerade etwa bei 20 ng/ml.
Dieser Assay misst falsch hohe Werte im niedrigen Bereich und falsch niedrige Werte im hohen Bereich.
Abb. 17: Passing-Bablok Regressionsanalyse für den Methodenvergleich ARCHITECT und LC-MS/MS.
Abb. 18: Bland-Altman Plot: Bias von durchschnittlich +2,3 ng/ml zwischen ARCHITECT und LC-MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -7,75 ng/ml bis 12,38 ng/ml.
Abb. 19: Bland-Altman Plot: Bias von 27,3 % zwischen ARCHITECT und LC-MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -52,7% bis 107,4%
3.1.3 Elecsys° ImmunoAssay auf Bindeproteinbasis versus LC-MS/MS Die Steigung der Passing-Bablok-Regressionsgeraden ist 1,01. Der Schnittpunkt mit der Y- Achse liegt bei -2,38. Die Werte vom Immunoassay liegen im Durchschnitt 2ng/ml unter dem Wert der LC-MS/MS.
Abb. 20: Passing-Bablok Regressionsanalyse für den Methodenvergleich Elecsys® und LC- MS/MS.
Abb. 21: Bland-Altman Plot: Bias von -1,39 ng/ml zwischen Elecsys® und LC-MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -11,47 ng/ml bis 8,68 ng/ml.
Abb. 22: Bland-Altman Plot: Bias von -16,4% zwischen Elecsys° und der LC-MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -88,8% bis 56,0%
3.2 HPLC-Methode versus LC-MS/MS-Methode
Die Steigung der Passing-Bablok-Regressionsgeraden ist 0,99. Der Schnittpunkt mit der Y- Achse liegt bei -0,04. Die Werte von der HPLC korrelieren hervorragend mit den Werten der LC-MS/MS.
Abb. 23: Passing-Bablok Regressionsanalyse für den Methodenvergleich HPLC und LC- MS/MS.
Abb. 24: Bland-Altman Plot: Bias von 0,02ng/ml zwischen der HPLC-Methode und der LC- MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -4,32 ng/ml bis 4,37 ng/ml.
Abb. 25: Bland-Altman Plot: Bias von -0,3% zwischen der HPLC-Methode und der LC- MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen –32,4% bis 31,9%
3.3 LC-MS/MS-Analytik
3.3.1 Kurze Methode ohne Epimererfassung
Diese Methode wurde als Referenzmethode für die anderen Methoden herangezogen und alle weiteren statistischen Daten darauf bezogen.
3.3.2 Lange Methode mit Epimererfassung versus kurze Methode
Die Laufzeit im Vergleich zur Referenzmethode ist relativ lang (25 Min.), dafür hat man eine bessere Auftrennung. Der deuterierte Interne Standard dient zur Kompensierung von
Matrixeffekten und Instrumenteneffekten.
Die Steigung der Passing-Bablok-Regressionsgeraden ist nur 0,81. Der Schnittpunkt mit der Y-Achse liegt bei 0,11, d. h. die kleinen Werte der zwei Methoden korrelieren sehr gut. Bei höheren Vitamin D-Konzentrationen ist eine größere Abweichung der Messwerte zwischen den beiden Methoden feststellbar. Das Epimer in erkennbarer Konzentration hat man bei einer Gesamtprobenzahl von 125 Proben in 27 Proben gefunden, d. h. in 25 % der Proben lag die 3- epi-25-Hydroxyvitamin D3-Konzentration oberhalb der Bestimmungsgrenze. In 10 Proben wurde mehr als 20% des 25-OH-Vitamin D3 als 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 gefunden.
Abb. 26: Passing-Bablok Regressionsanalyse für den Methodenvergleich der Epimer- Methode und LC-MS/MS.
Abb. 27: Bland-Altman Plot: Bias von -2,20 ng/ml zwischen der Epimer-Methode und LC- MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -6,23 ng/ml bis 1,83 ng/ml.
Abb. 28: Bland-Altman Plot: Bias von -16,6 % zwischen der Epimer-Methode und LC- MS/MS.
95 % der Differenzen liegen zwischen -41,1% bis 7,8%
3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse
Methode n Intercept 95%
CI
Slope 95%
CI
Korrelationskoeffizient nach Pearson
ADVIA Centaur®
113 2,81 2,24-
3,16
0,30 0,25- 0,35
0,85 ARCHITECT 118 6,15 5,19-
7,28
0,72 0,64- 0,81
0,84 Elecsys® 99 -2,38 -3,76-
(-0,46)
1,01 0,90- 1,12
0,88
HPLC 108 -0,04 -0,64-
0,41
0,99 0,94- 1,04
0,98
Epimer 113 0,11 -0,12-
0,41
0,81 0,79- 0,84
0,99
4 Diskussion
4.1 Diskussion der Fragestellung
Weltweit werden immer mehr Menschen auf ihren Vitamin-D-Status getestet. Der Einfluss des Vitamins auf die Gesundheit des Menschen ist durch viele Studien nachgewiesen worden (GRÖBER, 2010). HPLC und LC-MS/MS sind Methoden mit manueller Probenvorbereitung, die zeit- und arbeitsintensiv sind. Immunoassays mit unterschiedlichen Antikörpern und Testprinzipien bieten einen hohen Probendurchsatz, ein kleineres Probenvolumen und sind mit weniger menschlichen Fehlern behaftet. Die jeweiligen Tests wurden in den letzten Jahren immer wieder modifiziert und die Existenz des Epimers und andere Isobare in Blutproben sind erst in den letzten Jahren publik geworden (LUKAČIN, 2010; LENSMEYER 2012).
Ferner wurden schon viele Vergleichsmessungen mit unterschiedlichen Ergebnissen durchgeführt. Das Ziel dieser Vergleichsmessungen ist, die Richtigkeit und Robustheit der Immunoassays und der HPLC durch die Ergebnisse der mit der LC-MS/MS gemessenen Werte zu beurteilen, den Einfluss des Epimers bei Erwachsenenproben abzuschätzen und somit eine für den klinischen Alltag taugliche Methode zur Vitamin D-Messung zu erhalten.
4.2 Diskussion der Methodik
4.2.1 Standardisierung der Messungen
Es wurde ein NIST-Referenzmaterial (SMR 972) zur Kalibration und für Kontrollmaterialien zur Verfügung gestellt. Leider sind die Kalibratoren mit exogenem Vitamin–D-Metaboliten gespikt, und die Kalibratoren 2 und 3 sind mit Pferdeserum hergestellt und somit als
Referenzmaterial für Immunoassays schwierig (CARTER, 2011).
Vor einiger Zeit wurde außerdem die Rückführbarkeit der Werte auf die LC-MS/MS-Werte eingeführt (THIENPONT, 2012; VOGESER ET AL., 2004; SEMPOS ET AL 2012),.um einen gemeinsamen Bezugspunkt der Werte zu erhalten.
4.2.2 Problematik der Kreuzreaktivität von Immunoassays
Ein weiterer, kritischer Faktor sind die Kreuzreaktivitätsmuster der Antikörper bzw. der benutzten Bindeproteine. Die gängigen Immunoassays benutzen polyklonale und/oder monoklonale Antikörper oder human rekombinantes Vitamin-D-Bindeprotein. Sie zeigen unterschiedliche Kreuzreaktivitäten mit den Metaboliten und können bei Anwesenheit zusätzlich den Vitamin D-Spiegel erhöhen. Es sind zurzeit mehr als 40 Metaboliten bekannt, die mehr oder weniger die Testergebnisse beeinflussen (OFENLOCH-HAEHNLE, 2012).
Der Advia Centaur®-Test verwendet monoklonale Antikörper im Reagenz zur Vitamin-D- Messung. Monoklonale Antikörper werden von einer, auf einen einzigen B-Lymphozyten zurückgehenden, Zelllinie produziert und richten sich gegen ein einziges Epitop. Somit sollten monoklonale Antikörper eine gute Lot-zu-Lot-Vergleichbarkeit haben (WIKIPEDIA, die freie Enzyklopädie).
Der ARCHITECT-Assay verwendet polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper.
Polyklonale Antikörper sind Mischungen aus verschiedenen Antikörpern, die aus dem Serum von immunisierten Tieren (Schafe, Ziegen etc.) gewonnen werden (WIKIPEDIA, die freie Enzyklopädie). Sie richten sich also gegen verschiedene Epitope eines Antigens, was wiederum ein Vorteil sein kann, aber auch zu erhöhter Kreuzreaktivität führen kann. Sie erfüllen nur im begrenzten Rahmen die Lot-zu-Lot-Vergleichbarkeit (SIEMENS, 2012).
ADVIA Centaur® und ARCHITECT haben unterschiedliche Kreuzreaktivitäten mit 25-OH- Vitamin D2. Dies sollte in Deutschland nicht relevant sein, da man nur mit Vitamin D3
supplementiert. Weitere Substanzen, wie die 3-epi-Form von 25-OH-Vitamin D, sollten außerdem gar nicht erkannt werden, da sie auch nicht als Messanalyt benannt werden.
Der ARCHITECT Assay zeigt zusätzlich Kreuzreaktivität mit 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 und 24,25-Dihydroxy-Vitamin-D3.
Der Elecsys®-Test verwendet human rekombinantes Vitamin-D-Bindeprotein. Es macht den Test anfälliger gegenüber Matrixeffekten und Kreuzreaktivitäten zu anderen Metaboliten (ROTH ET AL., 2008). Dies zeigt sich durch zusätzliche Kreuzreaktivität des Tests zu 24,25- Dihydroxy-Vitamin D3 und 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3.
4.2.3 Chromatographische Methoden und ihre Probleme
Bei den chromatographischen Methoden hat man mehr Zeitaufwand für die Proben- aufarbeitung und größere Probenvolumina (500 µl für die HPLC und 100 µl für die LC- MS/MS). Beide chromatographische Verfahren erfassen die Einzelkonzentrationen von 25- OH-Vitamin D2 und 25-OH-Vitamin D3.
Bei chromatographischen Methoden mit kurzer Analysenzeit können Überlagerung von Epimeren und Isobaren mit den Analyten auftreten und somit zu hohe Werte ermittelt werden.
An der LC-MS/MS können zusätzlich Matrixeffekte und Ionensuppression zu falschen Werten führen (KOBOLD, 2012).
4.2.4 Vitamin-D-Bindeprotein
Das Vitamin-D-Bindeprotein liegt im Serum etwa 100-1000mal höher konzentriert vor als der Analyt 25-OH-Vitamin D. So muss das Vitamin-D-Bindeprotein quantitativ vom 25-OH- Vitamin D entfernt bzw. komplett deaktiviert werden, damit der Test den „wahren“ Vitamin- D-Wert anzeigt (HEIJBOER, 2012).
Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben unterschiedliche Arten, das Vitamin-D- Bindeprotein vom Vitamin D abzutrennen.
Der Advia Centaur® Assay gibt Releasing Reagenz zu, trennt somit das Protein vom Vitamin D und gibt anschließend einen monoklonalen Antikörper an Akridiniumester konjugiert hinzu. Dieser bindet das Vitamin D in der Probe.
Der ARCHITECT Assay gibt ein Releasing Reagenz zu, trennt somit das Protein vom
Vitamin D und gibt anschließend Mikropartikel hinzu, die mit polyklonalen Antikörper gegen Vitamin D beschichtet sind.
Beide Assays, der Advia Centaur®- und der ARCHITECT-Assay entsprechen einem
klassischen Immunoassay, bei dem alle Serumkomponenten im Reaktionsmix enthalten sind und so zu Störungen mit dem Vitamin-D-Bindeprotein führen können.
Der Elecsys®-Assay setzt speziell auf die Bindeproteinproblematik. Er setzt erst das Vitamin D frei und ersetzt im Anschluss das Vitamin-D-Bindeprotein durch ein Ruthenium-markiertes Vitamin-D-Bindeprotein.
Die LC-MS/MS-Methode und die HPLC-Methode fällen die Proteine, somit auch das Vitamin-D-Bindeprotein zu 100% aus. Der Überstand wird weiter zur Analyse ins Gerät gegeben.
Eine erst kürzlich veröffentliche Studie hat einen Zusammenhang zwischen der Vitamin-D- Bindeprotein-Konzentration im Blut des Patienten und der Vitamin D-Konzentration hergestellt (HEIJBOER, 2012).
4.3 Diskussion der Ergebnisse
Es wurden große Unterschiede in den Vitamin-D-Konzentrationen verschiedener Vitamin D- Untersuchungsmethoden gefunden. Da die Sammlung der Blutproben im Winter erfolgte, überwiegen die Werte im unteren Messbereich. Der Einsatz einer HPLC und einer LC-
MS/MS-Methode, die 25-OH-Vitamin D3 und 25-OH-Vitamin D2 einzeln erfassen können, ist hilfreich. Erhöhte Werte von 25-OH-Vitamin D3 durch Kreuzreaktivität mit 25-OH-Vitamin D2 bei Immunoassays sind in Deutschland jedoch selten, da Vitamin D3 supplementiert wird und allein durch die Nahrung nicht sehr viel Vitamin D2 aufgenommen wird (ROTH, 2008).
Aus diesem Grunde gibt es auch nur 8 Proben, die überhaupt Vitamin D2 in Spuren enthielten (unterhalb des LOQs, dies entspricht <2 ng/ml).
Werte zur Präzision und Wiederholbarkeit wurden bei diesen Vergleichsmessungen nicht durchgeführt.
Die LC-MS/MS-Methode ohne Epimererfassung ist laut Literatur die Methode zur
Rückführbarkeit der Werte der Immunoassays (KOBOLD, 2012). Aus diesem Grunde wurden alle Tests auf die Werte dieser Methode bezogen. Aufgrund der Tatsache, dass hierbei das Epimer, das mehr oder weniger in jeder Probe vorhanden ist, nicht erfasst wird, ist die Methode als Teil der Standardisierung überdenkbar. Die gemessenen 3-epi-25-
Hydroxyvitamin D3-Werte von KOBOLD, 2012 und STEPMAN ET AL., 2011 liegen bei bis zu 20 % relativ zum 25-OH-Vitamin D3-Wert. Im Gegensatz dazu finden KEEVIL, 2011 nur sehr wenig Epimer von 0-8,5 nmol/L und MIDASCH (persönliche Mitteilung am 22.06.2012) hat nur eine mittlere Abweichung der Epimer-Methode zur Referenzmethode von ca. 4 %.
Dies kann u. a. durch unterschiedliche Probenkollektive (z. B. Proben aus USA) bzw.
jahreszeitenbedingt durch andere Konzentrationsbereiche (Median) der Proben beeinflusst werden und muss durch größere Studien mit Patienten unterschiedlicher Altersgruppen, sozialer Schichten etc. herausgefunden werden (KOBOLD, 2012). Für die Kalibratoren und Kontrollen der Immunoassayhersteller ist es aufgrund der Herstellung zweier Kalibratoren aus Pferdeserum bzw. der exogenen Zugabe von Metaboliten schwierig NIST-Standardreferenz- material zu verwenden (CARTER, 2011).
Der ADVIA® Assay misst sehr niedrige Konzentrationen auch in Bereichen, die keine oder kaum Supplementierung benötigen. Die Ergebnisse von HEIJBOER ET AL., 2012 und FARRELL ET AL. 2012 mit diesem Assay zeigten, dass dieser Test falsch hohe Werte im niedrigen Bereich misst und falsch niedrige Werte im hohen Bereich. Zu falsch niedrigen Werten kann es durch ein unvollständiges Freisetzen des Vitamin D kommen (HEIJBOER ET AL., 2012) bzw. durch falsche Lagerbedingungen, die die Aktivität des Antikörpers negativ beeinträchtigen. Eine etwaige Kreuzreaktivität zu anderen Metaboliten wird aufgrund des monoklonalen Antikörpers eher ausgeschlossen. Das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 wird nur zu 1% erfasst.
Eine Wiederholung des Tests mit den gleichen Patientenproben und einer anderen
Reagenzcharge wird mit Hilfe der Firma Siemens angestrebt. Einer Erklärung des Phänomens konnte mir die Firma Siemens bis jetzt noch nicht geben.
Der ARCHITECT-Test misst falsch hohe Werte im niedrigen Bereich und falsch niedrige Werte im hohen Bereich. Die Steigung liegt bei 0,72 und der Intercept bei 6,15 ng/ml. Die Korrelation mit 0,84 und der Slope sind nicht akzeptabel. FARRELL ET AL. ermittelte für den gleichen Test einen Slope von 1,1 und einen Intercept von 5,8nmol/L - das entspricht 2,3 ng/ml - und ONG ET AL, 2012 ermittelte einen Slope von 1,25 und einen Intercept von 2,05 nmol/l (0,8 ng/ml). Dies würde einer höheren Einschätzung des Vitamin D-Status über den gesamten Messbereich entsprechen. Dies sind völlig andere Beurteilungen des Tests, die sich eventuell durch Verwendung polyklonaler Antikörper erklären lassen. Bei polyklonalen Antikörpern kann sich die Spezifität des Antikörpers von Lot zu Lot ändern. In der Kreuzreaktivitätsliste von der ARCHITECT-Packungsbeilage ist die 3-epi-25-
Hydroxyvitamin D3-Erfassung mit 2,7% beschrieben, 24,25,Dihydroxyvitamin D3 (ein weiterer Metabolit) wird zu 112% erfasst.
Der Elecsys® Assay der Firma Roche hat eine gute Übereinstimmung mit den HPLC- und Routine-LC-MS/MS-Methode mit einem Slope von 1,01 und einem Bias von -2,38 ng/ml.
Dies entspricht auch den Angaben der Packungsbeilage, die eine Kreuzreaktivität von ca.
100% zum 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 und 24,25-Dihydroxyvitamin D3 angibt. Der
Korrelationskoeffizient mit 0,88 ist zwar nicht sehr gut, jedoch noch akzeptabel und aufgrund seiner Konzeption als Bindeproteinassay erklärbar. Jedoch gibt es das Phänomen, dass bei ca.
10% der Messungen wesentlich zu hohe, aber auch wesentlich zu niedrige Werte gemessen werden, die weder durch Hämolyse, Lipämie, Epimer oder Vitamin D2 erklärbar sind. ONG ET AL., 2012 ermittelte hingegen einen Slope von 1,31, einen Intercept von -1,3 ng/ml und einen nicht akzeptablen Korrelationskoeffizienten.
Der Streuung der Werte der Immunoassays im unteren Bereich ist unwesentlich, da dies nur im Bereich eines hochgradigen Mangels an 25-Hydroxyvitamin D3 auftritt. Patienten mit hochgradigem Mangel müssen supplementiert werden (FARRELL ET AL., 2012)
Die HPLC-Methode hat eine sehr gute Übereinstimmung mit der LC-MS/MS-Methode. Beide Methoden haben als Probenvorbereitung eine vollständige Eiweißfällung und können in diesen Methoden Metabolite - außer 25-OH-Vitamin D2 und 25-OH-Vitamin D3 - chromatographisch nicht abtrennen, d. h. diese werden miterfasst.
Die LC-MS/MS-Methode mit Epimerbestimmung ist zur Bewertung von hohen 25-OH- Vitamin D3-Werten genauer als die kurze LC-MS/MS-Methode, da man dadurch auch feststellen kann, dass in vielen Fällen auch Erwachsene das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 in höheren Konzentrationen haben. Hohe absolute Epimerkonzentrationen wurden vor allem bei Patientenseren sichtbar, die einen 25-OH-Vitamin D3-Spiegel über 20ng/ml und höher haben.
Jedoch wurde auch das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 bei niedrigen 25-OH-Vitamin D3 – Konzentrationen gefunden. Es ist keine lineare Korrelation erkennbar (VAN DER OUWELAND ET AL., 2011, KOBOLD, 2012).
Die kurze LC-MS/MS-Methode (ohne Epimerbestimmung) bzw. die HPLC-Methode ist bei Werten im Vitamin D3-Mangelbereich gut einsetzbar. Werte im normalen, nicht zu
supplementierenden, Bereich können jedoch leicht überschätzt werden, da das Epimer bei dieser Methode und bei dieser Konzentration keinen unerheblichen Anteil hat. Geht man von einem Anteil von 20% Metaboliten (3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 und 24,25-Dihydroxy- Vitamin D3) aus, wäre es eine Möglichkeit die Referenzbereiche nach oben zu korrigieren (Diskussion bei KOBOLD, 2012). Der toxische Bereich von 25-OH-Vitamin D3 (ab 150 ng/ml) wird damit noch lange nicht erreicht (VIETH, 1999).
Die Fragen zur biologischen Signifikanz, also unter welchen Konditionen die Epimerisierung entsteht bzw. in welchem Maße die Epimerisierung stattfindet, wurden noch nicht ausreichend geklärt. Aus diesem Grunde wird das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 noch nicht separat in Befunden ausgewiesen (VAN DER OUWELAND ET AL., 2011).
Bei Methoden, die das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 als 25-OH-Vitamin D3 erfassen (HPLC, kurze LC-MS/MS und der Elecsys-Immunoassay), kommt es zur Zeit immer noch zu
erhöhten Messwerten und damit zu falschen Therapien (SINGH ET AL, 2006)
Der Vergleich der Ergebnisse der Immunoassays, der HPLC und der LC-MS/MS in dieser Arbeit mit denen, die in anderen Studien erzielt wurden, stimmen mit Ausnahme des Ergebnisses, das man mit der HPLC erzielt hat, nicht überein. Dies wird durch
Vergleichsmessungen mit den DiaSorin RIA in zwei verschiedenen Laboren in Australien mit ein und dem gleichen Test bestätigt (LAI ET AL., 2011).
5 Zusammenfassung
Es wurden die Assay-Performances von verschiedenen 25-Hydroxyvitamin D-Tests überprüft.
Drei unterschiedlich arbeitende Immunoassays, eine HPLC-Methode und eine, das 3-epi-25- Hydroxyvitamin D3 abtrennende LC-MS/MS-Methode im Vergleich zur Referenzmethode an der LC-MS/MS, die das 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 nicht abtrennt.
Ein Immunoassay hat Vorteile wie kleines Probenvolumen, schnelle Turnaroundtime, hoher Durchsatz und die Einfachheit der Automatisierung, dafür schneiden aber die meisten Assays bezüglich Präzision und Richtigkeit der Messergebnisse schlecht ab. Nur der Elecsys® Assay hat in dieser Vergleichsmessung sehr gute Übereinstimmung gezeigt, jedoch ist der
Korrelationsfaktor nach Pearson mit 0,88 relativ niedrig. Die beiden anderen Tests waren nicht akzeptabel. Immunoassays sind immer abhängig von der Qualität der Vitamin-D- Bindeprotein-Abtrennung und des Antikörpers. Somit hat man immer eine gewisse Toleranz und Unsicherheit bei der Messung. Selbst wenn Standardreferenzmaterial genutzt wird, kann man dieser Problematik nicht völlig aus dem Wege gehen, da jede Probe anders zusammen- gesetzt ist und sich somit anders verhält.
Die HPLC-Methode und die kurze LC-MS/MS-Methode (ohne Epimerabtrennung) sind gute und robuste Methoden zur Bestimmung von Werten im unteren Bereich. Würde man die Referenzbereiche um ca. 20 % nach oben korrigieren, könnte man nach einem theoretischen Abzug der Metabolitenkonzentration in den physiologisch optimalen 25-OH-Vitamin D3- Bereich und höher messen (Diskussion bei KOBOLD 2012).
Die LC-MS/MS-Methode mit Epimerabtrennung ist vorallem bei Konzentrationen im
Normalbereich und darüber wichtig, da hier meist die Epimer-Konzentration am höchsten ist.
Sie eine robuste, spezifische und reproduzierbare Methode. Jedoch benötigt sie längere Analysenzeiten. Folglich ist der Durchsatz nicht sehr hoch.
Die von mir verwendeten Patientenseren waren alle eingefroren. Wie die statistische Verteilung und die Ergebnisse bei nicht eingefrorenen Proben aussieht, könnte in einem weiteren Schritt überprüft werden.
Die Varianz der Ergebnisse bestätigt die Komplexität, die eine „einfache“ Vitamin D- Messung beinhaltet. Nach meiner persönlichen Einschätzung zeigt es wiederum, dass es notwendig ist, Assays einzuführen, die den tatsächlichen Vitamin D-Status eines Patienten widerspiegeln.
Falsche Testergebnisse führen zu falschen Diagnosen und Studienergebnissen, zu Fehlinterpretationen von Populationsdaten und somit zu einer nicht adäquaten
Gesundheitspolitik. Unser Wissen über Vitamin D und die dazugehörige Analytik wächst von Jahr zu Jahr. Jedoch wird das Thema Vitamin D dadurch auch immer komplexer und es gibt noch viel, was in diesem Themenkreis zu belegen ist.
Meine in dieser Arbeit analysierten Daten und Testergebnisse untermauern die in letzter Zeit publizierten Ergebnisse: Die Immunoassays sind aufgrund des Testprinzips problematisch, die LC-MS/MS mit anpassungsfähigen und erweiterbaren Methoden ist und bleibt der
„Goldstandard“.
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7 Anhang
25-OH-Vitamin D3 –Messwerte Architect
1000
Advia Centaur
Cobas
e601 HPLC
LC-MS/MS- Routine
LC-MS/MS
Epimer Bemerkung
CMIA CLIA ECLIA
Abbott Siemens Roche Chromsystems Chromsystems Chromsystems
ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml
16,2 6,16 24,74 18,12 16,4 15,3 Vit D2 < LOQ
14,4 5,28 11,14 13,89 13,3 11,8 Epimer
12,7 <3,70 7,12 5,76 5,77 4,96
15,8 5,81 7,98 13,69 13,5 10,9 Epimer
20,2 9,31 23,33 27,64 29,6 25,1 Epimer
12,3 4,96 7,11 10,31 9,57 8,77
5,7 3,74 <3 5,73 5,23 4,33
18,9 6,04 9,05 15,26 16,8 13,5 Epimer
15,7 4,18 8,28 12,42 12,1 9,62
22,3 8,6 17,11 23,78 21,8 18,4
9,8 4,33 <3 <4 4,12 3,46
10,4 4,04 <3 <4 4,72 3,88
8,6 4,26 <3 <4 3,91 3,46
7 4,46 4,51 6,85 7,14 5,59
14,9 8,75 14,89 29,96 28,3 22,2 Epimer
19,1 10,34 18 19,42 20,2 18,2
14 5,24 4,76 7,41 8,61 6,3
11,2 4,86 6,51 5,92 6,82 5,88
17,5 5,42 11,82 10,9 12,7 10,1
15,5 7,57 18,58 19,37 20,7 17,1
20,7 8,97 17,33 10,39 12,3 11,1
7,5 5,75 <3 4,98 5,78 4,15
4,9 6,13 <3 5,05 5,17 3,25
16,4 7,81 17,06 21,4 21,2 18,5 Epimer
11,1 4,33 4,16 4,92 5,74 4,38
10,8 6,13 9,72 10,96 11 9,78
22,7 9,03 16,09 16,17 18,4 15 Epimer
9 4,13 11,76 7,94 5,5 5,1 Epimer
10,1 4,39 4,16 5,74 4,3 3,62
10,6 4,57 5,34 5,06 5,11 4,28
9,4 3,91 6,94 4,91 4,97 3,7
10,9 6,1 15,1 4,8 5,46 4,2 Vit D2 < LOQ
7,7 8,83 8,59 15,3 12,9 10,6
8,8 6,84 <3 7,52 6,8 6 Epimer
17 7,97 11 20,42 18,7 16,8 Vit D2 < LOQ
27,6 14,36 42,38 35,55 34,5 29,9
32,2 18,26 41,61 42,16 41 32
