Universität Bonn
Direktor: Prof. Dr. A. Hörauf
Molekulare Phylogenie der Malariaerreger (Haemosporida) unter besonderer Berücksichtigung des Vogelmalariaerregers
Plasmodium (Haemamoeba) cathemerium, sowie Untersuchungen zum Vorkommen der Vogelmalaria in Deutschland
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von
Sandra Carolin Wiersch aus
Dinslaken
Bonn 2005
1. Gutachter: Prof. Dr. W. A. Maier 2. Gutachter: Prof. Dr. J.-W. Wägele Tag der Prüfung: 13.04.2006
Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert
Erscheinungsjahr 2006
Meinen Eltern
Inhalt
1 Einleitung 1
1.1 Die aktuelle Situation der Malaria des Menschen 1 1.2 Besonderheiten und Evolution von Plasmodium falciparum 2
1.3 Der Befall von Vögeln durch Haemosporina 4
1.4 Phylogenie der Malariaerreger 8
1.5 Zielsetzung der Arbeit 9
2 Material und Methoden 11
2.1. Haemosporina, die für die molekulare Phylogenie zur Verfügung standen 11 2.2 Gewinnung von Untersuchungsmaterial aus Vögeln 11
2.2.1 Freilebende, einheimische Vögel 11
2.2.2 Zoovögel 13
2.2.3 Kontrollen 13
2.3 Auswahl der untersuchten Gene 13
2.4 Kontinuierliche P. falciparum-Kultur 14
2.5 DNA-Gewinnung 14
2.5.1 DNA-Extraktion aus parasitiertem Kulturmedium, Patienten- und
Mäuseblut 14
2.5.2 DNA-Extraktion aus dem Blut der gefangenen Vögel 15 2.5.3 DNA-Extraktion aus Paraffinschnitten 15
2.6 DNA-Amplifikation 16
2.6.1 Amplifikation der spezifischen Gensequenzen für die molekulare Phylogenie 16 2.6.2 PCR zur Ermittlung der Infektionsprävalenzen einheimischer Vögel 19 2.6.3 PCR zur Ermittlung des Erregerspektrums einheimischer Vögel mit
Malariaparasiten 21
2.6.4 Unspezifische DNA-Präamplifikation 23
2.7 Agarose-Gelelektrophorese und Färbung der Gele 24
2.8 DNA-Elution 24
2.9 DNA-Sequenzierung 25
2.10 Phylogenetische Analyse 26
2.10.1 Sequenz-Alignment 26
2.10.2 Maximum-Parsimonie 29
2.10.3 Maximum Likelihood 30
2.10.4. Baye’ssche Analyse 31
2.10.5 Analyse der Sekundärstruktur der 18 SSU rRNA 32 2.10.6 Graphische Darstellung der phylogenetischen Stammbäume 35 2.11 Lichtmikroskopische Untersuchungen 35
2.11.1 Vogelblut-Ausstriche 35
2.11.2 Anfertigung von Paraffinschnitten 36
2.12 Statistische Auswertungen 37
3 Ergebnisse 38 3.1 Infektionsprävalenzen und Erregerspektrum bei den niedersächsischen Vogelpopulationen 38
3.1.1 Infektionsprävalenzen einheimischer Vögel mit Malariaparasiten 38 3.1.2. Erregerspektrum einheimischer Vögel mit Haemosporina 40
3.1.2.1 Erregerspektrum bei den Tannenmeisen 41
3.1.2.2 Erregerspektrum bei den Trauerschnäppern 43
3.1.2.3. Erregerspektrum bei den Kohlmeisen 45
3.1.3 Lichtmikroskopische Untersuchungen der Vögel auf Malariaparasiten 46 3.2 Untersuchungen an Zoovögeln 47
3.2.1 Vorkommen der Vogelmalaria in heimischen Zoos und Tierparks 47 3.2.2 Untersuchung der Organproben des Brillenpinguins 47 3.2.3 Untersuchung der Organproben des Balistars 48 3.3 Sequenzierung einzelner Gene der Malariaerreger P. cathemerium, P. y. yoelii,
P. chabaudi und P. ovale 49
3.4 Molekulare Phylogenie 54
3.4.1 Phylogenetischer Stammbaum des ClpC-Gens 54 3.4.2 Phylogenetischer Stammbaum des cyt b-Gens 55 3.4.3 Phylogenetischer Stammbaum des 18 SSU rRNA-Gens 58
4 Diskussion
604.1 Entdeckung der Vogelmalariaerreger 60
4.2 Entwicklung der Vogelmalariaerreger und ihre Auswirkungen auf den Wirt 60 4.3 Nachweis der Vogelmalariaerreger mit Hilfe molekularbiologischer Methoden 64 4.4 Infektionsprävalenzen heimischer Vögel mit Malariaerregern 67
4.5 Identifizierung der Malariaparasiten 68
4.5.1 Problematik der Speziesdifferenzierung nach morphologischen Gesichtspunkten 68 4.5.2 Unterstützung der Speziesidentifizierung durch DNA-Sequenzanalyse 69 4.5.3 Problematik der Speziesdifferenzierung aufgrund von DNA-Sequenzen 70 4.6 Auswirkungen allochthoner Malariaerreger auf die Avifauna 71 4.7 Erregerspektrum bei den niedersächsischen Vögeln 72
4.7.1 Tannenmeisen 72
4.7.2 Trauerschnäpper 73
4.7.3 Kohlmeisen 74
4.8 Lichtmikroskopische Einordnung des Malariaerregers aus dem Blut der
Tannenmeise 74
4.9 Untersuchung der Zoovögel auf Haemosporina 76
4.10 Molekulare Systematik 79
4.10.1 Theorien über die Abstammung von P. falciparum 83 4.10.2 Überblick über vorangegangene phylogenetische Untersuchungen an
Malariaerregern 86
4.10.3 Versuche zur Stammbaumerstellung anhand des 18 SSU rRNA-Gens 88 4.10.4 Versuche zur Stammbaumerstellung anhand des 30 SSU rRNA-Gens 91 4.10.5 Versuche zur Stammbaumerstellung anhand des Circumsporozoiten-Gens 91 4.10.6 Versuche zur Stammbaumerstellung anhand des cyt b-Gens 92 4.10.7 Versuche zur Stammbaumerstellung anhand des ClpC-Gens 94 4.10.8 Versuche zur Stammbaumerstellung anhand des Adenylsuccinatlyase-Gens 94 4.11 Erstellung phylogenetischerStammbäume unter Einbeziehung der neu
vorgestellten Sequenzen 95
4.11.1 DNA-Sequenzen von P. cathemerium, P. y. yoelii, P. chabaudi und P. ovale 96 4.11.2 Auf der Analyse des ClpC-Gens basierender Stammbaum der Malariaerreger 97 4.11.3 Auf der Analyse des cyt b-Gens basierender Stammbaum der Malariaerreger 98 4.11.4 Auf der Analyse des 18 SSU rRNA-Gens basierender Stammbaum der
Malariaerreger 99
4.12 Resümee 100
5 Zusammenfassung 102
6 Literatur 104
7 Publikationen 127
8 Anhang 128
1 Einleitung
1.1 Die aktuelle Situation der Malaria des Menschen
Die Malaria ist nach wie vor eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten des Menschen. Die vier humanpathogenen Erreger der Gattung Plasmodium (Apicomplexa: Plasmodiidae), P.
falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariae, sind heutzutage über weite Gebiete der Tropen und Subtropen verbreitet. Ungefähr 40 % der Weltbevölkerung lebt in Malaria- gefährdeten Gebieten, in denen zusammen 300 bis 500 Millionen Krankheitsfälle pro Jahr auftreten. Die Zahl der Todesfälle, die fast ausschließlich durch P. falciparum, den Erreger der Malaria tropica, verursacht werden, wird auf über eine Million jährlich geschätzt (WHO 2000). Man geht sogar davon aus, dass die Zahl der jährlichen Neuinfektionen und der Todesfälle in nächster Zeit zunehmen wird, zumal sich die Bevölkerung in einigen Malariagebieten in den letzten zwei Jahrzehnten verdoppelt hat (Greenwood und Mutabingwa 2002).
Zwar existieren verschiedene Medikamente, die zur Malariaprophylaxe und -therapie eingesetzt werden können, doch traten in den vergangenen Jahrzehnten zunehmend häufig und immer schneller resistente Erregerstämme auf (Mu et al. 2003). Dies war vor allem in Südostasien und in Afrika zu beobachten. Doch auch die Stechmücken, als Überträger der Malariaparasiten, haben in West- und Südafrika zunehmend Resistenzen gegen Insektizide (z.B. Pyrethroide) entwickelt und sind somit schlechter zu bekämpfen (Greenwood und Mutabingwa 2002). Des Weiteren ist es bis heute nicht gelungen, einen Malariaimpfstoff zu entwickeln, der es erlauben würde, die exponierte Bevölkerung vollständig durch immunisieren (Wang et al. 2003). In vielen der betroffenen Ländern führen Bürgerkriege dazu, dass die öffentliche Gesundheitsversorgung nicht mehr gewährleistet ist und Malaria- Bekämpfungsprogramme eingestellt werden müssen. Auch die globale Erwärmung (Vektoren dringen in Gebiete vor, in denen sie vorher aus klimatischen Gründen nicht vorkamen (Greenwood und Mutabingwa 2002) und von Menschen herbeigeführte Umwelt- veränderungen (z.B. Bau von Staudämmen, Bewässerungsmaßnahmen) tragen zur Verbreitung der Vektoren und der Krankheit bei. Ein weiteres Problem ist die ansteigende Zahl an Touristen, Bürgerkriegsflüchtigen, Migranten etc., die die Krankheit aus endemischen Gebieten in Gegenden bringen, in denen es die Erreger vorher nicht gab.
1.2 Besonderheiten und Evolution von Plasmodium falciparum
Weshalb es im Laufe der Evolution zu der hohen Pathogenität von P. falciparum kam, ist bis heute ungeklärt. Im Gegensatz zu den anderen menschlichen Malariaerregern bildet P.
falciparum so genannte ‚knobs’ an der Erythrozytenoberfläche aus, die zur Sequestration der Blutkörperchen in den Kapillaren führen kann (Newbold et al. 1999). Falls aus dieser eine Kapillarblockade mit Blutstauung im Gehirn resultiert, fällt der Patient in einen komatösen Zustand, und die Infektion kann einen tödlichen Verlauf nehmen. Doch nicht nur in seiner Pathogenität unterscheidet sich P. falciparum von den anderen humanen Plasmodienarten. Es zeichnet sich weiterhin durch das Fehlen einer typischen, mit regelmäßigen Fieberschüben einhergehenden Periodizität der asexuellen Vermehrungszyklen (Waters et al. 1993a) aus, durch die halbmondförmige Gestalt der Gametozyten und die starke Antigenvariabilität (Babiker und Walliker 1997).
Verschiedene Theorien wurden in den letzten Jahren aufgestellt, die sich mit der Abstammung von P. falciparum beschäftigen. Laut Brooks und McLennan (1992) lässt die hohe Pathogenität von P. falciparum auf eine entwicklungsgeschichtlich junge Wirt-Parasit- Beziehung schließen, da erst kürzlich erworbene Parasiten noch nicht optimal an den Wirt angepasst sind und den Wirt so stark schädigen können, dass sie ihn und damit ihr eigenes Refugium vernichten. Conway und Baum (2002) schätzen, dass P. falciparum – im Gegensatz zu den anderen humanpathogenen Spezies – erst vor ca. 10000 Jahren auf den Menschen übergegangen ist, etwa zur selben Zeit als die Sichelzellanämie und die Thalassämie entstanden sind, Krankheiten, die als Nebeneffekt vor Malaria schützende Auswirkungen haben können (Hebbel 2003; Mockenhaupt et al. 2004).
Auch DNA-Sequenzanalysen, bei denen Genregionen der vier humanpathogenen Plasmodienarten miteinander verglichen wurden (McCutchan et al. 1984, Waters et al. 1991, 1993b), legen nahe, dass P. falciparum nur entfernt mit den drei anderen Plasmodienarten verwandt ist. Waters und Kollegen warfen 1991 die Frage auf, ob P. falciparum von Vogelmalariaerregern abstammen könnte. In ihrer Studie, in der die 18 SSU rDNA verschiedener Plasmodienspezies von Mensch, Affen, Nagern und Vögeln miteinander verglichen wurden, stellte sich heraus, dass P. falciparum am engsten mit P. gallinaceum und P. lophurae, zwei Vogelmalariaerregern, verwandt sein könnte. Nach Waters et al. (1993a) könnte ein Wirtswechsel vom Vogel zum Menschen vor ca. 5000 Jahren mit dem Auf- kommen des kontrollierten Pflanzenanbaus und der damit verbundenen zunehmenden Sesshaftigkeit der Bevölkerung stattgefunden haben. Diese würde nämlich eine relativ hohe
Durchseuchung der Bevölkerung und eine enge Adaption des Parasiten an eine Vektorspezies (z.B. Anopheles gambiae) erlaubet haben. Dies sind Voraussetzungen für die Aufrecht- erhaltung des P. falciparum-Zyklus’.
Andere Autoren (Qari et al. 1996; Escalante et al. 1998; Perkins und Schall 2002), die später weitere Gene und weitere Erregerspezies molekularbiologisch untersucht haben, können die These, dass P. falciparum einen Vogelmalariaparasiten zum Vorfahren haben könnte, nicht unterstützen. Nach wie vor sind deshalb die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen den Malariaerregern weitgehend spekulativ.
Vielleicht würde aber gerade die Kenntnis über den phylogenetischen Ursprung von P.
falciparum Aufschluss darüber bringen, warum sich dieser Erreger so von den drei anderen humanpathogenen Plasmodienarten unterscheidet. Nicht nur aus Gründen der Grundlagen- forschung, sondern auch mit Hinblick auf die angewandte Malariaforschung wäre die Aufklärung der verwandtschaftlichen Beziehungen zwischen den Malariaerregern höchst bedeutsam. Erkenntnisse dazu könnten die Herangehensweisen bei der Entwicklung von neuen Malariamedikamenten und einer effizienten Vakzine entscheidend beeinflussen. Würde sich nämlich herausstellen, dass P. falciparum tatsächlich näher mit den Vogelmalaria- erregern verwandt ist als mit den anderen humanpathogenen Arten, wäre das Vogelmodell bei der Impfstoff- und Medikamentenforschung, auf das man schon früher mangels Kultivierungsmöglichkeiten zurückgegriffen hatte, möglicherweise einem Maus-Modell und sogar einem Affen-Modell mit humanpathogenen Malaria tertiana-Erregern vorzuziehen.
Bevor das Nagermalaria-Modell zum Testen von neuen Medikamenten in den Laboren Standard wurde, hatte man an Vogelmalaria-Modellen immerhin so wichtige Medikamente wie das Plasmochin, Primaquin und Atebrin (Roehl 1926; Walker und Richardson 1948; Fink und Dann 1967) entwickelt. Aber auch heute noch werden Vogel-Modelle verwendet, um die Effizienz von Vakzinen in ihrer natürlichen Umgebung zu testen (McCutchan et al. 2004).
Von grundsätzlicher Relevanz für die experimentelle Malariaforschung ist daher die Frage, ob die phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den Wirten wichtiger sind oder die zwischen den Parasiten.
1.3 Der Befall von Vögeln durch Haemosporina
Zu den Erregern der Vogelmalaria werden die Gattungen Plasmodium, Haemoproteus und Leucocytozoon gezählt (Hellgren et al. 2004), die nach der Systematik von Levine et al.
(1980) zu der Unterordnung der Haemosporina gehören.
Phylum: Apicomplexa Klasse 2: Sporozoa
Unterklasse 2: Coccidia
Ordnung 3: Eucoccidiida
Unterordnung 3: Haemosporina Familie 1: Leucocytozoidae Familie 2: Haemoproteidae Familie 3: Plasmodiidae
Die Vogelmalaria ist nahezu auf der ganzen Welt verbreitet (Smyth 1976; Seed und Manwell 1977; Krone et al. 2001; Schrenzel et al. 2003). Sie tritt in Australien allerdings nur sehr selten auf (Bennett et al. 1993), und in Neuseeland wurden im Rahmen umfassender Studien überhaupt keine Blutparasiten in der Avifauna festgestellt (Bennett et al. 1993).
Wenn Vogelmalariaparasiten durch den Stich der Mücke in den Vogel injiziert werden, befallen sie primär verschiedene Gewebe des retikuloendothelialen Systems (RES) und können erst nach einigen Tagen, wenn sie in die roten Blutkörperchen eingedrungen sind, lichtmikroskopisch nachgewiesen werden. In Vogelarten, die auf eine Koevolution mit dem Erreger zurückblicken können, steigt die Parasitämie zunächst an, nimmt dann aber wieder ab bevor lebensbedrohliche Werte erreicht werden, und der Parasit verschwindet aus dem Blut.
Falls eine Wirtsart zuvor allerdings noch nie mit Malariaparasiten Kontakt hatte oder ein neuer Parasitenstamm in eine Wirtspopulation eindringt, kann die Infektion einen tödlichen Ausgang nehmen (Bensch et al. 2000). Die durch Malaria verursachte Morbidität und Mortalität bei Wildvögeln ist jedoch bisher kaum untersucht und daher nicht genau bekannt (Garnham 1966).
Zur Zeit sind 34 gültige Spezies der Gattung Plasmodium mit unterschiedlich ausgeprägten Wirtsspektren beschrieben (Bennett et al. 1993). Neun Erregerarten sind streng wirts- spezifisch und befallen nur eine Vogelart. Von vier Spezies ist bekannt, dass nur zwei
Vogelarten an ihnen erkranken können. Acht Erregerarten befallen mehr als 50 verschiedene Vogelarten, und P. relictum wurde weltweit bereits bei 359 Vogelarten aus 70 Familien nachgewiesen. Andere stark verbreitete Arten sind P. vaughani und P. circumflexum, die beide mehr als 100 verschiedene Wirtspezies befallen können. Die umfangreichste Auflistung über die Erreger der Vogelmalaria und deren Wirte wurde von Bishop und Bennett (1992a,b) erstellt.
Über den Grad der Prävalenz der Vogelmalaria liegen unterschiedliche Daten vor. Bei Smyth (1976) wird beschrieben, dass die Gattung Plasmodium auf der ganzen Welt mit einer Häufigkeit von 5,8 % vorkommt (ca. 7000 Vögeln wurden untersucht), wobei die Infektion in gemäßigten Zonen nicht seltener auftritt als in tropischen. Die weltweite Verbreitung der Vogelmalaria kommt nach Manwell (1935) u.A. durch das Wanderverhalten der Vögel zustande. Greiner et al. stellten 1975 eine Arbeit vor, in denen die Ergebnisse von 57026 untersuchten Vögeln aus Nordamerika zusammengefasst war. Hier wurden Prävalenzen von 3,8 % für Plasmodium-, 19,5 % für Haemoproteus- und 17,7 % für Leucocytozoon-Spezies festgestellt. In einer Studie von McClure et al. (1978) waren von 55289 untersuchten Vögeln aus Südostasien 0,8 % mit Plasmodium-, 11,3 % mit Haemoproteus- und 2,7 % mit Leucocytozoon-Arten infiziert. Gabaldon (1974, 1975, 1976, 1978) sammelte über drei Jahre Daten zur Verbreitung der Vogelmalaria in Venezuela und stellte bei 0,6 % von insgesamt 21201 untersuchten Vögeln einen Plasmodien-, bei 2,6 % einen Haemoproteus- und bei 0,1 % einen Leucocytozoon-Befall fest.
Eine Zusammenfassung über den Kenntnisstand zur Verbreitung der Vogelmalaria in Europa veröffentlichte Kučera (1981a,b,c). Insgesamt wurden 10194 Vögel erfasst, von denen 11,3 % mit Plasmodium-, 11,8 % mit Haemoproteus- und 5,9 % mit Leucocytozoon-Erregern infiziert waren. Eine weitere Übersichtsarbeit von Scheuerlein und Ricklefs (2004) präsentiert die zusammengefassten Ergebnisse von 120 Studien über die Verbreitung von Blutparasiten insgesamt (inkl. Trypanosomen) in europäischen Vögeln. Sie stellten bei 14812 erfassten Individuen eine Prävalenz von 28,6 % fest.
Für Deutschland beschreiben Krone et al. (2001), dass von 1149 untersuchten Eulen und Greifvögeln nur bei einem Individuum ein Befall mit Plasmodien festgestellt werden konnte.
Insgesamt wurde aber bei 11 % der Tiere eine Infektion mit Vogelmalariaerregern gefunden.
Dieses Ergebnis wurde anhand von Blutausstrichen gewonnen, genauso wie die Daten von Haberkorn (1984), der 893 in Deutschland gefangene Sperlingsvögel (Passeriformes) von 44 Arten aus 14 unterschiedlichen Familien untersuchte. 14 % der untersuchten Vögel waren mit
Vogelmalariaerregern infiziert, davon 1,1 % mit Plasmodien. Kronberger und Schüppel beschrieben 1977 in einer Übersicht über 7126 durchgeführte Sektionen an Vögeln aus Zoohaltungen 14 Fälle von Plasmodienbefall, hauptsächlich bei Pinguinen.
Nähere Kenntnisse zur Verbreitung der Vogelmalaria in Deutschland sowie zur Pathogenität ihrer Erreger sind nicht nur von akademischem Interesse. Die Infektion kann auch unter den in Gefangenschaft gehaltenen Tieren in Zoos (Ippen und Schröder 1972), Wildparks (Valentin et al. 1994) und Privathaltungen enormen wirtschaftlichen Schaden im Bestand anrichten. Das Problem der Vogelmalaria ist vor allem aus zoologischen Gärten bekannt, in denen sich insbesondere Pinguine als hochanfällig für Malaria erwiesen haben (Kronberger und Schüppel 1977; Lindt und Hörning 1966).
Um festzustellen, ob ein Vogel mit Malariaerregern infiziert ist, kann ein Blutausstrich zur mikroskopischen Untersuchung angefertigt werden. Auch zur Artbestimmung wird diese Methode routinemäßig genutzt. Da aber die Parasitämie beim Vogel zeitweise erfahrungs- gemäß extrem gering ist, ist der Nachweis der Malariaerreger durch eine mikroskopische Untersuchung meist nur im akuten Stadium möglich, und die Identifizierung erweist sich selbst bei bekannten Parasitenspezies in vielen Fällen als schwierig. Vorzuziehen ist ein Nachweis der Parasiten-DNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), da die Sensitivität dieses Verfahrens nicht nur beträchtlich höher ist als der Lichtmikroskopie (Waldenström et al. 2004), sondern die amplifizierten DNA-Regionen auch einer Sequenzie- rung und vergleichenden Analyse mit Hinblick auf das Erregerspektrum zugänglich macht. Je größer nämlich die Parasitendiversität ist, der ein potentieller Wirt exponiert ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung und die Virulenz der Parasitenpopulation einzuschätzen (Bensch et al. 2004).
In den letzten Jahren hat sich das Interesse für die Vogelmalaria aus weiteren Gründen verstärkt. Möglicherweise als Folge einer voranschreitenden Klimaerwärmung und zunehmender Verschleppung infizierter Vögel und Mückenvektoren erobert sie seit einiger Zeit Gebiete, in denen sie vorher nicht vorkam. Die Folge ist die drohende Ausrottung nicht- adaptierter Vogelpopulationen (Feldman et al. 1995; Benning et al. 2002).
Ein früher in der Forschung häufig verwendeter Vogelmalariaerreger war P. (Haemamoeba) cathemerium (Abb. 1), der in der phylogenetischen Fachliteratur aber niemals Erwähnung
findet. P. cathemerium wurde 1924 von Ernest Hartmann im Blut eines Hausspatzes (Passer domesticus) entdeckt (Garnham 1966). Diese Vogelspezies wird zwar als typischer Wirt beschrieben, aber der Parasit wurde danach auch in anderen Arten der Sperlingsfamilie, insgesamt sogar in bisher 70 Vogelarten aus 29 verschiedenen Vogelfamilien gefunden (Bennett et al. 1993). Er tritt fast weltweit in allen zoogeographischen Regionen (Wallace’sche Zonen) außer Australien auf (Bennett et al. 1993).
Abb. 1: P. cathemerium-Erreger im Blutausstrich eines infizierten Kanarienvogels (Serinus canaria)
Typisch für die Untergattung Haemamoeba, ist P. cathemerium durch große und runde Schizonten in der erythrozytären Phase, runde Gametozyten und eine exoerythrozytäre Schizogenie im lymphoiden Makrophagensystem gekennzeichnet (Garnham 1966). Es produziert 16 Merozoiten und bewirkt am Ende der Entwicklung, den Ausschluss des Kerns der Wirtszelle aus derselben. Der natürliche Vektor ist unbekannt, aber im Labor erwiesen sich mehrere Moskitospezies als empfänglich, wie z.B. verschiedene Culex- und Aedes-Arten (Huff 1965; Garnham 1966).
Ein Laborversuch von Gehring (1974) mit P. cathemerium weist auf die prinzipielle Möglichkeit eines natürlichen Wirtswechsels von Vogelmalariaerregern auf Säuger hin.
Gehring überimpfte Blut mit P. cathemerium eines Kanarienvogels auf Labormäuse, von denen einige in der Folge eine tödliche Parasitämie entwickelten. Eine Wiederholung der Infektion mit demselben Parasitenstamm verlief ebenfalls erfolgreich. Anscheinend hatte beim Parasiten des Kanarienvogels eine Mutation vorgelegen, die zu einer Präadaption für einen neuen Wirt führte und es ihm gestattete, auch die kernlosen Säugererythrozyten zu befallen (Gehring 1974). Da der als Spender zweimal verwendete Kanarienvogel im Anschluss an die Experimente verstarb, ging der Parasitenstamm verloren, so dass eine spätere molekularbiologische Untersuchung nicht mehr möglich war. Eine Wiederholung der Versuche mit einigen anderen Vögeln als P. cathemerium-Quelle gelang nicht.
1.4 Phylogenie der Malariaerreger
Zurzeit sind ca. 450 verschiedene Malariaspezies beschrieben, die in 12 Gattungen eingeteilt werden (Perkins und Schall 2002). Sie sind über alle warmen und gemäßigten Klimazonen der Erde verteilt und nutzen eine Vielzahl von Wirbeltieren und Wirbellosen als Wirte (Garnham 1966). Bei den Wirbeltieren sind insbesondere die Primaten-, Nager-, Vogel- und Eidechsenarten als Zwischenwirte hervorzuheben.
Die Malariaerreger wurden neben ihrem Vorkommen in bestimmten Wirtsspezies (Garnham 1966) und ihrer geographischen Verbreitung (Rich und Ayala 2003) hauptsächlich nach morphologischen Gesichtspunkten und Eigenheiten ihres Lebenszyklus’ im Wirbeltierwirt und im Vektor beschrieben und in das phylogenetische System eingeordnet (Garnham 1966;
Perkins und Schall 2002). Als morphologische Unterscheidungskriterien werden die Anzahl der Merozoiten, die Entstehung oder das Fehlen von Malariapigment in der Wirtszelle und der Befall von Leukozyten zusätzlich zu Erythrozyten herangezogen. So wurden zur Spezies- identifizierung und -klassifizierung traditionell nach Giemsa gefärbte Blutausstriche ange- fertigt und lichtmikroskopisch untersucht (Waldenström et al. 2004). Auch heutzutage wird diese Methode noch zur Diagnose der Malaria bei in Gefangenschaft gehaltenen Vögeln (Graczyk et al. 1993) sowie zur Ermittlung von Infektionsprävalenzen (Valkiūnas und Iezhova 2001; Krone et al. 2001) und für weiterführende Speziesidentifizierungen heran- gezogen (Telford und Forrester 1992; Landau et al. 2003).
Die Ergebnisse Kissingers und seiner Mitarbeiter (2002) zur molekularen Systematik von Vogelplasmodien unterstützen allerdings die Ansicht, dass die auf der Basis morphologischer Merkmale erstellten Verwandtschaftsbeziehungen und Stammbäume der Malariaparasiten mit
Skepsis zu betrachten sind. So wiesen Erreger, die aufgrund morphologischer Merkmale in eine gemeinsame Untergattung gestellt wurden, Sequenzanalysen am Cytochrom b-Gen zufolge andere Gruppenzugehörigkeiten auf.
In den letzten Jahren wurde daher verstärkt versucht, die Verwandtschaftsbeziehungen der Malariaerreger mit Hilfe der molekularen Phylogenie zu klären. Diese nutzt die vergleichende Sequenzanalyse, indem sie auf der Basis von Unterschieden zwischen den DNA-Sequenzen verschiedener Erregerspezies einen zeitlichen Ablauf der Evolution simuliert. So wird ein denkbarer entwicklungsgeschichtlicher Ablauf der Auftrennung der Arten und somit eine mögliche Klärung der Verwandtschaftsverhältnisse in Form eines phylogenetischen Stammbaumes gegeben.
Molekular-phylogenetische Stammbäume sind allerdings jeweils nur so gut, wie es die Länge und Anzahl der vorhandenen Sequenzen der verschiedenen Spezies sowie die zum entsprechenden Zeitpunkt verfügbaren Berechnungsmodelle zulassen. Da die Einbeziehung weiterer Plasmodienspezies jeden phylogenetischen Stammbaum der Malariaerreger komplett verändern kann (Escalante et al. 1998), müssen so viele DNA-Sequenzen wie möglich von so vielen Parasitenspezies wie möglich gesammelt werden (Sidall und Barta 1992; Brooks und McLennan 1992; Waters et al. 1993a; Escalante et al. 1997; Kedzierski et al. 2002). Auch mit Blick auf die unklaren Abstammungsverhältnisse von P. falciparum wäre es hilfreich, weitere Daten für Vogelmalariaerreger zu sammeln.
1.5 Zielsetzung der Arbeit
In der vorliegenden Arbeit sollten von vier verschiedenen Malariaerregern unterschiedlicher Wirte (Mensch, Nager, Vogel) Gene amplifiziert und sequenziert werden. Ausgesucht wurden die Gene des mitochondrialen Cytochroms b (cyt b), der 18 SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA) und der caseinolytischen Protease C (ClpC), da für sie z.T. deutlich mehr Sequenzdaten als für andere Gene von Malariaerregern bereits existieren und somit die zuverlässigsten Stammbäume erstellt werden können. Unter Verwendung von aktuellen Computerprogrammen und Einbeziehung sämtlicher zur Zeit der Arbeit vorliegenden Gen- sequenzen sollte versucht werden, die Stellungen von P. falciparum und des neu hinzu- gefügten Erregers P. cathemerium im phylogenetischen Stammbaum der Malariaparasiten zu ermitteln, um gleichzeitig neue Erkenntnisse über die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen P. falciparum und den Vogelmalariaerregern zu erhalten. Diese Auswertungen sollten im Kontext einer kritischen Analyse vorangegangener Studien zur Phylogenie der Malariaerreger gemacht werden.
Des weiteren sollten erstmals Daten zum Vorkommen der Vogelmalaria in Deutschland mit Hilfe molekularbiologischer Techniken (PCR) gewonnen werden. Hierzu sollte das Blut von Vögeln aus drei Arten und von zwei Lokalitäten auf DNA von Malariaerregern getestet werden. Die positiven Proben sollten anschließend sequenziert werden, um Daten über das Erregerspektrum zu gewinnen.
2 Material und Methoden
2.1. Haemosporina, die für die molekulare Phylogenie zur Verfügung standen
Der für die phylogenetischen Untersuchungen verwendete Stamm des Vogelmalariaerregers P. cathemerium (Manwell-Stamm) war in den 1970er und ’80er Jahren von Maier und Piekarski zu Forschungszwecken im Institut für Medizinische Parasitologie, Bonn, in Kanarienvögeln (Serinus canaria) gehalten worden. Der Stamm ging auf Prof. Schulemann, Pharmakologisches Institut der Universität Bonn, zurück. In Flüssigstickstoff tiefgefrorene Aliquots des parasitierten Vogelblutes standen für die Untersuchungen zur Verfügung.
P. chabaudi und P. yoelii nigeriensis stammten aus einer im Institut gehaltenen NMRI-Maus- Zucht. P. ovale wurde aus Patientenisolat gewonnen.
2.2 Gewinnung von Untersuchungsmaterial aus Vögeln 2.2.1 Freilebende, einheimische Vögel
Zur Erhebung der Infektionsprävalenzen einheimischer, freilebender Vögel mit Malariaerregern und zur Feststellung des Erregerspektrums wurde das Blut von 94 Tannenmeisen (Parus ater), 219 Trauerschnäppern (Ficedula hypoleuca) und 56 Kohlmeisen (Parus major) aus den niedersächsischen Gemeinden Bahrdorf und Lingen untersucht. Die Proben waren 1993, 1996, 1999 und 2002 von Mitarbeitern des Institutes für Evolutionsbiologie und Zooökologie der Universität Bonn gewonnen worden (Tab. 1).
Tab. 1: Anzahl und Herkunft der gefangenen Vögel Tannenmeisen
(Parus ater)
Trauerschnäpper (Ficedula hypoleuca)
Kohlmeisen (Parus major) Bahrdorf 1993: 25 1993: 72 1999: 56 Lingen 2002: 69 1996: 147
Zur Blutabnahme wurde die Flügelvene (Vena ulnaris) der Vögel mit einer sterilen Einmal- Kanüle (Durchmesser 0,4 mm) punktiert. Der heraustretende Blutstropfen (ca. 50 µl) wurde mit einer Hämatokritkapillare (Durchmesser 1,1-1,2 mm) aufgenommen und durch Ausblasen in 250 µl APS-Puffer (0,27 M Na2EDTA, 0,24 M NaF, 0,007 M Thymol; Arctander, 1988)
überführt. Hörte die Blutung von allein nicht auf, wurde sie mit Clauden-Watte® gestillt. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Blutproben bei –20 °C gelagert.
In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Vogelarten aus zwei Fanggebieten untersucht. Der Trauerschnäpper (Ficedula hypoleuca) gehört zur Familie der Sänger (Muscicapidae). Diese Art ist von Skandinavien bis Südeuropa weit verbreitet und bewohnt bevorzugt Laubwälder und lichte Nadelwälder, Parks und Obstpflanzungen; sie brütet gerne in künstlichen Nisthöhlen (Heinzel et al. 1992).
Mit der Tannenmeise (Parus ater) und der Kohlmeise (Parus major) wurden des weiteren zwei Arten aus der Familie der Meisen (Paridae) untersucht. Die Tannenmeise kommt in Mitteleuropa sehr häufig vor. Sie ist transpaläarktisch vom Ostatlantik bis Kamtschatka und Japan verbreitet, wobei sich ihre höchsten Bestandsdichten in der montanen und subalpinen Stufe befinden (Glutz von Blotzheim et al. 1993). Die Tannenmeise brütet fast ausschließlich in Nadelwäldern, bevorzugt in alten Fichtenbeständen, kommt jedoch regional auch in Laub- und Mischwäldern vor.
Die Kohlmeise ist in der Paläarktis weit verbreitet und in fast allen Habitaten, mit Ausnahme von Wüsten und Tundren, beheimatet. Sie kommt in Mitteleuropa im Mittelgebirge und in den Niederungen häufig als Brutvogel vor. Man findet sie bevorzugt in Laubwäldern, aber vor allem in Osteuropa kann man sie auch in Laub-Nadelmischwäldern in hohen Dichten antreffen (Glutz von Blotzheim et al. 1993).
Die Blutproben der Vögel waren in den niedersächsischen Gemeinden Lingen und Bahrdorf gesammelt worden. Das 325 ha große Lingener Gebiet im Staatsforstrevier Elbergen im Emsland ist eine ehemalige Hochmoorregion, die Mitte der 1950er Jahre zum Großteil mit Kiefer (Pinus sylvestris) und zur Waldbrandsicherung streifenweise – v.A. an den Bestandsrändern – mit Japanischer Lärche (Larix leptolepis) aufgeforstet wurde. Im Rahmen eines Großversuches zur biologischen Bekämpfung der Lärchenminiermotte (Coleophora laricella) mit Hilfe angesiedelter insektenfressender Singvögel wurden 1972 sämtliche Lärchenbestände mit künstlichen Nisthöhlen ausgestattet. Heute befinden sich dort 540 Nisthöhlen aus Beton; natürliche Nisthöhlen fehlen fast gänzlich.
Seit 1974 wird die Vogelansiedlung im Staatsforstrevier Elbergen durch die Außenstation Braunschweig des Institutes für Vogelforschung ‚Vogelwarte Helgoland’ betreut. Diese sorgt unter anderem für eine jährliche Erhebung brutbiologischer Daten, die Beringung sämtlicher Nestlinge sowie die Markierung bzw. Ringkontrolle aller gefangenen Altvögel (Winkel 1975,
1981; Altenkirch und Winkel 1991). Die Tannenmeise tritt im Gebiet als zweithäufigster Brutvogel nach dem Trauerschnäpper auf (Winkel und Winkel 1997).
Das 160 h große Bahrdorfer Untersuchungsgebiet liegt im östlichen Niedersachsen an der Landesgrenze zu Sachsen-Anhalt und ist Teil des ‚Braunschweiger Höhlenbrüterprogram- mes’, in dessen Rahmen dort seit fast 40 Jahren populationsökologische Studien an ver- schiedenen höhlenbrütenden Singvogelarten durchgeführt werden. Das Gebiet ist ein Nutz- wald, der sich in verschieden strukturierte Teilflächen mit unterschiedlichem Baumbestand und Alter gliedert. Neben reinen Kiefern- (Pinus spec.) und Buchenbeständen (Fagus syl- vestris) herrscht Mischwald mit einigen Eichen (Quercus spec.) und unterschiedlich hohem Totholzanteil vor. Zur Zeit sind dort 690 Holzbeton-Nistkästen ausgehängt (Gerken 2001).
2.2.2 Zoovögel
Insgesamt wurden 47 deutsche Zoos und Tierparks von der Verfasserin dieser Arbeit angeschrieben, um das dortige Vorkommen der Vogelmalaria zu erfassen. Obwohl neun der Einrichtungen über Probleme und Todesfälle insbesondere bei Pinguinen berichteten, konnte nur von einem Zoo Untersuchungsmaterial erhalten werden. Es handelte sich um Paraffin- blöcke mit eingebetteten Organen von einem Brillenpinguin (Spheniscus demersus) und einem Balistar (Leucopsar rothschildi), die 1991 und 1996 im Kölner Zoo an einer Vogel- malaria verstorben waren. Das Material wurde freundlicherweise Prof. Reinacher, Institut für Tierpathologie der Universität Gießen, zur Verfügung gestellt.
2.2.3 Kontrollen
Die humanpathogenen Malariaerreger P. vivax, P. malariae und P. falciparum wurden für Kontrollversuche verwendet. P. vivax und P. malariae wurden aus Patientenisolaten gewonnen, während P. falciparum in einer kontinuierlichen Kultur gezüchtet wurde.
2.3 Auswahl der untersuchten Gene
Im Rahmen der Arbeit zur molekularen Phylogenie wurden drei Gen-Abschnitte sequenziert und vergleichend analysiert. Bei den untersuchten DNA-Regionen handelte es sich um die Gene für die Plastid-kodierte caseinolytische Protease C (ClpC), für das mitochondriale Cytochrom b (cyt b) und für die Kern-kodierte 18 SSU rRNA. Diese Gene wurden gewählt, da sie bereits bei vielen verschiedenen Plasmodienarten untersucht worden waren und eine
ausreichende Menge an Sequenzdaten von größtenteils bzw. sogar vollständig sequenzierten Genen für die Erstellung eines Stammbaumes vorlag.
Bei P. cathemerium wurden alle drei Gene untersucht. Von P. chabaudi wurde das 18 SSU rRNA-Gen und das ClpC-Gen analysiert. Bei P. ovale und P. y. nigeriensis konzentrierte sich die Studie auf das ClpC-Gen.
Für die Ermittlung der Infektionsprävalenzen der einheimischen, freilebenden Vögel wurde ein Teilbereich des cyt b-Gens analysiert, das weltweit für das Screening von Vogelblut auf Plasmodien große Bedeutung erlangt hat (z.B. Bensch et al. 2000; Perkins und Schall 2002;
Waldenström et al. 2002; Waldenström et al. 2004) und somit ein großer Datensatz in den Genbanken für vergleichende Analysen vorhanden war.
2.4 Kontinuierliche P. falciparum-Kultur
Zur Gewinnung von P. falciparum-DNA für Kontrollversuche wurde eine kontinuierliche Kultur geführt (Wiersch 2000), in der die Parasiten soweit angereichert wurden, bis ausreichend Material zur DNA-Extraktion zur Verfügung stand.
2.5 DNA-Gewinnung
2.5.1 DNA-Extraktion aus parasitiertem Kulturmedium, Patienten- und Mäuseblut Die DNA der Malariaerreger P. cathemerium, P. chabaudi, P. y. nigeriensis, P. falciparum, P. vivax, P. malariae und P. ovale wurde mit dem ‚QIAamp DNA Blood Mini Kit’ (Fa.
Qiagen) gemäß des Versuchsprotokolls des Herstellers extrahiert. Hierzu wurden 200 µl des Kulturmediums bzw. des Blutes zusammen mit 200 µl AL-Puffer und 20 µl Protease geschüttelt und 10 Minuten bei 56 °C inkubiert. Danach wurde das Gemisch mit 200 µl absolutem Ethanol versetzt und kurz abzentrifugiert. Die Lösung wurde anschließend auf ein Zentrifugensäulchen gegeben und zwei Minuten bei 13000 RPM zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden im nächsten Schritt 500 µl AW1-Puffer zugegeben, wiederum zwei Minuten zentrifugiert und der Überstand abermals verworfen. Nach Zugabe von 500 µl AW2-Puffer wurde die Säule drei Minuten zentrifugiert, der Überstand erneut verworfen und die Säule mit geöffnetem Deckel drei Minuten stehen gelassen, damit Restalkohol aus dem Puffer verdampfen konnte. Danach wurden 200 µl steriles Wasser auf die Säule gegeben, die noch drei Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde, um der
DNA Zeit zu geben, sich von der Filtermatrix der Säule zu lösen. Nach einem abschließenden zweiminütigen Zentrifugationsschritt lag die DNA-Lösung für die weitere Untersuchung vor.
2.5.2 DNA-Extraktion aus dem Blut der gefangenen Vögel
Für die DNA-Isolation aus dem in APS-Puffer konservierten Vogelblut wurde ein nach Miller et al. (1988) modifiziertes Protokoll verwendet. Das Blut bildet in dem APS-Puffer nach einer Weile eine flüssige und eine viskose Phase aus. Von der viskosen Phase wurden ca. 10 µl entnommen und in ein Eppendorfgefäß mit 150 µl Proteinase K-Puffer (20 mM Tris, 4 mM Na2EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,4) gegeben. Der Inhalt des Eppendorfgefäßes wurde anschließend gut durchmischt. Dabei wurde das Gefäß schnell und unter großem Kraftaufwand für ca. zwei Minuten an dem Gitter einer Reibe entlanggeführt. Anschließend wurde das Eppendorfgefäß fünf Minuten bei 10000 RPM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und auf das weißliche Sediment wurden weitere 280 µl Proteinase K-Puffer gegeben. Die Lösung wurde mittels der Reibe erneut solange durchmischt bis das Sediment gut gelöst war. Zu dem Gemisch wurden 18 µl 10 %iges SDS und 11 µl Proteinase K (10 mg/ml) gefügt. Die Gefäße wurden mehrmals vorsichtig invertiert und anzentrifugiert.
Anschließend folgte eine zweistündige Inkubation im Wasserbad bei 55 °C. Zur DNA- Fällung wurden 100 µl einer gesättigten 6 M NaCl-Lösung hinzugegeben, und die Lösung wurde wiederum mittels einer Reibe gut durchmischt. Nach einer 20-minütigen Zentrifugation (13000 RPM) wurde der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 1 ml 100 %igem Ethanol vermischt bis die DNA ausgefallen war. Das Gefäß wurde 20 Minuten bei –80 °C gekühlt und dann 15 Minuten bei 13000 RPM zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen. Zu dem Sediment wurde 1 ml 70 %iger Ethanol gefügt und das Gefäß nach zwei- bis dreiminütiger Wartezeit zehn Minuten zentrifugiert (13000 RPM). Der Überstand wurde abgegossen und das Sediment für zwei Stunden bei 37 °C im Wärmeschrank getrocknet. Die im getrockneten Sediment enthaltene DNA wurde in 200 µl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) gelöst. Die DNA-Lösung wurde bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.
2.5.3 DNA-Extraktion aus Paraffinschnitten
Um die genomische DNA des Pinguins und des Balistars zu gewinnen, mussten die eingebetteten Organe vom Paraffin gereinigt werden. Hierzu wurde mit einem Skalpell ein kleines Stück von dem Paraffinblock abgeschnitten und zusammen mit 1 ml Xylol in ein Eppendorfgefäß gegeben, das für zehn Minuten bei 500 RPM in einen Schüttler gestellt
wurde. Nach einem 15-minütigen Zentrifugationsschritt bei 13000 RPM wurde das Xylol vorsichtig abgenommen und die Prozedur noch zweimal wiederholt. Die gleichen Schritte wurden danach dreimal mit 100 %igem Ethanol durchgeführt. Nach diesem Auswaschen des Xylols wurden die Gefäße bei 50 °C in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Nach Zugabe von 160 µl ATL-Puffer (‚QIAamp DNA Blood Mini Kit’, Fa. Qiagen) und 40 µl Proteinase K (10 mg/ml, Fa. Merck) wurden die Proben bei 56 °C über Nacht in einem Heizblock geschüttelt.
Am nächsten Tag wurden die Proben mit Hilfe des ‚QIAamp DNA Blood Mini Kits’ (Fa.
Qiagen) aufgearbeitet, wobei einige Schritte des Extraktionsprotokolls leicht modifiziert wurden (Empfehlung C. Regenbrecht, Institut für Neuropathologie, Bonn). So wurde eine Inkubationstemperatur von 70 °C gewählt, und die Zentrifugationsgeschwindigkeit wurde von 13000 auf 8000 RPM reduziert.
2.6 DNA-Amplifikation
2.6.1 Amplifikation der spezifischen Gensequenzen für die molekulare Phylogenie
Primer zur Amplifikation des ClpC- (Tab. 2) und des cyt b-Gens (Tab. 3) wurden nach Sequenz-Alignment verschiedener Plasmodienspezies, die in der GenBank gefunden worden waren, mit Hilfe des ClustalX-Programms (Thompson et al. 1997) konstruiert. Hierzu wurden neun ClpC-Sequenzen und 15 cyt b-Sequenzen herangezogen. Die Primer zur Amplifikation des 18 SSU rRNA-Gens (AL399 und AL400; Tab. 4) wurden der Literatur entnommen (Qari et al. 1996). Weitere interne Primer für das 18 SSU rRNA- (Tab. 4) wie auch für das cyt b- Gen (Tab. 3) wurden mit Hilfe erster gewonnener Sequenzdaten selbst konstruiert.
Tab. 2: Primersequenzen zur PCR-Amplifikation des ClpC-Gens
Primer Nukleotidsequenz [5´Æ 3´] Position im Gen [bp]
Clp1 AAAACTGAATTAGCAAAAATATTA 1-24
Clp2 ATCCTTTAAAGGGAGCTCG 612-641
Tab. 3: Primersequenzen zur PCR-Amplifikation des cyt b-Gens
Primer Nukleotidsequenz [5´Æ 3´] Position im Gen [bp]
cytbF1 AATTACGGGTTSCTTTTAGG 1-20
cytbR1 AACACATTATGATTAC 1016-1032
cytbF2 AATTATGGAGTGGATGGTGTTTTA 122-145
cytbR2 CTTGTGGTAATTGACATCCAA 917-937
cytbF3 CTAGTTATGTTAGCATCTTTA 765-768
cytbR3 TGGATATCTGGATTACTTATA 244-264
Tab. 4: Primersequenzen zur PCR-Amplifikation des 18 SSU rRNA-Gens
Primer Nukleotidsequenz [5´Æ 3´] Position im Gen [bp]
AL399 AACCTGGTTGATCTTGCC 1-18
AL400 TAATGATCCTTCCGCAGG 2081-2098
AL399R ACCCCGTTACCCGACATA 366-383
AL400F GGATATGTGTTTAATGGCG 691-709
IntF2 GTAATCTTAACCATAAACTAT 1101-1121 IntF6 GTGAATATGATTTGTCTGGT 1424-1443 IntF7 TGTCCTTAGATGAACTAGGCTTG 1706-1727
IntR CCTTATGAGAAATCAAAGTC 1209-1228
IntR2 AATACAAATGCCCCCAAG 962-979
Pl2R GTGTAGGTAATCTTTATCAATA 1832-1853
Bis auf die spezifischen Primer stimmte die Zusammensetzung der PCR-Ansätze für alle zu amplifizierenden Genabschnitte überein. Die Reaktionskomponenten für einen Einzelansatz sind in Tabelle 5 aufgelistet. Das Gesamtvolumen betrug jeweils 50 µl. Sämtliche PCR- Amplifikationen wurden mit einem Thermocycler T personal (Fa. Biometra) durchgeführt.
Tab. 5: Zusammensetzung eines PCR-Reaktionsansatzes zur Amplifikation des ClpC-, des Cytochrom b- und 18 SSU rRNA-Gens
Chemikalien Konzentration
der Stocklösung Menge [µl] Endkonzentration
ddH2O 38,75
10 x Reaktionspuffer (pH 8,3)
100 mM Tris-HCl
500 mM KCl 5 10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
dNTPs 20 mM 1 0,4 mM
MgCl2 50 mM 3 3 mM
Primer 1 20 µM 0,5 200 nM
Primer 2 20 µM 0,5 200 nM
Taq DNA-Polymerase
(Invitrogen) 5 U/µl 0,25 0,025 U/µl
DNA 1
Gesamtvolumen 50
Für die Amplifikation des cyt b-Gens und des 18 SSU rRNA-Gens wurde ein identisches Temperaturprofil verwendet (Tab. 6).
Tab. 6: Temperaturprofil zur PCR-Amplifikation des cyt b- und 18 SSU rRNA-Gens
Arbeitsschritt Temperatur [°C] Dauer [s]
initiale Denaturierung 94 60
Denaturierung 94 30
Annealing 50 30
Extension 62 90
35 Zyklen
finale Elongation 62 180
Für die Amplifikation des ClpC-Gens musste der Literaturvorgabe (Rathore et al. 2001) zufolge ein anderes Temperaturprofil benutzt werden (Tab. 7).
Tab. 7: Temperaturprofil zur PCR-Amplifikation des ClpC-Gens
Arbeitsschritt Temperatur [°C] Dauer [s]
initiale Denaturierung 94 240
Denaturierung 94 20
Annealing 50 20
Extension 72 60
15 Zyklen, pro Zyklus Reduktion
der Annealing-Tem- peratur um 1 °C
Denaturierung 94 20
Annealing 50 20
Extension 72 60
20 Zyklen
finale Elongation 72 300
2.6.2 PCR zur Ermittlung der Infektionsprävalenzen einheimischer Vögel
Die Genus-spezifische PCR nach Hulier et al. (1996) diente zum schnellen Screening der DNA-Extrakte auf Plasmodium spec. Mit Hilfe dieser PCR wird ein spezifischer, 243 bp langer Abschnitt des 18 SSU rRNA-Gens der Plasmodien amplifiziert. Zur Amplifikation wurden die spezifischen Primer rPLU3 und rPLU4 (Tab. 8) eingesetzt. Vorversuche lieferten das erwartete DNA-Fragment für P. cathemerium, P. falciparum, P. vivax, P. ovale und P.
malariae.
Tab. 8: Primersequenzen der Genus-spezifischen PCR nach Hulier et al. (1996)
Primer Nukleotidsequenz [5´Æ 3´] Position im Gen [bp]
rPLU3 TTTTTATAAGGATAACTACGGAAAAGCTGT 132-161
rPLU4 TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC 347-376
Die Zusammensetzung eines einzelnen PCR-Ansatzes mit einem Gesamtvolumen von 50 µl und das verwendeten PCR-Temperaturprofil zeigen die Tabellen 9 und 10.
Tab. 9: Zusammensetzung eines PCR-Reaktionsansatzes nach Hulier et al. (1996)
Chemikalien Konzentration
der Stocklösung Menge [µl] Endkonzentration
ddH2O 27,7
10 x Reaktionspuffer (pH 8,3)
100 mM Tris-HCl
500 mM KCl 5 10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
dNTPs 20 mM 0,5 0,2 mM
MgCl2 50 mM 6 6 mM
rPLU3 20 µM 0,3 120 nM
rPLU4 20 µM 0,3 120 nM
Taq DNA-Polymerase
(Invitrogen) 5 U/µl 0,2 0,02 U/µl
DNA 10
Gesamtvolumen 50
Tab. 10: Temperaturprofil der PCR nach Hulier et al. (1996)
Arbeitsschritt Temperatur [°C] Dauer [min]
initiale Denaturierung 95 5
Denaturierung 95 2
Annealing 64 2
Extension 72 1
35 Zyklen
finale Elongation 72 10
Um die Rahmenbedingungen zu kontrollieren, wurden bei jeder PCR eine Positiv- und eine Negativkontrolle mitgeführt. In den Ansatz der Positivkontrolle wurden 10 µl einer DNA- Lösung eingesetzt, die aus einer P. falciparum-Kultur gewonnen worden war. Als Negativ- kontrolle diente ein Ansatz mit 10 µl DNA-Lösung aus dem Blut einer Buntfußsturmschwalbe (Oceanites oceanicus). Da die Blutproben der Buntfußsturmschwalbe aus der Antarktis stammen, in der keine Mücken als Überträger von Plasmodien vorkommen, wurde davon ausgegangen, dass eine Infektion mit Malariaerregern nicht möglich wäre.
2.6.3 PCR zur Ermittlung des Erregerspektrums einheimischer Vögel mit Malariaparasiten
Zu Beginn der Arbeit war geplant, mittels der selbst konstruierten cyt b-Gen- sowie der Clp1- und Clp2-Primer die verschiedenen Erregerspezies zu ermitteln. In Vorversuchen zeigte sich allerdings, dass diese Primerpaare zu einer verhältnismäßig geringen Sensitivität beitrugen, denn Vögel, die mit den Primern von Hulier et al. (1996) Plasmodium-positiv getestet worden waren, erwiesen sich mit den selbst konstruierten Primern häufig als negativ. Nur bei wenigen Tannenmeisen aus der Lingener Population und einigen Bahrdorfer Kohlmeisen konnten sequenzierbare DNA-Fragmente erhalten werden. Daher wurde zum Vergleich die nested PCR nach Waldenström et al. (2004) mit den dazugehörigen Primern erprobt und schließlich auch als Standardverfahren übernommen, nachdem sie sich als deutlich sensitiver erwiesen hatte.
Mit den Proben, in denen mit der PCR nach Hulier et al. (1996) Plasmodium-DNA nachgewiesen werden konnte, wurde daher weiterführend die Gattungs-spezifische nested PCR nach Waldenström et al. (2004) durchgeführt, bei der ein Abschnitt des cyt b-Gens amplifiziert wurde. Diese anschließende PCR war notwendig, da das Amplifikat der PCR nach Hulier et al. (1996) sehr kurz ist und somit relativ wenig Sequenzinformation liefert. Der cyt b-Genabschnitt ist dagegen viel länger, und es lagen für ihn wesentlich mehr Sequenzdaten in der GenBank vor als für das 18 SSU rRNA-Gen. Über die Sequenzierung der PCR-Produkte und einen nachfolgenden Sequenzvergleich sollten nämlich die verschie- denen Erregerspezies ermittelt werden. Die für die nested PCR nach Waldenström et al.
(2004) verwendeten Primer sind in Tab. 11 angegeben.
Auch die DNA des Brillenpinguins und des Balistars aus dem Kölner Zoo wurden mit der nested PCR untersucht.
Mit Ausnahme der Primer und der Zyklenzahl stimmten die Reaktionskomponenten und das Temperaturprofil der 1. und die 2. nested PCR überein.
Nach der 1. nested PCR wurde 1 µl Volumen in die 2. nested PCR überführt. Die 2. nested PCR bestand aus 35 anstatt 20 Zyklen.
Tab. 11: Primersequenzen für die nested PCR nach Waldenström et al. (2004)
Primer Nukleotidsequenz [5´Æ 3´] Position im Gen [bp]
HAEMNF
(1. nested) CATATATTAAGAGAATTATGGAG 109-131
HAEMNR2
(1. nested) AGAGGTGTAGCATATCTATCTAC 667-689
HAEMF
(2. nested) ATGGTGCTTTCGATATATGCATG 135-157
HAEMR2
(2. nested) GCATTATCTGGATGTGATAATGGT 636-659
Die Zusammensetzung eines einzelnen PCR-Ansatzes (Gesamtvolumen: 25 µl) und des PCR- Temperaturprofils sind in den Tabellen 12 und 13 dargestellt.
Tab. 12: Zusammensetzung eines nested PCR-Reaktionsansatzes nach Waldenström et al.
(2004)
Chemikalien Konzentration
der Stocklösung Menge [µl] Endkonzentration
ddH2O 18,5
10 x Reaktionspuffer (pH 8,3)
100 mM Tris-HCl
500 mM KCl 2,5 10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
dNTPs 20 mM 0,5 0,4 mM
MgCl2 50 mM 0,75 1,5 mM
HAEMNF bzw.
HAEMF 20 µM 0,75 0,6 µM
HAEMNR2 bzw.
HAEMR2 20 µM 0,75 0,6 µM
Taq DNA-Polymerase
(Invitrogen) 5 U/µl 0,25 0,05 U/µl
DNA 1
Gesamtvolumen 25
Tab. 13: Temperaturprofil der nested PCR nach Waldenström et al. (2004)
Arbeitsschritt Temperatur [°C] Dauer [s]
initiale Denaturierung 94 180
Denaturierung 94 30
Annealing 50 30
Extension 72 45
20 (1. nested) bzw.
35 Zyklen (2. nested)
finale Elongation 72 600
Wenn nach der 1. und 2. nested PCR nach dem beschriebenen Protokoll keine spezifische Bande erhalten werden konnte, wurden Modifikationen im Reaktionsansatz vorgenommen.
So wurde z.B. die Menge der eingesetzten DNA in der 1. nested PCR sukzessive bis auf 5 µl erhöht. Ebenso wurde in einigen Fällen die Menge des Volumens, das aus der 1. in die 2.
nested PCR überführt wurde, bis auf 5 µl gesteigert. Eine weitere Alternative war ein ‚Hot Start’ der PCR. Bei diesem ist der Thermocycler bereits auf die initiale Denaturierungs- temperatur vorgeheizt, wenn die Reaktionsgefäße in das Gerät eingesetzt werden. Dieser Schritt verhindert eine unkontrollierte Aktivität der Taq-Polymerase während des Vorheizens des Thermocyclers. Die Anwendung des ‚Hot Start’-Protokolls führte zu so guten Ergebnissen, dass sie anschließend in das Routineprotokoll aufgenommen wurde.
2.6.4 Unspezifische DNA-Präamplifikation
Da es in einigen Fällen trotz Variationen der in die nested PCR eingesetzten Menge an DNA nicht gelang, ein Amplifikationsprodukt zu erhalten, wurde der spezifischen PCR eine unspezifische DNA-Präamplifikation mittels des ‚GenomiPhi Kits’ (Fa. Amersham Biosciences) vorangestellt. Dabei wurde den Anweisungen des Herstellerprotokolls Folge geleistet mit der Ausnahme, dass von allen im Kit enthaltenen Reaktionskomponenten nur die Hälfte der angegebenen Menge verwendet wurde. Dementsprechend wurden 1 µl der DNA- Ausgangslösung zusammen mit 4,5 µl Probenpuffer in ein Eppendorfgefäß gegeben und vermischt. Danach wurde die Lösung zur DNA-Denaturierung für drei Minuten bei 95 °C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Parallel dazu wurden in einem anderen Eppendorfgefäß 4,5 µl Reaktionspuffer mit 0,5 µl Enzymmix, der das Enzym ‚Phi 29 DNA- Polymerase’ enthielt, vorsichtig auf Eis vermischt. Im nächsten Schritt wurde der Inhalt beider Reagenzgefäße zusammengegeben und das Gemisch für 16 Stunden bei 30 °C inkubiert. Das Enzym wurde durch anschließende 10-minütige Erwärmung auf 95 °C
inaktiviert und die Reaktion somit beendet. Die Proben konnten dann bei 4 °C gelagert werden. Aus dem resultierenden Reaktionsansatz wurde 1 µl Volumen in die 1. nested PCR eingesetzt. In allen zuvor negativen Fällen konnte auf diese Weise ein Amplifikat in der erwarteten Fragmentlänge erhalten werden.
2.7 Agarose-Gelelektrophorese und Färbung der Gele
Zur Amplifikationskontrolle wurden 15 µl des PCR-Produktes, vermischt mit 1,5 µl Lade- puffer (mit dem Farbstoffgemisch Bromphenolblau/Xylencyanol), in die Geltaschen eines 1,5
%igen Agarosegels gegeben. Zur Herstellung des Gels wurden 1,5 g Agarose in 100 ml 1 x TBE-Puffer (89 mM Tris; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA, pH 8) aufgekocht. Zusätzlich wurde ein Längenstandard (100 bp DNA-Leiter, Fa. Peqlab) auf das Gel aufgetragen, um die Größe der DNA-Fragmente bestimmen und diese identifizieren zu können. Hierzu wurden 1,5 µl des Längenstandards, 1,5 µl Ladepuffer und 8 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 7,4) miteinander vermischt. Die Gelelektrophorese wurde in 0,5 x TBE-Puffer bei 120 Volt und einer Laufzeit von ca. 1 bis 1,5 Stunden durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel für ca. 20 Minuten in einem Ethidiumbromidbad (0,5 µg/ml) gefärbt, um die DNA-Fragmente unter UV-Licht (312 nm) sichtbar zu machen. Zur Dokumentation der Ergebnisse wurden die Gele photographiert.
2.8 DNA-Elution
Um für die anschließende Sequenzierung saubere DNA-Fragmente zu erhalten, wurden die spezifischen Banden mit den PCR-Produkten nach der gelelektrophoretischen Auftrennung mit Hilfe eines Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten. Die Elution erfolgte mit Hilfe des
‚QIAquick Gel Extraction Kits’ (Fa. Qiagen) nach dem Protokoll des Herstellers. Das Gelstück wurde abgewogen und mit der dreifachen Menge an QG-Puffer versetzt. Nach einer 10-minütigen Inkubationsphase, während der alle zwei Minuten das Gemisch geschüttelt wurde, wurde ein Volumenanteil Isopropanol zugegeben. Anschließend wurde das Eppen- dorfgefäß mehrmals vorsichtig invertiert, die Lösung in eine Zentrifugationssäule gegeben und diese eine Minute bei 13000 RPM zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, und es wurden 500 µl QG-Puffer auf die Säule pipettiert. Es folgte eine erneute Zentrifugation von einer Minute. Nach Entfernung des Durchflusses wurden 750 µl PE-Puffer auf die Säule gegeben, und es wurde eine weitere Minute zentrifugiert. Anschließend wurde die Säule eine
Minute trocken zentrifugiert, in ein neues Eppendorfgefäß gegeben, und es wurden 30 µl steriles Aqua dest. hinzugegeben. Nach einer Minute Inkubationszeit wurde ein abschließender einminütiger Zentrifugationsschritt durchgeführt, der ein Eluat mit der DNA darin lieferte.
Zur Überprüfung der Qualität und Quantität der eluierten DNA wurden 5 µl des gewonnenen Eluats auf ein Agarosegel aufgetragen. Als Längenstandard wurde dieses Mal die
‚SmartLadder SF’ (Fa. Eurogentec) aufgetragen, eine 100 bp-Leiter, deren Banden eine definierte Menge an DNA enthalten. Durch Vergleich der Banden des Längenstandards mit denen des Eluats konnte die Menge der darin enthaltenen DNA grob abgeschätzt werden. Für die Sequenzierung wurden zwischen 20 und 30 ng pro 100 bp Fragmentlänge auf ein Volumen von 10 µl eingestellt, indem Flüssigkeit mit Aqua dest. ergänzt oder mit der Vakuumzentrifuge entfernt wurde.
2.9 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung der PCR-Produkte wurde in der Regel bei der Firma MWG in Auftrag gegeben und dort mittels der Cycle-Sequencing-Reaktion an einem ABI Prism 377 Sequencer (Fa. Applied Biosystems) durchgeführt. Als Sequenzierprimer wurde jeweils einer der PCR- Primer verwendet. Die Amplifikate wurden jeweils an beiden Strängen (d.h. in beide Richtungen) sequenziert.
Zum Teil wurden auch selber Sequenzierungen (im Institut für Evolutionsbiologie und Ökologie, Bonn) durchgeführt. Vor der Sequenzierung wurde eine Cycle-Sequencing- Reaktion angesetzt, die dem Einbau von mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Terminations- nukleotiden (ddNTPs) diente; diese werden später von der Detektoreinheit des Sequenzierers (ABI Prism 377 Sequencer) erkannt. Der ‚Big Dye Terminator Kit’ (Fa. Applied Biosystems), der für die Cycle-Sequencing-Reaktion verwendet wurde, enthielt ddNTPs, AmpliTaq DNA- Polymerase, MgCl2 und Tris-HCl-Puffer (pH 9) in unbekannten Konzentrationen. Die Zusammensetzung eines einzelnen Cycle-Squencing-Reaktionsansatzes und das Cycle- Sequencing-Temperaturprofil sind in den Tabellen 14 und 15 dargestellt.
Tab. 14: Zusammensetzung eines Cycle-Sequencing-Reaktionsansatzes
Chemikalien Konzentration
der Stocklösung Menge (µl) Endkonzentration
ddH2O 1
5 x Reaktionspuffer 5 x 1 1 x
Sequenzierprimer 100 mM 1 10 mM
AmpliTaq DNA-
Polymerase 3
DNA 4
Gesamtvolumen 10
Tab. 15: Temperaturprofil für das Cycle-Sequencing
Arbeitsschritt Temperatur [°C] Dauer [s]
initiale Denaturierung 96 120
Denaturierung 96 10
Annealing 50 5
Extension 60 90
15 Zyklen
2.10 Phylogenetische Analyse 2.10.1 Sequenz-Alignment
Per Sequenz-Alignment mit Hilfe des Programms ClustalX (Thompson et al. 1997) wurden die ermittelten ClpC-Gensequenzen der Malariaerreger mit entsprechenden, in der GenBank abgelegten Sequenzen von neun anderen Plasmodienspezies (Tab. 16) verglichen. Ebenso wurde mit den cyt b-Sequenzen und 50 GenBank-Einträgen (Tab. 17) für zur Familie der Haemosporidae gehörende Spezies verfahren.
Tab. 16: Sequenzdaten für die ClpC-Gen-Analyse
Parasit GenBank-Zugangsnummer Autor
Primaten-Plasmodien P. falciparum
P. vivax P. malariae P. cynomolgi P. knowlesi
X95276 AF348344 AF348342 AF348338 AF348341
Rathore et al. (2001) Rathore et al. (2001) Rathore et al. (2001) Rathore et al. (2001) Rathore et al. (2001) Nager-Plasmodien
P. berghei AF348337 Rathore et al. (2001)
Vögel-Plasmodien P. relictum
P. elongatum P. gallinaceum
AF348343 AF348339 AF348340
Rathore et al. (2001) Rathore et al. (2001) Rathore et al. (2001) Außengruppe
T. gondii U87145 Rathore et al. (2001)
Tab. 17: Sequenzdaten für die cyt b-Gen-Analyse
Parasit GenBank-Zugangsnummer Autor
Primaten-Plasmodien P. cynomolgi
P. falciparum P. fieldi P. gonderi P. hylobati P. inui P. knowlesi P. malariae P. ovale P. reichenowi P. simiovale P. simium P. vivax
Plasmodium spec. (Mandrill)
AF069616 AF069605 AF069615 AF069622 AF069618 AF069617 AF069621 AF069624 AF069625 AF069610 AF069614 AF069620 AF069619 AF069623
Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Escalante et al. (1998) Nager-Plasmodien
P. atheruri P. berghei P. chabaudi P. vinckei P. yoelii
AY099054 AY099049 AY099050 AY099052 AY099051
Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002)
Parasit GenBank-Zugangsnummer Autor Vogel-Plasmodien
P. elongatum P. gallinaceum P. relictum
Plasmodium spec. 1 Plasmodium spec. 2 Plasmodium spec. 3 Plasmodium spec. 4 Plasmodium spec. 5 Plasmodium spec. 6
AF069611 AY099029 AY099032 AY099041 AY099031 AY099033 AY099035 AY099036 AY099044
Escalante et al. (1998) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Eidechsen-Plasmodien
P. agamae
P. azurophilum (Erythrozyt) P. azurophilum (Leukozyt) P. chiricahuae
P. fairchildi P. floridense P. giganteum P. mexicanum Plasmodium spec.
AY099048 AY099055 AY099058 AY099061 AY099056 AY099059 AY099053 AY099060 AY099047
Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Hepatocystis von Säugern
Hepatocystis spec. (Pavian) Hepatocystis spec. (Fledermaus)
AF069626 AY099030
Escalante et al. (1998) Perkins und Schall (2002) Haemoproteus von Vögeln
H. majoris H. sylvae
Haemoproteus spec. 1 Haemoproteus spec. 2 Haemoproteus spec. 3 Haemoproteus spec. 4 Haemoproteus spec. 5 Haemoproteus spec. 6 Haemoproteus spec. 7
AY099045 AY099040 AY099034 AY099037 AY099043 AY099046 AY099039 AY099038 AY099042
Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Haemoproteus der Eidechsen
H. ptyodactyli H. kopki
AY099057 AY099062
Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Außengruppen
Toxoplasma gondii Leucocytozoon dubreuli Leucocytozoon simondi Theileria annulata
U03070 AY099063 AY099064 M63015
Holmdahl et al. (1994) Perkins und Schall (2002) Perkins und Schall (2002) Megson et al. (1991)
2.10.2 Maximum-Parsimonie
Phylogenetische Analysen für das cyt b- und das ClpC-Gen wurden mit den Programmen PAUP (Phylogenetic analysis using parsimony) 4.0 beta 10 (Swofford 1999), basierend auf den Ergebnissen des ClustalX-Alignments (Thompson et al. 1997), durchgeführt.
Bei der Maximum-Parsimonie (MP)-Methode wird davon ausgegangen, dass die Topologie eines Stammbaumes die realen Verhältnisse am besten wiedergibt, wenn sie die heute zu beobachtenden Sequenzunterschiede mit den wenigsten Substitutionsereignissen erklärt. Man geht hierbei von den Sequenzen des ClustalX-Alignments aus, ermittelt für jede Nukleotid- Position das Nukleotid der Vorläufersequenzen an den internen Knoten des Baumes, und zählt für jede mögliche Topologie die minimale Anzahl an Substitutionen, die die Evolution der Gruppe erklären kann. Die optimale Topologie von allen ist die, welche die wenigsten Substitutionen aufweist.
Die MP-Methode verwendet nicht alle Positionen eines Alignments. Positionen, die in allen Sequenzen gleich sind, sind uninformativ und werden nicht berücksichtigt. Bei Positionen, an denen nur eine Sequenz eine bestimmte Substitution aufweist, muss diese Substitution an einem terminalen Ast liegen, da diese Positionen unter dem Parsimonie-Kriterium keine Schlüsse auf die verwandtschaftliche Beziehung einer Art zulassen. Parsimonie-informativ hingegen sind all die Positionen, an denen mehr als eine Sequenz eine bestimmte Substitution aufweist. Nachteil der MP-Methode ist, dass Fehlinterpretationen aufgrund von Homoplasien (mehrfaches unabhängiges Entstehen von Merkmalen) auftreten können.
In die Berechnung mit PAUP wurden Außengruppen (Tab. 16 und 17) mit einbezogen, um den Baum zu wurzeln, d.h. einen zeitlichen Ablauf der Evolution zu veranschaulichen. Für das ClpC-Gen wurde T. gondii als Außengruppe gewählt, ein Parasit, der, wie die Plasmodien, zu der Unterklasse der Coccidia gehört. In die Berechnung des cyt b-Gens wurden zusätzlich noch drei andere Parasiten aus der Ordnung der Apicomplexa mit einbezogen: Leucocytozoon dubreuli und L. simondi aus der Familie der Leucocytozoidae, die zusammen mit den Plasmodien in der Unterordnung Haemosporina stehen, und Theileria annulata, ein Parasit der Unterklasse Piroplasmida (Systematik nach Levine et al. 1980). Die Außengruppen wurden so gewählt, dass sie so entfernt verwandt mit den Innengruppen waren, dass sie den Baum wurzeln konnten; andererseits mussten sie so nah mit ihnen ver- wandt sein, dass sie gemeinsame Vorfahren aufwiesen (Hall 2001).
2.10.3 Maximum Likelihood
Zur Berechnung des Maximum Likelihood (ML)-Baumes wurde das Programm Modeltest 3.0 (Posada und Crandall 1998) an das Programm PAUP (Swofford 1999) gehängt. Modeltest ist in der Lage, 56 verschiedene Substitutionsmodelle zu testen. Das Optimierungskriterium bei ML-Methoden ist die ‚Likelihood’ des Datensatzes unter Vorgabe einer bestimmten Topologie und eines bestimmten Substitutionsmodells. Die Topologie, bei der die
‚Likelihood’ maximal ist, ist die optimale. Wenn man ML-Methoden verwendet, muss man sich zwischen verschiedenen Substitutionsmodellen entscheiden, wobei im Prinzip jedes Modell falsch ist, da es die wahren Verhältnisse nur grob vereinfacht darstellen kann. Je komplizierter ein Modell ist, desto genauer spiegelt es in der Regel die Wirklichkeit wieder.
Bei Verwendung eines komplizierteren Modells besteht allerdings die Gefahr, dass man nicht die wahre Phylogenie beschreibt, weil die Varianz zunimmt. ML bietet die Möglichkeit, sich aufgrund eines statistischen Kriteriums zwischen verschiedenen Methoden zu unterscheiden.
Zunächst maximiert man die ‚Likelihood’-Funktion über alle Parameter eines vorher ausgesuchten Modells. Dann wählt man ein komplizierteres Modell und wiederholt die Berechnung. So sucht man nach einem Substitutionsmodell, für das die ‚Likelihood’-Funktion maximal ist. Die Modelle können im Prinzip immer weiter verfeinert werden, um die
‚Likelihood’-Funktion zu verbessern. Oberhalb einer gewissen Grenze sind diese Ver- besserungen allerdings nur noch minimal. Wenn das kompliziertere Modell jeweils ein Spezialfall des einfacheren ist, kann man testen, ob die Unterschiede zwischen den Fällen noch signifikant sind. Sind sie es nicht, kann das kompliziertere Modell den Datensatz nicht wesentlich besser erklären als das einfachere Modell. In diesem Fall entscheidet man sich für das einfachere Modell. Das einfachste der 56 Modelle ist das Jukes-Cantor Modell (Jukes und Cantor 1969). Dieses hat zur Grundlage, dass die Substitutionsraten zwischen allen Nukleotiden als gleich angesehen werden. Das Kimura-2-Parameter Modell (Kimura 1980) unterscheidet zwischen Transitions- und Transversionsraten. Das HKY-Modell (Hasegawa et al. 1985) berücksichtigt, dass die Nukleotide in unterschiedlichen Mengen vorkommen, was die Substitutionsraten auch beeinflusst. Im GTR-Modell (General time reversible; Lanavé et al. 1984) geht man von unterschiedlichen Raten für alle Arten von Substitutionen aus. Alle diese Modelle nehmen an, dass die Substitutionsraten für alle Positionen einer Sequenz die gleichen sind. Das trifft aber in der Regel nicht zu. So haben z.B. manche Gene stärker und schwächer konservierte Regionen. Erste, zweite und dritte Codonpositionen von Aminosäure- kodierenden DNA-Sequenzen haben meist auch verschiedene Substitutionsraten, da die dritte Codonposition meist „still“ ist und nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz im
Falle einer Punktmutation führen würde. Auch diese Variation kann man in Substitutions- modellen berücksichtigen, indem man verschiedenen Positionen des Alignments unter- schiedliche Substitutionsraten aus einer Häufigkeitsverteilung (Gamma-Verteilung) zuweist.
2.10.4. Baye’ssche Analyse
Die mit dem Programm Modeltest (Posada und Crandall 1998) ermittelte optimale Modellkomplexität wird der Bayes’schen Analyse (Programm MrBayes V3 b4 v2win;
Huelsenbeck 2001) vorgegeben, um die ‚a posteriori’-Wahrscheinlichkeit der freien Modellparameter für die Topologien und die Zweiglängen zu ermitteln. Die ‚Markov-Chain Monte Carlo’-Methode (MCMC), die in MrBayes V3 b4 v2win (Huelsenbeck 2001) angewandt wird, berechnet die ‚a posteriori’-Wahrscheinlichkeit aus einer Zufallsstichprobe von Bäumen, in denen die Bäume proportional zu posterioren Wahrscheinlichkeit vertreten sind. Ausgehend von einem Zufallsbaum verändert das Computerprogramm bei jedem Schritt der Markov-Kette einen Parameter der Phylogenie. Verbessert sich die posteriore Wahr- scheinlichkeit, wechselt das Computerprogramm zu einem neuen Baum, verschlechtert sie sich, wird die Veränderung nur mit einer geringen Wahrscheinlichkeit akzeptiert. Auf diese Weise bewegt sich das Programm durch den „Wahrscheinlichkeitsraum“ aller möglicher Phylogenien, wobei es Bäume proportional zu ihrer posterioren Wahrscheinlichkeit sammelt.
Nur eine geringe Anzahl „besuchter“ Bäume wird gespeichert, um so eine Zufallsstichprobe zu erhalten. Innerhalb der Markov-Kette ist allerdings jeder Baum unmittelbar von seinem Vorgänger abhängig, so dass es sich nicht um eine unabhängige Stichprobe handelt. Die Abhängigkeit wird allerdings immer geringer, je mehr Schritte sich zwischen den gesammelten Bäumen befinden. Die ersten Schritte werden verworfen, da die Werte wahrscheinlich weit von Regionen hoher posteriorer Wahrscheinlichkeit entfernt liegen.
Parallel laufen vier verschiedene Markov-Ketten, die von verschiedenen Zufallsbäumen aus- gehen. Das erhöht die Chance, dass die Analyse im optimalen Bereich der ‚Likelihood’- Oberfläche konvergiert. Der jeweils beste Wert der vier Ketten wird von einer so genannten
„kalten Kette“ beibehalten, die drei anderen „heißen“ Ketten suchen weiter nach den besten posterioren Wahrscheinlichkeits-Werten. Eine hohe Generationenzahl (= Schritte) erhöht die Chancen, gute posteriore Wahrscheinlichkeits-Werte zu bekommen. Anschließend wird ein Konsensusbaum aus der Summe der Einzelbäume erstellt und die Kanten auf deren Häufigkeit im Set untersucht.
