Selma Ugurel, Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Julius-Maximilians-Universität, Würzburg.
20. Juli 2008
Ex-vivo Chemosensitivitätstestung: Eine Strategie zur Realisierung einer individualisierten Therapie des metastasierten malignen Melanoms
Das maligne Melanom ist eine Tumorerkrankung mit weltweit steigender Inzidenz [1]. Die Prognose eines Patienten nach erfolgter Exzision eines frühzeitig erkannten Primärtumors (Stadium I nach Klassifikation der AJCC [2]) ist mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von über 90% als günstig zu werten.
Nach Eintritt einer Metastasierung sinkt die 5-Jahres-Überlebensrate jedoch unter 60% (Stadium III);
bei Vorliegen einer Fernmetastasierung (Stadium IV) sogar unter 10% [2]. Auch unter Berücksichtigung verschiedenster therapeutischer Optionen liegt die mediane Überlebenszeit einer vorliegenden
Fernmetastasierung innerhalb der Haut, Unterhaut oder der Lymphknoten bei ca. 12 Monaten. Sind Metastasen in der Lunge oder anderen Organen aufgetreten, liegt das mediane Überleben nur bei ca.
8 Monaten [2]. Trotz intensiver Bemühungen in der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien sind die Erfolge in der Behandlung des metastasierten Melanoms bisher eher als eingeschränkt zu werten [3; 4; 5]. Der Therapiestandard des fernmetastasierten Melanoms besteht aus einer
Monochemotherapie mit Dacarbazin (DTIC), und zeigt eine Ansprechrate <10% [3; 4; 6;7]. Andere Therapiestrategien wie die Polychemotherapie, die Immuntherapie, sowie neuere „Targeted
Therapien“ zeigten in der randomisierten Prüfung im Rahmen prospektiver klinischer Studien bislang keinen Überlebensvorteil gegenüber DTIC [3; 4; 6; 7]. Da keine prädiktiven Marker des Therapieerfolgs bekannt sind, erfolgt die Auswahl eines Therapieregimes zur individuellen Behandlung eines
Patienten mit metastasiertem Melanom aktuell empirisch.
Ex-vivo Chemosensitivitätstestung
Man ging bislang davon aus, dass der geringe Therapieerfolg einer Chemotherapie auf einer hohen intrinsischen Chemoresistenz der Melanomzellen beruht [8; 9]. Es liegen jedoch zahlreiche Berichte über Patienten mit fernmetastasiertem Melanom vor, bei denen es unter Chemotherapie zu einer kompletten und anhaltenden Remission sämtlicher metastatischer Läsionen kam. Dies gibt einen Hinweis auf eine mögliche Subgruppe von Melanompatienten, die längerfristig von einer Chemotherapie profitieren
könnten. Daher wurden Anstrengungen unternommen, um derartige, hinsichtlich einzelner Zytostatika sensible Patienten vor dem geplanten Beginn einer Behandlung zu identifizieren, um sie anschließend mit einem individuellen, ihrem Chemosensitivitätsprofil entsprechenden Therapieregime zu behandeln. Ex- vivo Testsysteme unter Verwendung unterschiedlicher Messmethoden wie beispielsweise der 3H- Thymidin-Technik oder der Quantifizierung der Kolonie-Bildung wurden hinsichtlich ihrer Eignung zur Voraussage der patienteneigenen Chemosensitivität von Melanompatienten evaluiert, zeigten jedoch durchweg hohe Resistenzen und wurden nicht in Korrelation zum klinischen Therapieerfolg der betroffenen Patienten gebracht [10; 11; 12]. 0
1997 wurde erstmals ein neu entwickeltes Testsystem, der ATP-basierte Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA; siehe Abb. 1) [13] an Gewebeproben von primären Melanomen der Uvea getestet [14]. Eine Mindestmenge von 1 cm3 Tumorgewebe wird zerkleinert und anschließend enzymatisch aufgeschlossen.
Die erhaltene Zellsuspension wird mittels Dichtegradientenzentrifugation von Erythrozyten und
zellulärem Debris gereinigt. Anschließend werden die Zellen in 96-Loch-Rundboden-Platten unter Zusatz verschiedener Zytostatika in 6 unterschiedlichen Verdünnungen der zuvor ermittelten „Test Drug
Konzentration“ (TDC) [13] kultiviert. Nach einer Kulturdauer von 7 Tagen werden die Zellen lysiert und die Menge an hierbei freigesetztem ATP mittels einer Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktion quantifiziert.
Aus den erhaltenen Datenkurven lässt sich ein individueller Chemosensitivitätsindex für jedes getestete Zytostatikum berechnen. Dieser Ansatz bietet gegenüber herkömmlichen Testverfahren den Vorteil, dass die zu untersuchenden Tumorzellen nicht zu Wachstum und Proliferation angeregt, sondern lediglich vital gehalten werden. Aufgrund der somit fehlenden Klonogenität des Assays bildet die Zusammensetzung der Zellen nach 7 Tagen Testdauer exakt die Verhältnisse im Tumorgewebe zum Zeitpunkt der
Probenentnahme ab. So wurde das Testsystem bereits erfolgreich eingesetzt, um die Chemosensitivität von Patientinnen mit metastasiertem Ovarialkarzinom vorherzusagen [15]. Proben von
Melanommetastasen, die von uns und anderen mit diesem Verfahren analysiert wurden, zeigten eine heterogene Sensitivität der Melanomzellen gegenüber einer Zytostatikaauswahl [16; 17], d.h. für einen beträchtlichen Anteil der getesteten Patienten ließ sich ein ex-vivo wirksames Chemotherapieregime detektieren. Dieses Ergebnis eröffnete erstmals die Möglichkeit, mittels einer prätherapeutischen Chemosensitivitätstestung tatsächlich Melanompatienten zu identifizieren, deren Tumorzellen eine Sensitivität gegenüber einzelnen Zytostatika aufwiesen. Die Korrelation der ex-vivo Testergebnisse mit dem klinischen in-vivo Therapieerfolg der betroffenen Patienten blieb jedoch ausstehend.
Erste klinische Studien
Um die Korrelation zwischen ex-vivo ermittelter Chemosensitivität der Tumoren und in-vivo
beobachtetem Therapieerfolg zu untersuchen, wurde 2001 unter der Aegide der Arbeitsgemeinschaft für Dermatologische Onkologie (ADO) eine multizentrische Phase-II-Studie initiiert. Diese Studie untersuchte die Behandlung von Patienten mit metastasiertem Melanom mittels einer individualisierten
Chemotherapie nach ex-vivo Chemosensitivitätsprofil. Aus Metastasen der Patienten gewonnene Tumorzellen wurden ex-vivo mit verschiedenen Zytostatika inkubiert, und über eine anschließende Messung des ATP-Gehaltes ließ sich für jede getestete Substanz ein individueller Chemosensitivitätsindex
(ICSI) berechnen (siehe Abb. 1). Die Substanzkombination mit dem besten individuellen
Chemosensitivitätsindex (BICSI) wurde für die anschließende Behandlung der Patienten eingesetzt. Die am häufigsten verwendeten Kombinationen waren Gemcitabin+Treosulfan, Paclitaxel+Cisplatin, Paclitaxel+Doxorubicin sowie Gemcitabin+Cisplatin. Von 57 behandelten Studienpatienten waren 53 auswertbar für die Studienendpunkte Ansprechrate und erkrankungsspezifisches Überleben. Anhand des BICSI konnten die Studienpatienten retrospektiv in eine „chemosensitive“ und eine „chemoresistente“
Gruppe unterteilt werden. Die chemosensitiven Patienten zeigten im Vergleich zu den chemoresistenten eine erhöhte Therapieansprechrate (CR+PR 36,4% vs. 16,1%, p=0,114; CR+PR+SD 59,1% vs. 22,6%, p=0,01), sowie ein verlängertes Gesamtüberleben (median 14,6 versus 7,4 Monate, p=0,041; siehe Abb. 2) [8].
Interessanterweise unterschieden sich chemosensitive und chemoresistente Patienten nicht signifikant in den für das metastasierte Melanom bekannten Prognose-Parametern Allgemeinzustand, skaliert nach den Leitlinien der Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG); Serumkonzen-tration der
Laktatdehydrogenase (LDH); sowie Lokalisation der Fernmetastasen (M Klassifikation nach den Leitlinien des American Joint Committee on Cancer (AJCC). 1
Ex-vivo Testung von Targeted Agents
Ein neue Möglichkeit zur Behandlung des metastasierten Melanoms eröffnet sich durch das aktuell rasch expandierende Feld der „Targeted Therapeutika“, meist kleine Moleküle, die speziell für die Interaktion mit den lebenswichtigen Signalkaskaden von Tumorzellen entwickelt wurden. Signalwege, die beim Melanom eine entscheidende Rolle spielen, sind z.B. die Raf-Ras-Mek-Erk-Kaskade oder der PI3K/PTEN- Akt-mTOR Signalweg [19; 20; 21]. In der Monotherapie zeigten die Targeted Therapeutika in ersten Phase- II-Studien an Patienten mit metastasiertem Melanom bislang wenig Wirkung [22], aber zahlreiche in-vitro Daten deuten darauf hin, dass sich von der Kombination dieser zielgerichteten Substanzen mit
Zytostatika eine Chemosensibilisierung der Tumorzellen und somit eine Wirkungsverstärkung der Chemotherapie erzielen lässt [23; 24]. Durch die Vielzahl der heute verfügbaren Targeted Therapeutika und der Kombinationsmöglichkeiten mit den verschiedensten Zytostatika ergibt sich eine kaum zu überschauende Menge an möglichen Therapieregimen. Eine willkürliche Auswahl einer derartigen Kombinationstherapie ohne Kenntnis prädiktiver Biomarker erscheint für den einzelnen Patienten wenig sinnvoll, daher ist hier mehr denn je die Möglichkeit einer Vorhersage der individuell am besten
geeigneten Therapiekombination mittels verlässlicher ex-vivo Testverfahren gefragt. 2
Erste Versuche einer ex-vivo Testung des mTOR-Inhibitors RAD001/Everolimus zeigten vielversprechende Ergebnisse. Diese Substanz wurde aus der Vielzahl zielgerichteter Therapeutika ausgewählt, weil sie nachweislich in den PI3K/PTEN-Akt-mTOR Signalweg eingreift, der für Wachstum und Proliferation von Melanomzellen eine entscheidende Rolle spielt [29; 30]. Erste Daten an Zellinien sowie im Tiermodell zeigen einen antiproliferativen Effekt von RAD001/Everolimus in Kombination mit einer Chemotherapie [25; 24; 26; 27]. RAD001/Everolimus ist bereits für die Behandlung transplantierter Patienten zur
Prophylaxe einer Abstoßungsreaktion zugelassen, und zeigt auch in höherer Dosierung, wie bereits in klinischen Phase-II-Studien bei Tumorpatienten eingesetzt, eine gute Verträglichkeit [28]. In ersten Vorversuchen konnten wir zeigen, dass sich RAD001/Everolimus ebenso wie ein Zytostatikum mittels des
ATP-Lumineszenz-Assays ex-vivo titrieren und mit Zytostatika kombinieren lässt. Erste ex-vivo Testserien ergaben eine sehr gute Wirkungsverstärkung der Chemotherapie durch Zugabe von RAD001/Everolimus in einigen der getesteten Tumoren (siehe Abb. 3), und erste Behandlungsversuche metastasierter
Patienten zeigten vielversprechende Ergebnisse.
Geplante Phase-III-Studie
Mit der erfolgreich beendeten multizentrischen Phase-II-Studie gelang es, die prätherapeutische ex-vivo Chemosensitivitätstestung als eine neue Methodik zur individualisierten Therapie metastasierter
Melanompatienten darzustellen [28]. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich eine derartige ex-vivo Testung an Tumor-Frischgewebe in einem multizentrischen Setting realisieren lässt, und dass eine klare Assoziation zwischen den Ergebnissen des Testverfahrens und dem klinischen Therapieansprechen der getesteten Patienten besteht. Es steht nun die Evaluation dieser Ergebnisse mittels einer klinischen prospektiv-randomisierten Phase-III-Studie aus, die eine individualisierte sensitivitätsgerichtete Kombinationstherapie mit der Standard-Monochemotherapie DTIC vergleicht. Eine derartige Studie befindet sich aktuell unter der Aegide der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie (ADO) unter dem Kürzel „ChemoSensMM“ in Planung und wird deutschlandweit in einem multizentrischen Setting durchgeführt werden. Das Studiendesign sieht vor, 360 Patienten in diese Studie einzuschließen, um folgende Fragen zu beantworten:
1. Ist der mittels des ATP-Testverfahrens aus Tumorfrisch-gewebe des Patienten ermittelte Chemosensitivitätsindex BICSI ein prädiktiver Biomarker des Therapierfolgs?
2. Ist eine mittels frühzeitig ausgetesteter Sensitivität individuell auf den Patienten zugeschnittene Kombinationschemotherapie der Standard-Monotherapie mit DTIC überlegen?
3. Wenn ja, ist dies global der Fall, oder nur in der chemosensitiven oder der chemoresistenten Patientengruppe ? (siehe Abb. 4).
Hierzu werden nach erfolgter ex-vivo Chemosensitivitätstestung aus Metastasengewebe die Patienten randomisiert auf zwei Therapiearme, individualisierte sensitivitätsgerichtete
Kombinationschemotherapie, oder DTIC Monochemotherapie, verteilt. Eine Studiendauer von ca. 4 Jahren wird erwartet; die Studie wird gefördert von der Hiege-Stiftung gegen Hautkrebs (www.hiege- stiftung-gegen-hautkrebs.de). 3
Schlussfolgerungen / Fazit
Sollte sich durch die geplante Phase-III-Studie zeigen, dass eine individualisierte, sensitivitätsgerichtete Chemotherapie der Standardtherapie mit DTIC überlegen ist, wäre die ex-vivo Chemosensitivitätstestung zukünftig als diagnostisches Verfahren zur gezielten Auswahl des für den einzelnen Patienten optimalen Therapieregimes nutzbar. Speziell im Hinblick auf die genannte Bandbreite der aktuell zur Verfügung stehenden Therapeutika und den vielfältigen Kombinationsmöglichkeiten wäre ein derart valides diagnostisches/prognostisches System von unschätzbarem Wert in der Therapieplanung. Desweiteren wäre es möglich, „chemoresistente“ Patienten frühzeitig zu identifizieren, denen sodann andere Therapieoptionen wie z.B. Immuntherapeutika [29], Kinaseinhibitoren, oder Modulatoren der
Genexpression [30] angeboten werden können, um ihnen die Belastung durch eine wenig erfolgversprechende Chemotherapie mit den ihr anhaftenden Nebenwirkungen zu ersparen.
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